🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Giáo trình công nghệ sinh học đại cương Ebooks Nhóm Zalo Đ Ạ I HỌ C THÁ I NGUYỀ N TRƯ Ờ N G Đ Ạ I HỌ C NÔN G LÂ M Đ Ô NĂN G VỊN H (Ch ủ biên ) - NG Ô XUÂ N BÌN H NHÀ XUẤT BẢ N NÔNG NGHIỆP Đ Ạ I HỌ C THÁ I NGUYÊ N TRƯ Ờ N G Đ Ạ I HỌ C NỒN G LÂ M Đ Ỗ NĂN G VỊN H (Ch ủ biên ) N G Ô XUÂ N BÌN H GIÁ O TRÌN H CÔN G NGH Ệ SIN H HỌ C Đ A I CƯƠN G N H À XUẤ T BẢ N NÔN G NGHIỆ P H À NỘ I - 2008 M Ở Đ Ầ U Công nghệ thông tin và công nghệ sinh học (CNSH) là hai lĩnh vực công nghệ ưu tiên phát triển ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Nhiều học giả đã dự báo sức mạnh to lớn của CNSH đối với cải tạo sinh giới, trong đó có bản thân con người. Vai trò của CNSH đối với phát triển kinh tế và y học, đối với an sinh xã hội và hệ sinh thái trên trái đất đang ngày càng mạnh lên cùng với sự tích lũy nhanh chóng của tri thức về các quá trình sống. Nhiều câu hỏi lớn liên quan đến phát triển công nghệ sinh học đang đặt ra: Ì. Lịch sử hình thành và phát triển của công nghệ sinh học? 2. Công nghệ sinh học là gì? Công nghệ sinh học bao gồm những ngành khoa học và công nghệ nào? 3. Quan hệ giữa CNSH với các ngành khoa học tự nhiên, khoa học xã hội khác? 4. Các kiến thức cơ bản của công nghệ sinh học? 5. Vai trò khám phá bản chất sự sống và khả năng cải tạo sinh giới của CNSH? 6. Vai trò của công nghệ sinh học đối với phát triển kinh tế- xã hội và ngược lại vai trò của kinh tế- xã hội và chính sách quốc gia dối với phát triển CNSH? 7. Hiện trạng và dự báo phát triển công nghệ sinh học trên thế giới và ỏ nước ta? 8. Định hướng phát triển công nghệ sinh học ở nước ta? Một trong các nhiệm vụ của quyển sách này là đặt ra những câu hỏi, đồng thời cùng sinh viên và người đọc tìm ra câu trả lời các câu hỏi mang tính tổng quát trên. Hiện nay, nền kinh tế toàn cẩu đang trải qua những thách thức ngày càng lớn. Đố là sự phát triển nóng của các nền kinh tế, nhất là ở Trung Quốc, An Độ, Brasiỉ, Nga vá các nước Đông Nam Á trong đó có Việt Nam, đòi hỏi sự gia tăng khai thác và sử dụng năng lượng. Khả năng suy kiệt các nguồn than đá, dầu mỏ, khí đốt là nhãn tiền trong khoảng 30 năm tới. Các quốc gia đông dân như Trung Quốc, An Độ, Nga đang dần trở thành các nên kinh tế lớn với mức tiêu dùng năng lượng và sản xuất khí thải nhà kính tương tự như Mỹ hiện nay. Tình hình đó có thể đẩy nhanh quá trình khủng khoảng năng lượng và môi trường toàn cầu, có thể dẫn đến chiến tranh vì những khoảng không gian sinh tồn và các nguồn năng lượng. Vấn đề môi trường sinh thái trở thành vấn đề tồn tại hay không tồn tại? Phát triển hay không phát triển? Phát triển phải như thế nào? Giải pháp phát triển nào được xem là bền vững trên phạm vi toàn cẩu và cho từng quốc gia? Vai trò của CNSH đến đâu trong giải quyết các vấn đê trên? Định hướng và xu thế phát triển của công nghệ sinh học trong tương lai phụ thuộc rất nhiêu vào việc trả lời cho các câu hỏi trên đây. 3 Vai trò của CNSH trong giải quyết các vấn dề an sinh xã hội, vấn đề năng lượng tái sinh và sinh thái bền vững là rất to lớn. Các nhà khoa học trẻ và sinh viên trong lĩnh vực sinh học - nông nghiệp, bên cạnh việc phải có những kiến thức chuyên môn sâu, phải có tầm nhìn rộng lớn hơn, bao quát hơn và định hướng tốt hơn trong hoạt động thực tiễn. Cuốn "Công nghệ sinh học đại cương" nhằm góp phần cung cấp cho học viên các kiến thức cơ bản về CNSH và vai trò của CNSH đối với thực tiễn, đồng thời gợi ý một số các định hướng và giải pháp phát triển của CNSH trong giai đoạn mới. Giáo trình được phản công viết như sau: Đỗ Năng Vịnh - Chủ biên, viết các chương từ ỉ đến lo. Ngô Xuân Bình - tham gia viết các chương lo và li . Vì công nghệ sinh học là một lĩnh vực khoa học rộng lớn, đang phát triển và đổi mới hàng ngày nên quyển sách này khó tránh khỏi có thiếu sót, mong bạn đọc góp ý hoàn thiện. Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn. Nhó m tá c gi ả 4 Chương Ì KHÁ I NIỆM , LỊC H s ử V À BIỆ N CHÚN G PHÁ T TRIỂ N CỦ A CÔN G NGH Ệ SIN H HỌ C 1.1. KHÁ I NIỆ M CÔN G NGH Ệ SIN H HỌ C VÀ QUA N H Ệ CỦ A CÔN G NGH Ệ SINH H Ọ C VỚ I CÁ C NGÀN H KHO A HỌ C T ự NHIÊ N VÀ XÃ HỘ I KHÁ C Công nghệ sinh học (CNSH) là tập hợp cá c ngàn h khoa học - côn g nghệ về sự sống, bao gồm sinh học phân tử, k ỹ thuật gen, công nghệ t ế bào, công nghệ v i sinh, công nghệ protein và enzym..., nghiê n cứu và khai thác cá c qu á trình sinh học, hoạt động sống của v i sinh vật, t ế bào động và thực vật, cơ thể sống và m ô phỏng cá c qu á trình sinh học ở quy m ô sản xuất côn g nghiệp. Hiệ n nay CNSH bao gồm các loạ i công nghệ và kỹ thuật chủ lực như công nghệ gen, công nghệ v i sinh vật, công nghệ t ế bào, công nghệ enzym, sinh học phân tử, sinh hoa học, lý sinh học, đi ều khi ển học, sinh tin học, genom học (genomics), protein học (proteomics), nano sinh học... Tuy vậy, CNSH khôn g chỉ đơn thuần là khoa học sinh học, nó là sự kế t hợp giữa cá c nguyê n lý sinh học với côn g nghiệp sinh học. CNSH là sự kế t hợp giữa các nguyê n lý khoa học và công nghệ trong một h ệ thống trong đó các cơ thể sống, m ô hoặc t ế bào, cơ quan tử, cá c phân tử hoặc qu á trình sống được khai thác sử dụng vào sản xuất ở quy m ô công nghiệp. M ỗ i tổ hợp sản xuất CNSH bao gồm trong n ó các y ế u t ố khá c nhau: - Các nguyê n lý khoa học và công nghệ. - H ệ thống cá c thiết bị hoặc dây chuyền công nghệ (các thiết bị nghiê n cứu khoa học và ki ểm soát chất lượng, cá c thiết bị sản xuất như cá c bioreactor, hệ thống lên men vi sinh vật, hệ đi ều khi ể n tự động). - Các hệ thống sống ở các mức đ ộ tổ chức khá c nhau từ phâ n tử, cấu trúc trên phân tử, t ế bào quan, t ế bào, mô , cơ quan, cơ thể sống, quần thể.... - Các qu á trình chuyển đ ổ i vật chất và năng lượng nhằm tạo ra các sản phẩm mong muốn (ví dụ," sản xuất các chất hoạt tính sinh học như hormon sinh trưởng, interĩeron, kháng sinh, insulin) trên quy m ô công nghiệp. Sự ra đ ờ i và phá t tri ển của CNSH có quan hệ chặt chẽ v ớ i sự phá t tri ển của nhiều ngành khoa học và công nghệ khá c nhau. Các mố i quan hệ đ ó được thể hiệ n ở các sơ đ ồ 1.1 và 1.2. 5 Tích lũy tri thức toán học.vật lý, hoa học, các khoa học về trái đất, về không gian... Cuộc cách mạng công nghiệp lần 1,2 và 3: Công nghiệp điện tử, chế tạo máy, thông tin, tin học, vật liệu... Tích tụ tri thức và phương tiện nghiên cứu khoa học sinh học và khoa học tự nhiên khác Công nghệ sinh học Dự báo Dự báo Công nghiệp sinh học Cuộc cách mạng công nghiệp sinh học the kỷ XXI Sơ đồ LI. Công nghệ sinh học ra đời và phát triển như một tất yếu lịch sử Quan h ệ giữa cá c ngàn h khoa học thể hiện quan hệ biệ n chứng giữa cá c hìn h thức vận động khá c nhau của vật chất và quan h ệ giữa vậ n động x ã hộ i và phá t tri ể n khoa học công nghệ. Hi ể u biế t được cá c mố i quan h ệ logic đó , chún g ta m ớ i c ó că n cứ đ ể t ổ chức hệ thống khoa học và xâ y dựng cá c chương trình nghiê n cứu phá t tri ể n ph ù hợp. V ậ n động sinh học là tổng hoa của nhiều hình thức vận độ ng khá c nhau của vật chất và là kế t quả của vận động vật lý, hoa học, vận động vũ trụ nó i chung. Kh i loà i ngư ờ i có k h ả năn g thao tác d i truyền ở mức phâ n tử và trở thàn h "đấng sán g tạo m ớ i " trong sinh g iới thì vận động sinh học cò n xả y ra trong mố i quan h ệ ngà y càn g chặt c h ẽ v ớ i vận động xã hội. Vì tính chất phức tạp của vận động sinh học, nê n CNSH chỉ c ó th ể hìn h thàn h và phát tri ển kh i các ngàn h khoa học khá c đã đạ t đ ế n q u á trình tích l ũ y t ri thức và phương tiện ở mức "tới hạn" nà o đó . CNSH ngày nay đan g đứng trên nền tảng của cá c khoa học tự nhiê n khá c nhau và thành tựu của cá c cuộc các h mạng côn g nghiệp. Do vậy, mộ t nh à CNSH chắc chắn phả i c ó tri thức khoa học tự nhiê n và kiế n thức công nghệ. Mộ t quốc gia muố n phá t tri ển côn g nghiệp CNSH vững chắc phả i k ế t hợp được sự phát tri ển cá c khoa học sinh học v ớ i côn g nghệ ti n học, đi ệ n tử, vật liệ u m ớ i và phải có t ầm nhìn toàn cầu và t ầm nhì n quốc gia v ề kinh tế , sinh thái và mô i trường. 1.2. CÁC NGÀNH KHOA HỌC VỀ sự SỐNG VÀ Mối QUAN HỆ BIỆN CHÚNG M ố i quan h ệ giữa cá c khoa học v ề sự sống và cá c ngàn h khoa học tự nhiê n khá c v ớ i CNSH được m ô tả vắn tắt trên sớ*đồ 1.2. Sơ đ ồ này cũng thể hiệ n quan h ệ giữa triế t học các khoa học xã hộ i như chính trị, lịch sử, kinh t ế v ớ i khoa học côn g nghệ nói chung và với CNSH nói riêng. Trên sơ đ ồ này, ngàn h khoa học được phâ n thàn h 3 loạ i hìn h hay 3 thang bậc khá c nhau trong mố i quan h ệ v ớ i thực ti ễ n : - Các ngàn h khoa học cơ bản; 6 - Cá c ngàn h khoa học công nghệ: là sản phẩm của khoa học c ơ bản k ế t hợp v ớ i côn g nghiệp và kinh tế; - Cá c ngàn h khoa học ứng dụng: là sản ph ẩm của 2 ngàn h trên, n ó chỉ ra lĩnh vực đ ờ i sống mà trong đ ó cá c ngành khoa học và côn g nghệ được ứng dụng. Các ngành khoa học về sự sống Công nghệ sinh học Các ngành khoa học công nghệ ^ Ị Ị Các ngành khoa học tự nhiên khác Các ngành khoa học cơ bản Di truyền học Sinh phân tử Sinh hoa học Sinh lý học Toán sinh học Điều khiển học sinh học Genom học Protein học Tế bào học Mô phôi học Sinh thái học Bệnh học Miễn dịch học Các ngành khoa học - công nghệ Kỹ thuật di truyền Công nghệ tế bào Công nghệ erưym và protein Công nghệ vi sinh Công nghệ lên men Công nghệ vacxin và chế phẩm dược CNSH úng dụng 1. CNSH y học: - Công nghệ vacxin và chế phẩm dược 2. CNSH nong nghiệp: - Công nghệ vi nhân giống thực vật - Công nghệ nhân bản động vật - Công nghệ tạo giống mới 3. CNSH môi trưòng-sinh thái và năng lượng tái sinh Khoa học - Công nghệ Công nghệ điện tử Công nghệ lazer Năng lượng nguyên tử Công nghệ vật liệu Tự động hoa Công nghệ chế tạo máy Công nghệ thông tin Công nghệ nano Các ngành khoa học cơ bản - Toán học - Vật lý học - Hoa học - Tin học - Thiên văn học - Các ngành khoa học về trái đất. Sơ đồ 1.2. Quan hệ biện chứng giữa các ngành khoa học công nghệ Ì TRIÊT HỌC KHOA HỌC CHÍNH TRỊ VÀ LỊCH s ử KINH TẾ HỌC ũ - Thế giói quan: Quan hệ giữa vặt chất và tinh thần, vật chất và vận động, vật chất và năng lượng, tinh thần là một thuộc tính của vật chất có tổ chức cao. Luận về con người như một sản phẩm của tự nhiên và dự báo vai trò của CNSH đối với tiến hoa của chính con người. - Phép biện chứng: Các quy luật phổ biến của vận động vật chất.vận động xã hội và tư duy. Tổng hoa các mối quan hệ tương" tác giữa các sự vật và hiện tượng trong vũ trụ. Vận động sinh học và vận động vũ trụ. - Nhận thức luận: Các phương pháp nhận thức cơ bản. Thực nghiệm khoa học và thực tiễn khách quan là tiêu chuẩn của chân lý. Vai trò của khoa học trong việc phát hiện các quy luật vận động, từ đó giải thích và dự báo phát triển CNSH trên nền dữ liệu hiện có. Quan điểm hệ thống trong xem xét sự vật. - Các quy luật phát triển xã hội, quan hệ giữa người với nguôi và xã hội loài người với thiên nhiên. - Quan hệ giữa chế độ xã hội, tính tiền phong của chế độ xã hội và phát triển khoa học công nghệ. Luật pháp và chính sách phát triển tiên tiến quyết định thành tựu phát triển KHCN và giáo dục ỏ các quốc gia. - Tác động của khoa học công nghệ lên con người: Phương tiện sản xuất và phương tiện sống - môi trường sống - năng suất lao động - các phương tiện nhận thức của con người. CNSH và tác động của nó lên bản thân con người: tiềm năng trí tuệ và khả năng sáng tạo, sức khoe, tuổi thọ... - Vai trò quyết định của KHCN đối với việc giải quyết các vấn đề phát triển kinh tế-xã hội. - Quan điểm lịch sử trong nhận thức luận khoa học. - Quan hệ giữa kinh tế và khoa học công nghệ. - Đòn bẩy kinh tế đối với phát triển khoa học công nghệ. - Đòn bẩy khoa học công nghệ đối với phát triển kinh tế. - Dự báo kinh tế, thị trường, dự báo tương lai quy định định hướng phát triển KHCN ở các quốc gia. Dự báo thị trường Nông nghiệp-Y dược, dự báo môi trường sinh thái quy định định hướng nghiên cứu CNSH. - Dự báo vai trò quyết định của CNSH đoi với phát triển nông- lâm - ngư nghiệp - y dược và môi trường sinh thái. Chính sách quốc gia về phát triển CNSH. 1.2.1. Cá c ngàn h khoa học cơ bả n v ề sự sống - Di truyền học - Sinh học phân tử - T ế bào học - M ô phôi học - Sinh lý học - Mi ễ n dịch học và các khoa học khá c - Sinh thái học - D i truyền học lý thuyết Sinh hoa học Bệnh học Phỏng sinh học Đ i ề u khi ể n học sinh học Toá n sinh học Genom học Protein học Nano sinh học Vv.. . Các ngành khoa học cơ bản về sự sống mớ i nhất hiện nay c ó thể nói là genom học (genomics) bao gồm cấu trúc, tổ chức và chức năng của từng gen, nhóm gen, h ệ thống 8 gen, các hệ đi ều hàn h gen. Riên g genom ngườ i có chứa đ ế n khoảng 30.000 gen khá c nhau, m ỗ i gen lạ i c ó các hệ đi ều hành phức tạp và nhiều chiều. M ỗ i gen lạ i chứa trong nó hàn g trăm đ ế n hàn g nghìn các nucleotid với cá c trình tự đặc thù. M ỗ i gen và nhóm gen lạ i kèm theo n ó hệ đi ều khi ể n phức tạp trong mố i quan h ệ với cá c giai đo ạ n phát tri ển khá c nhau của t ế bào, của cá thể và mô i trường sống. Do tính phức tạp như vậy nên genomics chắc chắn sẽ phải trở thành một khoa học độc lập. Tươn g tự như vậy sẽ là protein học, toán sinh học, đi ều khi ể n học sinh học và nano sinh học... sẽ dần trở thành cá c ngàn h học chuyê n sâu. 1.2.2. Cá c ngàn h khoa học côn g ngh ệ v ề sự sống - Côn g ngh ệ sinh học Sự phát tri ển của các khoa học cơ bản về sự sống đã và sẽ d ẫ n đ ế n sự ra đ ờ i của các ngàn h Khoa học - Công nghệ của CNSH, trong đ ó bao gồm: - K ỹ nghệ di truyền (genetic engineering). - Côn g nghệ t ế bào (cell biotechnology). - Côn g nghệ enzym và protein (protein and enzym technology). - Côn g nghệ v i sinh (microbiotechnology). - Côn g nghệ lên men (íermentation technology). - Công nghệ vacxin và c h ế phẩm dược (vacxin and biopharmaceutical technology) và các khoa học côn g nghệ khác . 1.2.3. Cá c ngàn h côn g ngh ệ sinh học ứn g d ụ n g Sự phát tri ển của các khoa học - công nghệ sinh học sẽ tạo ra sự bùn g n ổ của các lĩnh vực khá c nhau của khoa học CNSH ứng dụng, bao gồm: - CNSH y học: côn g nghệ vacxin và c h ế phẩm dược, liệ u phá p gen,... - CNSH Nôn g Lâ m Ng ư nghiệp: côn g nghệ v i nhâ n giống thực vật, côn g nghệ nhân bản động vật, CNSH tạo giống mớ i, CNSH bảo vệ sức khoe và dinh dưỡng cây trồng, vật nuôi. - CNSH Mô i trường - Sinh thái - CNSH và năng lượng sinh học - CNSH và vật liệ u mớ i 1.2.4. Cá c ngàn h khoa học côn g ngh ệ t ự nhiê n Sự phát tri ển của các ngành khoa học tự nhiên như toán học, vật lý học, hoa học, tin học, thiên văn học và các ngành khoa học về trái đất đã tạo ra hàng loạt các ngàn h Khoa học - Côn g nghệ (KHCN ) tự nhiên như: - Côn g nghệ c h ế tạo má y - Côn g nghệ đi ện tử - Côn g nghệ lazer 9 - Năn g lượng nguyê n tử - Côn g nghệ vật liệ u - Tự động hoa - Công nghệ thông tin - Côn g nghệ nano và nhiều ngành khá c Các ngành KHC N này đã tạo ra các cuộc cách mạng côn g nghiệp, làm biế n đ ổ i tận gốc các phương tiện sản xuất và phương tiện nhận thức của loài ngư ờ i, cũng nh ư làm thay đ ổ i toàn bộ đ ờ i sống xã hội. Chún g tạo ra những côn g cụ khôn g thể thiếu đ ố i v ớ i sự phát triển của các ngành khoa học về sự sống và tạo tiền đ ề cho sự ra đ ờ i của CNSH ở cuối t h ế k ỷ thứ XX . Do vậy, muốn phát tri ển CNSH phải hi ểu rõ nền tảng, cá c bước đi lịch sử khôn g thể thiếu được, xu hướng phát tri ển của CNSH trong mố i quan h ệ biệ n chứng v ớ i kin h t ế - xã hội. Công nghệ sinh học là quá trình tổng hợp và chuyển hoa cá c tri thức và k ỹ thuật về sự sống thành công nghiệp sinh học. Công nghiệp sinh học là qu á trình sản xuất hàng loạt, quy m ô lớn các sản phẩm sinh học bao gồm cá c hoạt chất sinh học, vật liệ u sinh học, sinh khố i t ế bào động, thực vật và v i sinh vật (công nghiệp lên men), cá c c h ế phẩm sinh học (kháng sinh, các enzym, protein, peptid hoạt tính nh ư interíeron, insulin, hormon sinh trưởng v.v...), các vacxin và thuốc chữa bệnh và cá c cơ thể sống (hàng trâm triệu cây trồng, vật nuôi). Phải nói thêm rằng sự phát triển của KHC N nói chung và CNSH nói riêng khôn g th ể tách rời sự phát tri ển của tư tưởng triết học và chính trị. Ngà y nay khôn g mộ t khoa học gia chân chính nào có thể đứng ngoà i kinh tế, chính trị và lịch sử phá t tri ể n của quốc gia. Khoa học - Công nghệ đã, đang và sẽ là đòn bẩy vĩ đ ạ i nhất đ ố i v ớ i văn min h nhâ n loạ i và tiến bộ của m ỗ i dân tộc. Khoa học - Côn g nghệ còn là giả i phá p duy nhất đ ể cứu vãn nhân loạ i đang rơi vào cuộc khủng khoảng môi trường sinh thái và năn g lượng. M ặ t khác , sự phát tri ển của m ỗ i một ngành khoa học công nghệ mớ i đ ề u cần đ ế n những quyết sách mạnh mẽ với tầm nhìn rộng lớn của cá c lãnh tụ quốc gia. Sự trì trệ trong phát tri ển khoa học - công nghệ và giáo dục của mộ t dâ n tộc trước hết thuộc về trách nhiệm của lãnh đạo cao nhất của quốc gia đó . T ổ chức h ệ thống, những cơ chế, chính sách quản lý khoa học, công nghệ của nước ta hiệ n nay hết sức lạc hậu, thiếu căn cứ khoa học và tầm nhìn chiến lược. Đ ó là nguyê n nhâ n quan trọng làm khoa học nước nhà đang bị hẫng hụt, thiếu tính k ế thừa, tính lịch sử trong sự phá t tri ể n đi lên. N ó đang bị thiếu hụt tính hệ thống, tính năng động, tính mục tiêu và định hướng chiến lược. Nước ta và hầu hết các nước đang phát tri ển hiện nay ở châu Á, châu Phi và M ỹ La tinh đ ề u nghè o nàn, lạc hậu do đã đi sau một l ầ n trong cuộc cách mạng côn g nghiệp l ầ n thứ nhất và lần thứ hai. Do vậy, chúng ta phải tranh thủ cơ hộ i đ ể khôn g tụt hậu trong cuộc cách mạng công nghiệp sinh học lần này. 10 1.3. LỊC H SỬ CÔN G NGH Ệ SINH HỌ C VÀ VẤ N Đ Ể BẢ N CHẤ T CỦA s ự SỐNG 1.3.1. Tó m t ắ t cá c gia i đo ạ n phá t tri ể n của côn g ngh ệ sinh học v à cá c sản ph ẩ m chín h của CNS H a) CNSH đ ã hình thành và ứng dụng trước kh i c ó khá i niệm CNSH Từ thời xa xưa, con ngườ i đã biết: - Sản xuất rượu, bia, cá c c h ế phẩm sữa, một số loạ i nước giả i khát. - Sản xuất cá c axit và dung mô i hữu cơ. - Côn g nghiệp khán g sinh với các nồ i lên men hàng trăm ngà n lít. b) Giai đo ạ n từ 1960- 1975 - Côn g nghệ t ế bào thực vật (nuôi cấy mô ) bắt đầu sản xuất hàng triệu cấy giống sạch bệnh trong đi ều kiệ n nhâ n tạo. - Sản xuất axit amin, axit glutamic, các enzym, khán g sinh bằng côn g nghiệp lên men sinh khố i khổng lồ . Sản xuất các chất bổ sung dinh dưỡng cho ngư ờ i, chăn nuôi, nguyê n liệ u công nghiệp dược và chất tẩy rửa. c) Giai đo ạ n từ sau 1975 - Hìn h thành k ỹ thuật AD N tái tổ hợp, khá i niệm CNSH và côn g nghiệp sinh học trở nên phổ biến. - Thuốc chữa bệnh và phòng bệnh cho nguôi và gia súc: insulin, interíeron, vacxin... tạo ra nhờ các k ỹ thuật tái tổ hợp AD N và chuyển gen - Cá c chất đi ề u tiế t sinh trưởng, phát tri ển và sinh sản cây trồng, vật nuôi đặc biệ t là hormon sinh trưởng và cá c chất hoạt tính sinh học khác . - Các bộ kít và phương phá p chẩn đoán bệnh. - Cấy truyền hợp tử và các k ỹ thuật nhân giống và nhâ n bản động vật. - Chất bổ sung thức ăn gia súc: vitamin, axit amin, sinh khố i t ế bào, n ấm men. - Nhâ n giống cây sạch bệnh quy m ô lớn. 1.3.2. Nh ữ n g phá t min h că n bả n của nhâ n loạ i tron g lĩn h vực sinh học d ẫ n đ ế n sự ra đ ờ i của CNS H 1.3.2.1. Phát minh ra tê bào, quá trình phân bào và phân hoa cơ quan - Năm 1665 Robert Hooke quan sát thấy t ế bào sống dư ớ i kính hi ển v i và đưa ra khái niệm tê bào "Cell". - Anton Van Leuvven Hoek (1632-1723), thiết k ế kính hiển vi khuếch đ ạ i được 270 lần, lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn, t ế bào tinh trùng trong tinh dịch người và động vật. - Matthias Schleiden và Theodore Schvvann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học g ọ i là Học thuyết tế bào năm 1838: l i + Mọ i cơ thể sống được cấu tạo bởi một hoặc nhiều t ế bào. + T ế b à o là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hìn h thức nhỏ nhất của sự sống. + T ế bào chỉ được tạo ra từ t ế bào tồn tạ i trước đó . - Oscar Hertwig (1875) chứng minh bằng quan sát trên kính hi ể n v i rằng sự thụ thai là do sự hợp nhất của nhân tinh trùng và nhân trứng. - Hermann p, Schneider F. A . và Butschli o . đã m ô tả chính xá c qu á trình phâ n chia t ế bào, năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên đã lý giả i về sự giảm phâ n trong phâ n bà o giảm nhi ễm ở cơ quan sinh dục. 1.3.2.2. Phát minh sự phát triển của cơ thể sống là kết quả của sự phân hoa của tê bào Cuối t h ế k ỷ XVI I và đ ầ u t h ế k ỷ XVIII , người ta nghĩ rằng trong tinh trùng đ ã chứa đựng toàn bộ người trưởng thành dư ớ i dạng thu nhỏ. Sự phát tri ển được coi nh ư sự phón g đ ạ i đơn giản cua hình nhân. Cách hình thành các con vật từ phôi trở thàn h đ ố i tượng tranh luận khoa học trong suốt t h ế k ỷ XVII I cho đ ế n cuối t h ế k ỷ XIX . Có hai trường phái đ ố i lập nhau: Đ ố i với những người theo thuyết tiền tạo, con vật mớ i hình thàn h hoà n toàn v ớ i đ ầ y đủ các cơ qụan đã có mặt ở dạng thu nhỏ trong trứng (hoặc trong tinh trùng), đ ố i với những người ủng h ộ thuyết "vi động vật" (khoảng thời k ỳ 1651 - 1700). Nh à T ự nhiên học Thụy Sĩ Charles Bonnet (1720 - 1793) quan sát được hiện tượng trinh sản ở con rệp (trong thí nghiệm, một con rệp cái được cô lập một các h cẩn thận sinh ra 95 rệp con mà khôn g cần rệp đực), từ đ ó ngườ i ta kế t luận rằng những con vật m ớ i đ ã tồ n tạ i hoà n chỉnh trong trứng của con vật cái. Đ ố i với những người theo thuyết biểu sinh: trứng ban đ ầ u khôn g c ó mộ t d ấ u vế t tổ chức nào và phôi được hình thành dần dần bằng qu á trình xâ y dựng c ó sự đón g gó p "giống" của cả cha và mẹ . Những người theo thuyết bi ểu sinh như Buffo n và Maupertuis lưu ý rằng cả cha và mẹ đều g ó p phần hình thành con vật mớ i (sự quan sát con la chứng tỏ đi ều đó). Phát triển phôi và phân hoa tế bào trở thành một khoa học trong đ ó trình tự hoạt động của thông tin di truyền và đi ều khi ể n hoạt hoa của gen trong qu á trình phá t tri ể n c á thể có ý nghĩa quan trọng. Khoa học về đi ều khi ể n học sinh học ra đ ờ i sau nà y phá t tri ển song song với các thành tựu về h ệ đi ều hành hoạt hoa của gen. 1.3.2.3. Phát minh quá trình tiến hoa của sinh giới và vật liệu mang thông tín di truyền N ăm 1859, Charles Darwin - Cha đẻ của học thuyết tiế n h ó a trong sinh học - đã xuất bản cuốn "Nguồn gốc của các loài tạo ra bởi chọn lọc tự nhiên" . Trong đ ó l ầ n đ ầ u tiên đưa ra quan đi ểm lịch sử của phát tri ển sinh giới và lý giả i sự tiến hoa của cá c loài: - Sự tiến hóa trong sinh giới đã xảy ra nhờ di truyền, biến dị và chọn lọc tự nhiên. 12 - M ỗ i một loài đ ề u có thể có quan hệ mật thiết với cá c loài khá c bởi cùn g c ó mộ t tổ tiên chung. Tiế p sau đó , Gregor Mendel cha đẻ của d i truyền học đã phát hiệ n các quy luật cơ bản đ ầ u tiên của di truyền: - Các tính trạng được di truyền từ t h ế hệ này sang t h ế hệ kia theo các quy luật thống kê. - Tính trạng được xá c định bởi các y ế u t ố d i truyền (sau này ngư ờ i ta gọ i là gen). Oskar Hertwing và Edouard Strasburger, trong những năm 1880 đã phát hiện nhâ n t ế bào là trung tâm của d i truyền. Cho tiêm vật liệ u d i truyền từ v i khuẩn chết vào v i khuẩn sống. Chất hóa học chưa biết (được gọ i là y ế u t ố Griffith ) từ một nòi v i khuẩn gây bệnh bị giết chết đã thâm nhập vào một nòi v i khuẩn sống khôn g có kh ả năng gây bệnh. K ế t quả nòi v i khuẩn vố n khôn g có kh ả năng gây bệnh này đã được chuyển hó a thành chủng gây bệnh. Sau này, Osvvald Avery và đồng nghiệp (1944) đã chứng minh được vật liệ u di truyền do Griffit h tìm ra hay "yếu t ố Griffith " chính là mộ t phân tử axit deoxyribonucleic (ADN). 