🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Vi sinh vật học môi trường Ebooks Nhóm Zalo TRẦN VIẾT CƯỜNG (Chủ biên) BÙI VĂN HẠT, LÊ THỊ BÍCH LAM, NGUYỄN XUÂN HUY PHẠM QUANG HÀ, BIỀN VĂN MINH GIÁO TRÌNH VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG NHÀ XUẤT BẢN BÁCH KHOA HÀ NỘI 1 Biên mục trên xuất bản phẩm của Thư viện Quốc gia Việt Nam Giáo trình vi sinh vật học môi trường / Trần Viết Cường (ch.b.), Bùi Văn Hạt, Lê Thị Bích Lam... - H. : Bách khoa Hà Nội, 2018. - 368tr. : hình vẽ, bảng ; 27cm Thư mục: tr. 366-367 1. Vi sinh vật học 2. Môi trường 3. Giáo trình 579.0711 - dc23 BKM0072p-CIP 2 LỜI NÓI ĐẦU Vi sinh vật học môi trường là ngành khoa học nghiên cứu các đối tượng vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên và nhân tạo. Nguồn gốc của các nghiên cứu bắt đầu từ sự quan sát của Antonie van Leeuwenhoek (1684). Ông đã sử dụng những chiếc kính hiển vi thủ công tự tay làm và là người đầu tiên quan sát thấy các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông gọi là “animalcules” (những động vật nhỏ bé), ngày nay được gọi là "vi sinh vật". Trong suốt nhiều thế kỷ tiếp theo, sự hiểu biết của chúng ta về vi sinh vật môi trường được dựa trên những quan sát chi tiết và các thí nghiệm với sự giúp đỡ của kính hiển vi và các công cụ lý, hóa, sinh cũng như toán học hiện đại. Như chúng ta đã biết, vi sinh vật hiện diện khắp nơi, trong đất, trong nước, không khí, trong cơ thể sinh vật khác, đặc biệt chúng có thể tồn tại trong những môi trường khắc nghiệt nhất. Chúng đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất. Vì thế, chúng được xem là một mắt xích quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất. Giáo trình vi sinh vật học môi trường dùng cho sinh viên ngành Khoa học môi trường gồm hai tín chỉ lý thuyết và một tín chỉ thực hành, giới thiệu một cách khái quát về các nhóm vi sinh vật, các quá trình chuyển hóa vật chất trong môi trường tự nhiên và nhân tạo. Qua đó, người học có thể nắm bắt được các quy luật chuyển hóa chất hữu cơ và vô cơ bởi vi sinh vật nhằm điều khiển và áp dụng chúng một cách hiệu quả trong các công trình xử lý chất thải. Nghiên cứu sự tác động tương hỗ giữa các cơ thể vi sinh vật, giữa vi sinh vật và môi trường (các tác nhân lý, hóa và sinh học) nhằm kiểm soát sự sinh trưởng, phát triển và nâng cao hiệu quả xử lý chất thải của chúng khi được áp dụng. Từ đó chúng ta sẽ có những hiểu biết đúng đắn về vi sinh vật và tầm quan trọng của chúng trong môi trường tự nhiên cũng như nhân tạo. Để giúp cho sinh viên tự học, tự nghiên cứu, trong quá trình biên soạn, chúng tôi đã cố gắng đưa vào giáo trình những kiến thức cơ bản nhất, hiện đại nhất của vi sinh vật học môi trường, đồng thời chú ý những vấn đề gợi mở cần tiếp tục nghiên cứu. Mỗi chương đều có trình bày mục tiêu, tóm tắt chương, bài tập, câu hỏi gợi mở, giải thích thuật ngữ khó. Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện nội dung nhưng giáo trình chắc chắn không thể tránh khỏi những nhược điểm và thiếu sót nhất định. Vì vậy, chúng tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của bạn đọc để cuốn sách được hoàn thiện hơn cho lần xuất bản sau. Chúng tôi xin chân thành tiếp thu và cảm ơn! CÁC TÁC GIẢ 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate BOD Biochemical Oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa) CMC Carboxymethyl cellulose COD Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa học) CFU Colony-forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CKS Chất kháng sinh DO Dissolved Oxygen (Lượng oxy hòa tan trong nước cần thiết cho sự hô hấp của các sinh vật nước) DNA Deoxyribonucleic acid ĐVNS Động vật nguyên sinh F-6-P Fructose-6-phosphate FAD Flavin adenine dinucleotide G-6-P Glucose-6-phosphate GAP Glyceraldehyde phosphate KDPG 2-Keto-3-deoxy-6-phosphogluconate N Nitrogen (Nitơ) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide dạng oxy hóa NADH Nicotinamide adenine dinucleotide dạng khử NADP+ Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng oxy hóa NADPH MT Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng khử Môi trường PP Pentose phosphate RNA Ribonucleic acid TDS Total dissolved solids (Tổng chất rắn hòa tan) TSS Turbidity & suspendid solids (Tổng chất rắn lơ lửng) TOC Total Organic Carbon (Tổng carbon hữu cơ) TS Total solids (Tổng chất rắn) VOCs Volatile Organic Compounds (Các hợp chất hữu cơ bay hơi) SS Suspended solids (Chất rắn lơ lửng) VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật 4 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................................... 3 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................. 4 CHƯƠNG MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 15 0.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG ..... 15 0.1.1. Khái niệm chung .......................................................................................... 15 0.1.2. Nội dung môn học vi sinh vật học môi trường ............................................. 17 0.1.3. Yêu cầu môn học vi sinh vật học môi trường .............................................. 17 0.2. LỊCH SỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG .................................................................................................... 18 0.2.1. Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 18 0.2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 20 0.3. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG .................................. 21 0.3.1. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên ........................................................... 21 0.3.2. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống và sản xuất của con người ............... 21 0.4. ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG VIỆT NAM .......................................................................................................... 22 0.4.1. Nghiên cứu cơ bản ....................................................................................... 22 0.4.2. Nghiên cứu ứng dụng và triển khai kỹ thuật ................................................ 22 0.4.3. Xúc tiến hoạt động chuyển giao công nghệ tiên tiến ................................... 23 0.5. VỊ TRÍ VI SINH VẬT TRONG SINH GIỚI ....................................................... 23 0.5.1. Một số hệ thống sinh giới ............................................................................. 23 0.5.2. Vi sinh vật là một hợp phần của môi trường sống ....................................... 26 TÓM TẮT CHƯƠNG ................................................................................................. 26 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ............................................................................................. 27 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ....................................................................................... 28 Chương 1. VI SINH VẬT NHÂN SƠ .............................................................................. 30 1.1. VI KHUẨN (Bacteria) ......................................................................................... 30 1.1.1. Hình dạng và kích thước .............................................................................. 30 1.1.2. Cấu trúc của vi khuẩn ................................................................................... 32 5 1.2. VI KHUẨN ĐẶC BIỆT ....................................................................................... 39 1.2.1. Xạ khuẩn (Actinomycetes) ........................................................................... 39 1.2.2. Niêm vi khuẩn (Myxobacteriales) ................................................................ 41 1.2.3. Xoắn thể (Spirochaetales) ............................................................................ 41 1.2.4. Mycoplasma ................................................................................................. 41 1.2.5. Rickettsia ...................................................................................................... 42 1.2.6. Chlamydia .................................................................................................... 43 1.2.7. Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) ..................................................................... 44 1.2.8. Ý nghĩa thực tiễn của vi khuẩn ..................................................................... 44 1.3. VI KHUẨN CỔ (Archaea) .................................................................................. 45 1.3.1. Các cơ thể sinh methane (methanogenes) .................................................... 45 1.3.2. Các cơ thể ưa mặn (halophiles) .................................................................... 45 1.3.3. Vi khuẩn cổ ưa nhiệt cao (hyperthermophiles) ............................................ 46 1.3.4. Các cơ thể ưa nhiệt cao, ưa acid (Thermoacidophiles) ................................ 46 1.3.5. Vai trò của vi khuẩn cổ ................................................................................ 46 TÓM TẮT CHƯƠNG ................................................................................................. 48 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ............................................................................................. 50 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ....................................................................................... 51 Chương 2. VI SINH VẬT NHÂN THỰC ........................................................................ 52 2.1. VI NẤM (Microfungi) VÀ NẤM MŨ (Crimini) ................................................. 52 2.1.1. Nấm men (Yeasts, Levures) ......................................................................... 54 2.1.2. Nấm sợi (Molds) .......................................................................................... 57 2.1.3. Nấm mũ (Crimini) ........................................................................................ 60 2.2. VI TẢO (Microalgae) .......................................................................................... 63 2.2.1. Đặc điểm chung ............................................................................................ 63 2.2.2. Đời sống của vi tảo ....................................................................................... 63 2.2.3. Vai trò của vi tảo trong môi trường .............................................................. 64 2.3. ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH ............................................................................. 65 2.3.1. Đặc điểm chung ............................................................................................ 65 2.3.2. Các nhóm động vật nguyên sinh .................................................................. 66 2.3.3. Vai trò của động vật nguyên sinh trong môi trường .................................... 66 TÓM TẮT CHƯƠNG ................................................................................................. 67 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ............................................................................................. 68 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ....................................................................................... 69 6 Chương 3. VIRUS HỌC .................................................................................................... 70 3.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUS ........................................................................... 70 3.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VIRUS .................................................................... 72 3.3. HÌNH DẠNG, KÍCH THƯỚC VÀ CẤU TRÚC CỦA VIRUS .......................... 73 3.3.1. Hình dạng và kích thước .............................................................................. 73 3.3.2. Cấu trúc của virus ......................................................................................... 74 3.4. SỰ NHÂN LÊN CỦA VIRUS ............................................................................. 78 3.4.1. Hấp phụ ........................................................................................................ 78 3.4.2. Xâm nhập, cởi vỏ và phiên mã ..................................................................... 79 3.4.3. Tổng hợp các thành phần của virus .............................................................. 80 3.4.4. Lắp ráp.......................................................................................................... 81 3.4.5. Giải phóng .................................................................................................... 81 3.5. BACTERIOPHAGE ............................................................................................ 81 3.5.1. Cấu trúc của phage ....................................................................................... 81 3.5.2. Sự nhân lên của phage độc trong vi khuẩn ................................................... 82 3.5.3. Tính tiềm tan và phage lambda (λ) .............................................................. 83 3.5.4. Phương pháp khảo sát phage ........................................................................ 