Lục Vân Tiên quê ở huyện Đông Thành, khôi ngô tuấn tú, tài kiêm văn võ. Nghe tin triều đình mở khoa thi, Vân Tiên từ giã thầy xuống núi đua tài. Trên đường về nhà thăm cha mẹ, gặp bọn cướp Phong Lai đang hoành hành, chàng đã một mình đánh tan bọn cướp, cứu được Kiều Nguyệt Nga. Cảm ân đức ấy, Nguyệt Nga tự nguyện gắn bó suốt đời với Vân Tiên và tự tay vẽ một bức hình chàng giữ luôn bên mình. Còn Vân Tiên tiếp tục cuộc hành trình, gặp và kết bạn với Hớn Minh, một sĩ tử khác.
Sau khi về nhà thăm cha mẹ, Vân Tiên cùng tiểu đồng lên đường đi thi, ghé thăm Võ Công, người đã hứa gả con gái là Võ Thể Loan cho chàng. Từ đây, Vân Tiên có thêm người bạn đồng hành là Vương Tử Trực, tới kinh đô lại gặp Trịnh Hâm, Bùi Kiệm. Thấy Vân Tiên tài cao, Hâm và Kiệm sinh lòng đố kị, ghen ghét. Lúc sắp vào trường thi, Vân Tiên nhận được tin mẹ mất, liền bỏ thi trở về quê chịu tang. Dọc đường về, Vân Tiên đau mắt nặng rồi bị mù cả hai mắt, lại bị Trịnh Hâm lừa đẩy xuống sông. Nhờ giao long dìu đỡ đưa vào bãi, Vân Tiên được gia đình ông ngư cứu mạng. Sau đó, chàng lại bị cha con Võ Công hãm hại đem bỏ vào hang núi Thương Tòng. Được Du thần và ông Tiều cứu ra, Vân Tiên may mắn gặp lại Hớn Minh (vì trừng trị cậu công tử con quan ỷ thế làm càn mà Hớn Minh phải bỏ thi, sống lẩn tránh trong rừng). Hớn Minh đón Vân Tiên về an dưỡng bệnh. Khoa thi năm ấy Tử Trực đỗ thủ khoa, trở lại nhà họ Võ hỏi thăm tin tức Vân Tiên. Võ Công ngỏ ý muốn gả Thể Loan, bị Tử Trực cự tuyệt và mắng thẳng vào mặt, Võ Công hổ thẹn quá ốm chết.
Nghe tin Lục Vân Tiên đã chết, Kiều Nguyệt Nga thề sẽ thủ tiết suốt đời. Thái sư đương triều hỏi nàng cho con trai không được, đem lòng thù oán, tâu vua bắt Nguyệt Nga đi cống giặc Ô Qua. Thuyền đi tới biên giới, nàng mang theo bức hình Vân Tiên nhảy xuống sông tự tử. Phật Bà Quan Âm đưa nàng dạt vào vườn hoa nhà họ Bùi. Bùi Công nhận nàng làm con nuôi, nhưng Bùi Kiệm lại nằng nặc đòi lấy nàng làm vợ. Nguyệt Nga phải trốn khỏi nhà họ Bùi, vào rừng nương tựa một bà lão dệt vải.
Lục Vân Tiên ở với Hớn Minh, được tiên cho thuốc, mắt lại sáng, liền trở về nhà thăm cha, viếng mộ mẹ, thăm cha của Kiều Nguyệt Nga. Đến khoa thi, chàng đỗ Trạng nguyên và được nhà vua cử đi dẹp giặc Ô Qua. Hớn Minh được tiến cử làm phó tướng. Đánh tan giặc, Vân Tiên một mình lạc trong rừng và gặp lại Nguyệt Nga. Chàng về triều tâu hết sự tình, kẻ gian ác bị trừng trị, người nhân nghĩa được đền đáp, Lục Vân Tiên và Kiều Nguyệt Nga sum vầy hạnh phúc
Mục đích chính của Nguyễn Đình Chiểu khi viết tác phẩm Lục Vân Tiên là để truyền dạy đạo lý làm người:
Hỡi ai lẳng lặng mà nghe
Dữ răn việc trước, lành dè thân sau
Trai thời trung hiếu làm đầu
Gái thời tiết hạnh là câu trau mình.