1.3.2.4. Phát minh vai trò của ADN đối với sự sống Ba đặc trưng cơ bản của sự sống là sinh sản, trao đ ổ i chất và tiến hoa. Tính chất của A D N quy định cả ba đặc trưng cơ bản này. James Watson và Francis Crick (1953) phát minh cấu trúc sợi ké p của ADN . Sợi xoắn kép hình thành theo định luật Watson và Crick, trong đó: một bazơ trên một sợi A D N luôn luôn tương đồng hoặc bắt cặp với mộ t bazơ tương ứng ở sợi kia. Adenin chỉ ghép cặp với Thymi n và Cytosin chỉ ghé p cặp v ớ i Guanin. H ệ quả của định luật ghép cặp này là hai mạch của vòn g xoắn ké p b ổ sung cho nhau như chìa khó a và ổ khóa . Kh i hai sợi tách rời nhau, m ỗ i sợi này lạ i có thể quyết định việc xâ y dựng mộ t mạch mớ i bổ sung cho n ó d ẫ n đ ế n sự nhân đôi của ADN . Nh ư vậy cấu trúc vật lý của phân tử AD N giải thích một gen có thể tự sao chép chính xá c như t h ế n à o m ỗ i l ầ n t ế bào phân chia. - Cũng vào năm 1953, G. Gamow cho biết d i truyền tính trạng phải thể hiện qua tổng hợp các protein trong t ế bào. - Han Gobind Khorana và Marshall Nirenberg (1966 -1967) phát minh mã di truyền. Từ đây "định luật tương ứng" giữa cá c nhóm chập ba nucleotid (triplet hay còn được gọ i là codons) của AD N và các axit amin của các protein đã được làm sáng tỏ hoàn toàn. Trong đó: + M ô hình hai sợi xoắn ké p của AD N lý giả i kh ả năng sinh sản bằng nhâ n đôi của A D N là cơ sở lý giả i hiện tượng di truyền tính trạng, sinh sản ở sinh giới. + Trong qu á trình sinh sản của phân tử và t ế bào lạ i xảy ra mộ t số sai sót d ẫ n đế n đột biến và tái tổ hợp gen tạo ra tiền đề cho biến dị và tiến hoa. 1.3.2.5. Tổng họp gen, kỹ thuật ADN tái tổ hợp và thao tác di truyền ở mức phân tử và tê bào - Nă m 1960, Jacob. F. và Mono J. (giả i thưởng Nobel năm 1964) l ầ n đầu tiên đã phát minh khá i niệm operon. Operon hay nhóm chức năn g là nhóm các gen liên quan 13 với nhau theo cá c chức năng hó a học nhất định trong một chu ỗ i cá c phản ứng sinh hóa . Operon gồm có: Các gen cấu trúc (structural genes): quy đinh cấu trúc bậc nhất hay trình tự axit amin của enzym hoặc protein. Gen điều chỉnh (regulatory genes): đi ều khi ể n hoạt hoa của cá c gen c ấ u trúc . Phát minh này m ở ra các nghiên cứu ngày càng sâu về h ệ đi ề u hàn h hoạt hó a của gen trong t ế bào. Jacob F. và Mono J. cũng đã phá t minh vai trò của AR N thôn g ti n (mARN ) trong cơ c h ế hoạt động của gen: gen (ADN ) quy định trình tự nucleotid của A R N thông tin, tiếp đ ế n trình tự nucleotid trong AR N thông tin lạ i quy định trình tự axit amin trong phân tử protein. Tính đặc thù của protein lạ i quy định c ấ u trúc và mọ i qu á trình hoa học xảy ra trong cơ thể sống. N hư vậy, nhân loạ i đ ã phát minh các công đo ạ n cơ bản trong dòn g chảy của thôn g tin di truyền: D N A - A R N - protein. - Năm 1967, Arthur Kornberg và cộng sự đã tổng hợp được AD N của mộ t virus trong phòng thí nghiệm. - Năm 1969, R. Edwards lần đầu tiên thụ thai thành côn g mộ t trứng ngư ờ i thụ tinh ngoài cơ thể. - Năm 1970, Khorana H . G đ ã thành công tổng hợp nhâ n tạo mộ t gen. Cùn g năm này, Hamiton và Smith đã tách chiết được enzym cắt giới hạn ở Haemophilus infỉuenzae và xác định được rằng enzym này chỉ cắt AD N ở đo ạ n c ó trình tự nucleotid đặc thù. - Paul Berg và cộng sự (1972) là những ngư ờ i đ ầ u tiên sử dụng enzym cắt đ ể m ở nhi ễm sắc thể mạch vòng của E. coli và cài vào đ ó mộ t AD N ngoại lai (AD N của virus gây bệnh ung thư ở người ), tạo ra phân tử AD N tái t ổ hợp đ ầ u tiên. Côn g trình nà y được nhận giả i thưởng Nobel năm 1980. - Năm 1973. S.'Cohen và H . Boyer hoàn chỉnh phương phá p chuyển gen ngoại lai vào cá c v i khuẩn, m ở đầu thời đ ạ i k ỹ thuật di truyền. Nh ờ vậy, việc nhâ n nhanh mộ t gen với số lượng tuy ý c ó thể thực hiện được thông qua chuyển gen và o v i khu ẩ n (kỹ thuật này gọ i là nhân dòn g gen - gene cloning). 1.3.2.6. Phát minh mới về vai trò của các ARN Sidney Altman và Thomas Cech được trao giả i Nobel nă m 1989 do phá t hiên ra rằng A R N có khả năng hoạt động như một chất xúc tác (catalyst) và cá c enzym c ó bản chất A R N được gọ i các Ribozym. Phát minh này m ở ra quan niệm hoà n toàn mớ i v ề vai trò của ARN . Quan đi ểm trước đ ó cho rằng AR N chỉ đón g vai trò trung gian giữa AD N và protein. Các nghiên cứu sau đó cho thấy AR N có thể tự xúc tác đ ể tự sao ché p và tổng hợp các phân tử AR N khác . Khá m phá đ ó đã d ẫ n đ ế n ý tưởng cho rằng AR N là vật liệ u di truyền đầu tiên trên trái đất. Hiệ n nay khoa học đã khẳng định rằng ribosomal RN A xúc tác tạo liên kế t peptid giữa các axit amin trong qu á trình dịch mã . Phá t hiệ n sau đ ó 14 c ò n cho thấy AR N khôn g chỉ như chất xúc tác, mà còn đón g vai trò quan trọng hơn nữa trong đi ều khi ể n biểu hiện gen: - Mộ t số lượng lớn các phân tử AR N nhỏ khôn g đón g vai trò như mã di truyền mà liên kế t với protein đ ể tạo ra các phức hợp gọ i là ribonucleoprotein. Các ribonucleoprotein ảnh hưởng trực tiếp lên các quá trình phiên mã (transcription), dịch mã (translation), nhân bản A D N và cấu trúc nhi ễm sắc thể (ví dụ gây xoắn sợi nhi ễm sắc thể). - Trong những năm đầu của thập k ỷ 1980, ngườ i ta đã phát hiệ n thấy cá c phân tử A R N nhỏ (dài khoảng 100 nucleotid, sau này được gọ i là cá c AR N đ ố i nghĩa) trong v i khuẩn Escherichia coli c ó thể bám vào cá c trình tự tương đồng trong mAR N và ức c h ế phiên mã (Mizuno và cs, 1984; Nordstrom và Wagner, 1994). Ngà y nay, đã biết khoảng 25 trường hợp trình tự AR N đ ố i nghĩa (antisense ARN) , có kh ả năn g triệ t tiêu hoạt hoa của các mAR N và đi ều tiế t q u á trình dịch mã trong E.coli (Gottesman, 2004). Sự đi ều hoa quá trình dịch m ã bởi antisense AR N cũng xảy ra trong sinh vật nhâ n chuẩn như đã được minh hoa năm 1993 cho thấy vai trò của antisense AR N quy định sự phá t tri ển của tuyến trùng Caenorhabditis elegans (Lee và cs, 1993; Wightman và cs, 1993). Hiệ n tượng gây bất hoạt gen bởi AR N đ ố i nghĩa, c ó kích thước l ớ n sau đ ó đã được phát hiện ở các cơ thể sống nhâ n thực (antisense ARN) . Phát minh gần đâ y nhất, được coi là phá t minh lớn nhất của khoa học cuối t h ế k ỷ X X là phát minh vai trò của cá c AR N ngắn đ ố i với đi ều khi ể n hoạt hoa gen ở các c ơ thể sống nhân thực. Cá c AR N ngắn c ó kích thước vào khoảng 21-27 nucleotids gọ i là siARN (short RNA ) hoặc miAR N (micro RNA ) có kh ả năn g bám vào cá c trình tự tương đồng với nó trên các sợi AR N (có thể là mAR N hoặc AR N của virus, cá c loạ i AR N thâm nhập vào cơ thể và t ế bào theo các con đường khá c nhau), làm cho các sợi AR N này trở thành sợi ké p ở một đoạn ngắn. Các enzym đặc thù (chỉ mớ i thấy ở các t ế bào nhân thực) có kh ả năn g nhận biết các trình tự ké p ngắn đ ó và cắt sợi AR N làm đôi, gây bất hoạt gen. Sự bất hoạt của gen c ó thể xảy ra ở hai mức đ ộ khá c nhau: Bất hoạt gen ở giai đoạn phiên mã (transcriptional gene silencing TGS) do methyl hoa cá c trình tự gen (Matzke và cs, 1989; Wassenegger và cs, 1994) và sau phiên m ã (post-transcriptional gene silencing PTGS) (Napoly và cs,1990; Van der Kro l và cs, 1990; Smith và cs,1990; de Carvalho và cs, 1992; van Blokland và cs, 1994). Hiệ n tượng bất hoạt gen sau phiên mã (PTGS) đã được phát hiện ở thực vật, ở n ấm men Neurospora carassa, ở tuyến trùng, ruổi d ấm và nhiều động vật khác , k ể cả con người. Ha i nh à khoa học M ỹ Andrevv Fire và Craig Mell o đã được trao giả i thưởng Nobel năm 2006 do c ó công lớn phát minh ra cơ c h ế gây bất hoạt gen bởi các AR N ngắn mà 2 ông gọ i là ARN i (ARN i viế t tắt từ tiếng A n h R N A interíerence). Công nghệ ARN i hiện nay được cá c nhà khoa học và công nghiệp sinh học gọ i là công nghệ đầy sức mạnh, có kh ả năng can thiệp hiệu quả vào nhiều lĩnh vực sinh học, nông nghiệp và y học. 15 1.3.3. Mộ t và i ứn g d ụ n g của CNS H - Năm 1977, hãng Genetech đã tạo ra v i khuẩn biến đ ổ i gen sản xuất được hormon người - somatostatin phục vụ mục đích công nghiệp. Nă m 1978 hãn g nà y lạ i sản xuất được insulin bằng kỹ thuật tương tự. - Năm 1980, hãng Biogen sản xuất được interíeron của bạch cầu ngư ờ i bằng k ỹ thuật di truyền. Interíeron ở người là một hợp chất thiên nhiên khán g virus c ó kh ả năn g làm tăng sức đề khán g bệnh ở người và có tính khán g ung thư. - Năm 1984, một trẻ sơ sinh đ ầ u tiên ở phòn g thí nghiêm của ú c phá t tri ể n từ mộ t phôi đã được đôn g lạnh nhiều tháng. - Năm 1985, ngườ i ta đã thu được kế t quả tuyệt vời kh i đi ề u trị bệnh ung thư bằng inteleukin-2, một protein được sản xuất trên quy m ô côn g nghiệp nhờ cá c v i khu ẩ n chuyển gen. - Năm 1986, s. Willedson thông báo đã thực hiện thành côn g sự sinh sản v ô tính của cừu cái. - Năm 1990, lần đầu tiên người ta đã thực hiện ca đi ều trị bệnh do gen trên mộ t bệnh nhân gái 4 tuổi bị thiểu năng mi ễ n dịch. Phương phá p chữa bệnh bằng liệ u phá p gen đã tỏ ra đầy triển vọng với việc đưa vào các t ế bào của cơ thể ngư ờ i bệnh mộ t gen bình thường để chữa bệnh do thiếu gen này. - Hiệ n nay, các chương trình nghiên cứu lớn mang t ầm cỡ toàn nhâ n loạ i đ ã ra đ ờ i và đang được triển khai, như: - Năm 1991, D ự án Quốc t ế về genom ngườ i (human genom project) bắt đ ầ u được triển khai với mục tiêu đến năm 2005 đọc toàn bộ trình tự genom của ngư ờ i v ớ i khoảng 3.000 triệu cập nucleotid trong giai đoạn 15 năm. Nă m 1994, mộ t nhó m nghiê n cứu Phá p ở phòng thí nghiệm Giê-nê-thông (Généthon) công b ố bản đ ồ đ ầ u tiên về h ệ gen người và phổ biến bản đ ổ đ ó cho toàn t h ế giới. Và đ ế n nă m 2004 trên 21.000 gen ở ngườ i đã được mã hoa (đọc trình tự); - Chương trình genom của một số các sinh vật quan trọng; - Chương trình chức năng genom (functional genomics) v ớ i sự tham gia của nhiều phương pháp công nghệ mớ i như so sánh Genom (comperative genomics), protein học (proteomics), công nghệ nano sinh học... N h ư vậy, đ ế n cuối thiên niên k ỷ X X sau công nguyê n nhâ n loạ i chẳng những đ ã xá c định được bản chất sinh hoa của gen mà còn tách được gen, chuyển n ó từ cơ thể sống này sang cơ thể sống khá c một cách kh á d ễ dàng, đọc được trình tự nucleotid của h ệ gen và đang từng bước khám phá chức năng của từng gen, của hệ thống gen và học các h đi ề u khi ển được hoạt động của chúng. T h ế k ỷ XX I sẽ là t h ế k ỷ của k ỹ thuật d i truyền và CNSH sáng tạo ra những dạng thức sống mới, các thiết bị vật liệ u mớ i, cá c phươn g thức hiện đ ạ i của y học trị liệ u vì lợ i ích của nhân loại. 16 1.4. KHÁ M PH Á BẢ N CHẤ T CỦ A s ự SỐNG VÀ VA I TR Ò CH Ủ Đ Ạ O CỦ A GE N T ừ thời tiền sử nhâ n loạ i đã bị ám ảnh bởi những câu h ỏ i gần như vĩnh hằng: 1. Sự sống do đâ u m à có ? 2. T h ế n à o là sự sống? Chất sống khá c với chất khôn g sống ở ch ỗ nào ? 3. Tạ i sao sinh giới lạ i đa dạng và hài hoa đ ế n như vậy? 4. Y ế u t ố nà o quyết định sự tồ n tại, vận động và phát tri ển của sinh giới? 5. Con ngườ i c ó thể cải tạo sinh giới không và bằng cách nào? Tấ t cả những câu h ỏ i đ ó gần như không có câu trả l ờ i cho đ ế n k h i phá t hiện ra gen, phân tử AD N và hoạt tính sinh học của nó. Chúng ta có thể phân biệt chất sống và chất không sống bằng 3 đặc tính cơ bản dưới đây: - Kh ả nâng sinh sản - Kh ả năng trao đ ổ i chất - Kh ả năng di truyền, biến dị và tiến hoa Trong đó , những thuộc tính của phân tử AD N quy định các đặc tính căn bản trên đây của cơ thể sống. 1.4.1. Khám phá bản chất của sự sống và khả năng cải tạo sinh giới bằng công nghệ sinh học Gen và cấu trúc của gen quy định mọ i đặc tính của cơ thể sống và tính đa dạng phong phú của hệ sinh thái. Muố n cải tạo sinh giới phải tác động trực tiếp vào gen. Sau những phá t min h của Mendel và Morgan, ngư ờ i ta đã khẳng định: Mọ i đặc tính của cơ thể sống do gen quy định. Nhưn g chỉ mã i đ ế n năm 1944 ngư ờ i ta m ớ i xá c định được gen chín h là cá c phâ n tử deoxyribonucleic acid (ADN). Đ ế n nă m 1953, Watson và Crick đ ã phá t min h cấu trúc hình sợi gồm hai chu ỗ i xo ắ n ké p tương đồng của ADN . M ỗ i sợi AD N là một polymer được tạo bởi cá c trình tự sắp x ế p khá c nhau của cá c nucleotid. Có bố n loạ i deoxyribonucleotid: adenin, guanin, cytosin và thimin. Cứ ba nucleotid lạ i tạo ra một tổ hợp chập ba (triplet) hay cò n gọ i là đơ n vị m ã d i truyền (codon), bốn nucleotid v ớ i tổ hợp chập ba sẽ tạo ra 4 3 = 64 codon khá c nhau. Chiều dà i của gen thường rất khá c nhau. N ế u tính mộ t gen trung bìn h được tạo bởi khoảng 900 nucleotid = 300 codons. Theo lý thuyết v ớ i 64 codon sẽ tạo ra 64.300 cá c phân tử AD N hay cá c gen khá c nhau. V ớ i 7 nốt nhạc, nhâ n loạ i đã tạo ra hàng triệu bài ca. V ớ i 32 chữ cái, các nhà văn đã viết ra hàng triệu cuốn sách. V ớ i 64 codon có thể sáng tạo ra hằng hà sa số cá c cấu trúc đa dạng vô cùn g vô tận của phân tử ADN . Đi ề u đ ó giả i thích tạ i sao t h ế giới sống của ta l ạ i phong phú, đa dạng và tuyệt vời đ ế n như vậy. Hàn g triệu cá c loài sinh vật trên trái đất, trên năm t ỷ ngư ờ i hầu như khôn g ai giống hệt ai. Hã y nhìn k ỹ vào một ngườ i, một ngườ i bạn yêu chẳng hạn, có biết bao nhiêu m à u sắc, bao nhiêu cấu trúc, bao nhiêu trí tuệ, ngô n từ và tâm hồn trong đó . 17 N h ư vậy, tất cả tính đa dạng phong phú, tất cả những v ẻ đ ẹ p thiên thần của sự sống đ ề u do gen và cấu trúc của gen quy định. Trật tự của các nucleotid quy định c ấ u trúc đặc thù của gen. Số lượng đa dạng của gen quy định tính đa dạng của sinh gi ớ i. 1.4.2. Vai trò của gen được thể hiện như thế nào trong tế bào sống? Cấu trúc đặc thù của gen lạ i quy định cấu trúc đặc thù của AR N thôn g tin . Đ ế n lượt A R N thông tin lạ i quy định cấu trúc đặc thù của các protein. M ỗ i codon trong phâ n tử A D N sẽ thích ứng với một phân tử axit amin trong mạch của protein. Trậ t tự của 64 codon trong AD N sẽ quy định trật tự sắp xếp của cạc axit amin (gồm trên 20 axit amin khá c nhau) trong phân tử protein. Ngà y nay người ta đã xá c định được trình tự cấu trúc nucleotid của hàn g trăm ngà n gen và trình tự axit amin trong phâ n tử của hàng chục nghì n protein. Trong số cá c protein đã được tinh chế, có khoảng 90% protein là các enzym, khoảng 10% protein cò n l ạ i là các protein cấu trúc (thiết k ế nên các tổ chức màn g t ế b à o sống và c ơ th ể sống) và các chất hoạt tính sinh học khá c nhau như các hormon, insulin, cá c interíeron... Nh ư vậy trình tự axit amin đặc thù lạ i quy định tính đặc thù của cá c enzym, trong đ ó m ỗ i một phản ứng sinh hoa học hoặc m ỗ i bước trong quá trình d ẫ n truyền đi ệ n tử trong h ệ thống màn g t ế bào đều được quy định bởi một enzym hoặc một protein cấu trúc. Hàn g nghìn các chuỗi phản ứng sinh hóa học trong m ỗ i t ế bào đ ề u do cá c enzym hoặc h ệ thống enzym quy định. Xét cho cùng gen và các sản phẩm trực tiếp của gen (các protein) quy định mọ i cấu trúc và qu á trình xảy ra trong cơ thể sống. Gen và hệ thống gen, enzym và hệ thống enzym, protein và các tổ chức sống, tất cả nằm trong mối quan hệ biện chứng phức tạp giữa chúng với nhau và vói môi trường sống, trong đó gen là chìa khoa của vận động sinh học. N ăm 1955, lần đầu tiên trật tự của các nucleotid trong phâ n tử AD N của mộ t con v i khuẩn đã được xác định gồm khoảng 1,8 triệu cặp nucleotid. Ngà y nay, ngư ờ i ta đã khẳng định trong m ỗ i v i khuẩn (t ế bào tiền nhâ n prokaryote) cá c gen được sắp x ế p trên một sợi AD N khé p kín. Trong trực khuẩn đường ruột v ớ i kích thước khoảng 1- 2 u m c ó chứa một sợi AD N c ó đ ộ dài khoảng lm m gồm trên bốn triệu cặp nucleotid hay tương đương với khoảng trên 3000 gen khá c nhau. Trong cá c sinh vật bậc cao hem, trong t ế b à o eukaryotes, các gen được sắp xếp theo trật tự nhất định trên sợi nhi ễm sắc thể . Trong một t ế bào của người có chứa khoảng 30.000 gen khá c nhau. M ỗ i gen trong t ế bào sống đ ề u được xếp đặt theo một trật tự đã được quy định và hoạt hoa của n ó được đi ều khi ển một cách chính xác . Thay đ ổ i vị trí của gen, cắt bớt gen hoặc thêm các gen, thậm chí thay đ ổ i vị trí của chỉ mộ t đo ạ n ngắn AD N hoặc mộ t nucleotid trong sợi AD N của nhi ễm sắc thể đ ề u có thể d ẫ n đ ế n những biến đ ổ i phức tạp trong cơ thể sống. Hiệ n nay việc chuyển gen vào cơ thể sống cò n phụ thuộc nhiều v à o các yếu t ố ngẫu nhiên, nhất là định vị của gen l ạ trên nhi ễm sắc thể . Định vị gen khôn g phù hợp cho biểu hiện gen d ẫ n đến hiệu quả chuyển gen thấp. 18 Hiệ n nay chương trình giả i mã hệ gen (genom) và chức năn g hệ gen ngư ờ i đã và đan g là mộ t chương trình nghiên cứu lớn nhất t h ế k ỷ v ớ i sự tham gia của cá c siêu cường kinh tế. Chương trình này nhằm vào việc xá c định cấu trúc, trình tự và chức năn g của tất cả cá c gen ở người. Với khoảng một triệu các gen khác nhau tồn tại trong tự nhiên, sẽ có thể sáng tạo ra biết bao nhiêu các tái tổ hợp khác nhau của gen trong tế bào và sẽ sáng tạo ra bao nhiêu loài sinh vật mới nữa? Trong thực t ế lượng các gen trong t ế bào của m ỗ i loài được giới hạn bởi số lượng nhi ễm sắc thể nhất định với các trình tự khá nghiêm ngặt của các gen trong m ỗ i nhi ễm sắc thể. Tạ i sao vậy? Tính hợp lý trong tổ chức và hoạt động của hệ gen là cả một khoa học đầy bí ẩn. Các khoa học như di truyền học, sinh học phân tử đi ều khi ển học sinh học... sẽ phải lý giả i các bí ẩn đó. Hiệ n tạ i chúng ta được biết m ỗ i một enzym (sản phẩm của gen) cũng chỉ có thể hoạt động trong hệ thống các enzym, bói một sản phẩm sinh hoa thông thường phải do nhiều enzym đồng thời tạo ra (ví dụ để tổng hợp ra một axit amin, để phân giải một phân tử đường .. cần rất nhiều enzym - hay hệ enzym tham gia). Sự sống nằm trong trật tự cấu trúc và đi ều hàn h phức tạp chặt chẽ với tính k ỷ luật và tính tổ chức nghiêm ngặt. Trong đ ó gen nằm trong qu á trình đi ều khi ể n và tự đi ều khi ển, chẳng hạn gen tổng hợp galactosidase chỉ hoạt động kh i thêm đường lacto vào mô i trường nuôi vi khuẩn. Kh i đường lacto bị phân giải, các gen hoạt động chậm lạ i và sau đ ó ngừng hoạt động nếu sản phẩm cuối cùn g của enzym bị tích l ũ y đ ế n mức bão hoa hoặc khi trong mô i trường lacto đã bị phân giả i hoà n toàn. Nh ư vậy gen chỉ có thể tổn tạ i trong những tổ hợp gen hợp lý v ớ i sự ki ểm soát của mô i trường sống và tự đi ều chỉnh. Khả năng sáng tạo ra các tổ hợp gen mới là vô cùng vô tận. Hàng loạt các cơ thể sống chuyển gen mói sẽ được tạo ra. Nhưng quá trình chọn lọc lại vô cùng khắt khe. Tiến hoa là một quá trình đào thải đầy bi kích để đạt đến sự hoàn mỹ hiện tại của sự sống. K h ả năng nhân đôi của phân tử ADN , sinh sản và tiế n hoa - đ ó là đặc tính cơ bản của sự sống. Chi phố i được phân tử AD N nhân loạ i sẽ trở thành "chủ thể " của sự tiến hoa sinh học trên trái đất. Kh ả năng nhân đôi của AD N lạ i quyết định kh ả năng nhâ n đôi của nhi ễm sắc thể và kh ả năng phân chia của t ế bào. Nh ờ vậy mà có hai qu á trình sinh sản: sinh sản vô tính (nhân bản t ế bào hoặc cơ thể sống mớ i giống với t ế bào và cơ thể mẹ ). Sinh sản hữu tính có kế t hợp t ế bào sinh sản và genom của hai cá thể b ố và mẹ . Mộ t t ế bào v i khuẩn trong đi ều kiệ n phù hợp sẽ phân chia (nhân đôi) cứ khoảng 20 phút một lần. Trong một nồ i lên men v i sinh vật với quá trình lên men ké o dài khoảng 3 ngày = 72 giờ, một t ế bào v i khuẩn có thể được nhân lên theo tính toán lý thuyết thành 22 1 6t ế bào mớ i. Nh ờ vậy mà c ó công nghiệp lên men v i sinh vật với các nồ i lên men khổng l ồ hàng triệu lít đ ể sản xuất thuốc khán g sinh, mì chính, bia rượu, vacxin tái tổ hợp... Mộ t cây phong lan nuôi cấy trong ống nghiệm cứ m ỗ i tháng c ó thể nhâ n lên gấp năm lần, một n ăm có thể nhâ n được trên một triệu cây phong lan con từ một cây ban đầu. Q u á trình nhâ n giống như vậy là kế t quả của một kh ả năn g có một khôn g hai của sinh vật sống - kh ả năn g sinh sản của phân tử AD N và t ế bào. Nhưn g chỉ mã i đ ế n năm 19 1962 đặc tính trên đây của t ế bào thực vật mớ i được ứng dụng l ầ n đ ầ u tiên và o côn g nghiệp nhân giống nhanh in vitro. Q u á trình nhân đôi của phân tử AD N - tạo ra một phâ n tử con giống hệt phâ n tử m ẹ ban đầu đ ó là bản chất của hiện tượng di truyền. Mặ c d ù vậy, trong qu á trình sao ché p và nhân lên hàng triệu lần, khôn g thể khôn g có sai sót d ẫ n đ ế n sự sai khá c trong c ấ u trúc phân tử của gen, hoặc thay đ ổ i sắp xếp của gen trên sợi AD N và trên nhi ễm sắc thể ... d ẫ n đế n hiện tượng biến dị. Hiệ n tượng biến dị thông thường xả y ra ở tần số 10"5 - 10" trong đi ều kiệ n tự nhiên. Trong đi ều kiệ n thí nghiệm, kh i c ó tác động của cá c chất gây đột biến hoặc phón g xạ, hoặc trong nuôi cấy t ế bào trần kh i màn g t ế b à o bị phâ n huy, tần số biến dị c ó thể lên tới 10' 2 hoặc hơn, nghĩa là cứ 100 cá thể mớ i sẽ xu ấ t hiệ n có một cá thể biến dị. Ngà y nay, kh ả năng gây đột biến đ ể chọn giống ngà y càn g c ó tính định hướng và hiệu quả cao. Hàn g loạt các chủng v i sinh vật côn g nghiệp (sản xuất kháng sinh, axit glutamic...), các giống cây trồng mớ i đã được tạo ra bằng đ ộ t biến . Biến dị là nền tảng của chọn lọc tự nhiên và tiến hoa của sinh giới. 1.5. CẢI TẠO DI TRUYỀN CÁC cơ THỂ SỐNG TRÊN cơ sở SINH HỌC PHÂN T Ử VÀ K Ỹ THU Ậ T GE N Thiế t k ế được cấu trúc và vị trí khôn g gian của gen, đi ều khi ể n được hoạt hoa của nó, con người có thể tạo ra hàng triệu các hợp chất thiên nhiên theo ý muốn, cả i tạo được sinh giới và sửa chữa được các khuyết tật di truyền ở chính bản thân con ngư ờ i. Nhưn g CNSH ngày nay mới chỉ đi được những bước đ ầ u tiên trong cuộc trường chinh cả i tạo vật chất sống. Các phương thức cơ bản trong cả i tạo thông tin d i truyền được trình bày tóm tắt dưới đây: /. Thay đổi trình tự nucleotid của gen - Thay đ ổ i trình tự gen cấu trúc: Trình tự nucleotid trên gen thay đ ổ i sẽ l àm thay đ ổ i thông tin trên mARN , d ẫ n đ ế n thay đ ổ i hoạt tính của enzym và cá c protein do gen này mã hoa; - Thay đ ổ i cấu trúc của gen đi ều hành. Các gen đi ều hàn h thay đ ổ i d ẫ n đ ế n thay đ ổ i q u á trình dịch mã từ các gen cấu trúc d ẫ n đ ế n sự thay đ ổ i sinh tổng hợp protein về lượng: tăng hoặc giảm, thậm chí làm ngừng sinh tổng hợp. 2. Thay đổi vị trí của gen trong genom Thay đ ổ i vị trí của gen trong genom: tái tổ hợp trình tự của cá c gen trên nhi ễm sắc thể và trong genom. - Chuyển gen từ vị trí này sang vị trí kia trong phạm v i nhi ễm sắc thể ; - Chuyển gen giữa các nhi ễm sắc thể trong cùng mộ t t ế bào: do trao đ ổ i ché o (crossing over), di chuyển của các gen nhảy (transposons). 3. Kiểm soát và thiết kế hệ điều khiển hoạt hoa gen Thay đ ổ i mức độ hoạt hoa của gen quan tâm, tính đặc thù về vị trí khôn g gian trong biểu hiện của gen. 20 4. Chuyển gen từ loài này sang loài kia Đ ưa một đặc tính d i truyền mớ i từ loài này sang loài kia. V í d ụ gen khán g sâu Bt toxin từ v i khuẩn Bacillus thurigìensis vào thực vật. 5. Lai hữu tính và vô tính tạo ra các tổ hợp gen mới Dung hợp t ế bào trần, lai t ế bào chất, nghiên cứu cơ c h ế phâ n tử của ưu t h ế lai để tạo ra các tái tổ hợp hệ gen và genom của b ố và mẹ ở con lai. ố. Gây ra đột biến gen và nhiên cứu khả năng gây đột biến theo định hướng X u ấ t hiện các phương phá p gây đột biến mớ i rất hữu ích cho nghiê n cứu chức nâng của gen và đi ều khi ể n hoạt hoa gen: Độ t biến bằng cài gen (AD N insertional mutagenesis), kích hoạt các gen nhảy (transposons) để tạo ra cá c đ ộ t biến đa dạng đồng thời d ễ ki ểm soát và nhận biết. Bảng LI. Các kiểu thay đổi vật liệu di truyền và tác động của nó đối vói trao đổi chất và các đặc tính sinh học khác nhau Các kiểu thay đổi vật liệu di truyền Kết quả nhận được Thay đổi trình tự nucleotid trong gen cấu trúc (do đột biến, do cài gen lạ vào nhiễm sắc thể, do gen nhảy cài vào nhiễm sắc thể ỏ các vị trí khác nhau trong quá trình phát triển cá thể) - Thay đổi cấu trúc và chức năng đặc thù của gen: - Thay đổi trình tự sắp xếp của nucleotid trong mARN và trình tự axit amin trong protein. - Thay đổi cấu trúc và gây biến tính protein, làm thay đổi hay làm mất hoạt tính enzym. - Thay đổi quá trình sinh hoa và hình thái của cơ thể sống. Thay đổi hệ điều khiển của gert Thay đổi mức hoạt hoa, hoặc môi trường hoạt hoa, hoặc các điều kiện hoạt hoa của gen. Hậu quả có thể dẫn đến như sau: - Quá trình nhân bản ADN và sinh tổng hợp mARN không thể kiểm soát được. Dọ vậy, sinh tổng hợp một số protein và các hoạt chất có thể được tăng cường hoặc suy giảm hoặc bị triệt tiêu. - Quá trình phân bào bị mất kiểm soát dẫn đến ung thư. Thay đổi vị trí của gen trên ADN và nhiễm sắc thể do đứt gãy, đảo đoạn nhiễm sắc thể, dịch chuyển gen, trao đổi chéo. Chuyển gen giữa các loài thông qua kỹ thuật ADN tái tổ hợp Không làm biến tính gen, nhưng có thể làm thay đổi hoạt hoa của gen do vị trí không gian của các gen trong sợi ADN thay đổi - Tạo ra các cơ thể sống biến đổi di truyền (GMO); - Cơ thể sống có thể tổng hợp được protein, enzym, hoặc các polypeptid mới. - Có thể gây bất hoạt các gen và triệt tiêu các hoạt chất không mong muốn. - Có thể gây đột biến gen do gen chuyển cài vào nhiễm sắc thể một cách ngẫu nhiên. Ghi chú: (đối vớitế bào tiền nhân (procaryote): nhiễm sắc thể là một sợi ADN mạch vòng gồm vài nghìn gen. Đối vớitế bào nhân thực (eukaryote): nhiều sợi ADN và gen sắp xếp theo trật tự trên nhiễm sắc thể). 