84 3.5.5. Ứng dụng của phage ..................................................................................... 85 3.6. CÁC BỆNH DO VIRUS ...................................................................................... 86 3.7. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ, HÓA HỌC ĐẾN VIRUS ... 88 3.8. CÁC THỰC THỂ DƯỚI VIRUS ........................................................................ 88 3.8.1. Viroid ........................................................................................................... 88 3.8.2. Prion ............................................................................................................. 89 TÓM TẮT CHƯƠNG ................................................................................................. 93 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ............................................................................................. 93 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ....................................................................................... 95 Chương 4. SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT ...................................................................... 96 4.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VI SINH VẬT ............................................... 96 4.1.1. Nước ............................................................................................................. 96 4.1.2. Protein .......................................................................................................... 96 4.1.3. Carbohydrate ................................................................................................ 97 4.1.4. Lipid và các chất tương tự (lipoid) ............................................................... 97 4.1.5. Một số chất hữu cơ có hoạt tính sinh học ..................................................... 97 4.1.6. Các nguyên tố khoáng .................................................................................. 97 7 4.2. DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT .................................................................. 97 4.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng ..................................................................................... 97 4.2.2. Chất dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi sinh vật ................................... 98 4.2.3. Các kiểu dinh dưỡng ở vi sinh vật ................................................................ 99 4.2.4. Vi sinh vật nguyên dưỡng và khuyết dưỡng .............................................. 101 4.3. SINH TRƯỞNG VÀ SINH SẢN CỦA VI SINH VẬT .................................... 101 4.3.1. Các nhân tố sinh trưởng ............................................................................. 101 4.3.2. Điều kiện sinh trưởng ................................................................................. 101 4.3.3. Sinh lý học sinh trưởng của vi sinh vật ...................................................... 104 4.3.4. Sinh trưởng trong môi trường tự nhiên ...................................................... 109 4.3.5. Sinh sản ở vi sinh vật ................................................................................. 111 4.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG .............................................................. 113 4.4.1. Phương pháp dùng hóa chất ....................................................................... 113 4.4.2. Khử trùng bằng các phương pháp vật lý .................................................... 115 4.4.3. Khử trùng bằng phương pháp phối hợp ..................................................... 116 4.4.4. Một số phương pháp khác .......................................................................... 117 4.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT ........... 117 4.5.1. Cấy truyền thường xuyên trên thạch nghiêng hoặc trích sâu vào thạch ............ 117 4.5.2. Các phương pháp bảo quản vi sinh vật khác .............................................. 117 4.6. HÔ HẤP, CHUYỂN HÓA VÀ LÊN MEN CỦA VI SINH VẬT ..................... 118 4.6.1. Hô hấp ở vi sinh vật ................................................................................... 118 4.6.2. Chuyển hóa của vi sinh vật ........................................................................ 120 4.6.3. Một số quá trình lên men của ví sinh vật ................................................... 120 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 127 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 127 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ..................................................................................... 129 Chương 5. VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG ĐẤT .......................................................... 130 5.1. MÔI TRƯỜNG ĐẤT ......................................................................................... 130 5.1.1. Thành phần rắn ........................................................................................... 130 5.1.2. Thành phần lỏng ......................................................................................... 133 5.1.3. Thành phần không khí ................................................................................ 133 5.1.4. Thực trạng thoái hóa đất tự nhiên ở Việt Nam ........................................... 134 5.2. ĐẤT LÀ MÔI TRƯỜNG SỐNG CỦA VI SINH VẬT .................................... 136 5.2.1. Các yếu tố sinh học .................................................................................... 136 5.2.2. Mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật trong đất ...................................... 136 8 5.2.3. Các yếu tố lý hóa học ................................................................................. 137 5.3. VI SINH VẬT TRONG ĐẤT ............................................................................ 138 5.3.1. Vi khuẩn (Bacteria) .................................................................................... 139 5.3.2. Xạ khuẩn (Actinomycetes) ......................................................................... 141 5.3.3. Vi khuẩn cổ ................................................................................................ 141 5.3.4. Vi nấm (Microfungi) .................................................................................. 141 5.3.5. Tảo (Algae) ................................................................................................ 142 5.3.6. Động vật nguyên sinh (Protozoa) ............................................................... 143 5.4. SỰ CHUYỂN HÓA CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ, VÔ CƠ TRONG ĐẤT ...... 144 5.4.1. Sự chuyển hóa các hợp chất carbon của vi sinh vật ................................... 144 5.4.2. Sự chuyển hóa các hơp chất hữu cơ chứa nitơ do vi sinh vật .................... 148 5.4.3. Sự chuyển hóa các hợp chất chứa phosphor của vi sinh vật ...................... 159 5.4.4. Khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh của vi sinh vật .............. 162 5.5. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG ĐẤT ................................................. 164 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 164 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 165 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ..................................................................................... 166 Chương 6. VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG KHÔNG KHÍ .......................................... 167 6.1. MÔI TRƯỜNG KHÔNG KHÍ ........................................................................... 167 6.2. SOL KHÍ VÀ SOL KHÍ SINH HỌC ................................................................. 169 6.2.1. Sol khí ........................................................................................................ 169 6.2.2. Sol khí sinh học .......................................................................................... 169 6.3. CHU TRÌNH VI SINH VẬT KHÔNG KHÍ ...................................................... 169 6.3.1. Quá trình thải .............................................................................................. 169 6.3.2. Phát tán ....................................................................................................... 170 6.3.3. Lắng đọng ................................................................................................... 170 6.4. VI SINH VẬT TỒN TẠI TRONG KHÔNG KHÍ ............................................. 171 6.4.1. Độ ẩm tương đối ......................................................................................... 171 6.4.2. Nhiệt độ ...................................................................................................... 172 6.4.3. Tia bức xạ ................................................................................................... 172 6.4.4. Oxy, các yếu tố kết hợp không khí (AOF) và ion ...................................... 172 6.5. VI SINH VẬT KHÔNG KHÍ NGOÀI TRỜI .................................................... 173 6.5.1. Phát tán lên không khí của mầm bệnh vi sinh vật trong đất ....................... 173 6.5.2. Đại dịch cúm .............................................................................................. 173 6.5.3. Vi sinh vật trong mây ................................................................................. 173 9 6.5.4. Nông nghiệp ............................................................................................... 173 6.5.5. Nước thải .................................................................................................... 174 6.5.6. Các độc tố trong không khí ........................................................................ 174 6.6. VI SINH VẬT KHÔNG KHÍ TRONG NHÀ .................................................... 175 6.7. KIỂM SOÁT SOL KHÍ SINH HỌC .................................................................. 176 6.7.1. Thông gió ................................................................................................... 176 6.7.2. Lọc khí ....................................................................................................... 176 6.7.3. Khử trùng không khí bằng các phương pháp vật lý hoặc hóa chất ............ 177 6.7.4. Cách ly........................................................................................................ 178 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 178 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 179 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ..................................................................................... 179 Chương 7. VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG NƯỚC ...................................................... 180 7.1. SINH CẢNH VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC ....................... 180 7.1.1. Các đặc điểm lý hóa ................................................................................... 181 7.1.2. Vi sinh vật phù du ...................................................................................... 183 7.1.3. Vi sinh vật tầng đáy .................................................................................... 184 7.2. CÁC KIỂU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC ................................................................................................................ 184 7.2.1. Sinh vật sản xuất ........................................................................................ 184 7.2.2. Sinh vật tiêu thụ ......................................................................................... 185 7.2.3. Quang dị dưỡng (Photoheterotrophy) ........................................................ 186 7.3. MÔI TRƯỜNG BIỂN ........................................................................................ 186 7.3.1. Quần xã sinh vật phù du ở đại dương ......................................................... 186 7.3.2. Quần xã sinh vật phù du ở tầng đáy biển ................................................... 190 7.4. MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT ......................................................................... 190 7.5. KIỂM SOÁT VÀ NGĂN NGỪA Ô NHIỄM NƯỚC Ở VIỆT NAM ............... 191 7.5.1. Thực trạng .................................................................................................. 191 7.5.2. Nguyên nhân .............................................................................................. 192 7.5.3. Tác hại của ô nhiễm nguồn nước ............................................................... 193 7.5.4. Biện pháp khắc phục .................................................................................. 193 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 194 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 195 10 Chương 8. VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG CỰC TRỊ ................................................. 197 8.1. MÔI TRƯỜNG CỰC TRỊ ................................................................................. 197 8.2. MÔI TRƯỜNG NHIỆT ĐỘ THẤP ................................................................... 197 8.3. MÔI TRƯỜNG NHIỆT ĐỘ CAO ..................................................................... 