21 1.6. MÓ T SỐ LĨN H vự c ỨNG D Ụ N G CỦA CNSH (Bảng 1.2) SÍT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản 1 CNSH thực vật 1.1 Công nghệ vi nhân giống: Nhân nhanh các cây trồng có giá trị kinh tế cao bằng công nghệ nuôi cấy tế bào như hoa, cây cảnh, cây ăn quả, cây dược liệu, cây lâm nghiệp nhưtếch..., cây có dầu như cọ dầu... 1.2 Làm sạch bệnh: Làm sạch bệnh các vật liệu nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (kết hợp với các kĩ thuật làm sạch các tác nhân gây bệnh bằng hoa học hoặc xử lý nhiệt). Kỹ thuật này áp dụng chủ yếu đối với các giống ưu việt sinh sản bằng con đường vô tính như cây ăn quả có múi, dâu tây, nho, khoai tây, mía... 1.3 Bảo tồn nguồn gen: - Bảo tồn nguồn gen ở nhiệt độ thấp như nitơ lỏng (- 196°C) - Hoặc bảo tổn thông qua phương thức sinh trưởng chậm trong môi trường nhân tạo 1.4 Cún phôi: - Cứu phôi trong các kĩ thuật lai xa - Cứu phôi đa bội thể (cứu phôi tam bội thể ỏ cây ăn quả có múi khi lai giữa cây tứ bội và cây nhị bội, cứu phôi tam bội ở các hạt lép, hạt nhỏ...) - Cứu phôi F1 khi lai tạo giữa các giống nho không hạt - Cứu phôi khi nội nhũ của hạt kém phát triển như trong nhân giống phong lan 1.5 Công nghệ đơn bội: Nhanh chóng tạo ra các dòng thuần, giống thuần chủng ứng dụng trong tạo giống mới và tạo giống ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, nuôi cấy noãn...) 1.6 Đột biến tế bào soma: Chọn tạo các đột biến tế bào soma. Rất hiệu quả trong tạo giống không hạt, dòng bất dục đực, nâng cao khả năng kháng bệnh và các chất diệt cỏ, khả năng chịu hạn, chịu lạnh khả năng sản xuất các hoạt chất sinh học... 1.7 Thao tác di truyền và chuyển gen: - Lai tế bào trần tạo giống đa bội thể: tạo giống tam bội thể không hạt bằng dung hợp giữa tế bào nhị bội và đơn bội, dung hợp các tế bào nhị bội với nhau tạo dòng tứ bội thể... - Tạo giông cây trồng chuyển gen kháng sâu, bệnh kháng chất diệt cỏ, nâng cao chất lượng nông sản, sàn sinh dược chất 22 - Hệ số nhân giống rất cao đặc biệt là nhản giống từ tế bào mỏ sẹo phôi hóa và phôi vô tinh; đáp ứng yêu cầu sản xuất quy mô lớn mà các kỹ thuật thông thường không đáp ứng được. - Nhân nhanh các kiểu gen, hoặc giống ưu việt. Rất cần đối với nhân giống sạch bệnh và trao đổi nguồn gen. - Cần trong bảo tồn các cây trồng sinh sản bằng con đường vô tính, các loại cây có củ và cây sinh sản bằng thân rễ... - Tạo các con lai xa khác loài không có khả năng tạo hạt có sức sống - Tạo giống không hạt (cam quýt, bưỏi, chanh...) - Cứu phôi lai giữa các giống nho không hạt - Nhân nhanh các giống phong lan ưu việt... - Rất hiệu quả đối với giống lúa, ngô, lúa mì, lúa mạch. Đã được ứng dụng rất thành công ở Trung Quốc, Triều Tiên... - Chọn giống bất dục trong sản xuất hạt lai. - Chọn giống cây ăn quả không hạt (citrus). - Chọn tạo được nhiều giống chuối, mía mới... - Nâng cao chất lượng protein... Công nghệ mang tính đột phá có thể tạo ra các cuộc cách mạng trong các lĩnh vực sinh học - nông nghiệp và y học STT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản 1.8 Marker phân tử hỗ trợ chọn giống: Chọn giống với sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phấn tử (sử dụng các kĩ thuật marker phân tử) 2 CNSH động vật 2.1 Thụ tinh trong ống nghiệm, thụ tinh nhân tạo, cấy truyền hóp tử hoác phôi 2.2 Liệu pháp hormon làm tăng số trứng rụng, kết hợp với thụ tinh nhân tạo, cấy truyền hợp tử để nhân giống ưu việt. 2.3 Tạo động vật chuyển gen để nâng cao sản lượng sữa, thịt, kháng bệnh, sản xuất một số sinh dược quý như protein trong sữa, nước tiểu, máu... 2.4 Thức ăn bổ sung chăn nuôi (các chất điều tiết sinh trưởng, kháng sinh chăn nuôi, inteiíeron, vitamines, protein đơn bào... 3 CNSH Y dược 3.1 Kháng thể đơn dòng/sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Ví dụ, các bệnh đường sinh dục, ung thư, các bệnh virus như viêm gan B... 3.2 Mầu dò DNA (DNA probes): dùng trong chẩn đoán bệnh, VD: bệnh kala-aser, bệnh buồn ngủ, sốt rét,... 3.3 Vacxin tái tổ hợp (viêm gan B, vacxin phòng bệnh virus ở gia súc lợn, thỏ, trâu) bò... như lở mồm long móng. 3.4 Các loại thuốc chữa bệnh có giá trị như insulin, interíeron, hormon sinh trưởng người và bò, erythropoietin,... - Giúp cho việc chọn giống ở mức phân tử thông qua các chỉ thị phân tử về các gen kháng sâu bệnh, gen chất lượng, các đặc tính năng suất... - Nhân nhanh các giống lai tốt. - Nhân nhanh các kiểu gen và giống lai ưu việt. - Các động vật chuyển gen như lợn, gà, chuột, thỏ, bò, cừu, cá... Nâng cao khả năng kháng bệnh, tăng năng suất, tỷ lệ nạc trong thịt, rút ngắn chu trình chăn nuôi. - Sản xuất bằng công nghệ tế bào lai (hybridoma) - Sản xuất bằng công nghệ gen - Sản xuất bằng công nghệ gen - Sản xuất chủ yếu bằng các vi khuẩn chuyển gen 3.5 Liệu pháp gen (trị liêu gen) chữa các bênh di truyền. - Đưa các gen bình thường vào cơ thể thay thế chức năng của các gen bệnh bằng nhiều kỹ thuật khác nhau đang được nghiên cứu cải tiến. 3.6 Sinh con theo giới tính chọn lọc bằng cách tách riêng các tinh trùng mang nhiễm sắc thể X và Y và thụ tinh tế bào trứng bằng 1 loại tinh trùng- 3.7 Xác định phả hệ hoặc tội phạm, xác định mộ liệt sỹ chưa rõ nguồn gốc thông qua phân tích ADN của họ. 4 CNSH Công nghiệp 4.1 sx các hợp chất hoa học như cồn, axit lactic, axit citric, axit gluconic, aceton, glycerin... 4.2 sx kháng sinh: penicillin, streptomycin, erythromycin, mitomycin, cycloheximide... - Có thể dẫn đến mất cân bằng giới tính trong dân số - Xác định chính xác quan hệ họ hàng, dòng tộc bằng phân tích ADN máu, tế bào (tinh trùng), sợi tóc... - Sản xuất bởi các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn - Sản xuất bởi các loại nấm, actinomycetes, vi khuẩn 4.3 sx các enzym: amilase, protease, lipase... - Sản xuất bôi vi khuẩn, nấm để sử dụng trong công nghiệp tẩy rửa, dệt, thuốc lá, sữa... trong chữa bệnh 23 SÍT Lĩnh vực công nghệ và sản phẩm Đặc trưng cơ bản 4.4 Chế biến một số chất nền thành các hợp chất có giá trị kinh tế và sử dụng cao hơn như sx các hornìón steroids từ sterols, sorbose từ sorbitol... 4.5 sx các protein đơn bào từ vi khuẩn, nấm men, nấm, tảo, dùng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi như thức ăn bổ sung. 4.6 Chất đốt, nguyên liệu và nhiên liệu tái sinh như là cồn bioethanol, biogas, biodiesel... 4.7 Thu hồi một số khoáng chất có giá trị như vàng, uranium, titan... 4.8 Cố định enzym để sử dụng nhiều lần trong chế biến một số sản phẩm công nghiệp. 4.9 Thay đổi cấu trúc bậc nhất của một số protein/erưym bằng công nghệ gen và công nghệ protein làm cho chúng hiệu quả hơn, bền vững hơn với môi trường; thay đổi tính đặc thù của enzym đối với một số cơ chất. Ví dụ thành công trong sản xuất T4 lysozym, trypcin, subtilisin, lactate dehydrogenase,... 4.10 sx các vi sinh vật hoặc tế bào có khả năng sản sinh các enzym hoặc nhiều hơn các protein hữu ích ỏ quy mô lớn. 5. CNSH môi trường sinh thái 5.1 Phân giải các chất thải sinh hoạt hữu cơ của con người và chất thải đô thị, xử lý chuồng trại chăn nuôi,... 5.2 Xử lý độc tố môi trường công nghiệp và nông nghiệp (hoa chất độc từ công nghiệp, thuốc trừ sâu bệnh, chất diệt cỏ, dư lượng phân bón trong nguồn nước.) 5.3 Xử lý các nguồn ô nhiễm từ dầu mỏ và các sản phàm từ dầu mỏ... 5.4 sx các chế phẩm sinh học kiểm soát sâu bệnh (các loại virus, vi khuẩn, nấm, côn trùng hữu ích để kiểm soát các tác nhân gây bệnh, trừ sâu) Tạo các giống cây trồng kháng sâu bệnh, chất diệt cỏ làm giảm sử dụng thuốc hoa học. 5.5 Sản xuất chất dẻo sinh học, dễ tiêu biến sau sử dụng để thay thế chất dẻo tổng hợp hoa học khó phân huy 5.6 Tăng cường cố định C02 từ khí quyển đồng thời tăng giải phóng dưỡng khí 0 2 bằng thảm xanh thực vật và các sinh vật quang hợp 24 - Sản xuất bằng các vi sinh vật hoặc băng ki thuật enzym cố định trong các íermenters - Đây là nguồn sinh khối vi sinh giàu protein và axit amin không thay thế... - Sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh vật biogas từ phân chuông và chất thải hữu cơ, từ sinh khói mía đường, sắn, khoai lang, cây có dầu, từ dong tảo biển... - Sản xuất từ các sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn có khả năng hấp thụ và tích lũy một số khoáng chất một cách đặc thù trong mô tế bào của chúng. Ưu việt hơn sử dụng cả tế bào vi sinh vật nguyên vẹn trong chế biến các chất hoặc làm sạch môi trường - Sử dụng computer để thiết kế protein theo hướng có lợi hơn. Các nhà khoa học đặc biệt quan tâm thay đổi enzym rubisco, một enzym chủ lực trong quang hợp để enzym này có ái lực mạnh hơn với C02 và kém ái lực với 0 2 (làm giảm quang hô hấp và tăng quang hợp) Thay đổi hệ điều hành của gen làm tăng cường biểu hiện của các gen mã hoa các protein/enzym hữu ích. - Phát triển các chủng vi sinh hoặc hệ vi sinh vật hữu hiệu (EM), hoặc các enzym trong xử lý môi trường. - Sử dụng các vi sinh vật chuyển gen hoặc các enzym cố định. - Các chủng Pseudomonas putida - Giảm thiểu các hoa chất nông nghiệp có hại cho môi trưởng và sức khoe con người. - Sản xuất các thuốc sâu bệnh sinh học, các giống cây trồng kháng sâu bệnh... - Sản xuất chất dẻo từ các sinh vật, các polymer sinh học - Nâng cao khả năng quang hợp của cây trổng và thực vật quang hợp biển. - MỞ rộng thảm xanh thực vật và nuôi trồng sinh vật quang hợp biển Chương 2 CÔN G NGH Ệ T Ê BA O TH Ự C V Ậ T 2.1. T Ế B À O TIỀ N NHÂ N VÀ T Ế B À O NHÂ N TH Ự C Các cơ thể sống có thể là đơn bào hoặc đa bào. Tấ t cả các cơ thể sống c ó cấu trúc t ế bào được chia làm 2 nhóm chính: - Procaryotes - t ế bào tiền nhâ n - Eucaryotes - t ế bào nhâ n thực T ế bào tiền nhâ n xuất hiệ n khoảng 3.500 triệu năm về trước. Cá c cơ thể sống tiề n nhân chủ yếu thuộc nhóm v i khuẩn (bacteria). T ế bào nhân thực bao gồm protests, n ấm, cây xanh, động vật và ngư ờ i. Bảng 2.1. Sự khác nhau cơ bản giữa tế bào tiền nhân và tê bào nhân thụt Đặc tính Tế bào tiền nhân Tế bào nhân thực Kích thước tế bào Đường kính trung bình 0,5-5nm (micromet) - Có dung tích 1000 - 10.000 lần lớn hơn so vớitế bào tiền nhân. Đường kính có thể tới 40 um hoặc hơn Hình dạng Đơn bào hoặc dạng sợi Đơn bào, hình sợi hoặc đa bào Vật liệu di truyền Sinh tổng hợp protein Tiểu bào tử (organeiles) Thành tế bào Hô hấp Quang hợp Sợi DNA mạch vòng nằm trong tế bao chất, không có nhiễm sắc thể, không có nhân tế bào và hạch nhân (nucleolus). - Ribosome nhổ hơn (70S) - Không có sự tham gia của endoplăsmic reticulùm - Cảm ứng mạnh với kháng sinh, ví dụ streptomycin, kanamycin - Rất ít tiểu bào tử (organelle). - Không có tiểu bào tử có màng hai lớp. Màng cứng và có chứa polysaccharid và axit amin. Murein là hợp chất chính tạo độ bền của màng - Xảy ra ở mesosome trong tế bào vi khuẩn, trừ vi khuẩn xanh lục (blue green) hô hấp xảy ra ỏ màng tế bào chất. - Không có lục lạp - Quang hợp xảy ra ở màng tế bào. Sợi ADN liên kết với protein và ARN tạo nên nhiễm sắc thể bên trong nhân te bào, trong nhân tế bào có hạch nhân. - Ribosome lớn hơn (80S) - Ribosome đính vào hệ thống màng endoplasmic reticulum. - Rất nhiều tiểu bào tử, các tiểu bào tử được bao bọc bởi màng hai lớp (ví dụ: ty thể, lục lạp, nhẩn tế bào). Nhiều tiếu bào tử được báo bọc bởi một lớp màng (ví dụ: golgi, lysosome, không bào, microbody, endoplasmic reticulum). Thành tế bào thực vật và nấm rất cứng và có chứa các polysaccharid. Celluiose là thành phần cơ bản tạo độ cứng của màng tế bào thực vật, trong khi chitin tạo độ bền của tế bào nấm. Hô hấp hiếu khí xảy ra ở ty thể. - Xảy ra ở lục lạp. - Lục lạp có chứa các lớp màng, các màng tạo ra các lamelle, các lamelle xếp lớp tạo thành các hạt gọi là grana Cố định nitơ Một số tế bào có khả năng cố định nitơ Không có khả năng cố định nitơ 25 2.2. NH Ữ N G ĐẶC TRUN G c ơ BẢ N CỦA T Ê BÀ O SỐNG VÀ CÁ C HƯ Ớ N G PHÁ T TRIỂ N C ơ BẢ N CỦA CÔN G NGH Ệ T Ế B À O TH Ự C V Ậ T Tất cả t h ế giới sống đa dạng, phong phú và sinh động tuyệt vời trên trái đất mà chúng ta quan sát thấy đ ề u được xây dựng từ các t ế bào sống. T ế bào sống mang trong nó những khả năng k ỳ diệu, đ ó là: 2.2.1. Khả năng phân bào và phân hoa T ế bào sống có khả năng phân chia và phân hoa. T ế bào thực vật có kh ả nân g phân chia, phàn hoa cơ quan và tái sinh thành cây trong điều kiệ n nuôi cấy in vitro. Băng cách biến đ ổ i gen, các nhà khoa học đã khám phá hem 100 gen tham gia vào chu k ỳ phâ n chia t ế bào trên cơ sở nghiên cứu ở m ô hình n ấm men. Mộ t trong số các gen đ ó là cdc28, gen này được gọ i là gen khởi đầu v i nó ki ểm soát bước quan trọng đ ầ u tiên trong chu k ỳ phân chia t ế bào. Chu k ỳ t ế bào bao gồm một loạt các sự kiệ n xảy ra theo trình tự nhất định, trong đ ó sự sinh trưởng d ẫ n đến sự phân chia một t ế bào thành hai t ế b à o con. Nhữn g t ế bào ngừng phân chia sẽ khôn g tham gia trong chu trình t ế bào nữa. Cá c giai đo ạ n của chu trình t ế bào được biểu hiện ở sơ đ ồ bên gồm các pha sau: G, - s - G 2 - M Gp Pha sinh trưởng sau phân bào; S: Pha nhân đôi ADN ; G2: Pha sinh trưởng tiếp sau khi A D N đã được nhân đôi; M : Pha phân chia nguyên nhi ễm (mitosis). Ở giai đoạn này nhi ễm sắc thể chia đều về hai phía và tiếp theo t ế bào chất chia làm 2. Pha M lạ i được chia làm 4 pha nhỏ gồm prophase, metaphase, anaphãs e và telophase. 2.2.1.1. Các gen điêu khiển chu kỳ tê bào Đ i ề u khi ển chu k ỳ t ế bào là các yếu t ố gây chín MPF (maturing promoting factor), bao gồm nhóm protein cyclins và Cdks (cyclin depent kinase). Cá c protein nà y làm vai trò kích hoạt các bước của chu k ỳ t ế bào, tạo ra sự chuyển pha trong chu k ỳ t ế b à o từ G! sang s, hoặc từ G 2 sang M . Mộ t trong các protein đ ó là P53 - protein c ó chức năng phong toa chu k ỳ phân bào nếu như AD N bị hư hại. N ế u sự hư hạ i là nghiêm trọng, P53 có thể gây ra chết t ế bào. H àm lượng P53 được tăng lên trong các t ế bào bị hư hại. Nh ờ vậy, t ế bào có thời gian sửa chữa các sai sót trong kh i P53 phong toa hoặc làm ngưn g chu k ỳ phân bào. Độ t biến xảy ra ở protein P53 là đ ộ t biến thường xuyê n nhất d ẫ n đ ế n ung thư. Mộ t ví dụ là hộ i chứng Liíaumeni, kh i P53 có sai sót về d i truyền- d ẫ n đ ế n tần số ung thư cao. M ộ t protein quan trọng khá c là P27- một protein có thể gắn với cyclin và Cdk làm ngưng chuyển từ pha G, sang pha s. Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng chẩn đoá n ung thư phổi được thực hiện bằng xác định hàm lượng P27. Kh i P27 giảm bá o trước c ó thể xảy ra ung thư. 26 Ba nhà khoa học gồm Timothy Hunt, Paul Nurse, thuộc Quỹ Nghiê n Cứu Ung Thư Hoàn g Gia An h và Leland (Lee) Hartwell thuộc Trung Tâm Nghiê n Cứu Ung Thư Fred Hutchinson, Seattle, Mỹ , đã nhận được giả i thưởng Nobel y học năm 2001 do những nghiên cứu suất sắc về phát minh hệ điều hành quá trình phân bào. Phát minh của h ọ đã cho ta hiểu thêm về những sai sót ở mức phân tử và mức dưới t ế bào (su/?- cellular) có thể d ẫ n đ ế n ung thư như t h ế nào. Hartwell đã phát minh ra các Gen chu kỳ phân chia tế bào (CDC genes - Cell Division Circle genes) ở n ấm men Saccharomyces cerevisea. Paul Nurse đã phát minh các gen chu k ỳ phân chia t ế bào ở một loài n ấm men khá c là Schiiosaccharomyces pumle. Các gen chu k ỳ phân chia t ế bào CDC mã hoa cá c proteins ki ểm soát chu k ỳ phân bào. Cdk và các cyclin đã được phát hiện ở 2 loạ i n ấm men trên. Mộ t vài gen mã hoa các phân tử Cdk và cyclin có thể có chức năng của genes ung thư (Oncogene, hoặc phối hợp với các sản phẩm của các gen ức c h ế ung thư (ví dụ P53 và Rb) trong chu k ỳ t ế bào). Hartvvell cũng đã đưa ra nguyê n tắc "đi ểm ki ểm soát - checkpoint" rất quan trọng trong nghiên cứu chu k ỳ t ế bào. Nurse cho biết các Cdk đi ều hành các bước của chu k ỳ t ế bào bằng phản ứng phosphoryl hoa (phosphorylation) hai chiều ở một số proteins (bao g ồm cả bản thân các Cdk) bằng thêm hoặc bớt phân tử phosphate vào protein. H u n cho biết cyclins gắn với các phân tử Cdk để tạo ra các tổ hợp Cdk - cyclins (CDKs), do vậy chúng khôn g chỉ đi ều khi ể n hoạt hoa của Cdk mà còn làm thuận tiện việc lựa chọn thêm phosphate vào phân tử protein. CDKs đón g vai trò đi ều khi ển các trạm ki ểm soát quá trình phân bào. Cá c trạm ki ể m soát khá c nhau và cá c gen đi ều khi ển các trạm ki ểm soát này đã được phát hiện ở hai loài n ấm men và ở các loài nhân thực bậc cao khác , trong đ ó c ó động vật có vú. H u n đã phát minh ra các protein cyclins phân giả i theo chu k ỳ trong chu k ỳ t ế bào - Sự phân giả i của protein được xem là một đặc tính đón g vai trò quan trọng ki ể m soát chu kỳ t ế bào. H u n cũng đã tìm thấy cyclins ở các cơ thể sống khá c nhau và cho biết cyclins là các protein bảo thủ trong quá trình tiến hoa. Các CDKs gen đi ều kiế n quá trình chuyển dịch các pha trong chu k ỳ t ế bào như chuyển pha G 2 sang M (G2/M), chuyển pha metaphase sang anaphase, Gị sang s, các sự kiệ n liên quan đ ế n hỏng hóc và chỉnh sửa ADN . Các trạm ki ể m soát này sẽ khôn g cho phép t ế bào chuyển từ pha n ọ sang pha kia nếu pha trước đ ó chưa hoàn thành. Ví dụ: các gen đứng ở các trạm ki ểm soát sẽ khôn g cho phép t ế bào chuyển sang giai đoạn M nếu tổng hợp AD N chưa được sửa chữa, hoặc chỉ cho phé p bắt đầu pha anaphase kh i tất cả các nhi ễm sắc thể (NST) đã nằm trên mặt phang đường xích đạo của t ế bào và các kinetochores của NST phải bám vào sợi thoi vô sắc. 27 2.2.1.2. Chu kỳ tế bào và ứng dụng trong thực tiễn * Chẩn đoá n và tiến tớ i ngă n ngừa bệnh ung thư 9 Những thay đ ổ i trong chu k ỳ t ế bào có thể d ẫ n đ ế n cá c biến độ ng hoặc sự khôn g ô n định của NST là nguyê n nhân gây bệnh ung thư. Cá c gen m ã hoa cá c protein chì a khoa trong điêu khiế n phân bào cũng chính là các gen ung thư (oncogenes). Cá c sản phàm cua Cdk và cyclins gen có thể tương tác với các sản phẩm của gen kìm hã m ung thư nh ư gen P53 (tumor suppressor genes). Đ ộ t biến gen P53 là nguyê n nhâ n gây ra trên 50% trường họp ung thư ở người. Những hỏng hóc ở các gen đi ểu khi ể n chu trình phâ n bà o đ ề u c ó thể d ẫ n tới ung thư. V í dụ, cyclin D I (sản phẩm của một gen ung thư - oncogen) được biểu hiện vượt mức bình thường ở trong hầu hết các trường hợp ung thư ph ổ i. Nhữn g con chuột khôn g có cyclin D I đã tỏ ra hoà n toàn khán g với ung thư. Việ c thiếu vắng hoạt động của các gen mã hoa các chất kìm hãm phâ n bà o như P53 và gen Rb (retinoblastoma) cũng có thể d ẫ n đ ế n ung thư. Gen P53 được gọ i là ngư ờ i bảo v ệ của genom (Guardian hoặc Watchman). Do vậy việc phát minh ra các gen chủ đạo điều khiển chu kỳ phân bào chắc chắn sẽ mở ra những triển vọng mới mẻ đổi với chẩn đoán và chữa trị ưng thư. * Các ứng dụng quan trọng khá c N h ờ nghiên cứu các quy luật đi ều khi ển phân chia t ế bào ngư ờ i ta c ó th ể ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khá c nhau của đòi sống: - Nhâ n bản t ế bào; - Sản xuất sinh khố i t ế bào như protein đơn bào, sinh khố i dược liệu ; - Tạo ra hàng loạt bản copy của một cây ưu việ t hay là nhâ n bản cây trồng quy m ô công nghiệp. Đâ y là nền tảng của Côn g nghệ v i nhâ n giống (micropropagation); - Kh ả năng phân hoa của t ế bào sinh dưỡng ( t ế bào soma) thành phô i trong đi ề u kiệ n in vitro là cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất hạt nhân tạo từ t ế bào. 2.2.2. Khả năng trao đổi chất T ế bào là nhà m á y sinh học c ó kh ả năng sản xuất ra hàn g vạn cá c loạ i hợp chất hữu cơ khá c nhau. Kh ả năng trao đ ổ i chất của t ế bào là cơ sở của côn g nghiệp sản xu ấ t cá c chất hoạt tính sinh học ứng dụng trong nôn g nghiệp và y học (bảng 3). V í dụ: - Nuôi cấy t ế bào nhâ n sâm trong bioreactors; - Sản xuất taxol chữa bệnh ung thư bằng nuôi cấy m ô thông đ ỏ ; - Sản xuất vacxin và các dược chất quan trọng bằng côn g nghệ AD N tái tổ hợp. Hiệ n nay, một hướng ứng dụng mới của kỹ thuật di truyền đang được ch ú ý: đ ó là canh tác phân tử. Cây trồng hoặc t ế bào trở thành bioreactor đ ể sản xuất ra cá c c h ế ph ẩm sinh học khá c nhau. 28 Bảng 2.2. Một số các sản phẩm thứ cấp ở thực vật và công dụng SÍT Chất Công dụng 1 Vinblastine Chữa ung thư 2 Taxol Chữa ung thư 3 Ajmalicine Tăng độ đàn hồi thành mạch 4 Digitalis Chữa rối loạn tim mạch 5 Quinine Chữa sốt rét 6 Codeine Thuốc an thần 7 Jasmine Hương thơm 8 Pyrethrine Thuốc trừ sâu 9 Spearmit Hương vị 10 Artemysilin Chữa sốt rét 2.2.3. T ế b à o là k h o lưu tr ữ thôn g ti n v à là đơ n vị tiế n hoa Thôn g tin di truyền được lưu giữ trong các phân tử AD N của t ế bào. Trong các t ế bào tiền nhân (prokaryote): nhi ễm sắc thể là một sợi AD N mạch vòn g gồm vài nghìn gen. Bên cạnh đó, trong các t ế bào tiền nhân còn có các plasmid là cá c phân tử AD N mạch vòng nhỏ khôn g chứa các gen thiết yếu đ ố i với trao đ ổ i chất của t ế bào. Trong các t ế bào nhân thực (eukaryote) thông tin di truyền chủ yếu được lưu giữ trên nhi ễm sắc thể, trong nhân t ế bào. Ngoà i ra, ty thể và lục lạp cũng mang gen trên một phân tử AD N vòng khé p kín, giống như nhi ễm sắc thể ở t ế bào tiền nhân. Số lượng gen trong t ế bào v i khuẩn là khoảng vài nghìn gen trong kh i ở ngườ i có ít nhất là 30.000 gen. 2.2.3.1. Tế bào là đơn vị sống nhỏ nhất bảo tồn khả năng tái sinh thành cơ thể hoàn chỉnh - Những biến đ ổ i d i truyền ở mức t ế bào là cơ sở để tạo ra cá c cơ thể sống mớ i làm tiền đề phát tri ển công nghệ t ế bào tạo giống. - T ế bào là vật liệ u tiến hoa, cung cấp vật liệ u di truyền mớ i cho quần thể, quần xã và có khả nâng gây ra những biến đ ổ i của h ệ sinh thái. Chuyển gen vào t ế bào sống trong đi ều kiệ n ống nghiệm đã tạo ra các cơ thể biến đ ổ i di truyền (GM O - Genic modified organism). Ví dụ, gen độc t ố trừ sâu của v i khuẩn Bacillus thuringiensis (gen Bt) đã được chuyển vào t ế bào ng ô nuôi cấy in vitro, từ các t ế bào mang gen Bt ngườ i ta đã tái sinh thành cây và tạo ra các dòn g ng ô Bt khán g sâu. Các dòng ng ô Bt này có khả năng thụ phấn tự do hoặc lai tạo với các dòng , giống ng ô có ý nghĩa kinh t ế khá c để tạo ra vô vàn các giống, dòng mang gen của GM O ban đ ầ u và có thể có những tác động đến hệ sinh thái {xem chi tiết vềGMO ở chương 3). 