198 8.4. MÔI TRƯỜNG KHÔ VÀ BỨC XẠ CỰC TÍM ................................................ 201 8.5. MÔI TRƯỜNG THIẾU ÁNH SÁNG................................................................ 203 8.5.1. Các miệng phun thủy nhiệt ở đáy biển sâu ................................................ 203 8.5.2. Hang động đá vôi ở sa mạc ........................................................................ 204 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 205 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 206 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ..................................................................................... 207 Chương 9. VI SINH VẬT TRONG XỬ LÝ PHẾ THẢI .............................................. 208 9.1. NGUỒN GỐC PHẾ THẢI VÀ BIỆN PHÁP XỬ LÝ ....................................... 208 9.1.1. Nguồn gốc phế thải .................................................................................... 208 9.1.2. Biện pháp xử lý phế thải ............................................................................ 209 9.2. SỬ DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ RÁC THẢI SINH HOẠT .......................... 210 9.2.1. Thành phần của rác thải sinh hoạt .............................................................. 210 9.2.2. Vi sinh vật phân giải rác thải sinh hoạt ...................................................... 211 9.3. SỬ DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI ............................................. 212 9.3.1. Nguồn nước thải ......................................................................................... 212 9.3.2. Khu hệ vi sinh vật và các tác nhân gây bệnh trong nước thải .................... 213 9.3.3. Vai trò tự làm sạch nước thải của vi sinh vật ............................................. 214 9.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ PHẾ THẢI ...................................................... 215 9.4.1. Xử lý nước thải ........................................................................................... 215 9.4.2. Xử lý chất thải rắn bằng phương pháp sinh học ......................................... 228 9.5. PHÁT TRIỂN CÁC QUÁ TRÌNH XỬ LÝ CHẤT THẢI THÂN THIỆN VỚI MÔI TRƯỜNG .......................................................................................... 233 9.5.1. Phát triển và thiết kế các nồi phản ứng sinh học (Bioreactor) ................... 233 9.5.2. Quản lý chất thải tích hợp (integrates waste management) ........................ 234 9.5.3. Ứng dụng công nghệ vi sinh vật xử lý chất thải ......................................... 234 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 234 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 236 GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ ..................................................................................... 236 11 Chương 10. CHẾ PHẨM VI SINH VẬT VÀ CÁCH SỬ DỤNG ................................ 237 10.1. CÁC DẠNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ....................................................... 237 10.1.1. Chế phẩm vi khuẩn ................................................................................... 237 10.1.2. Chế phẩm vi nấm ..................................................................................... 240 10.1.3. Chế phẩm virus......................................................................................... 241 10.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ................... 241 10.2.1. Phương pháp nhiễm vào hạt giống ........................................................... 241 10.2.2. Phương pháp hồ rễ cây ............................................................................. 242 10.2.3. Bón chế phẩm vi sinh vật vào đất ............................................................ 242 10.2.4. Phun, tưới chế phẩm vi sinh vật lên cây hoặc vào đất ............................. 242 10.3. MỘT SỐ CHẾ PHẨM VI SINH VẬT THÔNG DỤNG ................................. 243 10.3.1. Chế phẩm EM........................................................................................... 243 10.3.2. Chế phẩm cố định nitơ ............................................................................. 244 10.3.3. Phân lân vi sinh ........................................................................................ 245 10.3.4. Chế phẩm sinh học BIMA (Trichoderma) ............................................... 246 10.3.5. Chế phẩm sinh học xử lý nước thải BIO-EM .......................................... 248 10.3.6. Chế phẩm sinh học “Vườn Sinh Thái” đối với nuôi trồng thủy sản ........... 248 TÓM TẮT CHƯƠNG ............................................................................................... 249 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP ........................................................................................... 249 THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG .................................................. 250 Phần 1. NHỮNG CHỈ DẪN CHUNG ............................................................................ 250 1. QUY ĐỊNH KHI THỰC HÀNH .......................................................................... 250 2. MỘT SỐ THIẾT BỊ, DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM CẦN THIẾT ........................... 251 2.1. Thiết bị .......................................................................................................... 251 2.2. Dụng cụ ......................................................................................................... 254 3. XỬ LÝ VÀ BAO GÓI DỤNG CỤ, VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM .......................... 255 3.1. Xử lý các dụng cụ thủy tinh .......................................................................... 255 3.2. Bao gói dụng cụ vật liệu ................................................................................ 256 3.3. Vật liệu .......................................................................................................... 256 3.4. Các dụng cụ cần thiết .................................................................................... 257 3.5. Pha chế .......................................................................................................... 257 4. SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI ..................................................... 257 4.1. Sử dụng kính hiển vi ..................................................................................... 257 4.2. Bảo quản kính hiển vi ................................................................................... 259 12 Phần 2. HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH .......................................................................... 261 Bài 1. Làm tiêu bản và nhuộm tế bào vi sinh vật ...................................................... 261 Bài 2. Pha chế môi trường dinh dưỡng ..................................................................... 276 Bài 3. Phân lập, nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật .................................................... 282 Bài 4. Đo kích thước tế bào và đếm số lượng vi sinh vật ......................................... 290 Bài 5. Các tính chất sinh hóa của vi sinh vật ............................................................ 302 Bài 6. Lên men và phân giải các phế thải hữu cơ ..................................................... 313 Bài 7. Vi khuẩn cố định nitơ – sản xuất và sử dụng nitragin ........................................ 327 Bài 8. Xác định hoạt tính enzyme và chất kháng sinh của vi sinh vật ...................... 335 Bài 9. Phân tích vi sinh vật trong chất thải hữu cơ ................................................... 342 Bài 10. Tham quan thực tế cơ sở xử lý chất thải ....................................................... 352 CÂU HỎI ÔN TẬP VÀ GỢI Ý TRẢ LỜI CÁC BÀI TẬP .......................................... 354 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 360 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 366 13 14 CHƯƠNG MỞ ĐẦU Mục tiêu − Nắm được một cách tổng quát về khái niệm, đặc điểm, nội dung, lịch sử nghiên cứu và vai trò của vi sinh vật học môi trường. − Hiểu được sự phân bố và vai trò của vi sinh vật trong các môi trường đất, nước, không khí… − Biết được những định hướng nghiên cứu VSV môi trường hiện nay ở Việt Nam. − Vận dụng được kiến thức về vi sinh vật học môi trường vào thực tiễn cuộc sống, góp phần bảo vệ và phát triển môi trường bền vững. 0.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG 0.1.1. Khái niệm chung Vi sinh vật (Microorganisms) là tên gọi chung của những sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được, chỉ có thể quan sát chúng bằng kính hiển vi. Vi sinh vật (VSV) gồm rất nhiều nhóm khác nhau: virus và các thực thể dưới virus, vi khuẩn, cổ khuẩn, vi nấm, protozoa, vi tảo... Môi trường là hệ thống các yếu tố vật chất tự nhiên và nhân tạo có tác động đến sự tồn tại và phát triển của con người và sinh vật (Điều 3, Luật Bảo vệ Môi trường, 2014). Theo Luật Bảo vệ Môi trường của Việt Nam, 2014: "Ô nhiễm môi trường là sự biến đổi của các thành phần môi trường không phù hợp với quy chuẩn kỹ thuật môi trường và tiêu chuẩn môi trường gây ảnh hưởng xấu đến con người và sinh vật". Trên thế giới, ô nhiễm môi trường được hiểu là việc chuyển các chất thải hoặc năng lượng vào môi trường đến mức có khả năng gây hại đến sức khỏe con người, đến sự phát triển sinh vật hoặc làm suy giảm chất lượng môi trường. Các tác nhân gây ô nhiễm bao gồm các chất thải ở dạng khí (khí thải), lỏng (nước thải), rắn (chất thải rắn) chứa hóa chất hoặc tác nhân vật lý, sinh học và các dạng năng lượng như nhiệt độ, bức xạ. Tuy nhiên, môi trường chỉ được coi là bị ô nhiễm nếu trong đó hàm lượng, nồng độ hoặc cường độ các tác nhân trên đạt đến mức có khả năng tác động xấu đến con người, sinh vật và vật liệu. Bảo vệ môi trường là những hoạt động giữ cho môi trường trong lành, sạch đẹp, cải thiện môi trường, đảm bảo cân bằng sinh thái, ngăn chặn, khắc phục các hậu quả xấu do con người và thiên nhiên gây ra cho môi trường, khai thác, sử dụng hợp lý và tiết kiệm tài nguyên thiên nhiên. "Hoạt động bảo vệ môi trường là hoạt động giữ gìn, phòng ngừa, 15 hạn chế các tác động xấu đến môi trường; ứng phó sự cố môi trường; khắc phục ô nhiễm, suy thoái; cải thiện, phục hồi môi trường; khai thác, sử dụng hợp lý tài nguyên thiên nhiên nhằm giữ môi trường trong lành". (Điều 3, Luật Bảo vệ Môi trường, 2014). Vi sinh vật học môi trường (Environmental microbiology) là một môn khoa học nghiên cứu về những hoạt động sinh lý của VSV có ảnh hưởng đến chất lượng của môi trường, tìm hiểu các quy luật phát triển của VSV trong môi trường để có những biện pháp ngăn ngừa tác động tiêu cực và phát huy tác động tích cực của chúng trong quá trình bảo vệ và phát triển môi trường bền vững. Vi sinh vật học môi trường nghiên cứu về vi sinh vật trong tất cả các loại môi trường sống (đất, nước, không khí và môi trường cực trị…) và sự tác động có lợi cũng như có hại của chúng đến sức khỏe và phúc lợi của con người. Vi sinh vật học môi trường có mối liên hệ mật thiết với các môn khoa học khác (hình 0.1). Vi sinh vật môi trường đất Vi sinh vật môi trường không khí Vi sinh vật môi trường Xử lý sinh học các chất thải độc hại Vi sinh vật công nghiệp An toàn thực phẩm Quản lý sức khỏe/bệnh nghề nghiệp Vi sinh vật chẩn đoán nước Chất lượng nước Công nghệ sinh học Hình 0.1. Mối quan hệ giữa vi sinh vật học môi trường với các ngành khoa học khác. (Pepper et al., 2015). Phục hồi sinh học (Bioremediation) – đây là quá trình làm sạch nhờ sử dụng các hệ thống sinh học (chủ yếu là các VSV) đưa môi trường trở lại trạng thái ban đầu hoặc chí ít là làm cho nó ít độc hại hơn hoặc giảm nồng độ độc hại đến mức an toàn. Đối với vi sinh vật môi trường, xử lý sinh học liên quan đến việc tăng cường và tối ưu hóa quá trình phân hủy bằng vi sinh vật các chất gây ô nhiễm để mang lại môi trường trong sạch và giảm tác động tiêu cực đến sức khỏe con người. 16 0.1.2. Nội dung môn học vi sinh vật học môi trường − Tìm hiểu các quy luật về sự phát sinh, phát triển và tiến hóa của VSV, về hình thái, cấu tạo, sinh lý, sinh hóa, di truyền của các nhóm VSV thường gặp trong môi trường tự nhiên. − Nghiên cứu vai trò to lớn về nhiều mặt của các nhóm VSV trong tự nhiên, trên cơ sở tìm kiếm các giải pháp, biện pháp, các phương pháp nhằm khai thác một cách đầy đủ nhất những tác động tích cực của VSV và ngăn chặn một cách hiệu quả nhất các tác động có hại của chúng. − Nắm được nguyên lý cơ bản của công nghệ vi sinh, bản chất của từng chế phẩm vi sinh vật, quy trình công nghệ, hiệu quả tác dụng và cách sử dụng từng loại chế phẩm vi sinh vật dùng trong xử lý chất thải, phế thải chống ô nhiễm môi trường. − Định hướng trong nghiên cứu về các lĩnh vực của công nghệ vi sinh để tạo ra nhiều loại chế phẩm vi sinh vật hữu ích ứng dụng vào công tác bảo vệ, cải tạo và phát triển môi trường bền vững. 0.1.3. Yêu cầu môn học vi sinh vật học môi trường Sau khi học xong môn học này, người học phải hình thành được các năng lực cơ bản sau: 0.1.3.1. Về kiến thức Sau khi nghiên cứu học phần này, sinh viên có thể hiểu được thực trạng, những nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường, cơ sở khoa học và các biện pháp vi sinh vật góp phần bảo vệ và phát triển môi trường bền vững hiện nay. 0.1.3.2. Về kỹ năng − Trang bị cho sinh viên cơ sở lý luận và thực tiễn về phương pháp nghiên cứu, phân lập, nuôi cấy, định loại các vi sinh vật sống trong môi trường đất, nước, không khí, vật phẩm và môi trường cực trị. − Rèn luyện kỹ năng tư duy tổng hợp, biết lựa chọn, vận dụng những nội dung thích hợp vào bảo vệ và phát triển môi trường bền vững cũng như thực tiễn sản xuất, đời sống. 0.1.3.3. Về thái độ − Yêu thích môn vi sinh vật học môi trường với mong muốn khám phá những đặc tính còn tiềm ẩn của thế giới vi sinh vật kỳ diệu ảnh hưởng đến môi trường sống. − Có năng lực tự học, tự nghiên cứu để nâng cao hiểu biết của bản thân về lĩnh vực VSV học môi trường và ứng dụng VSV vào bảo vệ và phát triển môi trường bền vững. 17 0.2. LỊCH SỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG 0.2.1. Lịch sử nghiên cứu Lịch sử phát triển của ngành vi sinh vật học môi trường có thể chia thành bốn giai đoạn: 0.2.1.1. Giai đoạn trước Pasteur (1865) Các quá trình chuyển hóa các chất trong tự nhiên đã được con người biết đến từ lâu, nhưng ban đầu chủ yếu là những ứng dụng ngẫu nhiên, theo kinh nghiệm. Về sau, Antonie van Leeuwenhoek (1632 − 1723) đã sử dụng những chiếc kính hiển vi thủ công tự tay làm và trở thành người đầu tiên quan sát thấy các “animalcules” (những động vật nhỏ bé), ngày nay được gọi là "Vi sinh vật". Từ xa xưa, con người đã biết ứng dụng một số quá trình lên men phân giải cơ chất vào đời sống: làm mắm, làm tương, muối chua rau quả, ủ phân… Cuối giai đoạn này, con người đã biết ứng dụng lên men hiếu khí để ủ phân bón, sản xuất giấm, từ đó đã phát triển một bước lớn trong lĩnh vực nuôi cấy vi sinh vật và vệ sinh môi trường. Ở giai đoạn này, con người khai thác, lợi dụng tài nguyên thiên nhiên không hợp lý làm xấu hóa chất lượng môi trường. 0.2.1.2. Giai đoạn từ 1865 − 1940 Những đóng góp chính cho sự phát triển của giai đoạn này tập trung nhất vào các công trình của nhà bác học người Pháp Louis Pasteur (1822 − 1895). Đồng thời và tiếp theo Pasteur cũng có nhiều nhà vi sinh học nổi tiếng như: − Robert Koch (1843 − 1910) nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis,1882), bệnh tả (Vibrio cholerae,1883). Ông đã sáng tạo nhiều phương pháp nghiên cứu như kỹ thuật cố định, nhuộm màu vi khuẩn, nuôi cấy và phân lập vi sinh vật trên môi trường đặc. − Năm 1884, Elie Metchnikoff (1845 − 1916) miêu tả hiện tượng thực bào (phagocyto-sis); Hans Christian J. Gram (1853 − 1938) tìm ra phương pháp nhuộm Gram. − Năm 1892, Dmitri Iwanowski (1864 − 1920) phát hiện ra mầm bệnh nhỏ hơn vi khuẩn (virus) gây bệnh khảm ở cây thuốc lá. − Năm 1894, Alexandre Yersin (1863 − 1943) và Kitasato Shibasaburo (1852 − 1931) khám phá ra vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Yersina pestis). Đặc biệt trong giai đoạn này, nhiều nghiên cứu phát hiện thêm quá trình lên men lactic và ứng dụng rộng rãi quá trình này vào đời sống thực tiễn. Phát triển nuôi cấy thu sinh khối bằng cách thổi không khí vào môi trường lỏng; công nghiệp sản xuất glycerol, acetone, butanol phát triển mạnh mẽ; các thiết bị lên men được hoàn thiện dần. Trong giai đoạn này, người ta đã biết khử trùng không khí trước khi cung cấp cho các quá trình lên men hiếu khí. 18 0.2.1.3. Giai đoạn 1940 − 1970 Quá trình sản xuất kháng sinh được phát hiện, đặc biệt là quá trình sản xuất penicillin, sinh khối giàu protein. Bên cạnh đó đã sản xuất được vitamin B12 và riboflavin, hoàn thiện công nghệ sản xuất kháng sinh và bắt đầu công nghệ sản xuất amino acid và enzyme. Đây cũng là giai đoạn hoàn thiện toàn bộ thiết bị lên men. Quá trình lên men được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học, nông nghiệp, bảo vệ môi trường… 0.2.1.4. Giai đoạn từ năm 1970 đến nay Được đánh dấu bằng sự phát hiện ra các enzyme cắt giới hạn restrictase là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù của Daniel Nathans (1928 − 1999), Werner Arber (1929 – ), Hamilton O. Smith (1931 − ). Temin và Baltimore phát hiện các plasmid tái tổ hợp với sự gắn các gene lạ mang các thông tin tổng hợp các protein đặc biệt vào một cơ thể đã trở thành một phương pháp thông dụng và sự kiểm soát ngày càng tốt hơn sự biểu hiện của các gene này. Tuy nhiên, giai đoạn này với đặc trưng là sự tăng dân số, đô thị hóa và công nghiệp hóa phát triển nhanh đã gây ra sự ô nhiễm môi trường và phá hoại hệ sinh thái trong phạm vi rộng lớn. Môi trường sống ngày càng bị suy thoái nghiêm trọng. Các sự kiện lịch sử quan trọng của vi sinh vật học môi trường được tóm tắt như sau: − Antonie van Leeuwenhoek lần đầu tiên quan sát vi khuẩn bằng kính hiển vi thủ công vào năm 1674. − Louis Pasteur khám phá ra vai trò của vi sinh vật là tác nhân lên men vào năm 1857. − Robert Koch sử dụng đĩa thạch để đếm số lượng vi sinh vật đất vào năm 1881. − Hellriegel và Wilfarth khám phá quá trình cố định đạm trên nốt sần ở các cây họ đậu vào năm 1885. − Beijerinck và Winogradsky sử dụng các phương pháp làm giàu môi trường có chọn lọc để phân lập các chủng vi sinh vật thuần khiết có khả năng cố định đạm, oxy hóa hợp chất ammoniac thành nitric acid và cố định nitơ của các vi sinh vật cộng sinh và độc lập. − Ghi nhận các quần thể đa dạng ở trong đất như: vi khuẩn, nấm, tảo, sinh vật đơn bào, giun tròn, ấu trùng chân khớp. − Nhà khoa học người Nga Omelianskii lần đầu tiên phân lập được loài vi khuẩn Methanobacillus omelianskii có khả năng phân giải cellulose trong điều kiện kỵ khí năm 1902. − Cornelius Bernardus Van Niel và cộng sự nghiên cứu vi khuẩn có khả năng sử dụng sulfur năm 1931. 19 − Fred và cộng sự mô tả các đặc trưng của vi khuẩn nốt sần cây họ đậu vào năm 1932. − Phát hiện và phát triển kháng sinh mới. − Phương pháp quan sát trực tiếp các vi sinh vật môi trường dưới kính hiển vi nhờ quá trình nhuộm và cố định tiêu bản. − Phát triển kỹ thuật đánh dấu phóng xạ. − Đa dạng hóa các tiến bộ trong phân tích hóa học để định tính cũng như định lượng các hợp chất hóa học trong môi trường. − Phát triển phân loại sinh học phân tử bởi Woese năm 1977 và Pace năm 1997. − Áp dụng các phương pháp phân tử trong vi sinh vật môi trường bởi Olsen và cộng sự năm 1986, Pace và cộng sự năm1986; Amann và cộng sự các năm 1991 và 1995; Ward và cộng sự năm 1993; White năm 1994; van Elsas và cộng sự năm 1997; Madigan và Martinko năm 2006…. 0.2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu chủ yếu được sử dụng là phân tích, đánh giá môi trường các vùng lãnh thổ, sử dụng các công cụ tin học, hệ thông tin địa lý và kỹ thuật viễn thám trong nghiên cứu môi trường, đánh giá tác động môi trường các hoạt động kinh tế, xã hội; quy hoạch môi trường. Tiến hành quan sát, thu mẫu tại các điểm thực địa lựa chọn và thực nghiệm tại phòng thí nghiệm. Các phương pháp trên thường tạo ra các chế phẩm ở ba mức độ: − Nghiên cứu trên từng đối tượng vi sinh vật cụ thể. − Nghiên cứu tác động của vi sinh vật đến sự biến đổi môi trường tại một khu vực, vùng lãnh thổ cụ thể trong hệ sinh thái. − Nghiên cứu các đặc điểm sinh học, tạo chế phẩm vi sinh tại phòng thí nghiệm. Các đối tượng vi sinh vật thường được tiến hành nghiên cứu trong thời gian ngắn, gọi là phương pháp cấp diễn. Còn chế phẩm tiến hành nghiên cứu trong thời gian dài, gọi là phương pháp trường diễn. Phương pháp khoa học gồm các bước cơ bản. Sau khi thu mẫu và quan sát một vài hiện tượng trong môi trường tự nhiên, một giả thiết sẽ được đưa ra. Để biến giả thiết thành giả thiết khoa học, nó được chứng minh bằng các thực nghiệm và quan sát. Nếu giả thiết đưa ra phù hợp với thực nghiệm và quan sát thì sẽ có kết luận và được nêu thành một luận thuyết khoa học. Trong phương pháp khoa học, các số liệu thu được phải được lượng hóa bằng cách đo lường từ các nhóm thực nghiệm và các nhóm đối chứng. Các kết quả và số liệu thu được sẽ xử lý bằng phương pháp toán học thống kê có ý nghĩa. 20 0.3. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG 0.3.1. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên Vật chất trong tự nhiên luôn tuần hoàn: chuyển từ dạng vô cơ sang dạng hữu cơ và ngược lại. Trong quá trình tuần hoàn ấy, các cơ thể sống được chia thành ba nhóm tùy theo vai trò của chúng: Toàn bộ cây xanh và các vi sinh vật quang dưỡng tổng hợp các chất hữu cơ từ carbon dioxide nhờ sử dụng năng lượng mặt trời, nên được gọi là sinh vật sản xuất. Toàn bộ động vật sử dụng phần lớn sinh khối sơ cấp vào việc tạo ra năng lượng và một phần nhỏ vào việc tổng hợp sinh khối của chúng, nên được gọi là sinh vật tiêu thụ. Nấm và vi khuẩn có vai trò tích cực trong sự phân hủy chất hữu cơ của mọi động vật, thực vật thành chất vô cơ (sự vô cơ hóa hay sự khoáng hóa, mineralization), do đó được gọi là sinh vật phân hủy. Nấm đóng vai trò này trong môi trường đất, còn vi khuẩn trong cả môi trường đất và môi trường nước. Như vậy, các cơ thể sống tham gia vào sự tuần hoàn vật chất trong tự nhiên bằng cách làm cho vật chất ấy tuần hoàn từ dạng vô cơ sang dạng hữu cơ và ngược lại, thông qua các phản ứng khử và phản ứng oxy hóa. Các phản ứng khử và oxy hóa do các cơ thể sống thực hiện ấy cùng các quá trình không sinh học dẫn đến chu trình sinh địa hóa (biogeochemical cycles) là sự tuần hoàn của toàn bộ các nguyên tố trong nội bộ một phần hoặc giữa các phần của hệ sinh thái khổng lồ của chúng ta (Trái Đất), gồm khí quyển, thủy quyển, thạch quyển và sinh quyển. 0.3.2. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống và sản xuất của con người Chính nhờ sự vô cơ hóa chất hữu cơ mà các nguyên tố trong chất hữu cơ được trở về dạng vô cơ để trả về cho khí quyển và cho đất hay nước, do đó, sự sống không bị ngừng trệ. Nhiều khí vô cơ được trả về khí quyển, trong đó CO2 được dùng cho cây xanh thực hiện quang hợp, nhiều chất vô cơ được trả về đất và nước như N, P, S được cơ thể sống hấp thụ để tổng hợp trở lại các chất hữu cơ. Cũng chính bằng sự vô cơ hóa mà vi sinh vật tham gia vào sự tự làm sạch các thủy vực bị ô nhiễm hữu cơ ở mức vừa phải, cũng như tham gia vào sự phân hủy xác sinh vật và chất hữu cơ vẫn luôn xảy ra trong đất, làm cho mặt đất chúng ta đang sống nói chung không bị ngập tràn trong xác động, thực vật đến không còn nơi để sống. Mặt khác, sự vô cơ hóa nhờ VSV là cơ sở của hầu hết các quá trình phục hồi sinh học (bioremediations) đối với các môi trường nước và đất. Khi con người và động vật tiếp xúc với môi trường mang vi sinh vật gây bệnh, độc tố của chúng sẽ gây ra nhiều bệnh cho cơ thể, có thể để lại hậu quả nghiêm trọng, thậm chí dẫn đến tử vong. Các bệnh thường gặp là thương hàn do vi khuẩn Salmonella, tả do V. cholerae, lỵ do Shigella, lao do Mycobacterium... Ngoài ra còn có thể dẫn đến các 21 triệu chứng ngộ độc nghiêm trọng nếu chúng ta ăn phải độc tố của vi khuẩn như độc tố botulinum của vi khuẩn độc thịt Clostridium botulinum, độc tố enterotoxin của vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus… Trong thực tế đời sống hiện nay, người ta đã biết lợi dụng những biến đổi có lợi của vi sinh vật để tạo ra những sản phẩm, chế phẩm có chất lượng và phù hợp hơn cho nhu cầu ngày càng cao của con người. Như sử dụng sinh khối vi sinh vật làm nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng, ứng dụng các quá trình lên men rộng rãi trong việc sản xuất các loại thực phẩm quan trọng như: rượu, bia, nước giải khát, bánh mì, nước mắm, mì chính…, cũng như làm tăng giá trị dinh dưỡng của các loại thực phẩm như tempeh, natto… được lên men từ đậu nành. Sản xuất các loại phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu vi sinh thay thế cho các loại phân bón, thuốc trừ sâu hóa chất độc hại. 0.4. ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT HỌC MÔI TRƯỜNG VIỆT NAM Lĩnh vực vi sinh vật học môi trường hiện đang tập trung nghiên cứu theo ba nhóm định hướng chính: 0.4.1. Nghiên cứu cơ bản − Phân lập và tuyển chọn chủng giống vi sinh vật môi trường. − Lưu giữ và bảo quản các chủng giống có năng suất, chất lượng tốt. − Nghiên cứu cấu trúc vi sinh vật, di truyền và cải biến chủng giống vi sinh vật. − Nghiên cứu cơ chế lên men của vi sinh vật làm cơ sở cho nghiên cứu công nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi sinh vật. − Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật để áp dụng vào xử lý, cải tạo môi trường. − Nghiên cứu đa dạng và sinh thái của vi sinh vật nhằm ứng dụng trong lĩnh vực quan trắc và xử lý ô nhiễm môi trường. 0.4.2. Nghiên cứu ứng dụng và triển khai kỹ thuật − Nghiên cứu xây dựng các quy trình lên men phát triển sinh phẩm và công nghệ từ vi sinh vật môi trường chất lượng cao thay thế các công nghệ và sinh phẩm nhập ngoại (như enzyme, probiotic cho người và vật nuôi, chế phẩm vi sinh vật khác) phục vụ nông − ngư nghiệp và môi trường. − Phát triển, tiếp cận và ứng dụng công nghệ cao về protein, enzyme, công nghệ gene và kỹ thuật nano nhằm tạo ra các sinh phẩm cao cấp phục vụ trong y – dược, bảo vệ môi trường. 