2.2.3.2. Tê bào là đơn vị thao tác di truyền và là tiền đê của công cuộc tạo giống Thao tác di truyền ở mức t ế bào là một biện phá p chủ đạo trong tạo giống mớ i trong tương lai. Thao tác di truyền sẽ bao gồm các kỹ thuật dưới đây: - K ỹ thuật gen (cài gen, chuyển gen...). - Độ t biến, biến dị t ế bào soma. 29 - L a i ghé p t ế bào trần, lai xa, cứu phôi và biến nạp cơ quan tử (nhi ễm sắc th ể và nộ i bào quan). Những tiềm năng của t ế bào thực vật đã được phâ n tích trên đâ y cho thấy những hướng ứng dụng của Công nghệ t ế b à o là rất đa dạng và đan g được từng bước chuyê n hoa vào thực ti ễ n phát tri ển nôn g nghiệp, y học, cả i thiện mô i trường sinh thái. Tuy theo mục tiêu phát tri ển của nền kinh t ế của m ỗ i quốc gia và nhu cầu của thị trường ngư ờ i ta nghiên cứu phát tri ển các công nghệ phù hợp. 2.2.4. Tê bào thực vật còn là nhà máy năng lượng mặt trời - nền tảng cho phát triển Còn g ngh ệ sinh học xanh và cá c côn g ngh ệ sạch T ế bào thực vật có khả năng k ỳ diệu: hấp thụ năng lượng mặt trời và tạo ra cá c hợp chất hữu cơ. Nh ờ vào quá trình quang hợp, trên trái đ ấ t đã tạo ra: - Khoảng 170 t ỷ tấn các chất hữu cơ/năm. - Lươn g thực và thức ăn khá c nuôi dưỡng trên 8 t ỷ nguôi, hàn g chục t ỷ đ ộ n g vật và v i sinh vật trái đất. - Dưỡng khí: Từ thán khí C0 2 và nước, dư ớ i ánh sáng mặt trời tạo ra cá c chất hữu cơ và dưỡng khí (0 2 ). - Hấ p thụ thán khí (C0 2 ): Các giống cây trồng năn g suất cao c ó thể h ấ p thu 70 tấn C02/ha. Các cây C4 có kh ả năng hấp thụ C0 2 và kh ả năn g quang hợp cao hơn câ y C3. - Ngoài ra, t ế bào thực vật còn có khả năng phân ly nước thành oxy và hydro nguyên tử ở điều kiện nhiệt độ bình thường. Đâ y có thể là loại nhiên liệ u sạch vô giá trong tương lai. T óm lại, t ế bào thực vật là nh à má y năn g lượng mặt trời, chuyển hoa năn g lượng án h sáng thành năng lượng hoa học và tạo ra dưỡng khí. Do vậy, cá c nghiê n cứu t ế b à o thực vật sẽ đón g vai trò quyết định đ ố i với qu á trình xây dựng và phục hồ i cá c nguồn năn g lượng sống của trái đất. Ngà y nay, công nghệ sinh học ngà y càng c ó tiềm nân g tri thức và phươn g tiệ n côn g nghệ để .tác động vào kh ả năng quang hợp của thảm thực vật và tham gia và o qu á trình năng lượng và mô i trường toàn cầu. 2.3. MỘT SỐ HƯỚNG KHAI THÁC CÁC ĐẶC TRUNG cơ BẢN CỦA TẾ BÀO TRON G TẠ O GI Ố N G Bởi bản chất của khoa học - công nghệ là khai thác những tiềm năn g thiên nhiê n vì cuộc sống con người. Chún g ta nghiên cứu những tiềm năng to l ớ n của t ế b à o sống nh ằm xác định những khả năng ứng dụng của các tiềm năn g đó . Dư ớ i đâ y chỉ giới thiệu mộ t số ứng dụng trước mắt trong nông nghiệp để minh hoa. 2.3.1. Xây dựng hệ thông tái sinh nâng cao hiệu quả chuyển gen trong tạo giống Thàn h công của kỹ thuật gen tạo giống cây trồng phụ thuộc vào ba y ế u t ố c ơ bản như thiết k ế hợp lý gen và hệ đi ều hành của gen, kỹ thuật chuyển và lắp ghé p gen vào vị 30 trí thích hợp trong nhi ễm sắc thể và hệ gen của t ế b à o và phụ thuộc vào h ệ thống nuôi cấy và tái sinh t ế bào thành cây hoàn chỉnh. Vì vậy, sử dụng cá c giống có kh ả năng tái sinh cao in vitro là cơ sở không thể thiếu của các thao tác chuyển gen. Thàn h tựu n ổ i bật trong lĩnh vực này là h ệ thống tái sinh cây lúa từ nuô i cấy t ế bào phôi hoa. Thôn g qua chuyển gen vào h ệ thống t ế b à o c ó kh ả năn g tái sinh cao này, vài nghìn dòn g lúa chuyển gen với cá c tính trạng khá c nhau đã được tạo ra. Ở ng ô và một số cây trồng khác , người ta chưa thể chuyển cá c gen mong muố n vào các dòn g giống c ó giá trị thương mạ i một cách trực tiếp do cá c giống này khôn g c ó hoặc có khả năng tái sinh rất y ế u trong nuôi cấy in vitro. V ì vậy, trước hết ngư ờ i ta chuyển gen vào hệ thống t ế b à o nuôi cấy tái sinh mạnh. Sau kh i tạo ra cây mang gen mới, ngườ i ta phải thực hiện phé p lai ngược (back-cross) để tạo ra dòn g thuần có giá trị thương mại. 2.3.2. Kỷ thuật đơn bội tạo giống mới và dòng thuần Gi á trị của cây đơn bộ i trong các nghiên cứu d i truyền và chọn giống đã được ngườ i ta biết đ ế n từ lâu. K ể từ kh i Blakeslee (1921) m ô tả cây đơn bộ i tự nhiên đ ầ u tiên ở Datura stramonium, cây đơn bộ i tự nhiên đã được tìm thấy ở rất nhiều loạ i cây khá c nhau. Tuy vậy các cây đơn bộ i tự nhiên xuất hiện một cách ng ẫ u nhiên v ớ i tần suất rất thấp không thể đá p ứng yêu cầu của nghiên cứu và chọn giống. L ầ n đ ầ u tiên trên t h ế giới, hai nhà khoa học An Đ ộ Guha và Maheshvvari (1967), đã thành côn g trong việc tạo ra hàng loạt cây đơn bộ i từ nuôi cấy bao phấn in vitro cây cà Datura innoxia. Ngay sau đó, cây đơn bộ i đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cá c loạ i cây trồng khác . Các nhà khoa học đã tìm ra các y ế u t ố quan trọng ảnh hưởng đ ế n thành công của quá trình nuôi cấy như ảnh hưởng của ki ể u gen, giai đo ạ n phát tri ển của hạt phấn và các điều kiệ n mô i trường nuôi cấy. Ngoà i nuôi cấy bao phấn, các nhà khoa học còn có những thành côn g rất lớn trong việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy hạt phấn tách r ờ i. K ỹ thuật tạo cây đơn bộ i in vitro thông qua kích thích ti ểu bào tử hoặc đ ạ i bào tử phát tri ển thành cây trong nuôi cây hạt phấn, noãn cho phé p nhanh chón g tạo ra hàng loạt cây đem bộ i phục vụ đắc lực cho mục đích nghiên cứu d i truyền và tạo giống cây trồng. Trong kỹ thuật đơn bội, vật liệ u ban đầu cho quá trình nuôi cấy i n vitro gồm: - Bao phấn, hạt phấn tách rời, cụm hoa (phương phá p này thường được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ). - Phôi non. Kh i lai xa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H. bulbosum với nhau, sau quá trình thụ phấn phôi đơn bộ i đã được hình thành do nhi ễm sắc thể của H. bulbosum đã bị loạ i trừ, nhưng nộ i nhũ của phôi đơn bộ i đã khôn g phá t tri ển. Sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi đã cứu được các phôi này kh ỏ i bị chết và tạo ra hàng loạt cây đơn bội (Jensen, 1977). - Th ụ tinh giả . Đâ y là quá trình thụ phấn nhưng sau đ ó đã khôn g xảy ra sự thụ tinh. Mặ c dù vậy, t ế b à o trứng v ẫ n được kích thích phát tri ển thành cây đơn bội. Hess và 31 Wagner (1974) đã tiến hành thụ phấn in vitro giữa Mimulus luteus v ớ i Torenia/ournieri. K ế t quả h ọ đã tạo được cây đơn bội. - Noã n chưa thụ tinh. Trong số các vật liệ u k ể trên thì bao phấn, hạt phấn tách rời và noã n chưa thụ tinh là những nguồn nguyê n liệ u quan trọng và thường được sử dụng hơn cả đ ể tạo câ y đem bội. K ể từ thành công của Guha và Meheshinari, các cây đơn bộ i của hơn 247 loài thuộc 88 chi và 34 họ thực hạt kín đã được tạo ra rư nuôi cấy bao phấn và hạt phấn (Bajaj, 1990) trong khi đ ó thành công của nuôi cấy noãn còn hạn c h ế ở mộ t số loạ i câ y trồng như đ ạ i mạch, lúa mỳ , thuốc lá, củ cải đường, ngô . 2.3.3. Thụ tinh nhân tạo, nuôi cây và tái sinh tê bào trứng, tê bào họp tử, tế bào nội n h ũ non thàn h cây tron g đi ề u kiệ n i n vitr o Quy trình thụ tinh ké p ở thực vật: kh i noãn được thụ phấn, t ế b à o phấn hoa c ó mộ t nhân sinh dưỡng sẽ tạo thành ống phấn. Nhâ n của một tinh tử I n trôi theo ống phấn sẽ thụ tinh với t ế bào trứng I n và tạo ra t ế bào hợp tử 2n. Nhâ n của tinh tử thứ 2 sẽ thụ tinh với t ế bào trung tâm của noãn 2n và sẽ tạo thành t ế bào nộ i nhũ 3n. Các nhà khoa học tạ i Việ n Thực vật Đ ạ i cương ở Đức l ầ n đ ầ u tiên thực hiệ n việc thụ tinh nhân tạo cho t ế bào trứng hoàn toàn trong đi ều kiệ n in vitro và sự phá t tri ể n của cá c sản phẩm sau thụ tinh đã được quan sát thường xuyê n dư ớ i kín h hi ể n vi. T ế b à o trứng tách rời sau khi thụ tinh đã tạo thành phôi và tái sinh thành câ y hoà n chỉnh trong ống nghiệm. T ế bào trung tâm của túi phôi (2n nhi ễm sắc thể) sau kh i thụ tinh v ớ i nhâ n của t ế bào hạt phấn đã tái sinh in vitro thành nộ i nhũ tam bộ i ở cá c cây hoa thảo nh ư lúa mì, lúa mạch, ng ô và lúa nước... Những thành công này đan g m ở ra kh ả năn g thao tác di truyền dưới kính hi ển v i nhằm tạo giống mới, trong đ ó c ó cá c giống tam bộ i ở cây trồng. 2.3.4. Công nghệ tế bào tạo giống cây ăn quả không hạt, chất lượng cao và cây lâm nghiệp ư u t h ế lai thôn g qua nuô i c ấ y nộ i n h ũ t am bộ i Hiệ n tạ i có ba phương pháp công nghệ t ế bào đan g được á p dụng rộng rãi đ ể tạo giống ưu t h ế lai khôn g hạt và giống ưu t h ế lai tam bộ i thể khôn g hạt. 2.3.4.1. Phương pháp nuôi cấy và tái sinh cây từ nội nhũ tam bội Phương pháp được sử dụng khá phổ biến trong tạo giống cây ăn quả khôn g hạt ở cam quýt bưởi, chuối, táo tây... và tạo giống cây rừng ưu t h ế lai tam bội. Phươn g phá p nuôi cấy nộ i nhũ của hạt non đang được ứng dụng với cây ăn quả c ó mú i đ ể tạo giống cam quýt khôn g hạt, sạch bệnh. 2.3.4.2. Cứu phôi Hiệ n tượng quả khôn g hạt có thể do phôi sau kh i hình thành đã khôn g được tiếp tục phát triển mà tiêu biến đi. Hiệ n tượng này đã được phát hiện ở cá c giống nho khôn g hạt. Ớ các giống này, hạt non phát tri ển đ ế n giai đoạn nhất định rồ i dừng lạ i và bị tiêu biến. Phương pháp mới tạo giống khôn g hạt là lai hai giống khôn g hạt v ớ i nhau, hạt lai trước khi bị teo đi đã được tách ra nuôi cấy in vitro để tái sinh thành cây. Đâ y là k ỹ thuật nuô i 32 cấy m ô để cứu phôi hạt lai in vitro. Tạ i Israel, trong chương trình tạo giống nho, m ỗ i n ăm lai tạo và nuôi cấy khoảng 30.000 phôi non, tạo ra 30.000 cây con lai F l giống nho khôn g hạt đ ể khảo nghiệm nhằm chọn ra những con lai F l ưu việ t nhất. Những con lai ưu việ t sau đ ó sẽ được nhân nhanh bằng phương phá p vô tính phục vụ sản xuất. 2.3.4.3. Tạo giông đa bội thể4n Phương phá p cơ bản để tạo dòn g tứ bộ i thể là" xử lý colchicine t ế bào và m ô nhị bộ i in vivo hoặc in vitro hay bằng phương phá p dung hợp cá c t ế b à o trần nhị bộ i v ớ i nhau. Cây giống đa bộ i thể 4n sau kh i tạo được bằng xử lý colchicine sẽ được lai v ớ i giống nhị bộ i 2n đ ể tạo giống tam bộ i khôn g hạt 3n (cây ăn quả) hoặc là giống tam bộ i thể ưu thế lai có năng suất cao (các giống dâu tằm). Công nghệ t ế bào đã và sẽ đón g gó p vai trò ngà y càng cao trong chọn tạo giống cây trồng. Những tiến bộ mớ i đây trong lĩnh vực nuôi cấy t ế bào và m ô tách rời như hạt phấn, bao phấn, t ế bào trứng và phôi non, nộ i nhũ tam bội, t ế b à o thịt lá... cho phép công nghệ t ế bào thâm nhập vào tất cả các lĩnh vực tạo giống khá c nhau. Đ ó là: - Tạo giống ưu t h ế lai; - Tạo các dạng đ ộ t biến và biến đ ổ i gen (GMO); - Tạo các dạng tam bộ i thể ưu t h ế lai khôn g hạt ở cây ăn quả và cá c cây l ấ y lá, l ấ y gổ và l ấ y sợi; - Tạo dòn g t ế bào đ ộ t biến hoặc biến đ ổ i gen có kh ả năng sản sinh các dược chất ở quy m ô công nghiệp. Nhiệm vụ của cá c nh à khoa học là lựa chọn các côn g nghệ tiế n tiến nhất áp dụng vào phát triển nôn g nghiệp, bảo vệ mô i trường và sức khoe con ngư ờ i ở nước ta. 2.4. PHÁT MINH RA CÁC ỨNG DỤNG KHÁC NHAU CỦA KỸ THUẬT NUÔI CÂY M Ô VÀ T Ế B À O 2.4.1. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh và nhân giống nhanh - Năm 1949, Limmasets và Cornuet đ ã phá t hiệ n rằng virus phâ n b ố khôn g đồng nhất trên cây và thường khôn g thấy có virus ở vùn g đỉnh sinh trưởng. - Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đ ố i với nhiều loài cây trồng khá c nhau. - Năm 1952, More l và Marti n l ầ n đ ầ u tiên thực hiệ n v i ghé p i n vitro thàn h công . K ỹ thuật vi ghé p sau đ ó đã được ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhâ n giống bằng phươn g phá p vô tính khá c nhau, đặc biệ t là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh. - Năm 1960, More l đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng k ỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loạ i địa lan Cymbidium, m ở đầu công nghiệp v i nhân giống thực vật. 33 2.4.2. K ỷ thuậ t nuô i c ấ y , tá i sinh t ế b à o tr ầ n v à la i t ế b à o soma - Năm 1960, Cocking lần đ ầ u tiên sử dụng enzym phâ n giả i thàn h t ế b à o và đ ã tạo ra số lượng lớn t ế b à o trần. K ỹ thuật này sau đ ó đã được hoà n thiện đ ể tách nuô i t ế b à o trân ở nhiều cây trồng khá c nhau. - Năm 1971, Takebe và cs., đã tái sinh được cây từ t ế b à o trần m ô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá. - Năm 1972, Carlson và CS-, l ầ n đ ầ u tiên thực hiệ n lai t ế b à o soma giữa cá c loài, tạo được cây từ dung hợp t ế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. - Năm 1978, Melchers và cs., tạo được cây lai soma "cà chua - thuốc lá" bằng lai xa t ế bào trần của hai cây này. Đ ế n nay, việc tái sinh cây hoà n chỉnh từ t ế b à o trần hoặc từ lai t ế bào trần đã thành công ở nhiều loài thực vật. 2.4.3. Kỹ thuật đơn bội và ứng dụng tạo dòng thuần, cố định ưu thế lai - Nă m 1964, Guha và Maheshwari l ầ n đ ầ u tiên thàn h côn g trong tạo được câ y đơ n b ộ i từ nuô i cấy bao phấn của cây c à Datura. K ỹ thuật nà y sau đ ó đ ã được nhiề u tá c gi ả phá t tri ể n và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòn g đơ n bộ i (lx) , dòn g thuần nhị bộ i ké p (2x), c ố định ưu t h ế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòn g la i F l đ ể tạo giống thuần mang tính trạng ưu t h ế lai). 2.4.4. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch lỏng (suspensỉon culture) sử dụng trong sản x u ấ t cá c ch ấ t hoạ t tín h sinh học - Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khố i m ô thực vật quy m ô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. - Năm 1977, Noguchi và cs., đã nuôi cấy t ế b à o thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 lít. - Năm 1978, Tabata và cs., đã nuôi t ế bào cây thuốc ở quy m ô côn g nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. H ọ đ ã chọn lọc được dòn g t ế b à o cho sản lượng cá c sản ph ẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. - Năm 1985, Flores và Filner l ầ n đầu tiên sản xuất chất trao đ ổ i thứ cấp từ nhâ n nuô i rễ tơ ở Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơ n cây tự nhiên. Hiệ n nay, côn g nghệ nuô i c ấ y t ế b à o và m ô (ví d ụ , m ô r ễ của nhâ n sâm) trong cá c bioreactor dung tích l ớ n đã được thươn g mạ i hoa ở mức côn g nghiệp đ ể sản xu ấ t sinh dược. 2.4.5. Tạo các biên dị dòng tế bào soma ứng dụng trong chọn tạo giống và xác định chức năn g của cá c gen N ăm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biế n trong nuôi cấy m ô và t ế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và Scowcroft đ ã đưa ra thuật ngữ 34 "biến dị dòn g soma" (somaclonal variation) để chỉ cá c thay đ ổ i d i truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy m ô và t ế bào in vitro. Từ các dòn g t ế b à o hoặc cây biến dị d i truyền ổn định c ó thể nhân nhanh, tạo ra các dòn g và giống đ ộ t biế n có nân g suất, hàm lượng hoạt chất hữu ích cao, khán g một số các đi ều kiệ n bất lợ i như bệnh, mặn, hạn,... 2.4.6. Công nghệ tế bào ứng dụng trong chuyển gen vào cây trồng Đ ế n nay các n h à khoa học đã khẳng định rằng mức đ ộ thành công của chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuô i cấy và tái sinh t ế b à o thành cây i n vitro sau chuyển gen. - Năm 1974, Zaenen và cs., đã phát hiện plasmid T i đón g vai trò là y ế u t ố gây u (crown gall) ở cây trồng. - Năm 1977, Chilton và cs., đã chuyển thành công T-DNA vào thực vật. - Năm 1979, Marton và cs., đã xây dựng quy trình chuyển gen vào t ế bào trần thông qua Agrobacterium, bằng phương phá p đồng nuôi cấy t ế bào trần và Agrobacterỉum. - Năm 1982, Krens đã chuyển thành công AD N vào t ế b à o trần. - Năm 1985, Fraley và cs., thiết k ế vector plasmid T i đã loạ i bỏ cá c gen độc gây hạ i để sử dụng cho việc thiết k ế vector chuyển gen vào thực vật. Cùn g trong năm, Horsch và cs. đã chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumeỷaciens và tái sinh cây chuyển gen. A n và cs. (1985) đã phát tri ển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật. - Năm 1987, Klei n và cs. đã sử dụng súng bắn gen (particle gun) mang v i đ ạ n trong chuyển gen và tái sinh được cây biểu hiện gen chuyển. - Năm 1994, thương mạ i hoa giống cà chua chuyển gen 'Flavr-Savr'. 2.5. NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 2.5.1. Mộ t số cá c mô i trư ờ n g cơ bả n thư ờ n g dùn g tron g nuô i c ấ y m ô Thành phần hoa học của mô i trường đón g vai trò quyết định đ ố i với thành công của nuôi cấy t ế bào và m ô thực vật. M ỗ i loài cây, thậm chí m ỗ i ki ể u gen, các ki ể u nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy m ô sẹo, huyền phù t ế bào, t ế bào trần, bao phấn, hạt phấn...) có những đòi h ỏ i khá c nhau về thành phần mô i trường. Kh i bắt đ ầ u nuôi cấy m ô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải lựa chọn cho đ ố i tượng nghiê n cứu mộ t loạ i môi trường cơ bản phù hợp. Cho đ ế n nay, các nhà khoa học đã tạo ra số lượng rất lớn các mô i trường thích hợp với từng đ ố i tượng và mục tiêu nghiên cứu. Mộ t số mô i trường cơ bản thường được sử dụng trong nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật, và thành phần hoa học của chún g được thể hiện ở bảng dư ớ i đây: 35 Bảng 2.3. Một số môi trường cơ bản thường được sử dạng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Đơn vị khối lượng mgỉl) Thành phần Murashige & Skoog (1962) MS White (1963) Gamborg (1968) Bõ Heller (1953) Schenk & Hildebrandt (1972) Chu & Cs (1975) N6 Nitsch & Nitsch (1967) Knop (1865) KNO3 1.900 80 2.500 - 2.500 2.830 125 250 NH4N03 1.650 - - - - - - - (NH4 ) 2S04 - - 134 - -r 463 - - Ca(N03 ) 2.4H2 0 - 200 - - - 500 1,400 CaCI 2H2 0 440 - 150 75 200 166 - - MgS04.7H2 0 370 360 250 250 400 185 125 250 KH2P04 170 - - - 400 125 250 NaH2P04 H2 0 - 16,5 150 125 - - - NH4H2P04 - - - - 300 - - . FeS04 7H2 0 27,8 - 27,8 - 15 27,8 27,8 - Na2EDTA 37,3 - 37,3 - 20 37,3 37,3 - KI 0,83 0,75 0,75 0,01 1,0 0,8 - - H3BO3 6,2 1,5 3 1 5 1,6 10 - MnS04 4H2 0 22,3 5 10 (1 H2 0) 0,1 10 3,3 25 - ZnS04 7H2 0 8,6 3 2 1 1 1,5 10 - KCI - 65 - 750 - - 120 CuS04 5H2 0 0,025 - 0,025 0,03 0,2 0,025 0,025 - CoCI 2 6H2 0 0,025 - 0,025 - 0,1 0,025 0,025 - Na 2M0O4.2H2 0 0,25 - 0,25 - 0,1 0,025 0,25 - Na 2S04 - 200 - - - - - NaNOa - - - 600 - - - H2S04 - - - - - - - Fe 2 (S04 ) 3 - 2,5 - - - - - NiCI2 6H2 0 - - - 0,03 - - - AICI3 - - - 0,03 - - - FeCI36H20 - - - 1 - - - FeC6 06H7 5H2 0 - - - - - - - Sucrose Glucose 30.000 20.000 20.000 20.000 30.000 30.000 - 90.000 20.000- 30.000-_ Myo-lnositol 100 - 100 - 1.000 100 - Nicotinic Acid 0,5 0,5 1,0 - 0,5 0,5 5 - Pyridoxine. HCI 0,5 0,1 1,0 • 0,5 ' 0,5 0,5 36 Thành phần Murashige & Skoog (1962) MS VVhite (1963) Gamborg (1968) B5 Heller (1953) Schenk & Hildebrandt (1972) Chu & Cs (1975) N6 Nitsch & Nitsch (1967) Knop (1865) Thiamine.HCI 0,1-1 0,1 10 1 5 0,1-10 0,5 • Glycine 2 3 • 2 2 • Ca-Pantothenate 1 • " - Biotin • • • 0,05 - Cysteine.HCI • 1 - • - - Folic Acid ~ • • • 0,5 - Glutamine * • • • Bảng 2.4. Môi trường MS (Murashige & Skoog 1962) Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised mediumỷor rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497. Muối khoáng Nồng độ Nồng độ Đa lượng (mg/l) Vi lượng (mg/l) Potasium nitrate (KN03 ) 1.900 Manganese sulfate (MnS04. 4H2 0) 22,3 Ammonium nitrate (NH4N03 ) 1.650 Boric acid (H3BO3) 6,2 Calcium chloride (CaCI2.H20) 440 Colbalt chloride (CoCI2.6H20) 0,025 Magnesium sulíate (MgS04.7H20) 370 Cupric Sulíate (CuS04.5H20) 0,025 Potassium phosphate (KH2P04 ) 170 Ferrous sulíate (FeS04.7H20) 27,8 Na2EDTA.2H20 37,2 Potassium lodine (KI) 0,83 Sodium molybdate (Na 2Mo04.2H2 0) 0,25 Zinc Sulíate (ZnS04.7H20) 8,6 Các chất hữu cơ Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine.HCI 0,5 Thiamine.HCI 0,1 IAA 1-30 mg/l Kinetin 0,04-10 Glycine (recrytallized) 2.0 g/l Edamine 1,0 g/l Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l 37 2.5.2. Thàn h ph ầ n hoa học của cá c mô i trư ờ n g nuô i c ấ y mô , t ế b à o thực vậ t M ô i trường nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật tuy rất đ a dạng nhưn g đ ề u gồm mộ t số thành phần cơ bản sau: - Các muố i khoán g đa lượng và v i lượng - Các vitamin - Các amino axit - Nguồn cácbon: một số các loạ i đường - Các chất đi ều hoa sinh trưởng - Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết n ấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô... - Chất làm thay đ ổ i trạng thái mô i trường: cá c loạ i thạch (agar). Tất cả các hợp chất này đ ề u tham gia vào một hoặc nhiều chức năn g trong sự sinh trưởng và phân hoa của thực vật nuôi cấy in vitro. Các nhà khoa học sử dụng các mô i trường nuôi cấy rất khá c nhau. Việ c lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoa học đặc trưng phụ thuộc vào mộ t số y ế u tố: - Đ ố i tượng cây trổng hoặc m ô nuôi cấy khá c nhau có nhu cầu khá c nhau v ề thành phần mô i trường. - Mụ c đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khá c nhau (nuôi cấy tạo m ô sẹo phôi hoa hoặc phôi vô tính, nuôi cấy t ế bào trần hoặc dịch lỏng t ế bào , v i nhâ n giống...). - Trạng thái môi trường khá c nhau (đặc, lỏng, bán lỏng...). - Các mô i trường khoán g cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuô i cấy t ế b à o thực vật là MS (Murashige and Skoog, 1962), B5 (Gamborg cs. 1968), Whit e (1963). (xem bảng thành phần các môi trường). 2.5.2.1. Các chất khoáng Đ ọ i với cây trồng, các chất vô cơ đón g vai trò rất quan trọng. V í dụ, M g là mộ t phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màn g t ế bào, N là thành phần quan trọng của amino axit, vitamin, protein và các axit nucleic. Tương tự, Fe, Zn và M o cũng là thành phần của một số enzym. Các môi trường khá c nhau có hàm lượng và thành phần chất khoán g khá c nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoán g của mô i trường White hoặc Knop kh á nghè o nàn, nhưng lạ i rất giàu ớ môi trường MS và B5. Muố i khoán g là thành phần khôn g thể thiếu trong các mô i trường nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật: - Muố i khoáng là các vật liệ u (nguồn N , s, p...) cho sự tổng hợp cá c chất hữu cơ. Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần khôn g thể thiếu của các phân tử protein, cá c axit nucleic và nhiều chất hữu cơ khác . Canxi và axit boric được tìm thấy chủ y ế u ở thành t ế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định màn g sinh học. 38 - Đón g vai trò như một thành phần khôn g thể thiếu của nhiều enzym (là cá c co factor): magiê , kẽm, sắt... và nhiều nguyên t ố v i lượng là những phần quan trọng của cá c enzym. - Cá c lon của cá c muố i hoa tan đón g vai trò quan trọng ổn định á p suất th ẩm thấu của mô i trường và t ế bào, duy trì t h ế đi ệ n hoa của thực vật. V í dụ, K và c rất quan trọng trong đi ề u hoa tính th ấm lọc của t ế bào, duy trì đi ệ n t h ế và tham gia hoạt hoa nhiều enzym. Trong mô i trường, các muố i khoán g được chia thành các nguyê n t ố v i lượng và đa lượng: - Cá c nguyê n t ố đa lượng gồm 6 nguyê n tố: Mg , Ca, p, s, N và K . - Cá c nguyê n t ố v i lượng gồm: Fe, Mn , Zn, Cu, Mo , Co, B, ì, Ni , Cl, AI,.. . Việ c chia thành cá c nguyê n t ố v i lượng và đa lượng chủ y ế u dựa trên nhu cầu của thực vật đ ố i với cá c chất này. Nhu cầu của thực vật đ ố i v ớ i cá c nguyê n t ố đa lượng là lớn hơn, với nồng đ ộ > 0,5 mM . Cá c nguyê n t ố v i lượng được sử dụng trong mô i trường ở nồng đ ộ < 0,5 mM . Nhu cầu của cây đ ố i với nguyê n t ố v i lượng là rất thấp. Do vậy những nguyê n t ố này cũng có mặt trong mô i trường ở các nồng đ ộ tương ứng. H ầ u hết các nguyê n t ố vi lượng sử dụng ở lượng ịimol. Mộ t số nguyê n t ố v i lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay t h ế d ễ dàng bằng sự l ẫ n tạp ng ẫ u nhiên của chún g trong các thành phần của mô i trường như agar, các chất bổ sung như nước dừa, dịch chiết n ấm men (yeast extract), các muố i và nước. Tầm quan trọng của mộ t số nguyê n t ố v i lượng trong thành phần mô i trường còn chưa được hi ểu mộ t các h rõ ràng. Co, AI , Ni.. . c ó thể c ó lợ i đ ố i v ớ i thực vật nhưng cũng có thể là khôn g cần thiết. Trong thực tế, hầu hết các nguyê n t ố v i lượng chỉ có phần khoáng của muố i (cation) là quan trọng, cò n vai trò các anion c ó thể là khôn g cần thiết. lon SO^ 7 dư thừa trong mô i trường và chủ y ế u phát sinh từ cá c muố i MgS0 4, K 2 S 0 4. Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn. Nguyên tố đa lượng có nồng độ cao nhất trong cá c mô i trường nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật. Nhì n chung cả phần anion và cation của các nguyê n t ố đa lượng đ ề u quan trọng đ ố i v ớ i t ế bào thực vật. Ví dụ như KNO „ cả K + và NO" là cần thiết. Trong nhóm cá c nguyê n t ố đa lượng, các muố i có chứa nitơ chủ yếu ở dạng kali nitrat, amonium hoặc canxi nitrat. Cá c nguyê n t ố đa lượng + Nitơ (N): Thàn h phần chính của hầu hết các mô i trường là nitơ vô cơ dư ớ i dạng nitrat (NO" ) hoặc amonium (NH4) . Các muố i được dùng phổ biến là kali nitrat (KNO3), nitrat amon (NH 4 N 0 3 ) và canxi nitrat (Ca(N0 3 ) 2.4H2 0 ). Những hợp chất nà y cung cấp nitơ vô cơ cho thực vật đ ể tổng hợp các phân tử chất hữu cơ phức tạp. 39 Amonium chủ yếu được dự trữ ở rễ như nguồn nitơ hữu cơ. Nitrat c ó th ể được vận chuyển theo mạch xylem đ ế n các bộ phận của cây, tạ i đ ó n ó sẽ tham gia v à o q u á trình đồng hoa nitơ. Nitrat có thể được dự trữ ở khôn g bào và thực hiệ n chức năn g quan trọng trong việc đi ều chỉnh sự thẩm thấu và cân bằng ion của cây trổng. Sự biên đổi nitrat: Nitrat khôn g thể sử dụng ngay lậ p tức đ ể sinh tổng hợp cá c chất hữu cơ phức tạp mà trước tiên cần phải được kh ử thàn h amoniac. Phản ứng di ễ n ra như sau: NO" + 8H+ + 8e~ -> NH3 + 2 H20 + OH" Phản ứng này được thực hiện qua 2 bước nhờ hai enzym: nitrat reductase và nitrit reductase. Trước tiên, nitrat được biến đ ổ i thành nitrit nhờ nitrat reductase. Tiế p theo, nitrit bị khử thành amoniac nhờ enzym nitrit reductase. Sự biến đ ổ i của nitrat thàn h nitrit d i ễ n ra trong t ế bào chất. Trong hầu hết cá c cây trồng, sự kh ử nitrat c ó thể di ễ n ra ở cả lá và đỉnh chồi. Sự kh ử nitrat di ễ n ra ở mức đ ộ nà o phụ thuộc rất l ớ n vào cá c nhâ n t ố như: loài, tuổi cây, nồng đ ộ nitrat. Cụ thể, các loài cây thân g ỗ c ó kh ả năn g kh ử nitrat rất cao. K h i nồng đ ộ nitrat thấp, sự kh ử hầu như di ễ n ra ở rễ. Ngược lại, nếu nồng đ ộ nitrat cao thì quá trình này di ễ n ra cả ở lá. Cá c cation kế t hợp v ớ i nitrat c ó vai trò quan trọng trong việc hấp thu nitrat. N ế u cation là K+thì hoạt động của enzym nitrat reductase ở r ễ thấp và nitrat sẽ được vận chuyển lên các đỉnh chồi của cây. Trong trường hợp cation là Ca 2 + thì sự khử ở rễ lạ i di ễ n ra mạnh hơn. Sự khử nitrit thành NH 3 nhờ enzym nitrit reductase di ễ n ra trong lá cây, trong đ ó đi ện tử cần thiết cho phản ứng này được cung cấp từ sự kh ử cá c hợp chất sắt trong h ệ thống quang hợp. Sự khử nitơ chứa trong các hợp chất: Amonium và amoniac là những chất độc đ ố i với thực vật ngay ở nồng đ ộ thấp. Do đ ó chúng cần được chuyển hoa thật nhanh thành các hợp chất phân tử lượng nhỏ có chứa N như: asparagin, arginin, allantoin và betain. Sinh tổng hợp glutamin và glutamat di ễ n ra cả ở rễ và đỉnh chồ i là cá c qu á trình c ơ bản trong sự chuyển hoa amonium. Bên cạnh sự khử độc tính của amonium và amoniac, các hợp chất chứa nitơ phâ n tử lượng thấp còn có một số chức năng khác . Chức năng quan trọng nhất là cung cấp N trong các liên kế t hữu cơ và nhóm -NH 2 được thực vật hấp thụ như nguồn N hữu c ơ cho quá trình sinh tổng hợp các amino axit và protein. Cá c hợp chất phân tử lượng nhỏ nà y còn được sử dụng làm chất mang cation như Mn , Cu đ ể vận chuyển cá c cation qua h ệ thống mạch d ẫ n trong cây. Ngoà i ra, chún g còn như một kho dự trữ ni tơ dư thừa. Ngược l ạ i với con người và động vật, thực vật khôn g thể bài tiế t cá c hợp chất nitơ hữu c ơ nh ư urê nhưng nhờ cơ ch ế này đã cho phép thực vật dự trữ được nitơ hữu cơ. + Phospho (P): Phospho ở dạng HPO4" được hấp thụ nhờ hệ thống rễ của thực vật và ngược lạ i v ớ i nitrat, sunfat, n ó khôn g bị khử. Nó có thể có mặt trong thực vật dư ớ i dạng p vô c ơ hoặc 40 dạng hợp chất este (R-O-P). Năn g lượng thu được kh i giả i phón g một nguyê n tử p kh ỏ i cá c liên kết (cao năng lượng) là rất quan trọng đ ố i v ớ i quá trình trao đ ổ i chất của t ế bào. Axit nucleic: p là một nguyên t ố thiết y ế u trong cấu tạo của AD N và AR N đ ể nố i cá c đom phân tử axit ribonucleic để tạo thành đ ạ i phân tử. Phospholipid: Phospholipid ở màn g sinh học cũng có chứa một lượng lớn p. Trong những phospholipid này, p (qua liên kế t este) tạo nên cầu nố i giữa diglyxerit với một amin, axit amin hoặc một rượu. Phospholipid có một đ ầ u háo nước, phân tử diglyxerit và một đầu k ỵ nước có chứa PO^". Cả hai đ ề u có chức năng quan trọng trong việc giữ ổn định màn g t ế bào. Màn g t ế bào bao gồm hai lớp phospholipid đơn ghép lạ i tạo thành lớp màn g kép lipid. Đ ầ u ưa nước của lớp phospholipid quay ra ngoà i hướng về phía các phân tử nước trong khi đuôi k ỵ nước lạ i quay vào phía trong giữa hai lớp của màn g t ế bào và tương tác l ẫ n nhau. Quá trình chuyển hoa năng lượng: Phospho ở dạng liên k ế t este cao năn g (C-P) rất quan trọng đ ố i với qu á trình chuyển hoa năng lượng và tổng hợp sinh học ở thực vật. Đón g vai trò quan trọng hơn nữa là các liên kế t cao năng giữa hai nguyê n tử p như trong phân tử ATP (P-P = 30 kJ). Năn g lượng giả i phón g trong suốt qu á trình thúy phân glucoza, quá trình ox i hoa, phosphoryl hoa hoặc quang hợp được sử dụng để tổng hợp ATP. Ngược lạ i nâng lượng này kh i cần lạ i được giả i phón g ra qua phản ứng thúy phân A TP thành AD P và p vô cơ. Vì vậy ATP được chuyển hoa và tổng hợp mớ i liên tục. Mộ t g ăm đỉnh rễ đang trong giai đoạn trao đ ổ i chất mạnh có thể tổng hợp 5g ATP/ngày. Vùng dự trữ p (phosphat): Trong t ế bào bao gồm hai vùng dự trữ phosphat khá c nhau. Vùn g trao đ ổ i, chủ yếu phosphat ở dạng este, nằm trong t ế bào chất và ty thể. Vùn g không trao đ ổ i, chủ yếu là dạng p vô cơ, nằm trong khôn g bào. N ế u ngừng cung cấp p cho cây, nồng đ ộ p vô cơ trong khôn g bào ngay lập tức sẽ giảm trong kh i ở vùng trao đ ổ i tốc đ ộ giảm chậm hom nhiều. K h i tâng cường cung cấp p, nồng đ ộ p chứa trong các cơ quan của t ế bào cũng tăng theo, tuy nhiên khi tăng quá mức bình thường tỊiì chỉ có p vô cơ trong khôn g bào tăng lên. Vì vậy có thể nói, p dư thừa được dự trữ ở khôn g bào dưới dạng p vô cơ. Các enzym: p vô cơ cũng có kh ả năn g đi ều chỉnh tốt trong nhiều q u á trình trao đ ổ i chất của thực vật. Vậ y nên sự phâ n b ố p là cần thiết đ ể đi ều chỉnh qu á trình trao đ ổ i chất của t ế bào. Ở cà chua, sự giảm p vô cơ ở khôn g bà o trong t ế b à o chất kích thích hoạt tính của enzym phosphoíructokinase . Enzym này là enzym quan trọng trong sự phân giả i cơ chất của phản ứng thúy phâ n glyco và làm tăng sự h ô hấp của t ế b à o trong q u á trình chín. Cũng trong thời gian này, sự thiếu hụt p có thể làm chậm qu á trình chín của quả. Trong qu á trình tổng hợp tinh bột của lục lạp, p cũng đón g mộ t vai trò quan trọng. Chỉ với nồng đ ộ thấp, p vô cơ đã có thể gây ức c h ế q u á trình tổng hợp tinh bột. Sở dĩ như vậy là do ADP-gluco-pyrophosphorylase, enzym quan trọng nhất trong qu á trình tổng hợp tinh bột, bị kìm hãm bởi p vô cơ và được kích thích nhờ cá c triossephosphat. Vì thế , sự cân bằng giữa các hợp chất có chứa p là rất quan trọng trong đi ề u hoa tổng 41 hợp tinh bột ở lục lạp. Ngoà i ra, p vô cơ cũng tham gia q u á trình n à y theo mộ t con đ ườn g khác . Cá c phâ n tử vận chuyển phosphat ở màn g t ế bao sẽ mang p v ô c ơ và o t ế b à o và cá c triosephosphat ra ngoà i t ế bào, l àm nồng đ ộ p v ô c ơ trong lục lạ p táng, triosephosphat giảm. Đi ề u n à y lạ i tác động đ ế n q u á trình tổng hợp tinh bột theo c ơ ch ê đ ã trình bày ở trên. Ribuloza biphosphat (RuBP), v ớ i vai trò nh ư mộ t chất nhận C0 2, là hợp chất quan trọng trong sự c ố định C0 2. Sự tái tổng hợp nà y đ ò i h ỏ i phả i c ó cá c triosephosphat. Kh i nồng đ ộ p v ô c ơ cao sẽ kích thích giả i phón g cá c triosephossphat ra kh ỏ i lục lạp, gây thiếu hụt cá c chất này, do đ ó làm kìm hã m qu á trình c ố đ ị n h C0 2. Ngoà i ra, phospho cò n quan trọng trong việc đi ề u khi ể n hoạt đ ộ n g của nhiề u enzym khác . Nồn g đ ộ phospho tố i ưu cho sự sinh trưởng của thực vật là 0,3 - 0,5 g/kg trọng lượng khô . Sự thiếu p l àm cây chậm lớn , lá cây c ó mà u xanh thâm do trong th ờ i gian bị thiếu p, sự phá t tri ể n của lá chậm hơ n sự tổng hợp diệp lục t ố nê n làm tăn g nồng đ ộ diệp lục t ố trong lá cây. + Lư u hu ỳ n h (S): Lưu huỳnh như SO4" được hấp thụ ở rễ cây với tốc đ ộ chậm. Giốn g nh ư nitrat, lưu huỳnh phải được kh ử trước kh i sử dụng đ ể sinh tổng hợp cá c hợp chất c ó chứa lưu huỳnh như amino axit, protein và enzym. Lưu huỳnh ở dạng chưa kh ử được k ế t hợp trong cá c sulpholipid và các polysaccharid. Sự đồng hoa lưu huỳnh: Bước đầu tiên trong qu á trình đồng hoa lưu huỳnh là sự hoạt hoa gốc SO4" nhờ enzym ATP sulfurylase. Phản ứng nà y tạo ra adenosine phosphosulfate (APS) và p vô cơ. Tiế p theo là hai q u á trình hoa học hoà n toàn khá c nhau. Mộ t qu á trình khôn g di ễ n ra sự kh ử lưu huynh m à tạo liên k ế t v ớ i cá c polysaccharid trong sulpholipid. Trong quả trình thứ hai, lưu huỳnh được kh ử thàn h nhóm -SH (nhóm thiol) và nhóm sulfuryl của APS được vận chuyển t ớ i gluthantione (Glut-SH). Sau đ ó nhóm -SH được vận chuyển t ới cho acetylserine và phâ n tác h thàn h acetat và cystein. Cystein là sản phẩm bền đ ầ u tiên trong qu á trình đồng hoa và là tiề n chất của tất cả các hợp chất hữu cơ c ó chứa lưu huỳnh trong thực vật, ví d ụ như: protein, co-enzym, các hợp chất trao đ ổ i chất thứ cấp... Qu á trình đồng hoa lưu huỳnh chủ y ế u d i ễ n ra ở lục lạp. Kh i thiếu lưu huỳnh, sinh tổng hợp protein bị kìm hãm, lượng diệp lục t ố trong lá cây bị giảm sút. Các protein: Lưu huỳnh có mặt trong các protein có chứa cystein và methionin. Cả hai axit amin này đ ề u là tiền chất của tất cả các hợp chất c ó chứa lưu huỳnh trong thực vật. Lưu huỳnh, cấu tử hợp thành của nhiều coenzym và cá c nhó m prosthetic, c ó chức năng quan trọng trong rất nhiều phản ứng oxi hoa khử, được bi ểu di ễ n nh ư sau: R-SH + HS-R - > R-S-S-R Gốc R có thể là phần còn lạ i của phân tử cystein nhưn g cũng c ó thể là tripeptid gluthatione. Gluthatione tan được trong nước và do đ ó n ó đón g vai trò nh ư mộ t h ệ ox i hoa khử ở lục lạp và dịch bào. Cầu lưu huỳnh giữa hai phâ n tử cystein rất quan trọng trong cấu trúc bậc ba của phân tử protein và hoạt động của enzym. Nhó m -SH, nh ư đ ã đ ề 42 cập ở trên c ó trong thành phần của các coenzym và APS, tạo thành mộ t phần của nhóm chức năng trong phân tử enzym. Các metallothionein: CÁC hợp chất phân tử lượng thấp có chứa lưu huỳnh metallothionein, thường hay được tìm thấy trong thực vật. Hầ u hết cá c chất này đ ề u c ó chứa cystein. Đặc biệt, các kim loạ i như: đồng, cadimi và k ẽm thường liên kế t trong metallothionein. Gần như chắc chắn những phân tử protein nhỏ này tham gia vào sự bài tiết các ion k i m loạ i trên kh i chúng dư thừa, trước kh i liên kế t v ớ i nhóm chức năn g -SH của cá c enzym. Lưu huỳnh chưa bị khử: Lưu huỳnh ở dạng chưa bị khử là thành phần cấu tạo sulpholipid, là phần tử tạo thành cấu trúc của màn g sinh học. Lưu huỳnh thường có mặt ở dạng hợp chất este của lưu huỳnh và đường 6 cacbon, ví dụ như glucoza. Sulpholipid có nhiều trên màn g thylakoid của lục lạp và tham gia vào qu á ư ì n h vận chuyển ion qua màn g sinh học. Hơ n nữa, sự c ó mặt của sulpholipid trên màn g t ế bào chắc chắn liên quan đ ến khả năng chịu muố i của thực vật. Mù i vị đặc trưng của mộ t số loài như: hành, t ỏ i chủ yếu c ó liên quan đ ế n sự có mặt của cá c hợp chất có chứa lưu huỳnh d ễ biến đ ổ i. + Kali (K) : Trong thực vật, K + là một cation có tính linh động cao, ở cả mức đ ộ t ế bào cũng như trong quá trình vận chuyển qua các khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc mạch libe. Trong tất cả các nguyê n tố, kali là nguyê n t ố có mặt v ớ i nồng đ ộ cao nhất, ở t ế bào chất từ 100-200 mM , ở lục lạp từ 20-200 mM . Muố i kali có vai trò quan trọng trong việc đi ều chỉnh tính th ấm của t ế bào. Đ ố i với sự dãn t ế bào cũng như các quá trình khá c được đi ều chỉnh nhờ sức trương của t ế bào, K+ có vai trò như một lon trung hoa các lon vô cơ và hữu cơ hoa tan trong dung dịch, đồng thời duy trì p H trong khoảng 7 - 8 là p H thích hợp cho hoạt động của hầu hết các enzym. Vai trò của K+ đối với các enzym: K + cần thiết cho hoạt động của nhiều enzym. Trên 50 enzym của thực vật hoạt động v ớ i sự tham gia của K + hoặc bị kích thích bói K +. Sự liên kế t của K + v ớ i enzym gây ra sự thay đ ổ i cấu hình khôn g gian của enzym, do đ ó làm tăng ái lực của enzym với cơ chất. Kh i thiếu K+ ngư ờ i ta thấy c ó sự tăng nồng độ đường hoa tan và cá c hợp chất chứa nitơ, kèm theo sự giảm nồng đ ộ tinh bột, chủ y ế u do vai trò thiết yếu của kali đ ố i với việc đi ều khi ển hoạt động enzym trong qu á trình trao đ ổ i cacbon. Enzym ATPase màn g t ế bào cũng chịu sự tác động của K +. Ở cây trưởng thành, K + cần cho quá trình tổng hợp protein. K + còn cần thiết trong q u á trình dịch mã và tổng hợp tRN A ở ribosome. Sự tổng hợp ribuloza biphosphat cacboxilase cũng phụ thuộc rất mạnh vào nồng đ ộ K +. Đâ y còn là ion cần thiết cho hoạt động và tổng hợp enzym nitrat reductase. Bên cạnh vai trò trong hoạt động của nhiều enzym, K+c ò n đi ều chỉnh sự cân bằng ion và pH của lục lạp trong quang hợp. K + là lon trung hoa quan trọng nhất cho sự đưa dòn g H+qua màn g thylakoid. lon này cũng có mặt trong sự tạo thành gradiep pH màn g t ế bào cần thiết cho quá trình tổng hợp ATP. Sự tăng nồng đ ộ K + d ẫ n đ ế n sự tăng cường quá trình quang hợp, h ô hấp và hoạt động của enzym ribuloza biphosphat cacboxilase. 43 Sự dãn của tế bào: Sự tăng kích thước của khôn g bà o trung tâm ưon g t ế b à o là một quá trình quan trọng trong sự dãn t ế bào. Đ ể hình thành khôn g bào , đ ầ u tiên là sự tăng kích thước đủ lớn của thành t ế bào, tiếp theo kh ả năng thẩm thấu của khôn g bà o tăng lên. Đi ề u này có thể đạt được nhờ sự tích tụ K + gây ra sự tăng mạnh v ề th ể tích của khôn g bào do tính thấm. GA 3 và K + dường như có tác dụng h ỗ trợ nhau trong vai trò làm tăng chiều cao cây. Sự cân bằng ion: K + c ó vai trò quan trọng cho việc duy trì cân bằng lon. N ó trung hoa các anion kém linh động trong t ế bào chất và rất nhiều cá c anion linh động trong mạch xylem, libe và khôn g bào. Trong qu á trình trao đ ổ i nitrat, K + c ó chức năn g chủ y ế u là vận chuyển ion NO" qua những khoảng cách dài trong mạch xylem hoặc d ự trữ trong không bào. Sau qu á trình khử nitrat trong lá cây, lượng K + cò n lạ i được sử dụng đ ể tổng hợp các axit hữu cơ trung hoa ion K +. Cá c muố i kali của cá c axit hữu c ơ nh ư kali malat được vận chuyển tới rễ, sau đ ó K + có thể nhận ion nitrat ở t ế b à o r ễ và vận chuyển chún g qua mạch xylem. + Canx i (Ca): Ca là thành phần quan trọng của thành t ế bào và màn g t ế bào. Số lượng l ớ n Ca 2 + gắn trên thành t ế bào đón g vai trò chủ y ế u trong việc củng c ố đ ộ vững chắc cho thàn h t ế bào và đi ều hoa cấu trúc màn g t ế bào. Sự vận chuyển Ca 2 + từ ngoà i qua màn g và o t ế bào chất, trong phloem cũng như từ t ế bào này sang t ế bào khá c là rất hạn chế. lon Ca 2 + tự do có mặt trong t ế bào ở nồng đ ộ rất thấp, khoảng l|i M c ó tác dụng ngă n chặn sự kế t tủa p vô cơ. Do hàm lượng lon Ca 2 + trong t ế b à o thấp nê n khôn g c ó sự cạnh tranh với lon Mg 2 +về vị trí gắn cation và tránh làm bất hoạt enzym. lo n Ca 2 + chỉ c ó thể di chuyển qua màn g t ế bào theo một chiều (Ca 2 + chỉ ra ngoà i t ế b à o được nhưn g khôn g vào được), do đ ó đ ảm bảo được nồng đ ộ ion Ca 2 + nộ i bà o thấp. Đặc biệ t trong cá c t ế bào lá, có một lượng lớn canxi liên kế t v ớ i các khôn g bào. Canxi cần thiết cho sự thiết lập cân bằng lon nhờ trung hoa các anion hữu cơ và vô cơ. Hầ u như canxi ở dạng liên k ế t tạo muố i ocxalat. Mặ c dù hợp chất này kh ó tan nhưng n ó c ó vai trò duy trì nồng đ ộ lon Ca 2 + thấp trong lục lạp và t ế bào chất. Muố i canxiocxalat cò n c ó chức năn g đi ề u chỉnh sự thẩm thấu của t ế bào. Canxi có vai trò quan trọng trong qu á trình nhâ n lên của t ế b à o và rễ. Ngoà i ra sự phát tri ển của ống phấn cũng phụ thuộc vào canxi, đâ y là qu á trình được định hướng nhờ canxi ngoại bào. IA A tham gia vào quá trình vận chuyển canxi. Chất ức c h ế auxin như TIB A cũng ức c h ế sự phân phối Ca 2 + trong thực vật làm xuất hiệ n sự thiếu hụt canxi. Vai trò của Ca đối với thành tế bào: Pectin là thành phần quan trọng của màn g liên kết giữa các b ế bào với nhau và được phân huy nhờ enzym polygalacturonase. Tuy nhiên, Ca ức c h ế mạnh hoạt động của polygalacturonase. Hoạ t động mạnh của enzym này được ghi nhận kh i thiếu Ca. N ế u nồng đ ộ Ca có đủ thì hầu hết cá c pectin sẽ tồ n tạ i d ưới dạng muố i canxipectat. Nh ờ vậy, thành t ế bào có kh ả năn g chống chịu tốt đ ố i v ớ i hoạt động phá huy của enzym polygalacturonase. Sự có mặt của lon Ca 2 +cũng có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự xâm nhi ễm n ấm. 44 lon Ca 2 + có tác động lớn đế n sự ổn định của màn g t ế bào. Sự thiếu lon Ca 2 +sẽ làm tăng kh ả năng thoát ra ngoài màn g t ế bào của các hợp chất phân tử lượng nhỏ. Màn g t ế bào c ó thể sẽ bị phân huy hoàn toàn kh i thiếu hụt nghiêm trọng lon Ca 2 +. lon Ca 2 + có khả năng làm ổn định màn g t ế bào thông qua sự tương tác với các nhóm phosphat, cacboxil của hợp chất phospholipid và protein có mặt trong màn g t ế bào. ' Các enzym: Khá c với magi ê là nguyê n t ố tham gia và o qu á trình hoạt hoa của rất nhiề u enzym, canxi chỉ c ó tá c động lên mộ t vài enzym như: amilase và ATPase. Canxi chủ y ế u kíc h thích c á c enzym màn g t ế bào , m à hoạt đ ộ n g của những enzym này được quy định nhờ c ấ u trúc màng . Tuy nhiên , lon Ca 2 +cũng c ó tá c dụng kìm h ãm mộ t số enzym của t ế b à o chất. Calmodulin trong t ế b à o c ó kh ả năn g hoạt hoa các enzym như phospholipase bằng các h tạo thàn h phức của Ca 2 + -calmodulin v ớ i enzym. Ngoà i -à, ngư ờ i ta cò n cho rằng calmodulin c ó vai trò trong việ c vậ n chuyển ion Ca 2 + t ớ i khôn g bào . + Magi ê (Mg): M g 2 + là một lon rất linh động có khả năng hình thành phức với các nhóm chức năng khá c nhau. Vai trò của Mg2+ đối với quang hợp: Mg 2 + là nguyê n tử trung tâm trong phân tử chlorophyl của h ệ quang hợp ì và n . Trong phân tử chlorophyl, các photon được hấp thụ tạo ra dòn g đi ệ n tử, từ đ ó tạo ra ATP và NADP H đón g vai trò quan trọng đ ố i v ớ i c ố định C0 2. N ế u M g 2 +có mặt v ớ i nồng đ ộ tố i ưu thì khoảng 10-20% ion Mg 2 + trong lá được cố định ở lục lạp. Nồn g đ ộ cao các ion Mg 2 + và K + là cần thiết để duy trì p H khoảng 6,5 - 7,5 trong lục lạp và t ế b à o chất, trái v ớ i ở khôn g bà o p H chỉ vào khoảng 5 - 6. Trong mộ t chừng mực nà o đó , p H xá c định cấu trúc của protein và enzym nê n n ó ảnh hưởng đ ế n q u á trình sinh tổng hợp protein và chức năn g của lục lạp. Vai trò của Mg2+ đối với hoạt tính của các enzym: Mg 2 + là lon cần thiết cho cấu trúc bậc ba của nhiều phức enzym - cơ chất vì n ó tạo ra dạng cấu trúc khôn g gian phù hợp giữa enzym và cơ chất. Mg 2 + tham gia vào quá trình tổng hợp protein v ớ i nhiều cấp độ khác nhau. Mg 2 + tạo thành cầu nố i giữa các dư ớ i đơn vị của ribosome. Kh i thiếu M g 2 +, các dưới đơn vị sẽ bị tách ra và quá trình tổng hợp protein bị ngừng lại. Sự hoạt động của các enzym như: AR N polymerase tham gia vào qu á trình sinh tổng hợp AR N đòi h ỏ i phải c ó mặt Mg 2 +, do đ ó thiếu M g 2 +sẽ k ìm h ãm sinh tổng hợp ARN . ở lá cây, 25% protein tổng số nằm trong lục lạp, nếu thiếu M g 2 +thì ngay lập tức cấu trúc và chức năng của lục lạp bị ảnh hưởng. M g 2 + còn quan trọng trong hoạt động của enzym ribulose biphosphat cacboxilase. Đ â y là một enzym phụ thuộc nhiều vào pH và M g 2 +. Liên kế t của Mg 2 + v ớ i enzym làm tăng ái lực với cơ chất C0 2 và Vmax. Vai trò của Mg2+ đối với chuyển hoa năng lượng: M g là một chất khôn g thể thiếu trong quá trình chuyển hoấ năng lượng của thực vật do vai trò quan trọng của n ó đ ố i với sinh tổng hợp ATP (ADP + p vô cơ = ATP), đặc biệ t là ở lục lạp. Trong qu á trình này, M g 2 + tạo thàn h cầu nố i giữa enzym và ADP. Ngoà i ra, Mg 2 + còn c ó kh ả năn g tạo phức 45 v ớ i ATP. Enzym ATPase vậ n chuyển cá c nhó m phosphoryl cao năng , cung cấp cho protein hoặc đường. M ặ c d ù Mg 2 + c ó nhiều chức năn g nh ư vậ y nhưn g hầu nh ư n ó lạ i t ồ n tạ i ở dạng d ự trữ trong khôn g bào. Tạ i đây, n ó đón g vai trò nh ư mộ t ion trung hoa v ớ i các anion hữu cơ và vô c ơ trong việc cân bằng ion. á c nguyê n t ố v i lượng (Fe, B, Cl, Co, Cu, Mn , Mo , Zn...) + Sá t (Fe): Trong cây, sắt chủ y ế u được gắn với các phức chất. Hà m lượng Fe 2 +, Fe 3 + tự do rất thấp (lo- 1 0 raM). Hầ u hết thực vật chỉ hấp thu Fe 2 +. Do đó , Fe 3 + cần được kh ử thàn h Fe 2 + ở bề mặt rễ trước kh i n ó được chuyển vào trong t ế b à o chất (chỉ mộ t số loạ i cỏ là h ấ p thu sắt chủ y ế u dư ớ i dạng Fe 3 + ). Trong kh i vận chuyển đi xa, qua mạch xylem của cây, sắt chủ y ế u được d i chuyển d ưới dạng hợp chất sắt-cacbonhydrate (ở dạng Fe 3 + -citrate hay dạng phức hợp sắt peptid). Chức năng chính của sắt trọng thực vật là tạo cá c liên k ế t sắt. Cá c chức năng cơ bản nhữ một hệ thống ox i hoa kh ử thuận nghịch được bi ể u di ễ n trong phản ứng dư ớ i đây: Fe(H) <-> Fe(m) + e Các hemoprotein (các protein chứa sắt): Cá c hemoprotein được biế t đ ế n nhiều nhất là các cytochrome, có chứa một phức hệ sắt-porphyrin. Cá c cytocrome tạo thàn h mộ t phần hệ thống ox i hoa trong chuỗi truyền đi ện tử ở lục lạp và ty th ể của t ế b à o thực vật. Chức nâng của các cytocrome như chất trung gian cho đi ệ n tử, cần cho qu á trình k hử nitrat thành nitrit nhờ enzym nitrat reductase trong qu á trình đồng hoa nitơ. Trong quá trình cố định nitơ ở cây h ọ đậu, cá c cytocrome là trung gian trong chu ỗ i truyền'đi ện tử qua đ ó các đi ện tử được truyền đi để cuối cùn g kh ử N 2 thàn h NH 3. Các catalase và peroxidase tham gia vào qu á trình quang h ô hấp, thúy phâ n đường và kh ử độc của hydrrogen peroxid, theo cân bằng sau: 2H202 -» catalase -> 2H20 + 02 Hydrogen peroxit được tạo ra trong qu á trình kh ử superoxit nhằm trung hoa cá c gốc superoxit. Hydrogen peroxit, đ ế n lượt n ó lạ i được trung hoa nhờ enzym catalase. Cá c peroxidase có rất nhiều trong t ế bào thực vật. Thàn h t ế b à o gắn peroxidase xú c tác cho qu á trình trùng hợp của phenol v ớ i lignin. Rễ chứa lượng l ớ n peroxit và c ó vai trò hấp thu sắt của cây. Lượng phenol dư thừa kh i thiếu sắt sẽ được tiế t ra ngoài. Các protein sắt-lưu huỳnh: Nhó m protein chứa sắt thứ hai là cá c protein sắt-lưu huỳnh. Sắt được gắn trong nhóm thiol (-SH) của cystein. Ferridoxin là protein chứa sắt lưu huỳnh phổ biến nhất và là chất mang trong các phản ứng truyền đi ệ n tử được xú c tác bởi nitrit reductase, sulphat reductase, quá trình tổng hợp NADP* trong quang hợp và k hử nitơ được thực hiện nhờ phức hệ nitrogenase. Ba loạ i protein sắt - lưu huỳnh khá c 46 nhau, hoạt động liên tiếp nhau, đều nằm trong chuỗi truyền đi ệ n tử của phức h ệ nitrogenase. Bên cạnh hai nhóm này, thực vật còn có những enzym khá c cổ chứa sắt. Nguyê n t ố này cần cho các phản ứng oxi hoa kh ử và sự định vị của cá c phức hợp enzym - cơ chất. Sắt rất quan trọng trong sinh tổng hợp chlorophyl: Trong lá xanh 80% sắt nằm trong lục lạp. Kh i thiếu sắt, toàn bộ sắt sẽ tập trung ở lá. Trong lá non, thiếu sắt sẽ d ẫ n đ ế n sự giảm nhanh nồng đ ộ chlorophyl do quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại. Số lượng ribosom cũng giảm mạnh. Thiếu sắt ở rễ ké o theo những thay đ ổ i hình thái. Sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng lông rễ tăng. + Bo (B): Bo được hấp thu bởi rễ và được chuyển tới các bộ phận của cây nhờ các xylem. ở các màn g t ế bào, Bo c ó mặt chủ y ế u ở dạng liên kế t este. Khôn g có bất cứ một enzym đã biết nào có chứa hoặc được hoạt hoa bởi Bo. Có những chỉ d ẫ n cho biết Bo có mặt ở trên hoặc bên trong cá c màng , c ó thể ảnh hưởng tới hoạt động của cá c enzym liên kế t màng . Cá c chức năng chủ yế u của Bo là ở ngoại bào, được phát sinh trong quá trình hoa g ỗ của thành t ế bào và sự phân hoa xylem. Thành tế bào: Những liên kế t este đường - Bo là mộ t phần cấu trúc của các hemicellulose trong thành t ế bào. Hầ u hết Bo trong thực vật tồn tạ i ở dạng este trong thành t ế bào của cây. Yê u cầu về Bo đ ố i với cây hai lá mầm cao hơn so v ớ i cây một lá mầm. Có thể gi ả định rằng Bo, cũng giống như canxi, có chức năng đi ều hoa quá trình tổng hợp thành t ế bào cũng như ổn định các thành phần cựa thành và màn g t ế bào. Sự thiếu hụt Bo ngay lập tức ức c h ế q u á trình phát tri ển chiều dà i của các rễ sơ cấp và thứ cấp. Hơn thế, Bo g ó p phần đi ều hoa q u á trình trao đ ổ i phenol và tổng hợp lignin. + Đồ n g (Cu): Đồng là một cation hoa trị 2 và được hấp thu vào cây dư ớ i dạng Cu 2 + hay dưới dạng phức chất của nó. N ế u nồng đ ộ Cu 2 + và phức đồng tương đương nhau, cây dường như ưa ion đồng tự do hơn. Trong xylem và phloem, đồng hầu như tồn tạ i dưới dạng phức và chủ yế u là dạng một phức amino axit-đồng. Trong t ế bào, đồng chủ yế u là thành phần của phức h ệ enzym và rất quan trọng trong các phản ứng oxi hoa khử [(Cu2 + )/(Cu +)] được thực hiện nhờ những enzym này. Thiếu đồng lập tức d ẫ n đ ến sự giảm hoạt đ ộ của các enzym chứa đồng. Vai trò của đồng đối với quang hợp: Khoảng 50% đồng trong lục lạp được gắn với plastocyanin, ở giữa chuỗi truyền đi ện tử, giữa quang hệ ì và quang hệ li , có chứa Ì nguyê n tử đồng trên Ì phân tử. Trong trường hợp thiếu đồng, nồng đ ộ các plastocyanin sẽ bị giảm. Cũng giống như plastocyanin, các plastoquinone đón g vai trò quan trọng trong truyền đi ệ n tử giữa quang hệ ì và quang hệ li . Kh i đồng bị thiếu, màn g lục lạp sẽ 47 thiếu 2 protein đi ều hoa chuyển động của các plastoquinone. Đ ể tổng hợp các plastoquinone cần phải có enzym laccase, đây là một enzym chứa đồng và hoạt động của n ó sẽ bị giảm ngay kh i thiếu đồng. Do đó, hiện tượng thiếu đồng nhanh chón g ké o theo hiện tượng giảm quang hợp. Enzym super oxide dismutase: Đồng cùng với k ẽm là mộ t phần của enzym super oxide dismutase (Cu-Zn.SOD), đón g vai trò quan trọng trong qu á trình trung hoa gốc anion superoxide 0 " hoạt tính mạnh được tạo thành trong qu á trình quang h ô hấp. Bên cạnh Cu-Zn.SOD, một SOD chứa mangan cũng có trong t ế bào. SOD hoa giả i độc của gốc 0~ hoạt động thành H 2 0 2 và Oz, nhờ đ ó bảo v ệ t ế b à o trước kh ả năng phá huy của gốc này. SOD cùng với catalase phản ứng như sau: 02 + ẽ-> O2 (superoxide) O2 + O2 + 2H+ -> SOD -> H202 2H202 -> catalase -> 2H20 + 02 Superoxide được giả i độc nhờ SOD và ngay sau đ ó giả i phón g H 2 0 2 thàn h ox i và nước nhờ catalase. Cá c enzym SOD chứa đồng - k ẽ m chủ y ế u được tìm th ấ y ở chất n ề n stroma của lục lạp. Trong lá non, 90% SOD tập trung ở lục lạ p và chỉ c ó 4-5% ở ty th ể . Thiế u đồng sẽ xả y ra những thay đ ổ i trong c ấ u trúc lục lạp , đi ề u n à y th ể hiệ n r õ chức năn g bảo vệ của đ ồng . Đồng cũng đón g vai trò quan trọng trong chuỗi truyền đi ệ n tử của ty thể như cytochrome oxidase c ó chứa 2 nguyên tử đồng và 2 nguyê n tử sắt. + Manga n (Mn) : Mangan tồn tạ i trong thực vật ở dạng ion Mn 2 + khôn g liên kết, hoa trị hai và ở dạng này nó được chuyển từ rễ qua mạch xylem đ ế n các phần khá c của cây. Nguyê n tố này liên kế t chặt với một số loạ i protein chứa ki m loạ i (metalloprotein), hoặc như một thành phần cấu trúc của enzym hoặc như mộ t phần trong hệ ox i hoa kh ử [Mn(II)/Mn(III)]. Phản ứng HUI: Mangan có hai chức năng quan trọng trong thực vật. lo n nà y liên quan đến phản ứng ban đ ầ u được gọ i là phản ứng Hi n của quang h ệ n , trong đ ó nước được phân ly thành oxi và các photon, theo phương trình sau: 2H20 -» 02 + 4H+ + 4e Có gi ả thiết cho rằng 4 phân tử mangan là thành phần của mộ t protein, xú c tác cho quá trình quang phân ly nước. Các electron được giả i phón g ra tiếp tục chuyển tới magi ê chứa trong phức hệ 680, trung tâm của quang hệ li . 48 Enzym super oxide dismutase: Cho đ ế n nay mớ i chỉ c ó mộ t vài loạ i enzym chứa mangan được phân lập. Enzym có chứa mangan quan trọng nhất là Mn-SOD (xem phần về đon g để biết thêm thông tin về SOD). Cũng giống như đồng, nếu thiếu mangan, sẽ xảy ra các thay đ ổ i trong cấu trúc của lục lạp, thể hiện rõ nhất ở hệ thống bảo vệ của mangan. + Coban (Co): Coban đón g vai trò quan trọng trong quá trình c ố định nitơ ở rễ cây h ọ đ ậ u . Coban là thành phần cần thiết của enzym cobalamin. Co (IU) là thành phần ki m loạ i định vị giữa 4 nguyên tử nitơ trong cấu trúc porphyrin. Ba hệ thống enzym của v i khuẩn Rhizobium được biết tới có chứa Co. Người ta thấy rằng có mố i liên hệ giữa nồng đ ộ Co với sự c ố đinh nitrogen và sự phát triển rễ củ. Co có vai trò trong quá trình tổng hợp methyonine ở vi khuẩn, tổng hợp ribonucleotid và enzym methymalonyl-coenzym A - mutase, một enzym cần thiết cho sự tổng hợp leghemoglobin. Khôn g ai biết chắc rằng liệ u Co có giữ vai trò gì ở thực vật bậc cao hay không . Chỉ có một enzym phụ thuộc cobalamin đã được biế t tới là leucine -2,3-aminomutase ở khoai tây. Đ ố i v ớ i thực vật bậc thấp, Co là y ế u t ố cần thiết và c ó mặ t trong mộ t số cấu trúc dưới t ế bào và thylakoid ở lục lạp. + Molybde n (Mo): Molybden chủ y ế u tồn tạ i ở dạng M0O4" , một dung dịch giống như nước. Trong môi trường axit yếu , lon molybden tuy thuộc vào đ ộ axit có thể nhận Ì hoặc 2 proton theo phương trình sau: MoO*- -» HMoO; -> H2M0O4 Molybden có khả nâng chuyển vận qua mạch xylem và phloem như lon Mo04~. Nitrogenase: Một số enzym sử dụng Mo như một co-factor. Hai loại enzym có molybden được m ô tả nhiều nhất là nitrogenase và nitrate reductase. Nitrogenase liên quan đ ế n quá trình c ố định nitơ trong nốt sần ở rễ cây h ọ đậu nhờ vi khuẩn Rhizobium: N2 + 8H+ + 8e~ -> 2NH3 + H2 Molybden liên quan trực tiếp đ ế n quá trình khử N 2. Phâ n tử nitơ được gắn v ớ i nguyên tử molybden trong phức hệ nitrogenase. M ỗ i phân tử nitơ gắn v ớ i hai nguyê n tử molybden mà chính chún g lạ i là một phần của phân tử protein sắt - molybden. Sau quá trình hoạt hoa phức hệ enzym nitrogenase sử dụng ATP, phức h ệ sắt - molybden thay đ ổ i cấu trúc của nó . Dựa trên sự thay đ ổ i hợp lý này, quá trình kh ử N 2 x ẩ y ra. Nitrate reductase: Nitrate reductase kh ử nitrat thành nitrit trong qu á trình đồng hoa nitơ ở t ế bào thực vật. Nitrate reductase chứa Ì phân tử heme-sắt và 2 nguyê n tử molybden. Enzym này xúc tác cho quá trình khử nitrat thành nitrit. Sự hoạt động của 49 nitrat reductase bị giảm mạnh kh i thiếu molybden nhưng c ó th ể khô i phục nhanh chón g ngay kh i thêm molybden vào mô i trường. + Kẽm (Zn): K ẽ m được hệ r ễ hấp thu dư ớ i dạng Zn 2 +. Trong mạch xylem n ó được chuyển vận d ư ớ i dạng ion Zn 2 + hoặc muố i k ẽ m của một axit hữu cơ. Nguyê n t ố nà y là mộ t hợp phâ n k i m loạ i của mộ t số enzym. N ó có thể là một coíactor cấu trúc cũng nh ư cofactor đi ề u hoa của phức hệ enzym. Các enzym: Thực vật có một số loạ i enzym chứa kẽm , bao gồm cả enzym dehydrogen hoa rượu trong vùng m ô phâ n sinh của cây. Trong phức hệ enzym SOD, Zn liên kế t với Cu thay cho nguyê n tử nitơ từ histidine (xem thêm về SOD trong phần đồng). Enzym cacbon anhydrase c ố định C0 2, theo cân bằng sau: C02 + H20 <-> Heo; + H+ Phản ứng này giúp thực vật có thể dự trữ C02 dưới dạng HCO3 một cách thuận nghịch. Sau kh i chuyển thành C0 2, HCO3 có thể sử dụng làm c ơ chất cho enzym ribulose biphosphate cacboxilase. Enzym này có 6 ti ể u phần dư ớ i đơ n vị, m ỗ i ti ể u phần có Ì nguyê n tử k ẽm gắn vào và có thể tìm thấy trong lục lạp và t ế b à o chất. Tổng hợp protein: K ẽ m rất quan trọng trong quá trình tổng hợp protein. Thiế u k ẽ m gây ảnh hưởng lớn đ ế n quá trình tổng hợp protein. Sự tập trung ribosom và sự tích l ũ y các tiền chất của protein như các amino axit và cá c amin cũng nh ư hoạt động của AR N polymerase có thể xảy ra nhờ kẽm. Dư ớ i đi ều kiệ n thông thường, AR N polymerase chứa 2 nguyê n tử Zn , tạo ra cấu trúc đi ể n hình của enzym. Hơ n nữa, c ó mộ t mố i quan h ệ nghịch tương ứng giữa nồng đ ộ Zn và hoạt động của ARNse . Nồn g đ ộ Z n thấp sẽ làm tăng hoạt động của ARNse. Tổng hợp IAA: Thiếu k ẽ m cũng phá hỏng qu á trình tổng hợp indol acetic axit trong cây (Indol —> Trytophan -> Indol Acetic Acid). K ẽ m đón g vai trò quan trọng trong tổng hợp tryptophan, mộ t tiề n chất của IAA . V í dụ, thiếu k ẽm trong ng ô có thể thay t h ế bằng các h bổ sung tryptophan. + Chlo r (Cl): Chlor có ở thực vật dao động từ 70 - 700 m M trong Ì k g trọng lượng kh ô (2000 -r 20000 mg/kg trọng lượng khô). Chlor được hấp thu dư ớ i dạng c r và rất c ơ động trong cây. Chức năng chính của ion này là đi ều hoa th ẩm thấu và bổ sung cá c chất mang. Trong lục lạp có chứa hàm lượng chlor lớn. Ngư ờ i ta cho rằng chlor đón g vai trò hết sức quan trọng trong quang hợp. Cá c lục lạp của rau châ n vịt và củ cả i đườn g chứa chlor ở nồng đ ộ x ấ p xỉ lOOmM nhưn g trong lá, chỉ c ó dư ớ i lOmM , cho thấy ưu t h ế r õ ràn g của chlor tập hợp trong lục lạp. 50 Năng lực thẩm thấu: lon Cl đi ều hoa sự đóng , m ở kh í khổng. Tình trạng thiếu chlor làm khí khổng m ở mãi, có thể gây tình trạng mấ t nước nghiêm trọng. Chlor rất quan trọng trong đi ều hoa năng lực th ẩm thấu của cá c khôn g bào và với các qu á trình liên quan đế n sức trương. Sự trao đổi nitơ: Chlor hoạt hoa enzym tổng hợp asparagin, một enzym quan trọng trong qu á trình trao đ ổ i nitơ. Enzym này chuyển hoa glutamin thành asparagin và axit glutamic. Trong đi ều kiệ n có cr , tốc đ ộ của phản ứng tăng lên gấp 7 l ầ n . Bở i thế, chlor đã thực hiện một chức năng quan trọng trong quá trình trao đ ổ i nitơ ở các loài thực vật sử dụng asparagin như chất mang. 2.5.2.2. Các vitamin Tất cả các t ế bào được nuôi cấy đ ề u có kh ả năn g tổng hợp tất cả cá c loạ i vitamin cơ bản nhưng thường là v ớ i số lượng dưới mức yêu cầu. Đ ể m ô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung vào mô i trường một hay nhiều loạ i vitamin. Cá c vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoa. Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HC1 (BI), pyridoxine HC1 (Bó), nicotinic axit, trong đ ó vitamin B I là khôn g thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết những mô i trường nuôi cấy m ô và t ế bào thực vật. Linsmaier và Skoog đã khẳng định vitamin B I là cần thiết cho sự sinh trưởng của cây sau kh i nghiên cứu k ỹ lưỡng về sự có mặt của n ó trong mô i trường MS.'Cá c tác gi ả khá c cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của B I trong nuôi cấy mô . Inositol thường được nói đế n như là một vitamin kích thích một cách tích cực đ ố i với sự sinh trưởng và phá t tri ển của thực vật, mặc dù n ó khôn g phải là vitamin cần thiết trong mọ i trường hợp. Cá c vitamin khác , đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin B5) và biotin cũng được sử dụng đ ể nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy. Anh hưởng của các vitamin lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khá c nhau hoặc thậm chí còn có hạ i (gây độc). 2.5.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô Nước dừa Công b ố đ ầ u tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy m ô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941, 1942). Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô , t ế bào thực vật đã được nhiều tác gi ả ghi nhận. Nước dừa đã được xá c định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoán g và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chổi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường được l ấ y từ quả của các giống và cây chọn lọc để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được mộ t số côn g ty hoa chất bán dư ớ i dạng đón g chai sau c h ế biến và bảo quản. Thôn g thường nước dừa được xử lý để loạ i trừ các protein, sau đ ó được lọc qua màn g lọc đ ể kh ử trùng trước kh i bảo quản 51 lạnh. Tồ n d ư protein trong nước dừa khôn g gây ảnh hưởng đ ế n sinh truồng của m ô hoặc t ế bào nuôi cấy, nhưn g c ó thể d ẫ n tớ i kế t tủa dung dịch kh i bảo quản lạnh. Chất cặn co thể được lọc bỏ hoặc đ ể lắng dư ớ i đá y bình rồ i gạn bỏ phần cặn. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng đ ộ từ 5 - 20%. Bột chuối Bột chuối kh ô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuô i cấy m ô một số cây trồng như phong lan. Hà m lượng sử dụng vào khoảng 40g bột khô/1. Đ ê tranh đón g cục, cầu bổ sung bột vào dung dịch một cách từ từ rồ i khu ấ y đ ề u . Nước chiế t từ khoảng 100 g thịt quả chuối xanh cũng được sử dụng bổ sung và o mộ t lít mô i trường. Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp khác Nước cốt c à chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết n ấm men (yeast extract), casein thúy phân (casein hydrolysate) cũng được sử dụng đ ê làm tăng sự phát tri ể n của m ô sẹo hay c ơ quan nuô i cấy. Agar Đ ố i với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng mô i trường lỏng, m ô c ó th ể bị chìm và sẽ chết vì thiếu ôxy. Đ ể tránh tình trạng này, mô i trường nuô i cấy được làm đặc lạ i bằng agar - một loạ i tinh bột được c h ế từ rong bi ển và m ô được cấy trên bề mặ t của mô i trường. Agar thường được sử dụng ở nồng đ ộ 0,6 đ ế n 1%. 2.5.2.4. Nguồn cacbon (C) Đường sucrose (saccharose) là nguồn cacbon chủ y ế u và được sử dụng thường xuyê n trong hầu hết các mô i trường nuôi cấy mô , k ể cả kh i m ẫ u nuô i cấy là cá c chồi xanh có khả năng quang hợp. Kh i kh ử trùng, đường sucrose bị thú y phâ n mộ t phần, thuận lợ i hơn cho cây hấp thụ. Trong mộ t số trường hợp, ví d ụ nuô i cấy m ô câ y mộ t lá mầm, đường glucose tỏ ra tốt hơn so v ớ i sucrose. M ô thực vật c ó kh ả năn g hấp thu một số đường khá c như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm ch í tinh bột, nhưn g cá c loạ i đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuô i cấy t ế bào và m ô thực vật. 2.5.2.5. Các chất điêu hoa sinh trưởng Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho m ô nuôi cấy, việc bổ sung mộ t hoặc nhiều chất đi ều hoa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết đ ể kích thích sự sinh trưởng, phá t tri ển và phân hoa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho m ô và các tổ chức. Tuy vậy, yêu cầu đ ố i với những chất này thay đ ổ i tuy theo loài thực vật, loạ i mô , hàm lượng chất đi ều hoa sinh trưởng nộ i sinh của chúng . Cá c chất đi ề u hoa sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây: Nhóm các auxin (Bảng 2.5) Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùn g trong nuô i cấy m ô và t ế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của m ô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,... 52 Cá c auxin liên quan tới đ ộ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ... Đ ố i v ớ i nuôi cấy mô , auxin đã được sử dụng cho việc phân chia t ế bào và phâ n hó a rễ. Những auxin dùn g rộng rãi trong nuôi cấy m ô là IBA (3-indolebutiric axit), IA A (3-indole acetic axit), NA A (napthaleneacetic axit), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxiacetic axit) và 2,4,5-T (trichlorophenoxiacetic axit). Trong số các auxin, IB A và NA A chủ y ế u sử dụng cho m ô i trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho mô i trường ra ch ổ i. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đ ố i v ớ i mô i trường tạo và phá t tri ển callus. Auxi n thường hò a tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng. Va i trò của cá c chất thuộc nhóm auxin được khá i quá t dư ớ i đây: - Kích thích phân chia và ké o dài t ế bào. - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức c h ế sinh trưởng của chồi bên. Ư u t h ế chồi đỉnh làm ức c h ế sinh trưởng của chổi nách. N ế u ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ d ẫ n đ ế n sự phát chồi nách. N ế u thay t h ế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa I A A thì chồi nách v ẫ n bị ức c h ế sinh trưởng. Cơ c h ế ức c h ế của chồi đỉnh liên quan đến một chất đi ều hoa sinh trưởng khá c khá c là ethylene. Auxi n (IAA ) kích thích chổi bên sản sinh ra ethylen làm ức c h ế sinh trưởng của chồi đỉnh. - IA A đóng vai trò kích thích sự phân hoa của các m ô d ẫ n (xylem và phloem). - Auxi n kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô . - Auxi n có các ảnh hưởng khá c nhau đ ố i v ớ i sự rụng lá, quả, sự đ ậ u quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mố i quan hệ với đi ều kiệ n mô i trường. - Tạo và nhân nhanh m ô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng đ ộ thấp). - Tạo phôi soma (2,4-D). Nhóm các cytokinin (Bảng 2.6) Cytokinin liên quan tới sự phân chia t ế bào, phân hóa chồi... Trong mô i trường nuôi cấy mô , cytokinin cần cho sự phân chia t ế bào và phân hóa chồi từ m ô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thường được dùng là: tenyladenine; kinetin (6-furfurolaminopurine); BA (6-benzylaminopurine); 2-ip (isopentenul-adenine). Cytokinin hoa tan trong dung dịch H a pha loãng. Chức năng chủ y ế u của các cytokinin được khá i quá t như sau: - Kích thích phân chia t ế bào. - Tạo và nhâ n callus. - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô . - Kích thích phá t sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu t h ế của chổi đỉnh. - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của t ế bào. - Có thể làm tăng sự m ở của khí khổng ở một số loài. - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao). - ứ c c h ế sự hình thành rễ. - ứ c c h ế sự ké o dài chồi. - ứ c c h ế quá trình già (hoa vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. 53 Gibbereỉlin (Bảng 2.7) Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA 3 là chất được sử dụng nhiều hem cả trong thực ti ễ n . GA 3 kích thích ké o dài chồi và nảy m ầ m của phô i v ô tính. So VỚI auxin và cytokinin, gibberellin hiếm k h i được dùng . GA 3 c ó tính hoa tan trong nước. Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: - Các m ô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, cá c phôi non, t ế b à o đ ầ u r ễ , qu ả non, hạt chưa chín hoặc đan g nảy mầm đ ề u c ó chứa nhiều gibberellic axit. - Kích thích k é o dài chồi đ o tăng cường phân bào và ké o dà i t ế bào, ví d ụ ké o dà i thân và đ ò n g lúa sau khi phun GA 3, ké o dài đ ố t thân. Cá c cây lùn thường bị thiếu gibberellin. - Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch. - Ki ể m soát sự ra hoa của các cây 2 năm tu ổ i. Nă m đ ầ u thân m ầ m n ằm im, sau mù a đôn g mầm hoa ké o dài đốt rất nhanh và phâ n hoa hoa. - ứ c c h ế sự hình thành rễ bất đinh. - Kích thích sinh tổng hợp của a-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm, giú p tiêu hoa các chất dự trữ trong nộ i nhũ để nuôi m ầ m cây. - Các chất ức c h ế tổng hợp kích thích qu á trình tạo củ (thân củ, thân hàn h và củ). - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn. - Có thể gây tạo quả khôn g hạt hoặc làm tâng kích thước quả nho khôn g hạt. - Có thể làm chậm sự hoa già ở lá và quả cây có múi. Abscisic axit (ABA) (Bảng 2.8) Trong nuôi cấy m ô và t ế bào, A B A có tác dụng tạo phôi v ô tính, kích thích sự chúi của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật. Cá c tác dụng c ơ bản của A B A là: - Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ỏ hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả. - AB A thường được sản sinh kh i c ó các y ế u t ố ức c h ế cây trồng nh ư mấ t nước và nhiệt đ ộ thấp đón g bâng. - Tham gia vào sự ngủ nghỉ, ké o dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt. - ứ c c h ế sự ké o dài thân và được sử dụng để ki ể m soát sự ké o dà i thân cành . Gâ y ra sự đón g khí khổng. Ethylene Các chức năng cơ bản của ethylene: - Gâ y già hoa lá, kích thích sự rụng lá và quả. - Làm chín quả. - Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường kh i quả đang chửi, cây đan g bị úng , lão hoa, tổn thương cơ giới và bị nhi ễm bệnh. - Đi ề u khi ể n sự chín của một số loạ i quả. 54 - Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lạ i được kích thích bởi ethylene. - Kíc h thích nở hoa, kích thích sự lão hoa của hoa và lá. Cá c bảng dư ớ i đây m ô tả các đặc tính cơ bản của cá c nhóm chất đi ều hoa sinh trưởng, các h chuẩn bị hoa chất và bảo quản của chún g (tham khảo Sigma - Aldrich: http://www.sigmaaldrich.com/Area of Interest/Life Science/ Plant Biotechnology/Tissue Culture Protocols/Growth Regulators.html Bảng 2.5 Các chất thuộc nhóm Auxin Phân tử lượng và tương đương Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng Tên các chất Tên các chất Phân tử lượng Số ụM = ímg/l Dung môi Pha loãng Bảo quản khô Bảo quản lỏng Khử trùng Nồng độ sử dung (mg/l) p-Chlorophenoxiacetic acid (4-CPA) 186,6 5,36 EtOH - Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0 2,4-Dichlorophenoxi-acetic acid 221 4,53 - - Rĩ 2-8°C CA 0,01-6,0 2,4-Dichlorophenoxi-acetic acid Sodium salt 243 4,12 Nước - Rĩ 2-8°C CA 0,01-6,0 lndole-3-acetic acid Free acid (IAA) 175,2 5,71 EtOH/1 N NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-3,0 lndole-3-acetic acid Sodium salt 197,2 5,07 Nước Nước 2-8°C -0°c CA/F 0,01-3,0 lndole-3-acetic acid methyl ester 189,2 5,29 - - 2-8°C 2-8°C - - lndole-3-acetyl-L-aspartic acid 290,3 3,45 0.5N NaOH lndole-3-butyric acid (IBA) 203,2 4,90 EtOH/1 N NaOH Nước -0°c -0°c F 0,01-5,0 Nước 2-8°C -0°c CA/F 0,1-10,0 lndole-3-butyric acid Potassium salt (K-IBA) Alpha-Naphthalene-acetic acid Free acid (NAA) Beta-Naphthoxi-acetic acid Free acid (NOA) 241,3 4,14 Nước - 2-8°C -0°c CA/F 0,1-10,0 186,2 5,37 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0 202,2 4,95 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA 0,1-10,0 Phenylacetic acid (PAA) 136,2 7,34 EtOH - Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-50,0 Picloram 241,5 4,14 DMSO - Rĩ 2-8°C CA 0,01-10,0 2,4,5-Trichlorophenoxi acetic acid (2,4,5-T) 2,3,5-Triiodobenzoic acid Free acid (TIBA) 255,5 3,91 EtOH - Rĩ 2-8°C CA 0,01-5,0 499,8 2,00 IN NaOH Nước -0°c -0°c F 0,05-5,0 Ký hiệu: CA :Khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường.F : Khử trùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử ữùng bằng lọc qua phin lọc. 55 Bảng 2.6. Các chứ thuộc nhóm cytokinin Phân tử lượng và tương đương Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng Tên hóa chất Tên hóa chất Phân tử lượng Số ụM = img/l Dung môi Pha loãng Bảo quản Bảo quản lỏng Khử trùng Nồng độ sử dung (mg/l) Adenine Free bazơ 135,1 7,40 1.0 HCI Nước Rĩ 2-8°C CA 50-250 Adenine hemisulíate Hemisulíate salt 184,2 5,43 Nước - Rĩ 2-8°C CA 50-250 6-Benzylaminopurine (BA) 225,3 4,44 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0 6-Benzylaminopurine Hydrochloride 261,7 3,82 Nước - Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0 6-Benzylaminopurine (BA hoặc BAP) 225,3 4,44 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C CA/F 0,1-5,0 N-Benzyl-9-(2- tetrahydropyranyl)adenine (BPA)309,4 3,23 EtOH - -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0 N-(2-Chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea (4-CPPU) 247,7 4,04 DMSO - 2-8°C 2-8°C F 0,001-1,0 6-(gamma,gamma Dimethylallylamino) purine (2iF^203,2 4,92 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 1,0-30,0 6-(Y, Y-Dimethylallylamino) purine (2ỈP) 203,2 4,92 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 1,0-30,0 1,3-Diphenylurea (DPU) 212,3 4,71 DMSO - RT 2-8°C F 0,1-1,0 Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0 Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0 Kinetin 215,2 4,65 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0 Kinetin Hydrochloride 251,7 3,97 Nước - -0°c -0°c CA/F 0,1-5,0 1-Phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea 220,2 4,54 DMSO - Rĩ 2-8°C CA/F 0,001-0,05 Trans-Zeatin Free bazơ 219,2 4,56 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0 Zeatin 219,2 4,56 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0 Trans-Zeatin Hydrochloride 255,7 3,91 Nước - -0°c -0°c CA/F 0,01-5,0 Trans-Zeatin riboside 351,4 2,85 IN NaOH Nước -0°c -0°c F 0,01-5,0 Ký hiệu: CA = coautoclavable (khử trùng cùng với các chất khác trong môi trường). F = íilter sterilize: Khử ưùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác cùa môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc. 56 Bảng 2.7. Nhóm các chá điều hoa sinh trưởng khác Phân tử lượng và tường đương Chuẩn bị dung dịch, bảo quản và sử dụng Tên hóa chất Tên hóa chất Phân tử lượng Số ịiM 1mg/l Dung môi Pha loãng Bảo quản Bảo quản lỏng Khử trùng Nồng độ sử dung (mg/l) C.)-cis,trans-Abscisic acid (ABA) 264,3 3,78 IN NaOH Nước -0°c -0°c CA/F 0,1-10,0 Ancymidol 256,3 3,90 DMSO - 2-8°C -0°c CA/F 1,0-10,0 Chlorocholine chloride (CCC) 158,1 6,33 Nước - Rĩ 2-8°C F úp to 500 3,6-Dichloro-o-anisic acid (Dicamba) 221,0 4,52 EtOH/Nước - 2-8°C 2-8°C F 0,01-10,0 Gibberellic acid (GA3) 346,4 2,89 EtOH - Rĩ 2-8°C CA/F 0,01-5,0 Gibberellic acid Potassium sau (K-GA3) 384,5 2,60 Nước - 2-8°C -0°c CA/F 0,01-5,0 Gibberellin A4 Free acid (GA4) 332,4 3,01 EtOH - -0°c -0°c F 0,01-5,0 (*.)-Jasmonic acid 210,3 4,76 EtOH - 2-8°C -0°c F 0,01-100,0 Phloroglucinol 126,1 7,93 Nước - Rĩ 2-8°C CA/F > 162 N-(Phosphonomethyl)glycine (GÌyphosate) Succinic acid 2,2- dimethylhydrazide 169,1 5,91 IN NaOH Nước Rĩ 2-8°C F - 160,2 6,24 Nước - 2-8°C 2-8°C CA/F 0,1-10,0 Ký hiệu: CA = coautoclavable (Khử ưùng cùng với các chất khác trong môi trường). F = filter sterilize: Khử trùng bằng lọc qua phin lọc. CA/F: Khử trùng cùng với các thành phần khác của môi trường nhưng có khả năng bị mất hoạt tính ít nhiều, có thể bù đắp bằng cách bổ sung hoặc khử trùng bằng lọc qua phin lọc. Bảng 2.8. Giói thiệu vê nhóm chất điều hoa sinh trưởng chính và chức năng chung của mỗi nhóm trong nuôi cấy mô và tê bào ở thực vật A Nhóm auxin Chức năng chung của nhóm 1 lndole-3-acetic acid (IAA) - Phân chia tế bào 2 lndole-3-butyric acid (IBA)- Tạo và nhân callus - Tạo và nhân callus - Tạo và nhân callus - Tạo và nhân callus - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) 3 1-naphthaleneacetic acid (NAA) 4 2,4-dichlorophenoxi-acetic acid (2.4D) - Tạo rễ bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp) - Tao phôi soma (2,4-D) - Tao phôi soma (2,4-D) - Tao phôi soma (2,4-D) - Tao phôi soma (2,4-D) - ức chế chồi nách 5 (2,4,5-T) - ức chế chồi nách - ức chế chồi nách - ức chế chồi nách 6 Picloram 7 Dicamba 8 p-chlorophenoxi-acetic acid (CPA) 9 Phenylacetic acid (PAA) B Nhóm cytokinin Chức năng chung của nhóm 1 Kinetin - Phân chia tế bào 2 6-Bezylamino-purine (BAP) - Tạo và nhân callus 3 Zeatin (Z) 57 B Nhóm cytokinin Chức năng chung của nhóm 4 Zeatinriboside (ZR) - Kích thích bật chổi nách - Kích thích bật chổi nách - Kích thích bật chổi nách - Kích thích bật chổi nách - Kích thích bật chổi nách - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) 5 Isopentenyladenosine (iPA) 6 Isopentenyladenine (iP) 7 Thidiazuron (TDZ) - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự hình thành rễ - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế sự kéo dài chồi - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá 8 N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea (CPPU) - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá - ức chế quá trình già (hoa vàng) ở lá c Nhóm gibberellin Chức năng chung của nhóm 1 Gibberellic acid (GA3) - Kéo dài chổi - Kéo dài chổi - Kéo dài chổi - Kéo dài chổi - Phá ngủ ở hạt giống - Phá ngủ ở hạt giống - Phá ngủ ở hạt giống 2 Gibberllin 1 (GA,) 3 Gibberellin 4 (GA„) - Phá ngủ ở hạt giống - ức chế sự hình thành rễ bất định - ức chế sự hình thành rễ bất định - ức chế sự hình thành rễ bất định - ức chế sự hình thành rễ bất định - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ) 4 Gibberellin 7 (GA7) củ (thân củ, thân hành và củ) củ (thân củ, thân hành và củ) củ (thân củ, thân hành và củ) D Nhóm các chất ĐHST khác Chức năng chung của nhóm 1 Ethylene - Gây già hoa lá - Làm chín quả 2 Abscisic acid - Sự chín của thể phôi - Kích thích sự hình thành thân hành và thân củ - Thúc đẩy sự phát triển của tình trạng ngủ 3 Nhóm polyamine - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự tự hình thành rễ - Kích thích sự hình thành chồi - Kích thích sự hình thành chồi - Kích thích sự hình thành chồi a Putrescin - Kích thích sự hình thành chồi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi b Spermidine - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi - Đẩy mạnh sự phát sinh thể phôi c Spermine 4 Jasmonic acid (Ja) - Kích thích sự hình thành thân củ và thân hành - Kích thích sự hình thành thân củ và thân hành Methy - Đẩy nhanh sự hình thành đỉnh sinh trưỏng. l jasmonate (MeJa) - Đẩy nhanh sự hình thành đỉnh sinh trưỏng. 