22 − Kết hợp thành tựu nghiên cứu vi sinh vật, công nghệ lên men, sinh học phân tử để phát triển các chế phẩm vi sinh mới phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu như: màng sinh học, nhựa sinh học, nhiên liệu sinh học và các dung môi hữu cơ có giá trị khác. 0.4.3. Xúc tiến hoạt động chuyển giao công nghệ tiên tiến Xúc tiến hoạt động chuyển giao công nghệ sản xuất và ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật phục vụ cho xử lý ô nhiễm môi trường, sản xuất nông lâm ngư nghiệp… mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội. 0.5. VỊ TRÍ VI SINH VẬT TRONG SINH GIỚI 0.5.1. Một số hệ thống sinh giới Giới (Regnum) là đơn vị phân loại hiện nay bao gồm những sinh vật có chung những đặc điểm nhất định. Các hệ thống phân loại sinh vật là kết quả của hơn 200 năm nghiên cứu về hệ thống học. Hệ thống các cơ thể ngày càng hợp lý nhờ những hiểu biết sâu sắc về sinh học phân tử. Ngày nay, nhờ các phương pháp phân loại hiện đại như: hóa phân loại (Chemotaxo-nomy), phân loại số (Numerical taxonomy), phân loại chủng loại phát sinh (Phylogeney taxonomy)... mà khoa học đã xác định khá chính xác vị trí của các nhóm cơ thể và mối liên hệ chủng loại phát sinh giữa chúng. Bảng 0.1. Một số hệ thống phân loại Hệ thống Giới Sinh vật bao gồm Đặc điểm phân loại Linnaeus (1735) Vegetabilia Animalia Nấm, tảo, thực vật ĐVNS, động vật bậc cao Hình thái, cấu tạo, sinh sản Haeckel (1865) Plantae Animalia Protista Tảo đa bào, thực vật Động vật Vi khuẩn, ĐVNS, nấm men, nấm sợi Whittaker (1969) (hình 0.2) Plantae Animalia Fungi Protista Monera Tảo đa bào, thực vật Động vật Nấm ĐVNS, sinh vật nhân chuẩn đơn bào Vi khuẩn và vi khuẩn lam Kiểu dinh dưỡng Woese (1977) (hình 0.3) Bacteria Archaea Eucarya VK thường gặp sống trong tự nhiên VK sống trong môi trường đặc biệt: kỵ khí, muối cao hay nhiệt độ cao, pH thấp ĐVNS, nấm, tảo, thực vật, động vật Trình tự rRNA 23 Đa số vi sinh vật là đơn bào và ít phân hóa về hình thái. Do đó, theo Linnaeus, chúng nằm phần lớn trong giới Vegetabilia (giới thực vật), phần nhỏ trong Animalia (giới động vật) (bảng 0.1). Theo Haeckel, chúng lại được xếp trong giới Protista (giới nguyên sinh). Whittaker với hệ thống phân loại năm giới thì tách VSV vào ba giới: Monera (giới khởi sinh), Protista và Fungi (hình 0.2). Còn Woese chia VSV vào hai giới vi khuẩn và vi khuẩn cổ, một phần trong giới Eukaryote (ĐVNS, nấm và tảo). Các đặc điểm căn cứ để phân loại ở các hệ thống phân loại là không giống nhau: Linnaeus, Haeckel dựa chủ yếu vào đặc điểm hình thái, Whittaker thì lấy kiểu dinh dưỡng, Woese dựa vào trình tự rRNA. Theo đề nghị của nhà bác học Thụy Điển C. Linnaeus (1707 – 1778), hội nghị quốc tế các nhà sinh vật học đã thông qua hệ thống các đơn vị phân loại sinh vật từ thấp lên cao như sau: Loài (Species), Chi (Genus), Họ (Familia), Bộ (Ordo), Lớp (Classis), Ngành (Phylum) và Giới (Regnum). Hiện nay, trên giới còn có một mức phân loại nữa gọi là Lĩnh giới (Domain). Đó là chưa kể đến các mức phân loại trung gian thấp hơn có tiền tố (Sub-) hay cao hơn (Super-)… Nhờ có hệ thống phân loại sinh vật mà người ta có thể biết vị trí của mỗi cá thể trong cây phát sinh từng nhóm sinh vật. Hình 0.2. Hệ thống phân loại năm giới của R. H. Whittaker (1920 – 1981). 24 Loài: là đơn vị cơ bản của hệ thống các đơn vị phân loại kể trên. Nó tập hợp các cá thể sinh sống trong một khoảng không gian xác định, giống nhau về các dấu hiệu hình thái, sinh học và sinh thái. Các cá thể của loài này cách biệt về phương diện sinh sản với các cá thể của loài khác. Giống: bao gồm một hoặc là tập hợp của một số loài có nhiều đặc điểm chung và có điều kiện sống gần giống nhau. Tương tự như vậy, một giống hoặc tập hợp của một số giống gần gũi tạo thành một họ; một hoặc tập hợp của một số họ gần gũi – một bộ; một hoặc tập hợp của một số bộ gần gũi – một lớp; một hoặc một tập hợp của một số lớp gần gũi – một ngành; tập hợp của một số ngành gần gũi – một giới. Để tránh nhầm lẫn, người ta đặt tên loài theo nguyên tắc dùng tên kép (theo tiếng Latinh). Tên thứ nhất là tên chi (viết hoa), tên thứ hai là tên loài (viết thường), ví dụ: Escherichia coli. Khi cần viết tắt ta chỉ viết tắt tên chi, tên loài viết đầy đủ (bằng chữ thường), ví dụ: E. coli. Một loài bất kỳ chưa được định tên thì thường viết tắt là "sp." còn số nhiều là "spp.". Thông thường tên chi và loài in chữ nghiêng. Vào những năm 1970, các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép phân tích trình tự nucleic acid, bao gồm các RNA ribosome với các cấu trúc bảo toàn cao được sử dụng trong tổng hợp protein của sinh vật. Dựa vào kết quả phân tích trình tự rRNA 16S, Carl Woese đã phân ra một giới sinh vật mới là vi khuẩn cổ − Archaea, từ đó đưa ra hệ thống phân loại hiện đại gồm ba giới: Bacteria, Archaea và Eukarya (hình 0.3). Hiện tại, các tài liệu về phân loại tại Hoa Kỳ sử dụng hệ thống 6 giới: Animalia – Động vật, Plantae – Thực vật, Fungi – Nấm, Protista – Sinh vật Nguyên sinh, Archaea – Vi khuẩn cổ, Bacteria – Vi khuẩn. Trong khi đó, các tài liệu tương tự tại Anh và Australia lại sử dụng hệ thống năm giới: Animalia – Động vật, Plantae – Thực vật, Fungi – Nấm, Protista – Sinh vật Nguyên sinh, Monera – Giới Khởi sinh. Hình 0.3. Cây phát sinh chủng loại chung của sinh giới dựa vào trình tự rRNA. (Woese, 1977) (Jeffrey et al., 2011). 25 0.5.2. Vi sinh vật là một hợp phần của môi trường sống Vi sinh vật do có kích thước hiển vi và do có nhiều khả năng sinh học rất đặc biệt mà tồn tại ở hầu khắp mọi nơi trên Trái Đất: ngay xung quanh chúng ta (đất, nước, không khí, đồ dùng, thực phẩm…) và ngay trên bề mặt cơ thể, trong cơ thể chúng ta (trên da, trong xoang miệng, xoang ruột…). Trong tự nhiên, ở những môi trường bình thường – nơi có các điều kiện thuận lợi cho hầu hết cơ thể sống (về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH, oxy…) – thì có một khu hệ vi sinh vật phong phú về chủng loại và đông đúc về số lượng. Ví dụ: trong 1 gam đất ở tầng canh tác có thể có tới khoảng hơn 20 tỷ vi khuẩn, vài chục triệu vi nấm, vài chục nghìn vi tảo; trên cơ thể chúng ta, trong 1 cm2 da của vùng trán có thể có tới bốn mươi nghìn vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, còn ở vùng các ngón chân thì số vi khuẩn này là hơn một triệu; đó là chưa kể các vi sinh vật khác. Đặc biệt ở những môi trường khắc nghiệt (extreme environments), nơi mà mọi động vật và thực vật không thể tồn tại cũng vẫn có một số vi sinh vật sinh trưởng. Các môi trường cực trị ấy là những nơi có một hay nhiều điều kiện rất khắc nghiệt như nhiệt độ rất cao hoặc rất thấp, pH rất acid hoặc rất kiềm, độ mặn cao, áp suất cao, nghèo dinh dưỡng, không có oxy… Riêng về nhiệt độ, những giới hạn trên về nhiệt độ đối với vi khuẩn cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) và vi sinh vật có nhân thực (eukaryotic microorganisms) là 113, 95, và 62 0C, theo thứ tự, trong khi đó hầu hết động vật và thực vật không thể sinh trưởng ở trên 50 0C. TÓM TẮT CHƯƠNG Vi sinh vật học môi trường (Environmental microbiology) là một ngành khoa học nghiên cứu về những hoạt động sinh lý của VSV có ảnh hưởng đến chất lượng của môi trường. Vi sinh vật học môi trường nghiên cứu về vi sinh vật trong tất cả các loại môi trường sống (đất, nước, không khí, sinh vật và môi trường cực trị) và sự tác động có lợi cũng như có hại của chúng đến sức khỏe và phúc lợi của con người. Vi sinh vật học môi trường có mối liên hệ mật thiết với các môn khoa học khác như công nghệ sinh học, an toàn thực phẩm, xử lý sinh học các chất thải độc hại, vi sinh vật chẩn đoán... Người ta chia lịch sử nghiên cứu ngành Vi sinh vật học môi trường ra bốn giai đoạn: – Giai đoạn trước Pasteur (1865): Con người khai thác, lợi dụng tài nguyên thiên nhiên không hợp lý làm xấu hóa chất lượng môi trường, – Giai đoạn từ 1865 đến 1940: Biết phát triển kỹ thuật nuôi cấy VSV môi trường. 26 – Giai đoạn từ 1940 – 1970: Ứng dụng các quá trình sản xuất lên men tạo chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ, cải tạo môi trường. – Giai đoạn từ 1970 đến nay: Dân số tăng nhanh, đô thị hóa và công nghiệp hóa gây ô nhiễm môi trường, phá hoại hệ sinh thái trong phạm vi rộng lớn. Môi trường sống ngày càng suy thoái nghiêm trọng; các phương pháp nghiên cứu phân tử trong vi sinh vật môi trường được nhiều nhà khoa học thực hiện như Olsen và cộng sự năm 1986; Amann và cộng sự các năm 1991 và 1995; Ward và cộng sự năm 1993; White năm 1994; van Elsas và cộng sự năm 1997; Madigan và Martinko năm 2006…. Vi sinh vật môi trường là một ngành khoa học mới phát triển, nhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về lý luận cũng như thực tiễn nên sẽ phát triển hết sức nhanh chóng trong thế kỷ XXI. CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Vi sinh vật môi trường là gì? Yêu cầu, nội dung của môn học? 2. Lịch sử phát triển của vi sinh vật học môi trường? 3. Những tác động của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên? 4. Tại sao nói vi sinh vật là một hợp phần của môi trường? 5. Một số định hướng hiện nay trong nghiên cứu vi sinh vật học môi trường? * Chọn đáp án đúng nhất 6. Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong môi trường tự nhiên gồm: a. Virus và các thực thể dưới virus; b. Vi khuẩn (Bacteria) và vi khuẩn cổ (Archaea); c. Vi nấm (Microfungi); d. Vi tảo (Microalgae); e. Động vật nguyên sinh (Protozoa); f. Tất cả các nhóm trên. 7. Lĩnh vực vi sinh vật học môi trường Việt Nam hiện đang tập trung nghiên cứu theo các định hướng: a. Nghiên cứu cơ bản về vi sinh vật môi trường. b. Nghiên cứu ứng dụng và triển khai kỹ thuật. c. Xúc tiến hoạt động chuyển giao công nghệ tiên tiến sản xuất và ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật phục vụ cho xử lý ô nhiễm môi trường, sản xuất nông nghiệp… d. Cả ba ý trên. 27 * Điền vào các chỗ trống 8. Dựa vào trình tự các nucleotide của 16S rRNA và 18S rRNA mà Woese C. R và cộng sự đã xếp toàn bộ các cơ thể sống vào ba lãnh giới (Domains). Đó là……. 9. Các vi sinh vật hoạt động trong các địa điểm vật lý được gọi là……. của chúng. GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ 1. Môi trường là gì? Môi trường là hệ thống các yếu tố vật chất tự nhiên và nhân tạo có tác động đối với sự tồn tại và phát triển của con người. (Luật Bảo vệ Môi trường Việt Nam, 2014). 2. Môi trường sống? Môi trường sống là phần bao quanh sinh vật mà ở đó các yếu tố cấu tạo nên môi trường trực tiếp hay gián tiếp tác động lên sự sinh trưởng, phát triển và những hoạt động khác của sinh vật. 3. Sinh khối là gì? Sinh khối là tổng trọng lượng của sinh vật sống trong sinh quyển hoặc số lượng sinh vật sống trên một đơn vị diện tích, thể tích vùng. 4. Suy thoái môi trường là gì? Suy thoái môi trường là sự làm thay đổi chất lượng và số lượng của thành phần môi trường, gây ảnh hưởng xấu cho đời sống của con người và thiên nhiên. 5. Chủng (Strain): Chỉ một vi sinh vật của một loài mới phân lập. Nó mang theo ký hiệu chi, loài và chủng. Ví dụ Staphylococcus aureus ATCC 1259. 6. Loài (Species): Theo nghĩa rộng, loài là một nhóm các cá thể sinh vật có những đặc điểm sinh học tương đối giống nhau và có khả năng giao phối với nhau cho con cái hữu thụ. 7. Chi (Genus): Một đơn vị phân loại sinh học dùng để chỉ một hoặc một nhóm loài có kiểu hình tương tự và mối quan hệ tiến hóa gần gũi với nhau. 8. Họ (Familia): Tập hợp của các CHI gần nhau nhất. Họ có thể chia nhỏ thành các phân họ, các tộc, các phân tộc. Tên họ các vi sinh vật thường có tận cùng là ceae, còn các loài động vật là idae. 9 Bộ (Ordo): Bậc phân loại trên HỌ trong hệ thống thang bậc phân loại sinh vật. Là tập hợp của các họ gần nhau nhất. Tên bộ của các vi sinh vật có phần đuôi là –les. 10. Lớp (Classis): Tập hợp những BỘ có quan hệ gần nhất. 11. Ngành (Phylum): Bậc phân loại trên LỚP trong hệ thống thang bậc phân loại sinh vật. Là tập hợp của các lớp gần nhau nhất. Những ngành có đặc điểm chung nhất được xếp vào một giới. 28 12. Giới (Regnum): Sự phân chia các giới có sự thay đổi rất lớn trong lịch sử phát triển của sinh học. Đầu tiên, Linnaeus (1735) chia thế giới này thành hai giới: Động vật và Thực vật. Haeckel (1866) chia thành ba giới: Động vật, Thực vật và Sinh vật nguyên sinh (protista) bao gồm các sinh vật có đặc điểm chung là cơ thể có một tế bào nhân chuẩn (động vật nguyên sinh và tảo đơn bào). Năm 1969, Whittaker chia giới sinh vật ra làm năm giới: Khởi sinh (monera), Nguyên sinh (protista), Nấm (fungi), Động vật (animalia) và Thực vật (plantae). Năm 1985, Hội các nhà động vật nguyên sinh quốc tế đề nghị tách Động vật nguyên sinh (protozoa) ra khỏi Sinh vật nguyên sinh và thành một giới của động vật – phân giới động vật đơn bào (protozoa). Carl R. Woese và cộng sự, 1977, đã đề nghị chia thành ba lĩnh giới (Bacteria, Archaea và Eukarya). 29 Chương 1 VI SINH VẬT NHÂN SƠ Mục tiêu – Nắm được các dạng hình thái cơ bản, cấu tạo chung và cấu tạo đặc biệt của các nhóm vi sinh vật nhân sơ. – Hiểu được vai trò của các nhóm vi sinh vật nhân sơ trong đời sống, sản xuất và bảo vệ môi trường. – Phân biệt vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Ý nghĩa thực tiễn của các nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ. 1.1. VI KHUẨN (Bacteria) Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, không có màng nhân (procaryote). Thành tế bào chứa peptidoglycan (hay murein), sinh sản chủ yếu theo hình thức phân đôi, chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn nhiều so với các tế bào có màng nhân (eukaryote). Tuy có cấu trúc đơn giản nhất nhưng có khả năng trao đổi chất linh hoạt và có độ đa dạng cao nhất. Vi khuẩn chiếm ưu thế về số lượng trong môi trường. Dựa vào phân tích trình tự vùng bảo toàn của rRNA 16S, 50 ngành vi khuẩn được đánh giá. Gần một nửa số ngành đó chưa được nuôi cấy. Vì vậy, chúng ta nghiên cứu các ngành vi khuẩn môi trường đã được nuôi cấy thành công như: vi khuẩn (Bacteria), vi khuẩn đặc biệt gồm xạ khuẩn (Actinomycetes), niêm vi khuẩn (Myxobacteriales), xoắn thể (Spirochaetales), Rickettsia, Mycoplasma và vi khuẩn lam (Cyanobacteria). 1.1.1. Hình dạng và kích thước Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định. Các hình dạng và kích thước này là do thành tế bào quyết định. Bằng các phương pháp nhuộm và soi kính hiển vi, người ta có thể xác định được hình dạng và kích thước của các vi khuẩn… Để xác định vi khuẩn, hình thái là một tiêu chuẩn rất quan trọng, mặc dù phải kết hợp với các yếu tố khác (tính chất sinh hóa, kháng nguyên, khả năng gây bệnh…). Kích thước của vi khuẩn được đo bằng micromet 1μm = 10–3 mm. Kích thước của các loại vi khuẩn khác nhau thì không giống nhau và kích thước của một loại vi khuẩn cũng phụ thuộc vào điều kiện tồn tại của chúng. Về hình thái, người ta chia vi khuẩn làm ba loại chính: các cầu khuẩn, trực khuẩn và xoắn khuẩn (hình 1.1). 30 a – Cầu khuẩn b – Trực khuẩn c – Xoắn khuẩn (a) (b) (c) Hình 1.1. Hình dạng một số loại vi khuẩn thường gặp. Hình 1.2. Tương quan kích thước của các vi sinh vật Tế bào hồng cầu người kích thước 7 – 10 µm, Staphylococcus 1 µm; E.coli 1 × 5 µm; Poliovirus 30 nm, Herpesvirus 100 nm. 1.1.1.1. Cầu khuẩn Là những vi khuẩn hình cầu, mặt cắt của chúng có thể là những hình tròn, hình trứng hay hình hạt cà phê. Đường kính trung bình 1 μm. Cầu khuẩn được chia làm nhiều loại: – Micrococcus (Đơn cầu): đây là những cầu khuẩn xếp hàng đều hoặc không đều, đó là những tạp khuẩn tìm thấy trong đất, trong không khí và nước. − Diplococcus (Song cầu): là những cầu khuẩn xếp từng đôi phân chia trong một mặt phẳng. Một số gây bệnh cho người như phế cầu, lậu cầu, cầu khuẩn màng não. − Streptococcus (Liên cầu): là những cầu khuẩn xếp thành chuỗi ngắn hoặc dài. Một số loại gây bệnh cho người như Streptococcus pyogenes thuộc nhóm A của Lancefield. − Tetracoccus (Tứ cầu): các cầu khuẩn Gram dương hợp thành 4, phân chia theo hai mặt phẳng, rất ít khi gây bệnh. 31 − Sarcina (Bát cầu): các cầu khuẩn Gram dương xếp thành 8 − 16 tế bào, phân chia theo ba mặt phẳng, thường tìm thấy trong không khí. − Staphylococcus (Tụ cầu): các cầu khuẩn Gram dương hợp thành đám như chùm nho, phân chia theo mặt phẳng, một số loại gây bệnh cho người và động vật. Chúng thường phát triển nhanh chóng tính đề kháng với nhiều loại kháng sinh. 1.1.1.2. Trực khuẩn Là những vi khuẩn có hình que đầu tròn hay vuông kích thước bề rộng 1 μm, chiều dài 2 – 5 μm, bao gồm các nhóm: − Bacteria: là những trực khuẩn hiếu khí, không tạo bào tử như vi khuẩn đường ruột E. coli, vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphtheriae, vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis... − Bacillus: là những trực khuẩn hiếu khí tuyệt đối Gram dương tạo bào tử, ví dụ trực khuẩn bệnh than Bacillus anthracis, trực khuẩn cỏ khô Bacillus subtilis. − Clostridium: là những trực khuẩn kỵ khí Gram dương tạo bào tử, ví dụ trực khuẩn uốn ván Clostridium tetani, trực khuẩn ngộ độc thịt Clostridium botulinum. 1.1.1.3. Xoắn khuẩn Xoắn khuẩn là những vi khuẩn hình sợi lượn sóng và di động. Chiều dài của các vi khuẩn loại này có thể tới 30 μm. Trong loại này có ba chi gây bệnh quan trọng là Treponema (ví dụ, xoắn khuẩn giang mai Treponema pallidum), Leptospera và Borrelia. Ngoài những vi khuẩn có hình dạng điển hình trên còn có những loại vi khuẩn có hình dạng trung gian: trung gian giữa cầu và trực khuẩn là cầu – trực khuẩn như vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis); trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn mà điển hình là phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae. Cách sắp xếp của các loại vi khuẩn cũng khác nhau: đứng từng con, từng chuỗi, từng chùm hoặc hình chữ V, chữ N... là do các trục phân bào của chúng. 1.1.2. Cấu trúc của vi khuẩn Dưới kính hiển vi điện tử, cấu trúc của vi khuẩn gồm các bộ phận sau: 1.1.2.1. Vỏ nhầy (Capsule) Nhiều vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bằng một lớp vỏ nhầy (lớp glycocalyx) có bản chất hóa học là polysaccharide, protein và thậm chí có cả DNA ngoài (eDNA), ngoại trừ vi khuẩn than là polypeptide. Khi làm khô, người ta xác định được 90 − 98% trọng lượng của vỏ nhầy là nước. Vi khuẩn Acetobacter xylinum có vỏ nhầy cấu tạo bởi cellulose. Người ta dùng vi khuẩn này nuôi cấy trên nước dừa để chế tạo ra thạch dừa (Nata de coco). 32 Khi vi khuẩn mọc trên môi trường đặc (thạch 20%), thường tạo thành các dạng khuẩn lạc: Dạng S (Smooth) − trơn bóng; dạng R (Rough) − xù xì và dạng M (Mucoid) − nhầy nhớt. Ý nghĩa sinh học của vỏ nhầy là: − Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, tránh bị thực bào (trường hợp phế cầu khuẩn − Diplococcus pneumoniae). – Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn. − Là nơi tích lũy một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...). − Giúp vi khuẩn bám vào giá thể (trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans...). Các loại vỏ nhầy hay giáp mạc (Capsule): − Vỏ nhầy lớn (Macrocapsule) có bề dày > 0,2 μm. Ví dụ: Leuconostoc mesenteroides. − Vỏ nhầy bé (Microcapsule) có bề dày < 0,2 μm. Ví dụ: Pseumococcus denitrificans. − Khối nhầy (Zooglea) dùng trong xử lý nước thải. − Có những vi khuẩn chỉ hình thành vỏ nhầy trong điều kiện nhất định. Ví dụ B. anthracis tạo vỏ nhầy trong môi trường có chứa protein động vật. Streptococcus pneumoniae chỉ tạo vỏ nhầy khi xâm nhập vào cơ thể người hay động vật. Muốn quan sát vỏ nhầy thường làm tiêu bản âm với mực nho, bao nhầy có màu trắng hiện lên trên nền tối. Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo một tế bào vi khuẩn (Pearson Prentice Hall, 2008). 33 1.1.2.2. Thành (hay vách) tế bào (cell wall) Sự hiện diện của thành tế bào ở vi khuẩn được phát hiện bằng cách nhuộm Gram và bằng phân lập trực tiếp. Tác dụng cơ học như siêu âm phối hợp với ly tâm cho phép thu hoạch thành tế bào ròng, tách rời khỏi sinh chất. a) Thành tế bào vi khuẩn Gram dương Kính hiển vi điện tử cho thấy thành tế bào vi khuẩn Gram dương dày từ 15 đến 50 nm. Thành phần chủ yếu là peptidoglycan gọi là murein, một chất trùng hợp mà những đơn vị hóa học là những đường amine. N-acetyl glucosamine và acid N-acetyl muramic và những chuỗi peptide ngắn chứa alanine, acid glutamic và acid diaminopimelic hoặc lysine. Ngoài ra, thành tế bào của một số vi khuẩn Gram dương còn chứa acid teichoic. Ở một vài loại vi khuẩn, acid teichoic chiếm tới 30% trọng lượng khô của thành tế bào. b) Thành tế bào vi khuẩn Gram âm Lớp peptidoglycan mỏng hơn khoảng 10 nm và hai lớp lipoprotein và lipopolysaccharide ở bên ngoài, lớp lipoprotein chứa tất cả những amino acid thông thường. Không có teichoic acid, thành tế bào vi khuẩn Gram âm chứa một lượng lipid đáng kể, khoảng 20% trọng lượng khô của thành tế bào. Teichoic acid Lipoteichoic acid Lipopolysaccharide Porin Màng ngoài Peptidoglycan Khoang chứa chất Protein Gram âm Màng tế bào Lipid Màng protein Gram dương Hình 1.4. Sơ đồ minh họa cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Pepper et al. 2015, vẽ bởi Wayne L. Miller, McGill University) (xem hình màu 1.4 trang 360). c) Chức năng của thành tế bào Thành tế bào vi khuẩn có nhiều chức năng: − Duy trì hình thể của vi khuẩn: thành tế bào thường cứng tạo nên bộ khung, làm cho vi khuẩn có hình thể nhất định. 34 − Quyết định tính bắt màu Gram của vi khuẩn: Sự bắt màu Gram khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm là do tính thẩm thấu khác nhau đối với cồn của hai nhóm vi khuẩn đó. Nếu dùng lysozyme cắt dây nối β1-4 glycoside của peptidoglycan thì sẽ biến đổi vi khuẩn Gram dương thành dạng cầu gọi là protoplast (tế bào trần) không có thành tế bào. Ở dạng protoplast, tế bào mất luôn kháng nguyên bề mặt và thụ thể dành cho virus. Tế bào không chết nhưng không sinh sản được. Dưới tác dụng của lysozyme, tế bào Gram âm chỉ mất từng phần thành tế bào, tế bào có dạng cầu gọi là spheroplast. Tế bào vẫn còn kháng nguyên bề mặt và thụ thể của virus nên vẫn sinh sản được và bị virus tấn công. − Tạo nên kháng nguyên thân O của vi khuẩn đường ruột, để điều chế kháng nguyên O của vi khuẩn đường ruột cần xử lý vi khuẩn không di động bằng nhiệt và cồn. − Tạo nên nội độc tố của vi khuẩn đường ruột. Nội độc tố chỉ được giải tỏa lúc vi khuẩn bị phân giải. Ở vi khuẩn đường ruột, nội độc tố là những phức hợp lipopolysaccharide dẫn xuất từ thành tế bào. 1.1.2.3. Màng sinh chất (Cytoplasmic membrane) Là màng bán thấm dày khoảng 10 nm nằm sát thành tế bào. Người ta có thể chứng minh sự hiện diện của nó bằng hiện tượng ly tương hoặc nhuộm với xanh Victoria 4R. Nó chứa 60 – 70% lipid, 20 – 30% protein và một lượng nhỏ carbohydrate. Màng sinh chất có chức năng rào cản thẩm thấu của tế bào, ngăn cản không cho nhiều phẩm vật vào bên trong tế bào nhưng lại xúc tác việc chuyên chở hoạt động của nhiều phẩm vật khác vào bên trong tế bào. Ngày nay, khoa học với các thiết bị nghiên cứu hiện đại đã biết khá rõ cấu trúc màng sinh chất (xem hình màu 1.5 trang 360). Chất nền protein ngoại bào Glycoprotein Glycolipid Protein xuyên màng Glycoprotein Cholesterol Protein ngoại vi Các vi sợi actin của khung tế bào Các vi sợi trung gian của khung tế bào Hình 1.5. Mô hình cấu trúc màng sinh chất (Peter Raven et al., 2017). 35 Màng sinh chất có nhiệm vụ thẩm thấu chọn lọc vì là nơi chứa enzyme đặc biệt là enzyme chuyển hóa, hô hấp và đóng vai trò kháng nguyên thân đặc hiệu. Màng sinh chất giữ cho vi khuẩn có hình dạng nhất định và giúp vi khuẩn không bị ly giải do áp lực thẩm thấu. Màng sinh chất còn thu nhận thông tin và tham gia điều khiển sự phân chia của tế bào vi khuẩn. 1.1.2.4. Tế bào chất (Cytoplasm) Tế bào chất của vi khuẩn chứa đựng tới 80% nước dưới dạng gel. Bao gồm các thành phần hòa tan như protein, peptid, các amino acid, vitamine, RNA, ribosomes, các muối khoáng (Ca, Na, P...) và cả một số nguyên tố hiếm. Protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của vi khuẩn và khoảng 90% năng lượng của vi khuẩn để tổng hợp protein. Các enzyme nội bào được tổng hợp đặc hiệu với từng loại vi khuẩn. Tế bào chất chứa dày đặc những hạt hình cầu đường kính 18 nm gọi là ribosome. Ribosome có chức năng dịch mã mRNA thành các protein. Ribosome của vi khuẩn gồm tiểu phần lớn (50S) và tiểu phần bé (30S). Ngoài ra, còn có thể tìm thấy những hạt dự trữ glycogen, polymetaphosphate. Quá trình nhân đôi của tế bào và tổng hợp protein diễn ra tập trung ở tế bào chất. Nếu so sánh với tế bào có nhân thực (eucaryote), ta thấy trong tế bào chất của vi khuẩn không có: ti thể, lạp thể, lưới nội chất, bộ máy Golgi và cơ quan phân bào nào. 1.1.2.5. Thể nhân (Nuclear body) Thể nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen hoặc Shiff có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là một nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa một sợi DNA xoắn kép (ở Xạ khuẩn Streptomyces có thể gặp nhiễm sắc thể dạng thẳng). NST ở vi khuẩn Escherichia coli dài tới 1 mm, tức là gấp 500 đến 1000 lần chính chiều dài của vi khuẩn, được định vị tại một điểm trên màng tế bào chất lúc sắp phân chia và có khối lượng phân tử là 3.109 dalton, chứa 4,6.106 pb (cặp base nitơ). Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn. Những nghiên cứu gần đây cho thấy ở một số vi khuẩn cổ ưa nhiệt như Thermoplasma đã tìm thấy histol. 1.1.2.6. Plasmid Plasmid là trình tự DNA ngoài NST có cấu tạo vòng mã hóa các sản phẩm protein giúp tế bào có lợi thế cạnh tranh trong môi trường sống như kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng, 2,4-D và một số mã hóa cho các gen gây độc tố trên vi khuẩn gây bệnh. Plasmid được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn và vi khuẩn cổ. Plasmid thường chỉ được duy trì dưới áp lực chọn lọc, ví dụ như có mặt của kháng sinh để duy trì plasmid mã hóa kháng sinh. Mối liên hệ giữa plasmid và NST rất phức tạp bởi vì một số plasmid có thể chèn (cài xen) vào NST trong quá trình nhân đôi và có chức năng như là một phần của NST. 36 Hệ gene Hình 1.6. Một tế bào vi khuẩn có chứa plasmid và ảnh kính hiển vi điện tử phóng đại hệ gene của plasmid. Đó là một vòng DNA khép kín và thường xoắn cuộn vào nhau. (Nguồn: http://biology.kenyon.edu/) Vi khuẩn có thể mang một hoặc nhiều loại plasmid với số lượng khác nhau. Chiều dài plasmid từ 1 đến 1000 kbp. Lợi dụng sự xâm nhập và nhân lên dễ dàng của các plasmid, gần đây người ta đã thực hiện được ghép gene và chuyển gene nhờ plasmid. 