2.5.3. ứn g d ụ n g của côn g ngh ệ nuô i c ấ y m ô v à t ế b à o 2.5.3.1. Nhân giống sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Nuôi cây đỉnh sinh trưởng nhân giống sạch bệnh Limmasets và Cornuet (1949) đã phát hiện rằng, ở cá c cây nhi ễm bệnh virus, virus phân b ố khôn g đồng nhất trên cây và thường khôn g thấy chún g ở vùn g đỉnh sinh trưởng. Phát hiện đ ó là cơ sở để More l và Martin (1952) chứng min h gi ả thuyết trên bằng các h tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. N ăm 1960, More l đã thực hiện bước ngoặt kh i áp dụng thành côn g k ỹ thuật nà y trong nhân nhanh các loài địa lan Cymbidium thông qua protocorm. Sau đó , việc phá t hiện ra cytokinin và môi trường nuôi cấy mô cải tiến (Murashige và Skoog, 1962) đ ã tạo sức sống mới để ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhâ n giống thương mạ i ở thực vật. K ế t quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc vào vật liệ u kh ở i đ ầ u , nguồn gốc và kích thước của mẫ u . Đ ể đạt được hiệu quả cao, cần l ấ y m ẫ u nuô i cấy từ chồ i đan g sinh trưởng mạnh (Gupta và cs., 1981) hoặc chồi của cây mớ i ghé p (Jones và cs., 1985). Nuô i cấy đỉnh sinh trưởng cây non d ễ dàng hơn cây trưởng thành, t ỷ l ệ ra rễ trong trường hợp 58 này đạt 83%, trong kh i với cây trưởng thành chỉ đạ t 63% (Vieitez và cs, 1985). Đi ề u kiệ n nuôi cấy, thời đi ểm l ấ y mẫ u cũng ảnh hưởng rất l ớ n đ ế n k ế t quả tái sinh cây từ đỉnh sinh trưởng. Mộ t số loài c ó ưu t h ế chồi đỉnh mạnh, nuô i cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi đỉnh d ễ dàn g hơn từ chồi nách, đ ố i với một số loài khá c lạ i thu được k ế t quả ngược lại. Kíc h thước m ẫ u nuôi cấy càng lớn, t ỷ l ệ tái sinh và sống sót của m ẫ u càn g cao, tuy nhiên mầ u càn g nhỏ thì kh ả năng sạch bệnh virus lạ i cao hơn. Do vậy, kích thước mẫ u nuôi cấy cần phải xá c định bằng thực nghiệm đ ố i v ớ i m ỗ i loài. M ẫ u nuô i cấy nhỏ nhất chỉ c ó chó p sinh trưởng và 2 - 3 mầm lá sẽ là lý tưởng đ ể tạo giống sạch bệnh do m ô phân sinh đỉnh nằm ở chó p đỉnh chổi, là trung tâm hoạt động sinh trưởng, phâ n hoa và phát tri ển của thực vật. Ngay dư ớ i m ô phân sinh này là cá c mầm lá. Đô i kh i kích thước mẫ u lớn hơn v ẫ n đ ảm bảo sạch bệnh vừus (Vine và Jones, 1969), song mộ t số trường hợp khá c lạ i đòi h ỏ i m ẫ u nhỏ hơn (Hunter và cs, 1984). Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là kỹ thuật nuôi cấy m ô được ứng dụng rộng rãi nhất trong nông nghiệp và nghề làm vườn với các ưu đi ểm chính sau: - Loạ i trừ bệnh virus và tương tự virus. - Bảo quản quỹ gen i n vitro và trao đ ổ i nguồn gen an toàn giữa cá c quốc gia. - Nhâ n nhanh hàng loạt, đồng nhất với số lượng lớn cây giống từ một cây mẹ ban đầu. 2.5.3.2. Ghép mắt in vitro Ghép chồi đỉnh M ộ t trong các phương phá p quan trọng để tạo cây ăn quả có mú i sạch bệnh là chọn lọc cây con từ phôi vô tính (phôi có nguồn gốc từ t ế b à o phôi tâm). Tuy nhiên, những cây này có chu k ỳ sinh trưởng dài (6-7 năm) trước kh i bước vào giai đoạn sinh sản. Do vậy, hiện nay v i ghé p là k ỹ thuật tạo cây sạch bệnh được sử dụng thành công ở nhiều phòng thí nghiệm. Murashige và cộng sự (1972) dùn g v i ghé p đỉnh sinh trưởng đ ể tạo vật liệ u sạch bệnh ở cây ăn quả có múi, cây con tái sinh đã sạch cá c tác nhâ n gây bệnh virus và tương tự virus. Năm 1975, Navarro và cộng sự đã hoà n thiện quy trình v i ghép chồi đỉnh cây có mú i in vitro. Bằng k ỹ thuật này, khoảng 90 loạ i cây có mú i khá c nhau được làm sạch bệnh (Navarro và cs, 1988). K ỹ thuật v i ghé p đã loạ i trừ được hàng loạt bệnh kh ỏ i nguồn gen cây c ó múi, ví dụ: - Virus gây bệnh tristeza, psorosis - Stubborn spiroplasma - Exocortis viroid - Tá c nhâ n gây bệnh chảy gôm, cristacortis, impietratura Kỹ thuật vi ghép chồi bao gồm các bước sau: - Chuẩn bị gốc ghé p trong ống nghiệm: Cây gốc ghé p thường dùn g trong v i ghép là Troyer citrange hoặc một vài gốc ghép khá c có khả năng tương hợp cao với mắt ghép. 59 Hạt dùn g làm gốc ghé p được gieo trong mô i trường lỏng v ô trùng, đ ể cho câ y nảy mâm trong tố i 10 - 14 ngày, sau đ ó thực hiện v i ghép. - Chuẩn bị mắt ghép trong ống nghiệm: Chọn giống tốt cần phá t tri ể n sản xuất và cây đún g giống cần nhân. T ừ cây này, chọn l ấ y đo ạ n cành non bán h tẻ, kh ù trùng roi nuôi cấy in vitro. Kh i thân non bật mầm, thao tác tách l ấ y chồ i đỉnh (gồm đỉnh sinh trưởng và 1-3 mầm lá non từ cây mẹ ). Thao tác tách chồi đỉnh thường được thực hiệ n d ưới kính hi ển v i soi n ổ i vì chồi đỉnh c ó kích thước rất nhỏ (0.1 - 0.2 min). - Cấy ghép chồi đỉnh lên đoạn thân non của gốc ghé p trong ống nghiệm. - Sau 4-6 tuần nuôi dưới ánh sáng, chồi đỉnh bật mầm và c ó lá thật, chuyển cây ghé p ra đất. Hiệ n nay phương phá p v i ghé p chồi đỉnh đan g được sử dụng rộng rãi đ ê tạo các dòn g Citrus sạch bệnh phục vụ cho nhân giống thương mại. Vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt hoặc hoa chất Quy trình: - Gốc ghé p được chuẩn bị từ hạt nuôi cấy in vitro trên mô i trường c ơ bản M S c ó 1% agar. Troyer citrance thường được dùn g làm gốc ghép, cò n gốc ghé p Etrog citron được dùn g để ghép các loạ i chanh. - Cây giống đã nhi ễm bệnh dùn g làm mắt ghé p được chuẩn bị nh ư sau: b ỏ lá, giữ cây ở nhiệt đ ộ 32° c từ 12-15 ngày. Sau đó , tách đỉnh sinh trưởng kíc h thước 0,1-0,2 mm từ chồi mới hình thành và v i ghé p theo ki ể u chữ T lộ n ngược trên gốc ghép . - Nuôi cây sau v i ghé p trên mô i trường MS có 100 mg/1 myo-inositol, đường 4%, thiamin HC1 0,2 mg/1, pyridoxine HC1 lmg/1, nicotinic lmg/1, đặc biệ t sử dụng nồng độ đường sucrose, cá c vitamin B cao v ớ i hàm lượng BA , IA A và GA 3 khá c nhau đ ể kích thích bật chồi từ đỉnh sinh trưởng v i ghép. T ỷ l ệ v i ghé p thành côn g là 60-70% và cây chuyển ra đất đ ã sống x ấ p xỉ 90%. Chương trình v i ghé p tạo giống sạch bệnh ở cây có mú i đã được tri ển kha i ở hầu hết các nước. 2.5.3.3. Công nghiệp nuôi cấy mô thực vật nhân giống sạch bệnh Nhâ n giống sạch bệnh bằng nuôi cấy m ô (còn được gọ i là v i nhâ n giống) đ ã trở thành một trong những phương thức quan trọng nhất đ ể nhâ n nhanh đ ố i v ớ i nhiều loạ i cây trổng khá c nhau. Từ kh i bắt đầu xuất hiện công nghiệp v i nhân giống vào đ ầ u những n ăm 70 của t h ế k ỷ X X số lượng cá c phòng thí nghiệm v i nhâ n giống thương ph ẩm đã tăng lên nhanh chóng . Sự toàn cầu hóa của công nghiệp v i nhâ n giống đã di ễ n ra rất tích cực trong những năm 80 của t h ế k ỷ XX . Sự m ở rộng của côn g nghiệp v i nhâ n giống khôn g chỉ gó p phần tăng năng suất cây trồng mà còn thúc đ ẩ y việc côn g nghệ hó a cá c mặt hàng nôn g nghiệp. Các loài cây trồng đang được v i nhân giống trên thị trường t h ế giới là: 60 - Cá c loài hoa, cây cảnh đặc biệt là phong lan, địa lan. Cá c chi hoa lan được cấy m ô và sử dụng cho hoa cắt, hoa chậu thương phẩm gồm: Dendrobium, Ầrachis, Aranda, Ascocenda, Catleya, Cymbidium, Cypripedium, Oncidium, Mokara, Phalaenopsis, Vanda. - Cá c cây dạng hành, gồm các loài như Lilium, Lay ơn,.... - Các loài cây có củ như gừng, khoai tây. - Các loài cây ăn quả như chuối, dâu tây, đu đủ, mít... - Các loạ i cây trồng khá c như dứa, cây cọ dầu, mía , cá c loạ i cây lâm nghiệp như bạch đàn, keo lai, hông, tếch... - Các dòn g b ố m ẹ để sản xuất hạt lai kh ó nhâ n và gi ữ bằng con đường hữu tính như các dòng hoa, rau bất thụ đực. Những ưu điểm và nhược điểm của công nghệ vi nhăn giống Ưu điểm của vi nhân giống - Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việ t bất k ỳ đ ề u c ó thể tạo ra một quần thể có độ đồng đ ề u cao v ớ i số lượng khôn g hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt d i truyền. - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ v i nhân giống đá p ứng tốc đ ộ nhâ n nhanh cao, từ Ì cây trong vòng 1-2 năm c ó thể tạo thành hàng triệu cây. - Sản phẩm cây giống đồng nhất: V i nhâ n giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có đ ộ đồng đ ề u cao dù xuất phát từ cây m ẹ c ó ki ể u gen dị hợp hay đồng hợp. - Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòn g thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiế t và các vật liệ u khởi đ ầ u có kích thước nhỏ. Mậ t đ ộ cây tạo ra trên một đơn vị diệ n tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà lánh theọ phương phá p truyền thống. - Nâng cao chất lượng cây giống: Nuô i cấy m ô là một phương phá p hữu hiệu để loạ i trừ virus, n ấm khuẩn kh ỏ i các cây giống đã nhi ễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy m ô thường tăng năng suất 15-30% so với giống gốc. - Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: CÁC dạng sản phẩm khá c nhau có thể tạo ra từ h ệ thống v i nhân, giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Cá c cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ. - Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa d ễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiệ n vô trùng được xá c nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đ ảm an toàn, đáp ứng các quy định về vệ sinh thực vật quốc tế. - Sản xuất quanh năm: Qu á trình sản xuất có thể tiế n hàn h vào bất k ỳ thời gian nào, không phụ thuộc mù a vụ. Nhược điểm của vi nhân giống - Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong đi ều kiệ n k ỹ thuật hiện nay, khôn g phải tất cả cây trồng đ ề u được nhân giống thương phẩm bằng v i nhâ n giống. Nhiề u cây trồng có giá trị kinh t ế hoặc quý hiếm v ẫ n chưa thể nhân. nhanh đ ể đá p ứng nhu cầu thương 61 m ạ i hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiề u v ấ n đề lý thuyết liên quan đ ế n nuô i c ấ y và tái sinh t ế bào thực vật in vitro v ẫ n chưa được giả i đáp. - Chi phí sản xuất cao: V i nhâ n giống đòi h ỏ i nhiều lao độ ng k ỹ thuật thành thạo. Do đó , giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương phá p truyền thống như chiet, ghé p và nhâ n giống bằng hạt. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuô i cấy m ô c ó thể sai khá c với cây mẹ ban đ ầ u do hiện tượng biến dị t ế bào soma. K ế t quả là cây con khôn g g i ũ được các đặc tính qu ý của cây .mẹ . Tỷ l ệ biến dị thường thấp ở giai đo ạ n đ ầ u nhâ n giông, nhưng sau đ ó c ó chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy ké o dài và tăng hà m lượng cá c chát kích thích sinh trưởng. Hiệ n tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nh ằm đ ả m bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền. 2.5.3.4. Sản xuất các chứ hoạt tính sinh học từ thực vật ở quy mô lớn bằng bioreactor Các chất hoạt tính sinh học từ thực vật Hiệ n nay, ngườ i ta đã xá c định vài chục nghìn chất thứ cấp. Cá c chất c ó hoạt tính sinh học ở thực vật thường chia làm ba nhóm: - Các chất thứ cấp. - Các peptid và protein hoạt tính sinh học. - Các sản phẩm mớ i khác . Va i trò của các chất thứ cấp đ ố i với đ ờ i sống cây trồng chưa được nghiê n cứu kỹ nhưng nói chung chúng thường có vai trò trong bảo vệ thực vật. Cá c chất nà y được tích lũy ở khôn g bào của t ế bào thực vật. Rất nhiều chất thứ cấp là nguồn dược liệ u c ó giá trị thương mạ i cao. Ngư ờ i ta chia các chất thứ cấp thành cá c nhó m được thể hiệ n ở bảng sau: Bảng 2.9. Các chất thứ cấp ở thực vật bậc cao Dạng sản phẩm thứ cấp Số lượng các chất trong mỗi nhóm Nhóm chết có chứa nitơ: Amin 100 Alkaloid 12.000 Các axit amin không phải protein (NPAAs) 400 Cyanogenic glycoside 100 Glucosinolate 100 Nhóm chất không có chứa nitơ: Monoterpene 1.000 Sesquiterpene 3.000 Diterpene 1.000 Triterpene, steroid, saponin 4.000 Tetraterpene 350 Polyketide 750 Polyacetylene 1.000 Flavonoid 2.000 Phenylpropanoid 500 62 Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật bằng nuôi cấy mô Thực tế, một số cây dược liệ u qu ý rất kh ó trồng hoặc cho hàm lượng chất có giá trị* cao trong sinh khố i qu á thấp nên các nhà khoa học đ ã nghiê n cứu ứng dụng côn g nghệ nuôi cấy m ô t ế bào thực vật như một công cụ để sản xuất cá c chất hoạt tính sính học. Côn g nghệ này bao gồm các bước sau: - Chọn lọc loài thực vật hoặc giống cây trồng sản xuất các chất có giá trị thương mại. - Nuôi cấy t ế bào, m ô hoặc cơ quan tách rời in vitro tạo sinh khố i t ế bào. - Gâ y đ ộ t biến hoặc chọn dòn g t ế bào soma có kh ả năng tạo sinh khố i lớn, c ó hàm lượng hoạt chất cao. - Chiết rút, thu hồ i cá c chất hoạt tính từ sinh khối. Cho đến nay, chỉ c ó một số ít cá c quá trình công nghệ được ứng dụng sản xuất ở quy mô pilot công nghiệp. Hầ u hết các bioreactor trong nuôi cấy t ế bào thực vật được nghiên cứu cả i tiến từ các loạ i nồ i lên men sử dụng trong nuôi cấy t ế bào v i sinh. Bảng 2.10. Một số loại bioreactor đã được sử dụng trong nuôi cấy tế bào thực vật Phường thức nuôi cấy Loại bình Quy mô (lít) Bình có trục khuấy-Stirred tank 1- 75.000 Nuôi cấy tế bào dịch lỏng Bình lăn tròn-Rotating drum 2-1.000 Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 1-1.500 Bình có trục khuấy-Stirred tank 1-20 Bình có trục khuấy cải tiến-Modified stirred tank 1-14 Nuôi cấy rễ tóc Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 1-13 Bình nhỏ giọt-Droplet reactor 2-500 Bình sương mù-Mist reactor 1-35 Nuôi cấy cơ quan và tế bào Bình có trục khuấy-Stirred tank 1-10 phôi hoa Bình thổi khí từ dưới: Air-lift 0,6-6 Bên cạnh việc tăng quy m ô sản xuất (tăng kích thước của bioreactor), v ấ n đ ề đặt ra là phải chọn dòn g t ế bào có khả năng tạo sinh khố i lớn và hàm lượng hoạt chất cao trong sinh khối. Bảng 2.11. Các hoạt chất được sản xuất với hàm lượng cao bởi những dòng tế bào nuôi cấy chọn lọc (Curtìs, 1999) Tên hoạt chất Tỷ lệ hoạt chất trong sinh khối khô (%) Anthocyanin Anthraquinone Berberine Jalrorrhizine Rosmarinic axit Shikonin stevioside Theanine(Caffeine antagonist) Vanillin 20 18,7 10,5 10,1 36 21,2 36,4 22,3 8,0 63 Bảng 2.12. Các hoạt chất được sản xuất quy mô lớn bằng bioreactor ở một số loài cây trồng (Wỉldi and Wink, 2001) Tên hoạt chất Loài cây dược liệu Tác giả sản xuất Anthocyanin Berberine Betacyanin Echinacea polysaccharid Gingseng saponin Rosmarinic acid Sanguinarine Shikonin Taxol Vanilin Euphorbia millii Coptis ịaponica, Thalictrum minus Beta vulgaris E. purpurea, E. angustiíolia Panax gingseng Coleus blumei Papaver somniỉerum Lithospermum erythrorhizon Taxus breviíolia, T. chinensis, Taxus sp. Vanilla planiíolia Nippon Paint (Nhật) Mitsui Petrochemical Industries (Nhật) Nippon Shinyaku (Nhật) Diversạ (Đức) Nitto Denko (Nhật) Nattermann (Đức) Vipon Research Labs (USA) Mitsui Petrochemical Industries (Nhật) Nippon Oil (Nhật), ESCA genetics (USA), Phýton Catàlytic (USA) ESCAgenetics (USA) Mặc dù các nhà khoa học đã đạt được một số thành công trong sản xuất dược chất nhưng công nghệ bioreactor v ẫ n còn phải tiếp tục cải tiến để nâng cao năn g suất, đơn giản hoa thiết bị để giảm giá thành sản xuất. Hiệ n tạ i bioreactor chỉ được sử dụng đ ể sản xuất các chất có giá trị cao, đắt tiền hoặc các hợp chất khôn g thể sản xuất bằng con đường khác. Gần đây một hướng phát triển mớ i gọ i là canh tác phân tử đ ã được hình thành, trong đ ó cây trồng được xem như một loạ i bioreactor đ ể sản xuất cá c chất qu ý hiếm. Bước đầu, các gen liên quan đến dược liệ u hoặc c h ế phẩm công nghiệp như vacxin, khán g thể, enzym... từ người, động vật, vi sinh vật đã được chuyển vào thực vật, tạo cây trồng chuyển gen có khả tăng tạo ra sinh dược trên đồng ruộng hoặc trong nh à kính. 2.5.3.5. Kỹ thuật đơn bội in vitro trong công tác giống cây trồng K ỹ thuật tạo cây đơn bộ i in vitro: thông qua trong nuô i cấy hạt phấn và noã n cho phép tạo ra nhanh chón g hàng loạt cây đơn bộ i hoặc đơn bộ i ké p từ cá c t ế b à o sinh dục đực và cái, phục vụ đắc lực cho mục đích nghiê n cứu d i truyền và tạo giống câ y trồng. N ăm 1964, lần đầu tiên trên t h ế giới, hai nhà khoa học A n Đ ộ Guha và Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn bộ i từ nuôi cấy bao phấn in vitro cây c à Datura innoxia. Ngay sau đó, cây đơn bộ i đã được tạo ra bằng nuô i cấy bao phấn ở hàn g loạt cây trồng khá c nhau. Ha i phương phá p cơ bản của k ỹ thuật đơ n bộ i hiệ n nay là: - Nuô i cấy bao phấn hay ti ể u bào tử tách rời hay còn gọ i là phương phá p trinh sinh đực trong ống nghiệm (in vitro androgenesis). - Nuôi cấy t ế bào trứng chưa thụ tinh hay còn gọ i là phương phá p trinh sinh cái trong ống nghiệm (in v i tro gynogenesis). V ậ t liệ u ban đầu cho qu á trình nuôi cấy in vitro tạo cây đơn bộ i thường là: - Bao phân, hạt phấn tách rời, cụm hoa (phương phá p này hay được áp dụng cho những loài có hoa nhỏ). 64 - Cứu phôi sau lai xa. Kh i lai xa giữa hai loài lúa mạch Hordeum vulgare và H. bulbosum, sau qu á trình thụ phấn tạo ra nhiều phôi đơn bộ i do nhi ễm sắc thể của t ế bào sinh dục loài H. bulbosum bị loạ i trừ. Do nộ i nhũ của phôi đơn bộ i khôn g phát tri ển nên người ta đã phải sử dụng phương phá p nuôi cấy t ế bào để cứu những phôi này và tạo ra hàng loạt cây đơn bộ i (Jensen, 1977). - Th ụ tinh giả . Đâ y là quá trình thụ phấn nhưn g khôn g xảy ra sự thụ tinh. Mặ c dù vậy, t ế bào trứng v ẫ n được kích thích phát tri ển thành cây đơn bội. Hess và Wagner (1974) đã tiến hành thụ phấn in vitro giữa Mimulus luteus v ớ i Torenia ỷournieri và kế t quả là đã tạo được cây đơn bội. - Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh. Trong số các vật liệ u trên, bao phấn, hạt phấn tách rời và noãn chưa thụ tinh là những nguồn nguyê n liệ u quan trọng, được sử dụng phổ biến hơn để tạo cây đơn bội. T ạ i Trung Quốc, công nghệ đơn bộ i đã được tri ển khai có h ệ thống trên quy m ô lớn và có định hướng chiến lược rõ ràng trong tạo giống mớ i. Hơ n mộ t nghìn cơ sở nuôi cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những năm 1970, kế t quả đã tạo được trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn. Trong đó , giống lúa nước và lúa mì mớ i tạo ra từ kỹ thuật đơn bộ i đã m ở rộng sản xuất trên diện tích vài triệu ha. Tạ i Triều Tiên, k ỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 42 giống lúa mớ i (Sasson,1993; Jain cs., 1997). Ư u t h ế của các phương phá p nuôi cấy này là tất cả cá c cây tạo thành đ ề u có nguồn gốc từ ti ể u bào tử hoặc đ ạ i bà o tử, vì vậy cây con nhận được sẽ là cây đơn bộ i hoặc cây nhị bộ i đồng hợp tử với cá c cặp nhi ễm sắc thể tương đồng hoàn toàn giống nhau (trừ trường hợp đột biến). Cây nhị bộ i thu được là do qu á trình nhị bộ i hoa tự nhiên của hạt phấn đơn bộ i trong nuôi cấy hoặc xử lý đa bộ i hoa bằng thực nghiệm. 2.5.3.6. Kỹ thuật chọn tạo biến dị tế bào soma và khả năng ứng dụng Biến dị t ế bào soma - một hiện tượng chung và phổ biến xảy ra trong nuôi cấy m ô in vitro. Căn cứ vào quy luật của Vavilốp, trong những đi ều kiệ n mô i trường giống nhau có thể quan sát thấy cá c biến dị di truyền giống nhau ở các loài gần nhau về phân loại. Số liệ u của hơn 30 năm qua cho thấy m ô và t ế bào tách rời, nuôi cấy trên mô i trường nhân tạo là nguồn khôn g có giới hạn của các biến dị d i truyền. Larkin và Scowcroft (1981) đưa ra khái niệm biến dị t ế bào soma làm tên gọ i chung cho cá c loạ i biến dị này. Nguồn gốc của các biến dị tế bào soma Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấy mô in vitro: Trong quá trình phát tri ển cá thể, phân hoa và già hoa của m ô và t ế bào mộ t số các thay đ ổ i d i truyền đã xảy ra và được tích l ũ y trong các t ế b à o soma (D'amato, 1985). N h ờ kỹ thuật nuôi cấy mô , cây được tái sinh từ t ế bào soma sẽ là cá c đ ộ t biến. Các nhà khoa học đưa ra khá i niệm automutagenesis - tự đ ộ t biến (đột biến xảy ra khôn g do các tác nhân từ bên ngoà i gây nên). De Vries (1901) - ngư ờ i khởi xướng học thuyết về đột biến cho ràng cây bị đ ộ t biến do được tái sinh từ hạt già (có nhiều đ ộ t biến đã tiềm ẩn từ trước trong hạt già). Ba mươi năm sau, Nawacin chứng minh đ ộ t biến ở hạt già là do các 65 chất tham gia qu á trình trao đ ổ i chất và các sản phẩm cặn bã c ó trong hạt gâ y nên. Các chất này có thể là: hợp chất chứa lưu huỳnh, amin, amino axit, amid, aldehyde, alkloide, phenol, quinone, axit nucleic và cá c sản phẩm khác . Nguyê n nhâ n gây đ ộ t biế n có the do cấu trúc bình thường của hạt và t ế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp x ú c v ớ i cá c chất và tạo ra sản phẩm đ ộ t biến. Tuy theo phương thức nuôi cấy t ế bào soma, ngư ờ i ta phâ n biệt cá c loạ i biế n dị dư ớ i đây: - Biến dị dòn g t ế bào m ô sẹo (callusoclonal variation): kh i cây biế n dị tái sinh từ m ô sẹo (callus). - Biến dị dòn g t ế bào trần (protoclonal variation)-khi cây biến dị tái sinh từ t ế bào trần. Ngoà i ra Evans và cộng sự (1984) còn đưa ra khá i niệm "biến dị giao tử" (gameto clonal variation) kh i cây được tái sinh từ các t ế bào sinh dục (gamete). Nhữn g biế n dị di truyền xảy ra và được phá t hiện trong quá trình nuôi cấy i n vitro gọ i chung là đ ộ t biến t ế bào dòng. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro: M ộ t nguồn biến dị t ế bào soma quan trọng là thay đ ổ i trong b ộ má y d i truyề n xả y ra khi nuôi cấy tạo m ô sẹo và phân hoa cơ quan in vitro. Đ ế n nay c á c n h à khoa học đã phát hiện hai nguyên nhân cơ bản d ẫ n đ ế n các biến dị (đột biến) xả y ra trong t ế b à o nuôi cấy in vitro: - T ế bào nuôi chịu tác động trực tiếp của các chất hoa học trong mô i trường nuôi cấy. - Trong điều kiệ n in vitro, các gen di động (transposon) hay cò n gọ i là cá c gen nhảy hoạt động rất mạnh, các gen nhảy đã được phá t hiệ n l ầ n đ ầ u tiên ở ng ô nă m 1963. Người phát minh ra gen nhảy (transposon) là McClintocr, bà đ ã được giả i thưởng Nobel năm 1983 nhờ phát minh này. Đ ế n nay, khoa học đã xá c định được cá c gen nhảy tồ n tạ i ở hầu hết các cây trồng. Hoạ t động của chún g phụ thuộc và o ki ể u gen và đi ề u kiệ n môi trường. Trong cấy mô , cá c gen này d i chuyển tích cực, n ó c ó thể cài và o bất k ỳ gen nào trên nhi ễm sắc thể và gây ra tần số đ ộ t biến rất cao. Chroqui và Bercetch (1985) cho biết auxin gây ra đa bộ i hoa bê n trong t ế b à o nuôi cấy (endopolyploidization). Oono (1982) nuôi cấy m ô sẹo từ hạt lúa và tái sinh câ y từ m ô sẹo cho biết B AP có nồng đ ộ 30 mg/1 tạo ra tần số đ ộ t biến lớn gấp 50 l ầ n so với BAP ớ nồng đ ộ 2 mg/L Mức đ ộ đ ộ t biến t ế bào soma lớn đ ế n mức tần số đ ộ t biến do cá c chất đột biến gây ra cũng khôn g cao hơn (Larkin and Scowcroff, 1981). Orton (1984) cho biết trong thời gian nuôi cấy trên mô i trường dinh dưỡng h ệ gen của các t ế bào thực vật đã trả i qua quá trình cải tổ nhanh chón g và đã phá t hiệ n nhưn g thay đ ổ i số lượng, cấu trúc nhi ễm sắc thể, đ ộ t biến gen. Tầ n số đ ộ t biến gen nhiều k h i rất cao (l o 2 -10"') tính theo locus trên cây. Thay đ ổ i d i truyền phổ biến nhất xả y ra trong t ế bào nuôi cấy là đa bộ i thể. Sau kh i m ô được nuôi cấy, nhâ n t ế bào có th ể trả i qua quá 66 trình nộ i phân (endoreduplication) làm số lượng nhi ễm sắc thể trong t ế bào tăng lên gấp đôi hoặc hơn nữa nhưng không x ẩ y ra phân chia t ế bào. K ế t quả số lượng nhi ễm sắc thể của t ế bào tâng lên. Qu á trình nộ i phân của nhi ễm sắc thể trước khi phâ n bào đã cho phé p ngườ i ta nhận được cây lưỡng bộ i đồng hợp (dihaploid) từ hạt phấn đơn bộ i trong nuôi cấy bao phấn. Phổ rộng các biến đ ổ i nhi ễm sắc thể đã được quan sát thấy ở nhiều loài cây trồng khá c nhau (Murashige và Nakano, 1967; Sacristan và Melchers, 1960; Sunderland 1973; Nishi và Mitsuoka, 1969). Nghiê n cứu t ế bào học cho thấy 10% số loài phân hoa cơ quan không kèm theo hiện tượng nộ i phâ n nhi ễm sắc thể, 90% số loài phân hoa cơ quan có kèm theo nộ i phân nhi ễm sắc thể. Đột biến t ế bào soma xảy ra ở các gen trong t ế bào chất đã được chứng minh bằng phương pháp tách AD N ty thể và lục lạp nhờ enzym cắt (Kemble R.T cs, 1984). Độ t biến t ế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều cây trồng như mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì. Ở Petunia đã nhận được giống mớ i gọ i là Velevetrose, giống mí a Q47 (Larkin and Scrowroft, 1981). 2.5.3.7. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (protoplast) và thao tác di truyền ở mức tế bào Tách nuôi tế bào trần Khá c với t ế bào v i sinh và t ế bào động vật, t ế b à o thực vật có thành t ế bào cứng được tạo ra bởi nhiều loạ i polyme khá c nhau. Thàn h t ế bào có chức năng cơ học, tạo khung xương t ế bào và hệ màn g liên kế t giữa cá c t ế bào với nhau. Thàn h phần hoa học của t ế bào rất phức tạp. Cellulose là thành phần chủ y ế u của màn g t ế bào thực vật. Công thức hoa học tổng quát của cellulose là (C6 H 1 5 0 5 ) n. Phân tử cellulose có hình sợi dài, thậm chí rất dài với sự liên kế t của hàng nghìn các phân tử đường đơn v ớ i nhau. Ngoà i cellulose còn có hemicellulose, pectin, lignin, một số chất béo và chất khoáng , pectin còn đóng vai trò quan trọng liên kế t giữa các t ế bào với nhau. T ế bào trần (protoplast) là t ế bào đã được loạ i bỏ màn g t ế bào (một lớp polyme bao bọc t ế bào) và màn g liên kế t giữa các t ế bào. Cá c enzym đón g vai trò chủ yếu trong phân huy màn g t ế bào và tạo ra t ế bào trần là cellulase và pectinase. T ế b à o sau k h i bị mất lớp màng cứng sẽ có dạng hình cầu dư ớ i áp suất thẩm thấu phù hợp của mô i trường. T ế bào trần có thể được tách ra từ các m ô hoặc cơ quan khá c nhau ở cây như lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro (hình 5 - tách nuôi t ế bào trần từ m ô lá cả i dầu). Ư u t h ế của k ỹ thuật tách và nuôi cấy t ế bào trần là t ế bào khôn g có màn g cứng, ở trạng thái đơn bào, mậ t đ ộ t ế bào thu được trên Ì đơn vị thể tích mô i trường có thể rất cao (đạt lo 6t ế bào/1 m i mô i trường). T ế bào trần ở một số cây trồng có kh ả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ t ế bào m ô thịt lá ở thuốc lá, cả i dầu... Bằng thao tác di truyền ở t ế bào trần có thể d ễ dàng tạo ra các t ế bào biến đ ổ i gen. T ế bào với ki ể u gen biến đ ổ i sẽ được bảo tồn khi tái sinh t ế bào thành cây hoàn chỉnh. Một số ứng dụng của kỹ thuật tế bào trần - Lai xa: Ngư ờ i ta c ó thể d ê dàng lai t ế bào trần của các cây khá c loài với nhau: khoai tây với cà chua, cam ba lá với cam ngọt và tạo ra con lai khá c loài. 67 - Lai tế bào chất tạo ra các dòng đồng đẳng bất dục: Phương phá p tạo dòn g đồng đẳng bất dục được tóm tắt như sau: - Tạo quần thể t ế bào trần từ các dòng củng c ố bất dục (dòng B tiềm năng) VỚI te bào chất bình thường. - Tạo quần thể t ế bào trần từ các dòng bất dục đực t ế bào chất (dòn g CMS) với t ế bào chất bất dục. - Phá nhâ n của dòn g CMS bằng chiếu xạ hoặc hoa chất. - Dung hợp (hay lai) hai loại t ế bào trần với nhau và tái sinh t ế bào lai thành cây. - Chọn lọc các cây từ t ế bào lai mang toàn bộ gen nhâ n của dòn g B và t ế b à o chất của dòn g CMS. Cây chọn lọc bất dục đực sẽ là dòng A đồng đẳng bất dục đực của dòn g B, giống hệt nhau về gen nhân, dòn g A chỉ khá c dòng B ở tính trạng bất dục đực t ế b à o chất. Nhâ n dòng cây lai thông qua thụ phấn cây này bằng phấn của dòn g B đ ể tạo ra dòn g A . Dòn g B tiềm năng trở thành dòng B củng cố (maintainer) của dòn g A . Phươn g phá p nà y cho phép nhanh chóng tạo ra các dòn g thuần đồng đẳng bất dục phục vụ cho tạo giống ưu t h ế lai. Nhưng hiện nay kỹ thuật này chưa được ứng dụng v ớ i nhiều câ y kin h t ế quan trọng như lúa, ngô... - Chuyển nạp các cơ quan tử: Trong quá trình dung hợp t ế bào trần giữa hai loài hoặc hai giống sẽ xả y ra chuyển nạp các cơ quan tử (tái tổ hợp t ế bào chất). Trong t ế bào chất ở thực vậ t c ó rất nhiều cơ quan tử như lục lạp, ty thể... với nhiều đặc tính d i truyền quan trọng nh ư kh ả năn g kháng bệnh, tính trạng bất dục hoặc hữu dục, gen quang hợp... La i t ế b à o chất c ó th ể tạo ra các dòng t ế bào hoặc dòng giống cây trồng có những đặc tính d i truyền t ế b à o chất mớ i. - Tạo ra các tái tổ hợp mới của ADN: Trong quá trình dung hợp t ế bào có thể tạo ra cá c tái t ổ hợp m ớ i của nhi ễ m sắc thể hoặc ADN . Trong quá trình lai t ế bào k h i xử lý bằng phón g xạ , nhi ễm sắc th ể của nhân có thể bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên, dung hợp t ế b à o trần c ó thể cò n tạo ra tái tổ hợp A D N giữa các loài hoặc các đ ộ t biến gen khá c nhau. - ưng dụng trong nghiên cứu cơ bản T ế bào trần được ứng dụng đ ể xá c định chức năng của t ế bào chất và c ơ quan tử thông qua phân tích con lai t ế bào chất. Thao tác di truyền: Vì t ế bào trần khôn g có màn g cứng nên rất thuận tiện cho nhiều thao tác di truyền khá c nhau như chuyển gen hoặc nhi ễm sắc thể, ti ểu bào tử, nhân t ế bào bằng các v i thao tác (vi tiêm vật liệ u di truyền vào t ế bào), xung điện... Thao tác di truyền trên t ế b à o trần ở một số loài có khả năng tái sinh in vitro mạnh như cả i dầu, thuốc lá, khoai tây... có thể góp phần tạo ra hàng loạt cá c giống mớ i chuyển gen trong tương lai. 68 - Dung hợp tế bào trần đề tạo các dạng đa bội thể: Dun g hợp 2 loạ i t ế b à o trần nhị bộ i (2n) c ó th ể d ễ dàn g tạo ra cá c th ể tứ bộ i (2n + 2n = 4n). Dung hợp t ế bao trần nhị bộ i v ớ i t ế b à o trần đơn bộ i tạo ra cá c thể tam b ộ i (2n + I n = 3n). Cắt lá trong môi trường PCM, dùng enzym tách tế bào trần Ly tâm thu được các tế bào trần Tái sinh callus trên môi trường Phân chia tế bào Nuôi tế bào trần trong môi trường Chồi tái sinh Câ y co n in vitro Hình 2.1. Tách nuôi tế bào trần từ mô lá và tái sinh cây (cải dầu) 69 Chương 3 C ơ S Ở SIN H HỌ C PHÂ N T Ử CỦ A K Ỹ THU Ậ T D I TRUYỀ N 3.1. C Á C NGUYÊ N LÝ CÂ U TRÚ C HO A HỌ C CỦ A AD N N ăm 1953, James Watson và Francis Crick đã công b ố m ô hình phâ n tử AD N gom hai sợi xoắn kép, sợi này là tương đồng bổ trợ của sợi kia. M ô hình đã tạo ra là cơ sơ khoa học giả i thích được những sự thần k ỳ của các hiện tượng sinh học như kh ả năng sinh sản bằng nhân đôi, khả năng di truyền, biến dị và tiến hoa, tính đa dạng và phong phú tuyệt vời của sinh giới. M ỗ i sợi AD N là mộ t polyme r được tạo bởi bốn phâ n tử deoxyribonucleotid khá c nhau gọ i tắt là nucleotid đ ó là Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) và Cytosin (C). Trình tự của các nucleotid trong sợi AD N quy định tính đa dạng của cá c gen. Phâ n t ử AD N gồm 2 sợi xo ắ n kép , trong đ ó đ ố i diện v ớ i nucleotid A trên sợi này luôn là T trên sợi kia và ngược lạ i và đ ố i diện với G trên sợi nà y sẽ là c trên sợi kia và ngược lại. Hai nucleotid đ ố i diện như vậy gọ i là tương đồng và tạo ra mộ t cặp nucleotid (hay một cặp bazơ) (sơ đồ 3.1.). V í dụ như cặp Á T hay cặp CG. Đơ n vị đ o đ ộ l ớ n hoặc kính thước của các phân tử AD N được tính bằng số lượng cặp bazơ, cứ 1000 cặp bazơ sẽ gọi là kb (kilobazơ). C á c baz ơ tron g cá c nucleotỉd (Adenỉn và Thymin, Guanin và Cytosirì) c ó kh ả năng bắt cặp tương đồng với nhau từng đôi một bởi lực liên k ế t hyđr ô yếu . Lực liên k ế t yếu này cho phép 2 sợi AD N có thể d ễ dàng tách đôi (trong trường hợp tổng hợp sợi AD N mới hoặc sao mã gen). Adenin trên sợi này bắt cặp hay liên k ế t v ớ i Thymi n trên sợi kia và ngược lạ i bởi hai liên kế t hydro. Guanin và Cytosin trên hai sợi cũng liên k ế t v ớ i nhau bằng ba liên kế t hydro. Kh ả năng liên kế t từng đôi của cá c bazơ như trên đ ã quy định tính đ ố i xứng trong cấu trúc của hai sợi AD N (sơ đ ồ 3.2). Luậ t đ ố i xứn g nà y tron g c ấ u trú c phâ n t ử của AD N là phổ biến trong sinh giới. Nó quy định những thuộc tính quan trọng nhất của sự sống: khả năng sinh sản và di truyền. - Khả năng sinh sản: Kh ả năng nhân bản của phân tử AD N tạo ra cá c phâ n tử AD N mới có cấu trúc giống hệt với phân tử AD N mẹ . Dư ớ i tác động của các enzym, cụ thể là enzym helicase làm hai sợi AD N m ở xoắn ké p và tách đôi tạo ra hai sợi khuôn . Dư ớ i tác động của các enzym ADN - polymerase, các nucleotid tự do trong t ế bào sẽ bắt cặp v ớ i các bazơ tương đồng trên 2 sợi khuô n tạo ra sợi AD N ké p mớ i tương đồng v ớ i sợi khuô n ban đầu. K ế t quả là từ một phân tử AD N xoắn kép tạo hai phân tử AD N giống hệt nhau. 70 Sợi A sợi B Sơ đồ 3.1. Nguyên lý cấu trúc hai sợi của phân tử của ADN Sơ đồ 3.2. Liên kết hydro giữa 2 nucleotid tương đồng trong phân tửADN: mỗi nucleotid nằm trên Ì sợi của ADN liên kết với Ì Nucleotid tương đồng trên sợi kia của phân tửADN. Ký hiệu: T: Thymin, A: Adenin, C: Cỵtosin, G: Guanin. - Khả năng phân bào: Khả năng nhân đôi của ADN dẫn đến khả năng phân chia của t ế bào. Từ một t ế bào mẹ tạo ra hai t ế bào con mang vật liệ u d i truyền giống nhau. M ỗ i phâ n t ử nucleotid gồm 3 ti ể u ph ầ n : phân tử bazơ (bazơ), phân tử đường (deoxyribose) và mộ t phân tử phosphate. Ha i nucleotid trên cùn g một sợi AD N liên kế t với nhau qua cầu phosphate (sơ đ ồ 3.3). 71 H Phosphat e / / / H H H c l i H o [ ỉ c N H Bazơ (base) N 5* c 4. H \ l c 3. Liên kết vói phosphat của Ó nucleotid tiếp theo ^ Đường (deoxyribose) H c r 1 / I H Sơít ô 3.3. Cấu trúc hoa học của phân tửnucleotid 3.2. DÒNG CHẢY CỦA THÔNG TIN DI TRUYỀN Q u á trình chuyển hoa thông tin d i truyền gồm hai dòn g chảy dư ớ i đây : ADN -> ADN Thông tin di truyền ở phâ n tử AD N m ẹ được sao ché p lạ i theo luậ t đ ố i xứng tạo ra hai phân tử AD N mớ i có cấu trúc tương tự nhau và giống hệ t v ớ i phâ n tử AD N m ẹ (nếu khôn g xảy ra đột biến). Đâ y là dòn g chảy thôn g ti n d i truyền từ t ế b à o m ẹ sang t ế bào con trong quá trình phân bà o và từ t h ế h ệ này sang t h ế h ệ khá c qua qu á trình sinh sản. ADN -> ARN -> Protein Axit deoxyribonucleotid (ADN ) và axit ribonucleic (ARN ) là hai loạ i polymer quan trọng của cơ thể sống. Trong kh i AD N được tạo bởi bố n deoxyribonucleotid khá c nhau: Guanin, Adenin, Cytosin và Thymi n thì AR N thôn g thường chỉ gồm mộ t sợi và được cấu tạo bởi bốn ribonucleotid khá c nhau v ớ i cá c bazơ: Adenin, Guanin, Cytosin và Uracin. Thôn g tin di truyền của tất cả cá c cơ thể sống trên trái đ ấ t đ ề u lưu gi ữ thôn g ti n trong phân tử AD N gồm hai sợi (trừ một vài loài virus) và qu á trình sinh tổng hợp AR N và protein gọ i là quá trình biểu hiện của gen. ARN -> ADN Phân tử AD N được hình thành từ sợi AR N v ớ i sự xú c tác của enzym sao ché p ngược (reverse transcriptase). Hiệ n tượng sao chép ngược xả y ra trong qu á trình sinh sản của một số virus có genom là AR N trong t ế b à o sinh vật chủ. 72 3.3. BIỂ U HIỆ N CỦ A GEN 3.3.1. Qu á trìn h phiê n m ã (transcription) Q u á trình sinh tổng hợp AR N trên khuô n AD N gọ i là qu á trình phiên mã (transcription). Trong hai sợi xoắn ké p của AD N chỉ có một sợi đón g vai trò sợi khuô n quy định trình tự cấu trúc của AR N theo nguyê n tắc tương đồng bổ trợ. Qu á trình phiên mã di truyền của gen được bắt đ ầ u từ đ ầ u 5' của gen trong vùng promoter cho đ ế n k h i gặp đi ểm kế t thúc phiên mã (termination) ở đ ầ u 3'. Qu á trình sao mã được thực hiện với sự tham gia của các ARN-polymerase. Đ ố i với các cơ thể sống nhâ n thực, sau kh i kế t thúc phiên mã , sợi AR N được tổng hợp trong nhân của t ế bào c ò n phải trả i qua một qu á trình chỉnh sửa: Phân tử AR N đầu tiên được tổng hợp từ AD N có thể được gọi là hnARN (tiếng A n h heterogeneous nuclear A R N - A R N nhân dị hình như sơ đ ồ 3.4) hay còn gọ i là AR N sơ cấp (primary RNA ) hoặc là tiền mARN . Cấu trúc của tiền A R N gồm các đoạn trình tự được gọi là exon và intron (các đoạn exon biểu thị bằng ô có dấu chấm đậm) như sơ đ ồ 3.4. Sau quá trình phiên m ã là quá trình chỉnh sửa hnARN : Q u á trình này xảy ra nhờ AR N splicing (cắt và ghé p nối). Cá c đoạn AR N được phiên mã từ introns sẽ bị cắt đi, các đoạn được phiên mã từ cá c exons được ghé p nố i lạ i với nhau và bổ sung thêm mộ t đoạn là mộ t đoạn đuôi gồm 4 phân tử adenin (AAAA) . K ế t quả tạo ra phân tử mAR N (AR N thông tin). Trong t ế bào nhâ n thực, hnAR N được tạo ra trong nhân, sau kh i chỉnh sửa tạo thành mAR N và d i chuyển ra ngoà i t ế bào chất. Q u á trình phiên mã và dịch mã được m ô tả ở cá c hình như dư ớ i đây (Sơ đ ồ 3.4). Gen Genom ADN L Prnmnter ) Phiên mã hp. ARN v/\/ l Y\/\ A Y\/\ Ằ IA/ N Chỉnh sủa mARN xAA/ 1 AAAA-3' Dịch mã Protein Sơ đồ 3.4. Sơ đồ biểu hiện gen theo Miesỷeld R.L, 1999. 73 Các bước trong quá trình dịch mã và phiên mã ở t ế bào tiề n nhâ n chỉ gồm 2 bước: - Bước Ì: m AR N được trực tiếp tạo ra từ AD N khôn g qua chỉnh sửa - Bước 2: Protein được tổng hợp trên sợi mAR N Có 5 đi ểm khá c biệt cơ bản giữa sinh tổng hợp AD N và AR N nh ư sau: - Trong phân tử AR N không có Thymi n thay vào đ ó là Uracin (U), nê n trong kh i hình thành sợi ARN , đ ố i xứng với Adenin trên sợi AD N sẽ là Uracin trên sợi ARN . - ARN-polymerase hoạt động khôn g cần đi ểm mồ i primer trên sợi ADN . - Tổng hợp AD N liên quan trực tiếp với quá trình phâ n chia và sinh sản của t ế bào. K h i lượng AD N trong t ế bào được nhân đôi hiện tượng phâ n chia t ế b à o m ớ i xảy ra. Trong khi sinh tổng hợp AR N có liên quan trực tiếp đ ế n các quá trình trao đ ổ i chất cùa t ế bào: tạo ra các protein và enzym khởi động các quá trình sinh hoa học của t ế bào . - Đi ểm khởi đầu sinh tổng hợp AD N (gọi là origin o f replication) khá c v ớ i đi ểm khởi đầu sinh tổng hợp ARN . - Trong khi sinh tổng hợp hai sợi AD N con xảy ra đồng thời trên cả hai sợi của AD N mẹ . Sinh tổng họp mAR N chỉ được thực hiện trên một sợi AD N của gen, gọ i là sợi khuôn (template) hay là sợi có nghĩa (sense), sợi còn lạ i không được mã hoa (non-sense). N ế u A R N sẽ được tổng hợp trên một sợi AD N tương đồng với sợi khuôn , ngư ờ i ta sẽ nhận được một sợi AR N tương đồng bổ trợ, nhưng nghịch nghĩa (antisense ARN) với sợi mAR N được tổng hợp từ sợi khuôn. Kh i hai sợi AR N nghịch nghĩa gặp nhau, chún g sẽ tạo nên một sợi AR N xoắn kép làm cho mAR N mấ t kh ả năng sinh tổng hợp protein. Ngư ờ i ta đã ứng dụng đặc tính này của sinh tổng hợp AR N đ ể tạo ra cá c gen nghịch nghĩa (antisense gene) nhằm khống c h ế sinh tổng hợp mộ t enzym hoặc mộ t hoạt chất nào đó , ví dụ, các nhà khoa học M ỹ đã ứng dụng nguyê n lý gen đ ố i nghĩa đ ể tạo ra giống cà chua chuyển gen có khả năng khống c h ế sinh tổng hợp ethylen đ ể kìm hãm quá trình chúi tự nhiên của quả. Nhiề u copy khá c nhau của phân tử AR N được tổng hợp từ chỉ mộ t sợi trong phâ n tử ADN . Số lượng copy của AR N được quy định bởi tần suất của enzym ARN - polymerase khởi động quá trình dịch mã , thể hiện mức đ ộ hoạt hoa của gen. Ở v i khuẩn, một nhóm (một dãy) các gen có thể được dịch m ã cùn g lúc và tạo ra một sợi mAR N dài. Dãy gen này được gọ i là một operon. Hoạt động của operon cho phép ki ểm soát được một nhóm gen có cùng chức năng. 3.3.2. Quá trình dịch mã (translation) Q u á trình tổng hợp protein trên sợi mAR N ở các t ế bào nhâ n thực (eukaryote) xảy ra ở t ế bào chất. Sinh tổng hợp của protein được xảy ra trong t ế bào chất của t ế b à o v ớ i sự tham gia của mARN , ribosome, các tAR N (AR N vận chuyển), các axit amin tự do, ATP,... Sinh tổng hợp protein là quá trình chuyển hoa thông tin (mã di truyền) từ gen thành cấu trúc và chức năng đặc thù của protein. Trình tự axit amin của protein là do trình tự 74 các nucleotid trong gen quy định. AR N thông tin (mARN ) c ó chứa cá c codon, m ỗ i codon gồm ba nucleotid gọ i là triplet (cặp ba). Phân tử AR N vận chuyển (tARN ) có cấu trúc 2 cực: Mộ t đ ầ u của tAR N có đính Ì phân tử axit amin, mộ t đ ầ u kia là Ì bộ ba (triplet) gọ i là anticodon. M ỗ i một tAR N có mang một axit amin và mộ t anticodon đặc thù cho nó . Trong qu á trình tổng hợp protein, các anticodon của tAR N sẽ nhận biết các codon tương ứng trên sợi mAR N và tìm ra vị trí khôn g gian thích hợp cho n ó trên m AR N và đồng thời cũng là vị trí khôn g gian thích hợp hay là trình tự thích hợp của axit amin mà n ó mang theo ở đầu kia của tARN . Tổng số c ó 64 codon khá c nhau, trong đ ó c ó 61 codon quy định trình tự của 20 axit amin, ba codon còn lạ i được gọ i là cá c codon kế t thúc hay là cá c codon vô nghĩa (không ứng với một acid amin nà o trong phân tử protein). Tạ i đi ểm codon vô nghĩa trên mAR N quá trình tổng hợp protein sẽ dừng lại. 3.4. CÁC ENZYM THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH SINH HOA CỦA ADN Cá c enzym tham gia vào cá c qu á trình trao đ ổ i chất của AD N có ý nghĩa rất quan trọng đ ố i v ớ i k ỹ thuật d i truyền. Các enzym này được thương mạ i hoa và được gọ i là bộ kít cá c enzym của sinh học phâ n tử (xem chi tiết ở chương 4). 3.5. ĐIỂU KHIỂN BIỂU HIỆN CỦA GEN Đ i ề u khi ể n hoạt động của h ệ thống gen là mộ t trong các bí ẩn lớn nhất trong tự nhiên và việc khám phá ra n ó c ó thể là chìa khoa để m ở ra các bí ẩn khá c trong hệ đi ều khi ển các quá trình sinh học. Cho đ ế n nay nhâ n loạ i v ẫ n chưa h ề biết đ ế n mộ t hệ thống đi ều khi ể n nà o lạ i tinh tế, chính xác , nhạy bén như cá c h ệ thống đi ều khi ển trong t ế b à o và cơ thể sống, nhất là trong hệ thần kinh trung ương của con người. Đ ó là những bí mậ t của tạo hoa tồn tạ i ngay trong m ỗ i chún g ta m à trí tuệ nhâ n loạ i hiện v ẫ n còn đang từng bước nghiên cứu. Nghiên cứu bi ểu hiệ n của gen là nộ i dung hoạt động cơ bản của chương trình chức năng genom. Muố n tìm hi ểu chức năng của một gen cần xá c định rõ cá c nộ i dung sau: - Các AR N do gen này mã hoa trong quá trình phiên mã gen (transcription). - Protein cấu trúc, hoặc enzym sản phẩm của gen này tạo ra trong quá trình dịch mã gen (translation). - Cá c qu á trình đi ều khi ể n biểu hiện của gen như t h ế nào: gen n à y được phiên mã ở loạ i t ế bào, m ô nà o trong cơ thể và ở vào giai đoạn nà o trong qu á trình phát tri ển của cơ thể đó , các đi ều kiệ n mô i trường tác động lên biểu hiện của gen... - Va i trò của cá c promoter hoặc các gen đi ều khi ể n liên quan đ ế n bi ểu hiệ n của gen này. - Cá c promoters đón g vai trò quyết định đ ố i với biểu hiện của gen. Hiệ n nay, hàng loạt các promoter đặc thù đã được phát hiện, ví dụ, promoter đặc thù m ô (tissue specific promoter) quy định một gen gắn với promoter đặc thù m ô sẽ chỉ bi ể u hiện kh i n ó nằm ở m ô tương ứng. Ví dụ, gen được gắn với promoter đặc thù hạt sẽ chỉ bi ểu hiện trong hạt (seed specific promoter). 75 3.5.1. Phé p biệ n chứng tron g nghiê n cứu h ệ thốn g sống v à v ấ n đ ề đi ề u khi ể n hoạ t hoa của gen Cái hay nhất của triết học duy vật là phép biện chứng. Quan trọng nhất của phé p biện chứng là phân tích cấu trúc h ệ thống, tìm ra "gốc" của h ệ thống đ ó và quy luật vậ n hành của n ó trong các mố i quan hệ nhiều chiều trong khôn g gian, thời gian và những đi ều kiệ n cụ thể. Sống có nghĩa là vận động, hệ đi ều hành phải chi phối sự vậ n động khôn g ngừng đó , một sự cố xảy ra là tín hiệu để các sự c ố khá c bắt đầu hoặc dừng lại. Cá c tổ chức sống và các quá trình sinh học luôn luôn tồn tạ i trong quá trình phát tri ể n lịch sử của nó : hìn h thành, phát sinh, phát tri ển và diệt vong, trong dòn g chảy của thời gian và khôn g gian, trong sự luân h ổ i giữa phân giả i và tổng hợp, giữa biến dị và d i truyền, giữa trẻ hoa và lão hoa, giữa vật chất và năng lượng, giữa nhớ và quên, giữa sống và chết. M ỗ i mộ t ngà y có hàng vạn t ế bào mới sinh ra và hàng vạn t ế bào chết đi trong cơ thể sống. M ỗ i ngà y có hàng triệu sinh linh mớ i sinh ra trong khi hàng triệu cá c sinh linh khá c bị diệ t vong. Sự chết chưa phải là ng õ cụt. Sự chết ở chỗ này có thể là bắt đ ầ u của sự sinh ở nơi khác . Sự tăng lên trở thành tín hiệu báo trước sự giảm xuống, sự cạn kiệ t bá o trước bắt đ ầ u của sự tạo ra. Đ ó là những xu hướng mà ta c ó thể tìm thấy trong h ệ đi ề u hàn h của gen và các chu trình vận động sống. Tính cân bằng, ổn định trong các h ệ thống sống vố n là thiết yếu đ ố i với sự sinh tồn, nhưng sự cân bằng chỉ là tương đ ố i và luôn ở trạng thái cân bằng động. Vậ n động sống thật phức tạp biết bao. N ó xảy ra trong mộ t khôn g gian và thời .gian rộng lớn, lạ i rất cụ thể trong các đi ều kiệ n và bố i cảnh cụ thể của m ỗ i mộ t phản ứng sinh hoa. Phép biện chứng trong kh i phân tích hệ thống phức tạp và ly k ỳ như vậy phả i m ổ x ẻ nó, tìm ra các mắt xích và các khâu chìa khoa của sự vật, khôn g bỏ qua cái tổng thể và khôn g rơi vào sự vụn vặt và phiến diện. Khoa học hiệ n nay đ ã tìm thấy "đầu mối " của vận động sống - một cuộn chỉ rố i nhất trong tự nhiên. Đầu mối của vận động sinh học chính là phân tửADN, đầu nguồn của dòng chảy sự sống. 3.5.2. Tính phức tạp của hệ thống sống Cấu trúc của hệ thống sống rất đ a dạng với vô vàn các "linh kiện " li ti. Cá c "linh kiện " đó lạ i được cấu trúc từ các phân tử. V í dụ, ở ngườ i có khoảng 30.000 gen, v ớ i số lượng ngần ấy các phân tử mAR N và khoảng 30.000 các protein đặc thù, biết bao nhiêu triệu siêu cấu trúc, hay các "linh kiện " khá c nhau sẽ được tạo ra từ tổ hợp của cá c phâ n tử đó? Do vậy, chúng ta đã thấy những cấu trúc đa dạng v ớ i những thuộc tính đặc biệt,ví dụ như các giác quan k ỳ diệu ở người. K ỳ diệu nhất có l ẽ là đôi mắt. Chỉ v ớ i mộ t lượng tử của ánh sáng rơi trên mắt ngườ i đã có thể gây ra xung thần kinh và phản ứng trong não bộ. Trong kh i các thiết bị tinh v i nhất của ngành vật lý hiện đ ạ i cũng chưa c ó kh ả 76 năn g ghi nhận một năng lượng nhỏ như vậy. Có những ngư ờ i c ó thể đọc được suy nghĩ của ngư ờ i khá c kh i h ọ ở gần nhau. Có những người thông thạo gần 100 ngoại ngữ. Những "thiết bị" hay hệ thống cấu trúc phân tử nào đã tạo ra những thuộc tính đặc biệt n hư vậy của vật chất sống? Hệ thống sống có các mức tổ chức và điều khiển khác nhau. Tươn g ứng v ớ i các mức tổ chức khá c nhau của hệ thống sống sẽ là các hệ tự đi ều chỉnh và đi ều khi ể n thích hợp (sơ đ ồ 3.5). Mức phân tử: Bắt đầu là cấu trúc phân tử với hàng vạn cá c hợp chất vô cơ và hữu cơ,trong đ ó có: - Cá c monomer như các đường đơn, các axit amin, cá c nucleotid... Sự có mặt của m ỗ i monomer trong t ế b à o với hàm lượng là bao nhiêu, được tổng hợp kh i nào và ở đâu đ ề u được đi ều chỉnh hợp lý. - Cá c polymer của sự sống như polysaccharid, các proteins, các lipids, các phân tử A R N và ADN.. . Trong đ ó quan trọng nhất là gen và đi ều khi ển hoạt hoa của gen. Mức trên phân tử: Tiế p đ ế n là các tổ chức trên phân tử do tổ hợp của vô số các phân tử tạo ra như Operon, nhi ễm sắc thể, hệ thống Cytochrom trong lục lạp (cytochrom là thiết bị d ẫ n truyền của hàng triệu các dòng đi ện tử li ti trong bộ má y quang hợp ở thực vật) hệ thống màn g của t ế bào... Đặc đi ểm cấu trúc ở mức trên phân tử được quy định bởi cấu trúc đặc thù của các phân tử do gen xác định. Mức tế bào quan (organell): Trên nữa là các tổ chức nộ i bào bên trong m ỗ i t ế bào: nhân t ế bào, ty thể , lục lạp... trong t ế bào chất được gọ i là tế bào quan. Tế bào sống: Cá c tổ chức trên đây chưa có thể gọ i là sống kh i n ó chưa tạo ra t ế bào với những đặc trưng độc lập như: khả năng sinh sản bằng nhân đôi, kh ả năng trao đ ổ i chất với mô i trường ngoài. Virus có thể coi là cơ thể sống (có kh ả năng sinh sản) chỉ kh i nó được k ý sinh trong t ế b à o chủ. Trên mức tổ chức tế bào là mô, cơ quan, cơ thể sống, trên nữa là quần thể, quần xã, hệ sinh thái, xã hộ i loài ngườ i trong mố i tương tác thường xuyê n về năng lượng và vật liệ u với t h ế giới khôn g sống và toàn vũ trụ. ứ n g với m ỗ i mức tổ chức chắc chắn phải có các mức đi ều khi ển và tự đi ều khi ển thích hợp. Các nhà khoa học đã xác định được rằng tổ chức sống luôn là tổ chức "tự nó" . Cá c phân tử "tự nó " tái tổ hợp với nhau để tạo ra các tổ chức trên phân tử. "Tự tổ chức" và "tự điều chỉnh" đ ó là phương thức vận động tốn ít năng lượng nhất trong một hệ thống phức tạp như vậy. Đ i ề u đáng nói ở đây là hệ đi ều khi ển trong cơ thể sống luôn là hệ tự đi ều chỉnh và thích ứng một cách tuyệt vời với mô i trường nộ i tạ i và bên ngoài. 77 Sơ đồ 3.5. Các mức khác nhau trong tổ chức sống từ phân tử đến tế bào (Theo Nelson. D.L and CoxMM, 2000) Phân bào và phân hoa tế bào và cơ quan là các thang bậc trong hệ điều hành gen: N ế u t ế bào luôn sinh sản bằng nhâ n đôi mộ t các h chín h xác , nếu thôn g tin d i truyền ở mọ i t ế bào sống trong cơ thể của chún g ta đ ề u được copy giống hệt nhau, thì tạ i sao từ một t ế b à o phôi ban đ ầ u , chún g ta lạ i c ó mộ t c ơ th ể sống hoà n chỉnh v ớ i những c ơ quan chức năn g khá c biệ t và b ổ sung l ẫ n nhau mộ t các h hà i hoa và nhịp nhàn g nh ư vậy. H ệ tiêu hoa tạo ra vật liệ u và năn g lượng cho cơ thể hoạt động gồm miệng, hà m răng , thực quản, tuyến nước bọt, d ạ dày, gan, mật... cảm giác ngá n ăn kh i no và thèm ăn kh i thiếu chất. H ệ h ô hấp v ớ i nhí p thờ cung cấp oxy tới cá c mao mạch của hai lá ph ổ i và tả i thán k h í từ cơ thể ra ngoài, rồ i cảm giá c thiếu hơi làm ta phả i thở sâu và nhịp th ở được tăn g cường kh i cơ thể vận động mạnh. H ệ tuần hoà n vận tả i vật liệu , dưỡng kh í đ ế n m ỗ i t ế b à o sống và vận chuyển chất thải, thán khí ra ngoài. H ệ thần kin h của chún g ta đi ề u phố i hoạt động sống, những xúc cảm nghệ thuật và th ẩm mỹ , trí nhớ và kh ả năn g sán g tạo, tình yêu. Phân hoa cơ quan tạo ra sự khá c biệt và sự thống nhất trong toàn c ơ thể . Đi ề u khi ể n qu á trình phâ n hoa của t ế bào là cả một khoa học v ề phá t tri ển cá thể . Tín h thống nhất và tính " hà i hoa" tuyệt m ỹ trong sự "phân hoa" và phâ n côn g chức nân g bê n trong cơ thể sống còn đan g n ằm trong bí mậ t của hệ đi ều khi ể n của t ế b à o và cơ thể . Đi ề u 78