1.1.2.7. Mezosome Mezosome là cấu tạo chỉ xuất hiện ở màng sinh chất của tế bào nhân sơ khi sắp phân chia, chính ở vị trí này DNA được cố định. Ở vi khuẩn Gram dương thì mezosome rất phát triển. Ở vi khuẩn Gram âm mezosome chỉ là một nếp nhăn đơn giản. Trong mezosome chứa nhiều enzyme, đặc biệt là các enzyme xúc tác hình thành ATP. 1.1.2.8. Roi (flagellum), tiêm mao (fimbriae), nhung mao (pili) Một số vi khuẩn có các cấu trúc phụ kéo dài từ lớp màng tế bào ra môi trường xung quanh của tế bào giúp cho vi khuẩn chuyển động hoặc kết dính bề mặt, bao gồm: roi, tiêm mao và nhung mao. Roi (flagellum): là cấu trúc phụ phức tạp giúp cho vi khuẩn chuyển động. Nhờ roi, vi khuẩn có thể di chuyển một khoảng cách ngắn (µm) hướng đến nơi có chất dinh dưỡng (tính hướng hóa dương tính) cũng như tránh xa hóa chất có hại (tính hướng hóa âm tính). Roi xuất phát từ hạt cơ bản ở tế bào chất qua màng ra ngoài. Về cấu tạo hóa học, roi được cấu tạo bởi protein gọi là flagelin. Các flagelin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên H. Cách sắp xếp roi là một tiêu chuẩn trong phân loại hình thái (Morphology taxonomy) vi khuẩn. Trong công tác nuôi cấy vi khuẩn, xác định roi cũng là một điểm để phân biệt giữa các loại vi khuẩn. Khi cấy trên mặt thạch, khuẩn lạc của vi khuẩn có roi thường có mép răng cưa hoặc có thùy. 37 Hình 1.7. Hình chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) của vi khuẩn đất với nhiều roi (Raven et al., 2017). Tiêm mao (Fimbriae): là cấu trúc phụ, ngắn, có số lượng lớn nằm trên bề mặt tế bào và không giúp cho vi khuẩn chuyển động. Thường có ở vi khuẩn Gram dương (như S. pyogenes) và có thể ở một số vi khuẩn Gram âm. Chúng tham gia vào việc bám vào bề mặt tế bào hình thành màng sinh học để bắt đầu quá trình lây nhiễm. Nhung mao (Pili): thường có số lượng ít hơn tiêm mao nhưng dài hơn tiêm mao. Nhung mao chỉ có ở vi khuẩn Gram âm và nó liên quan đến quá trình tiếp hợp của vi khuẩn. Trong quá trình này, DNA được trao đổi thông qua cầu nối nhung mao giữa 2 tế bào. Tiếp hợp vi khuẩn trong môi trường giúp tăng cường đa dạng vi khuẩn cũng như thích ứng tốt hơn với môi trường. + Pili giới tính (F): Ngoài roi, qua kính hiển vi điện tử còn thấy ở vi khuẩn Gram âm có một sợi dài cứng xuất phát từ thành tế bào và tận cùng là một nút. Pili là chỗ bám của phage để phage bơm vật liệu di truyền vào vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn có từ 1 – 4 pili giới tính. + Pili chung: là những sợi ngắn và thẳng cũng xuất phát từ thành tế bào. Mỗi vi khuẩn có từ 100 – 200 pili chung. Ở một số vi khuẩn, nhờ có pili mà có tính chất gây bệnh, làm cho hồng cầu bị ngưng kết. 1.1.2.9. Nội bào tử vi khuẩn (Bacterial Endospores) Một số vi khuẩn Gram dương khi gặp điều kiện không thích nghi, chúng hình thành nội bào tử. Nó là một cấu trúc “tạm nghỉ” gồm nhiều lớp màng dày khó thấm, bao ngoài bởi hợp chất calci dipicolinate (DPA–Ca) có tính bền nhiệt, chịu được ánh sáng tử ngoại, chất phân giải và nguồn dinh dưỡng thấp (hình 1.8). Một tế bào vi khuẩn chỉ tạo một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là bào tử sinh sản. 38 Một hợp chất khác của vỏ bào tử mới tìm thấy là acid L-N-succinyl-glutamic không có trong tế bào sinh dưỡng và chỉ được tổng hợp khi hình thành bào tử, ngay giai đoạn đầu khi hình thành vách ngăn DNA mới với một ít nguyên sinh chất, hợp chất này giúp cho bào tử bền nhiệt. Tùy theo từng loại vi khuẩn mà nội bào tử nằm ở giữa thân (vi khuẩn than Bacillus anthracis), ở một đầu như trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani). Khi vi khuẩn bị phân giải thì nội bào tử trở thành tự do, nếu gặp điều kiện thuận lợi, bào tử mọc mầm trở thành trạng thái vi khuẩn sinh dưỡng hoạt động như trước. Những vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử gồm nhiều loài thuộc các chi Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces... Khi hình thành bào tử, tế bào có thể mất đi 70% nước và kích thước bé lại. Bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên, ví dụ B. anthracis có thể sống tiềm sinh trong nhiều năm, trong một số chất độc, trong kháng sinh mà bình thường tế bào sinh dưỡng bị chết rất nhanh. Khi đưa bào tử vào môi trường thuận lợi để phát triển, bào tử sẽ có hàng loạt thay đổi tích cực và mọc mầm, trải qua ba giai đoạn chủ yếu: hoạt hóa, nứt vỏ và mọc ra. Muốn quan sát được bào tử, người ta dùng phương pháp nhuộm bào tử của Schaefera và Fulton, M.A. Peskov hoặc phương phương pháp Ziehl do Muller cải tiến... Nội bào tử Tế bào mẹMàng ngoài Áo bào tử Vỏ bào tử Màng bào tử Thành bào tử Tế bào chất Vi khuẩn mới C A B Thể nhân (Nucleoid) Nội bào tử Hình 1.8. Nội bào tử vi khuẩn (Manisha, 2013) A – Vị trí nội bào tử trong tế bào mẹ; B – Cấu trúc của một nội bào tử; C – Quá trình mọc mầm của nội bào tử. 1.2. VI KHUẨN ĐẶC BIỆT 1.2.1. Xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.2.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn Xạ khuẩn là tên chung để chỉ nhóm VSV đơn bào có hình sợi phân nhánh như nấm nhưng kích thước và cấu trúc giống với vi khuẩn Gram dương. Thành tế bào không chứa 39 cellulose và chitin mà có glucopeptide dày khoảng 50 µm. Nhân chưa có màng, chất nhân phân tán, chưa có ti thể, lưới nội chất và bộ máy Golgi. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU: Colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1 g đất thường có 106 − 108 CFU. Xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi phân nhánh không có thành ngăn, thường gọi là khuẩn ti, tập hợp nhiều khuẩn ti gọi là khuẩn ti thể, đường kính khuẩn ti từ 0,4 − 0,6 µm (hình 1.9). Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng một đoạn sợi; bằng bào tử (cắt khúc hay kết đoạn) sinh sản cận hữu tính bằng cách thành lập cầu tiếp hợp. 1.2.1.2. Vai trò của xạ khuẩn Xạ khuẩn tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa trong tự nhiên của nhiều hợp chất trong đất. Khoảng 80% thuốc kháng sinh thu nhận từ xạ khuẩn. Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các enzyme, một số vitamin thuộc nhóm B và acid hữu cơ. Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh dùng trong y học, nông nghiệp, bảo quản thực phẩm. Sau khi Waskman, 1943, phát hiện ra kháng sinh chống lao Streptomycin từ loài xạ khuẩn Streptomyces streptomycini thì nhóm này trở thành trung tâm của các cuộc tìm kiếm những loại kháng sinh mới. Hình 1.9. Xạ khuẩn chi Streptomyces. 1 – Hình dạng khuẩn ti xạ khuẩn; 2 – Bào tử xạ khuẩn nảy mầm; 3 – Cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử (Nguyễn Lân Dũng và CS, 2002). 40 1.2.2. Niêm vi khuẩn (Myxobacteriales) Chúng là những vi khuẩn Gram âm tạo khuẩn lạc nhầy nhớt, ký sinh hoặc hoại sinh. Chu trình sinh sản gồm hai giai đoạn: − Giai đoạn tế bào sinh dưỡng; − Giai đoạn bào tử, hình thành quả thể. Một số loài niêm vi khuẩn đã có nhân phân hóa khá phát triển. Chúng phân bố rất rộng rãi trong đất, trong phân chuồng, trong rác rưởi… Rất nhiều niêm vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ khó phân hủy như cellulose, chitin… Chúng góp phần tích cực vào những quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Theo Krassilnicov, niêm vi khuẩn bao gồm 5 họ và 13 chi. Trong đó các chi phân giải cellulose được tìm thấy thuộc chi Promyxobacteria, Cytophyta, Sporocytophyta, Sorangium. Vai trò: Niêm vi khuẩn là những vi sinh vật sống hoại sinh, hiếu khí, tiết enzyme phân hủy cellulose, chitin và nhiều chất hữu cơ phức tạp khác. Phân bố rộng rãi trong đất, rác thải hữu cơ, phân chuồng. Chúng góp phần tích cực vào những quá trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. 1.2.3. Xoắn thể (Spirochaetales) Chúng là những VSV đơn bào hình sợi xoắn không phân nhánh, chất nhân (nucleoid), tế bào xoắn có thể đi qua các lỗ màng lọc rất nhỏ (0,2 − 0,5 µm). Kích thước xoắn thể khác nhau (0,1 − 0,6) × (5 − 100) µm. Xoắn thể sinh sôi nảy nở theo lối phân cắt ngang, nhưng đôi khi có thể phân cắt theo chiều dọc, một số có thể tạo thành thể qua lọc di động bằng uốn vặn cơ thể. Khi gặp điều kiện thuận lợi, thể qua lọc phát triển thành xoắn thể bình thường. Xoắn thể không sinh bào tử, không hình thành vỏ nhầy và không chứa sắc tố, không có thành tế bào vững chắc, khó nuôi cấy trên môi trường thông thường. Xoắn thể thường gây bệnh cho người và động vật: xoắn thể giang mai (Treponema pallidum), sốt hồi quy (Borrella recurrentis). Theo Bergey, xoắn thể gồm 2 họ và 6 chi. 1.2.4. Mycoplasma Đây là loại VSV nhỏ nhất trong sinh giới có đời sống dinh dưỡng độc lập. Khó nhuộm với thuốc nhuộm kiềm, hình thể khác nhau tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy, người ta có thể quan sát bằng kính hiển vi nền đen, nhuộm Giemsa. Mycoplasma có thể phát triển trên môi trường có hoặc không có tế bào sống, hiếu khí hoặc kỵ khí tuyệt đối, nhiệt độ thích hợp 35 – 37 0C, pH 7 – 7,8. Trên môi trường lỏng khó quan sát vi khuẩn mọc vì canh khuẩn trong suốt. Trên môi trường đặc mọc thành khuẩn lạc, mọc lấn xuống thạch, rìa khuẩn lạc mỏng và bẹt. Chứa DNA và RNA, tỷ lệ RNA/DNA nhỏ hơn 1. Thuộc loại hiếu khí và hiếu khí không bắt buộc. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có đời sống hoại sinh, nhiều loại có thể gây bệnh viêm màng phổi (Pleuro-Pneumonia Like 41 Organisms – PPLO) cho người, gia súc, gia cầm. Mycoplasma có hình hạt nhỏ riêng lẻ hay tập trung từng đôi, từng chuỗi ngắn, hình vòng nhẫn, vòng khuyên, là loại Gram âm, có kích thước khoảng 150 – 300 nm. Mycoplasma không có thành tế bào, chỉ có màng nguyên sinh chất dày 70 – 100 Å, trong tế bào có các hạt ribosome và thể nhân (hình 1.10). Mycoplasma sinh sản theo phương thức cắt đôi. Hiện nay người ta đã biết khoảng 80 loài. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994), chúng thuộc bộ Mycoplasmatales và có ba họ là Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae. Hình 1.10. Tế bào Mycoplasma chụp dưới kính hiển vi điện tử (Kamran Afzan, 2010) và sơ đồ cấu tạo tế bào Mycoplasma fermentans (phải). 1.2.5. Rickettsia Rickettsia được Ricketts và Wilder phát hiện năm 1910. Rickettsia có cấu trúc giống với tế bào vi khuẩn. Chúng là loài bắt buộc ký sinh trong nội bào, nên sự tồn tại của Rickettsia phụ thuộc vào sự tồn tại, phát triển và nhân lên trong tế bào chủ. Ricketts (1909) phát hiện ra mầm bệnh của bệnh sốt thương hàn phát ban và ông đã mất năm 1910 trong khi nghiên cứu bệnh này. Vì vậy, để ghi nhớ công lao của nhà khoa học, người ta đã đặt tên ông cho nhóm vi khuẩn này là Rickettsia (hình 1.11). Vi khuẩn Rickettsia prowazekii Ký chủ Dermacentor andersoni Hình 1.11. Howard Taylor Ricketts (1871 – 1910) (Andersson et al., 2000). 42 Khác với Mycoplasma, Rickettsia có nhân, tế bào chất và màng tế bào chất, có hai loại acid nucleic là DNA và RNA nhưng hệ thống enzyme nghèo nàn, vì vậy không phát triển được ở môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Tế bào có kích thước khá thay đổi, loại nhỏ nhất chỉ là 0,25 × 1,0 µm, có loại có kích thước 0,6 × 1,2 µm, loại lớn nhất đạt 0,8 × 2,0 µm. Tế bào có hình thái biến hóa, có thể có hình que, hình cầu, hình song cầu, hình sợi. Trong tế bào chủ, Rickettsia thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, thường tụ tập thành từng khối dày đặc. Sinh sản bằng cách phân cắt thành hai phần bằng nhau. Dưới kính hiển vi điện tử, Rickettsia có thành tế bào, màng nguyên sinh chất và các thể trung tâm hình sợi gọi là chất nhân. Rickettsia chứa khoảng 30% protein, ngoài ra còn có khá nhiều lipid trung tính, phospholipid và carbohydrate. Hàm lượng DNA chiếm khoảng 9% so với khối lượng khô của tế bào. Hàm lượng RNA thay đổi tùy theo loài nhưng thường gấp 2 – 3 lần so với DNA. Rickettsia có khả năng dự trữ năng lượng trong ATP và có hệ thống enzyme cytochrome nhưng không tự tổng hợp và tích lũy được amino acid cần thiết cho chúng. Vật chủ của Rickettsia là các động vật chân đốt như ve, bét, bọ, rận, các động vật nhỏ bé này sẽ truyền mầm bệnh qua động vật và người như bệnh sốt phát ban, bệnh sốt hồi quy. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì Rickettsia thuộc bộ Rickettsiales, trong bộ này có 3 họ với 14 chi: họ Rickettsiaceae có 8 chi, họ Bartonellaceae có 2 chi và họ Anaplasmataceae có 4 chi. 1.2.6. Chlamydia Chlamydia là loại vi khuẩn nhỏ bé, Gram âm, chúng vừa có một số đặc tính giống vi khuẩn vừa có đặc tính giống virus. Giống vi khuẩn vì chúng có cấu tạo tế bào, có chứa cả hai loại acid nucleic DNA và RNA, có thành tế bào chứa peptidoglycan…, nhưng lại ký sinh trong tế bào vật chủ, hay nói một cách khác chỉ nhân lên trong tế bào chủ nhân thực (điều này giống virus). Chlamydia có cấu tạo tế bào ở hai dạng: một dạng là tế bào hình cầu có khả năng chuyển động, kích thước nhỏ (0,15 – 0,2 µm), khi nhiễm vào vật chủ, thể này tấn công và bám chắc vào mặt ngoài của tế bào chủ, loại tế bào này gọi là thể cơ bản. Thể cơ bản này xâm nhập tế bào chủ và nhờ tác dụng của thực bào ở tế bào vật chủ mà thể cơ bản này lọt vào trong tế bào, phần màng bao quanh thể cơ bản biến thành không bào, thể cơ bản dần dần lớn lên trong không bào và trở thành dạng gọi là thể lưới. Thể lưới này có tế bào hình cầu lớn, với màng bao bọc mỏng. Dạng hình cầu này có kích thước 0,8 – 1,5 µm, ở trong tế bào vật chủ dạng này có thể phân cắt chia đôi và tạo thành nhiều tế bào vi khuẩn trong vật chủ. Đây chính là hình thức sinh sản của Chlamydia. Sau khi đạt đến số lượng lớn thì các tế bào này lại phân hóa thành các thể cơ bản màng dày và có tính lây nhiễm cao. Tế bào vật chủ vỡ ra sẽ giải phóng hàng loạt những thể cơ bản và rồi vi khuẩn lại gây nhiễm vào các tế bào khác. 43 Chlamydia khi gây bệnh đường sinh dục chúng thường gây viêm cổ tử cung, viêm hố chậu, niệu đạo, đặc biệt chủng C. trachomatis còn gây đau mắt ở trẻ sơ sinh, đau mắt hột, viêm kết mạc, viêm phổi người lớn và trẻ em. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì Chlamydia chỉ là một chi thuộc họ Chlamydiaceae, bộ Chlamydiales. 1.2.7. Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) Vi khuẩn lam là nhóm vi sinh vật nhân sơ, có cấu tạo gần giống với cấu tạo của vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn lam có kích thước khoảng 1 – 30 µm (hình 1.12). Chúng có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ chứa sắc tố quang hợp α-carotene và các sắc tố phụ. Vi khuẩn lam là thành phần của thực vật phù du sống trong nước ngọt, một số sống trong vùng nước mặn giàu chất hữu cơ. Vi khuẩn lam có khả năng cố định nitơ và đề kháng cao với điều kiện bất lợi. Hình 1.12. Hình dạng vi khuẩn lam Nostoc (Ashish Dhakal – October 02, 2012) (trái); Hiện tượng nước nở hoa ở Hồ Xuân Hương – Đà Lạt (phải). Ảnh: Khắc Dũng, 2012. Một số vi khuẩn lam sống trong ao hồ thường phát triển mạnh quá mức làm nước bị đục và tạo ra hiện tượng “nước nở hoa”. Khi đó nước có màu xanh xỉn và có mùi vị khó chịu, làm giảm lượng oxy trong nước, gây hại cho cá, nhiều khi ảnh hưởng tới nguồn nước cung cấp cho các đô thị, các khu công nghiệp… 1.2.8. Ý nghĩa thực tiễn của vi khuẩn Vi khuẩn chiếm hơn 90% vi sinh vật đất, bởi vậy nó đóng vai trò quyết định trong các quá trình chuyển hóa trong đất. Vi khuẩn tham gia vào hầu hết các vòng tuần hoàn trong tự nhiên. Nhiều vi khuẩn có ích được ứng dụng vào sản xuất, chế biến nhiều sản phẩm có giá trị như mì chính, nước chấm, các loại phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu sinh học. Ngược lại, cũng có rất nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người, động thực vật như bệnh uốn ván (tetanus), sốt thương hàn (typhoid fever), giang mai (syphilis), tả (cholera), bệnh lây qua thực phẩm (foodborne illness) và lao (tuberculosis). Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá (leaf spot), fireblight và héo cây… và gây hư hỏng quân trang vật dụng. 44 Ngày nay, với những thành tựu khoa học hiện đại, người ta đã tìm ra những biện pháp hạn chế những tác hại do vi khuẩn gây ra, ví dụ như việc dùng chất kháng sinh, vaccine phòng bệnh. 1.3. VI KHUẨN CỔ (Archaea) Vi khuẩn cổ (Archaea) là nhóm cơ thể nhân sơ xuất hiện sớm nhất (khoảng 4 tỷ năm trước đây), thành tế bào chứa pseudomurein, có intron và exon trong DNA được Carl R. Woese tách ra thành một nhánh tiến hóa riêng. Những cơ thể còn lại hiện nay thường sống trong các điều kiện khác thường. Những nghiên cứu gần đây về nhiệt độ và pH tối ưu của vi khuẩn ưa nhiệt và Archaea cho phép chia VSV cổ thành hai nhóm: Crenarchaeota và Euryarchaeota. Nhóm Crenarchaeota là những VSV cổ kỵ khí bắt buộc, ưa nhiệt và ưa acid (Thermoacidophiles, Thermophiles anaerobies stricts). Nhóm Euryarchaeota là những VSV cổ ưa mặn, sinh methane (methanogenes) và một vài loài kỵ khí ưa nhiệt. Có các nhóm sinh lý và sinh thái quan trọng là: 1.3.1. Các cơ thể sinh methane (methanogenes) Đây có lẽ là nhánh cổ xưa nhất, ở các lớp nước sâu ở đáy, kỵ khí, các thủy vực nước ngọt, nước lợ và nước mặn, trong đường ruột của động vật nhai lại và trong các nguồn chất thải động vật. Vi khuẩn methane có khả năng sử dụng H2 làm nguồn năng lượng và CO2 làm nguồn carbon để thực hiện quá trình trao đổi chất, điển hình là Methanobacterium ivanovii, M. Thermoautotrophicum... Sản phẩm của quá trình trao đổi chất là khí methane được tích tụ trong môi trường. Vi khuẩn sinh khí methane có nhiều tiềm năng được sử dụng để tạo năng lượng sinh học từ chất thải nông, công nghiệp. 1.3.2. Các cơ thể ưa mặn (halophiles) a) Vi khuẩn cổ chi Stella 0,5 μm b) Vi khuẩn cổ chi Haloacula 0,5 μm Hình 1.13. Hình thái một vài đại diện vi khuẩn cổ ưa mặn (Tortora et al.,1997). 45 Các cơ thể ưa mặn như Haloarcula, Halobacterium. Những cơ thể này sống trong môi trường có nồng độ muối cao (ở biển, ở các mỏ muối), hấp thu chất dinh dưỡng chủ yếu là do chênh lệch gradient nồng độ muối tạo ra, quá trình quang hợp ở đây khá đặc biệt nhờ Bacteriorhodopsine, hợp chất liên kết trong màng tế bào chất chứ không phải là khuẩn diệp lục (bacteriochlorophyll). 1.3.3. Vi khuẩn cổ ưa nhiệt cao (hyperthermophiles) Vi khuẩn cổ ưa nhiệt cao là những sinh vật có khả năng sống ở điều kiện nhiệt độ cao hơn cả trong giới sinh vật, chúng đều có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trên 80 0C, nhiều loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ nước sôi hoặc cao hơn nữa. Ngoại trừ một vài trường hợp, đa số vi khuẩn cổ ưa nhiệt cao sinh trưởng kỵ khí bắt buộc và thực hiện dinh dưỡng theo phương thức hóa dưỡng hữu cơ hoặc hóa dưỡng vô cơ. Hầu hết các loài đều có nhu cầu về lưu huỳnh, hoặc làm chất nhận điện tử trong hô hấp kỵ khí, hay làm chất cho điện tử trong hô hấp hiếu khí. Các loài kỵ khí có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ và vô cơ (như H2) để khử lưu huỳnh S0 thành H2S. Ngược lại, các loài hiếu khí oxy hóa H2S, S0 thành acid sulfuric. Ngoài ra, một số loài có khả năng thực hiện hô hấp kỵ khí sử dụng các chất nhận điện tử khác ngoài S0 như nitrate (Pyrolobus, Pyrobaculum), sulfate (Archaeoglobus) hay sinh methane (Methanopyrus). Về hình thái, vi khuẩn cổ ưa nhiệt cao tương đối đa dạng, nhiều loại có hình dạng tế bào đặc biệt. Các loài sống ở những vùng núi lửa dưới đáy đại dương với nhiều đại diện sinh trưởng ở trên 100 0C nhờ áp lực của nước biển. 1.3.4. Các cơ thể ưa nhiệt cao, ưa acid (Thermoacidophiles) Chúng là những cơ thể sống ở nguồn đất – nước nóng, ở vùng núi lửa, chúng là những cơ thể hiếu khí hoặc hiếu kỵ khí. Ví dụ: Sulfolobus acidocaldaricus có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 90 0C và tối ưu là 75 0C, ở pH tối ưu là 2,5. Thermoplasma acidophilum có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 65 0C và tối ưu là 60 0C, ở pH tối ưu là 1,5. 1.3.5. Vai trò của vi khuẩn cổ Vi khuẩn cổ là một nhóm vi sinh vật phân bố khắp mọi nơi, chúng sống ở những môi trường rất khắc nghiệt, như suối nước nóng hay hồ mặn, những nơi có pH thấp, trong các vùng sình lầy và đặc biệt tập trung nhiều trong các đại dương. Các vi khuẩn cổ trong cộng đồng sinh vật phù du có thể là một trong những nhóm các sinh vật có số lượng đông đảo nhất trên Trái Đất. Chúng được ghi nhận như một phần quan trọng của sự sống trên hành tinh và có thể đóng vai trò ở cả chu trình carbon, chu trình nitơ và chu trình các chất khoáng. Chưa phát hiện thấy các mầm bệnh hay ký sinh là vi khuẩn cổ, chúng thường là những sinh vật hỗ sinh hoặc hội sinh. Nhiều loài sinh methane cư trú trong ruột người và động vật nhai lại, có số lượng lớn trợ giúp tốt cho tiêu hóa. Các vi khuẩn cổ sinh methane thường được ứng dụng trong sản xuất biogas và xử lý nước thải, các enzyme từ 46 các vi khuẩn cổ sống nơi khắc nghiệt, có thể chịu được độ mặn cao, nhiệt độ cao và các dung môi hữu cơ, được khai thác trong ngành công nghệ sinh học. Bên cạnh đó cũng có một số vi khuẩn cổ sinh methane là nguồn chính của methane khí quyền và là nguyên nhân làm tăng phát thải khí nhà kính, gây ra hiện tượng ấm lên toàn cầu. Bảng 1.1. So sánh một số tính chất giữa vi khuẩn (Bacteria) và vi khuẩn cổ (Archaea) Tính chất Bacteria Archaea Thành phần thành tế bào Lipid của màng Hình dạng tế bào có loại hình vuông và dẹt Nội bào tử (endospore) Chất "ở nhánh" của RNAt Hình thành chất kích thích methionyl RNAt Các intron trong gen Có Polymerase – RNA loại nhân thực Có coenzyme đặc biệt Nhiệt độ sinh trưởng tối đa Có quang hợp phức tạp Có thể sinh methane Chu trình Calvin được sử dụng khi cố định CO2 Murein Glycerol, acid béo, ester – + (hoặc không) Ribothymidin + – – – 90 0C Có thể – Có thể Pseudomurein, protein, polysaccharide Glycerol, ester isopropanol + (hoặc không) – Pseudouridine hoặc L-methylpseudouridine – + + + 110 0C hoặc hơn – + – 47 TÓM TẮT CHƯƠNG Vi sinh vật nhân sơ là các sinh vật có cấu trúc đơn giản nhất, nhân chưa có màng (thường gọi là thể nhân – nucleoid) chưa có ty thể, lưới nội chất và bộ máy Golgi. Sinh vật nhân sơ bao gồm vi khuẩn và vi khuẩn cổ (Archaea). Đặc tính cấu trúc của sinh vật nhân sơ được tóm tắt ở (bảng 1.2). Vi khuẩn thật (Bacteria) là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ, nhân chưa có màng, 1 NST trần, chưa có hiện tượng xoang hóa, sinh sản chủ yếu theo hình thức phân đôi. Chúng thường có thành tế bào với thành phần cấu tạo là murein (peptidoglycan). Xạ khuẩn (Actinomycetes) là tên chung để chỉ nhóm VSV đơn bào có hình sợi phân nhánh như nấm nhưng kích thước và cấu trúc giống với vi khuẩn Gram dương, có vai trò quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, trong y học, thú y học, trong bảo vệ thực vật. Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) có chứa sắc tố quang hợp tilacoid, nên có khả năng quang hợp. Chúng có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều protein, amino acid, vitamin và nhiều yếu tố sinh trưởng khác. Chúng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình hình thành và cải tạo đất, là nguồn thức ăn tốt cho thủy sản. Các vi khuẩn cổ (Archaea), mà trước đây gọi là Archaebacteria, là nhóm cơ thể nhân sơ xuất hiện sớm nhất (khoảng 3,5 – 4 tỷ năm trước đây), thành tế bào chứa pseudomurein, có intron và exon trong DNA. Vi khuẩn cổ là một nhóm VSV đa dạng, không những về hình thái và sinh lý, mà còn về môi trường sống, cung cấp nguồn gene quý và có vai trò rất quan trọng trong hệ sinh thái trên Trái Đất mà hiện nay con người còn chưa hiểu rõ được. Bảng 1.2. Cấu trúc và chức năng tế bào sinh vật nhân sơ Vị trí Cấu trúc Chức năng Tế bào chất Nhiễm sắc thể Plasmid Ribosome – Chứa thông tin di truyền và quá trình nhân đôi (DNA). – DNA ngoài nhiễm sắc thể cung cấp các lợi thế cạnh tranh cho tế bào như kháng kháng sinh… – Tổng hợp protein (rRNA và protein). Vỏ bọc tế bào Màng tế bào – Màng thấm chọn lọc có ở các loại vi khuẩn cho phép hấp thụ và đào thải chất dinh dưỡng, độc tố và các sản phẩm đào thải của tế bào, được cấu trúc bởi 2 lớp phospholipid và protein tạo thành các kênh trao đổi ion, bơm proton và các thụ thể. 48 Thành tế bào Khoang chu chất (periplasmic space) Màng ngoài Lipopolysaccharide (LPS) Teichoic acid Lớp S – Cứng, cấu trúc bán thấm nhằm tạo hình và bảo vệ tế bào. – Chứa các chất dinh dưỡng đạt được, vận chuyển điện tử, biến đổi các độc chất đối với tế bào. – Màng bán thấm thứ hai chỉ được tìm thấy ở các tế bào Gram âm. Lớp ngoài cùng chứa các phân tử lipopolysaccharide (LPS) – nội độc tố. – Nằm ở lớp ngoài của màng ngoài tế bào Gram âm. Các phân tử mang điện tích âm giúp tế bào tương tác gián tiếp với môi trường. Các phân tử này là nội độc tố và kháng nguyên. – Nằm chèn vào thành peptidoglycan của các tế bào Gram dương. Các phân tử mang điện tích âm giúp tế bào tương tác gián tiếp với môi trường, bám dính... Acid teichoic là kháng nguyên. – Lớp protein đơn phân ở bề ngoài của tế bào, bảo vệ tế bào chống lại các thể ăn khuẩn (phage), đóng vai trò bảo vệ sự xâm nhập của các đại phân tử, giúp ổn định tế bào và cũng có vai trò điểm bám dính cho các protein bên ngoài. Lớp S kết hợp với LPS ở vi khuẩn Gram âm, với peptidoglycan ở vi khuẩn Gram dương, với Pseudomurein hay Methanochondroitin ở Archaea. Mặt ngoài tế bào Glycocalyx – Một lớp hỗn hợp polysaccharide, protein và DNA ngoài bao bọc bên ngoài màng tế bào, bảo vệ tế bào khỏi bị thực bào và khô. Một lớp khuếch tán không đều có vai trò như lớp chất nhờn và một lớp phân biệt khác như là giáp mạc. Phần phụ Roi Tiêm mao hay vi nhung – Phần phụ dài ra giúp cho việc di chuyển của tế bào. – Cấu trúc protein mảnh và rỗng giúp cho việc bám dính giữa các tế bào cũng như các bề mặt. 49 CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Các loại vi sinh vật nhân sơ? Vi khuẩn phân bố ở đâu? 2. Đặc điểm của các loại vi sinh vật nhân sơ? 3. Vai trò của các loại vi sinh vật nhân sơ? 4. Xạ khuẩn giống và khác nấm sợi ở những đặc điểm nào? 5. Khuẩn lạc của xạ khuẩn giống và khác với khuẩn lạc nấm sợi ở những đặc điểm nào? 6. Vai trò của vi khuẩn cổ? Archaea khác với Bacteria ở những đặc điểm nào? * Chọn đáp án đúng nhất 7. Đặc điểm chung của vi khuẩn và xạ khuẩn là: (1). Chưa có nhân phân hóa; (2). Chưa có bào quan có màng bao; (3). Thành tế bào chứa peptidoglycan; (4). Chưa có sinh sản hữu tính; (5). Ribosome 70S. a. 1 – 2 – 3 – 4; b. 2 – 3 – 4 – 5; c. 1 – 2 – 3 – 5; d. 1 – 2 – 4 – 5; e. Tất cả các ý trên. 8. Peptidoglycan gặp ở thành (vách) tế bào vi khuẩn chứa tất cả các phân tử sau đây, trừ: a. NAM; b. Các tetrapeptide; c. NAG; d. Các phospholipid. 9. Mục đích nào sau đây của thành tế bào vi khuẩn là mục đích chủ yếu? a. Nó cho phép tế bào di động; b. Nó giúp tế bào thu nhận chất dinh dưỡng. c. Nó tạo cho tế bào một hình dạng đặc thù; d. Nó bảo vệ tế bào khỏi lực thẩm thấu. 10. So sánh một số tính chất giữa vi khuẩn và vi khuẩn cổ Đặc điểm so sánh Bacteria Archaea a. Tế bào có dạng hình vuông hoặc hình sao b. Không hình thành nội bào tử c. Không có intron trong gene (hệ gene không phân mảnh, gene liên tục) d. Nhiều loài sinh methane và dinh dưỡng methane e. Sống trong điều kiện sinh thái đặc biệt f. Lipid màng có glycerol, acid béo mạch thẳng và liên kết ester g. Có thymine trong tRNA 50 * Điền vào các chỗ trống 11. Sự khác biệt cơ bản giữa tế bào Prokaryote với tế bào Eukaryote là ở chỗ: a. Nguyên liệu di truyền của chúng...................... không được bao bọc bởi........ b. Thiếu các bào quan như:....................................được bao bọc bởi màng. c. Thành tế bào luôn luôn chứa phức hệ....................hay còn gọi là.......... d. Ribosome của các tế bào prokaryote thuộc loại............................ 12. Nội bào tử là thể.......(a)........ của các tế bào vi khuẩn, không phải là phương tiện sinh sản, khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và mỗi bào tử chi cho....(b)....tế bào sinh dưỡng. GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ 1. Angstrom (Å): Đơn vị đo chiều dài tương ứng 10–10 m. 2. Archaea: Vi khuẩn cổ, trước đây dùng là Archaebacteria. 3. Bào tử đính (Conidiospore): Bào tử vô tính được sinh ra từ đầu của cuống bào tử. 4. Bộ gen của vi khuẩn: là một phân tử DNA dạng vòng gấp khúc và tự xoắn nằm trong tế bào chất (còn gọi là nhiễm sắc thể vi khuẩn hay nucleoid). Chiều dài 1 mm nhưng gấp khúc để nằm trong tế bào có đường kính 2 – 3 μm. Không gian chật hẹp còn buộc DNA tạo nên cấu trúc siêu xoắn (supercoil). DNA được chuyển đổi trong quần thể nhờ: tiếp hợp, tải nạp và biến nạp. 5. Cuống bào tử (Conidiophore): Sợi khí sinh mang các đính bào tử. 6. Intron: là những đoạn DNA bên trong một gene nhưng không tham gia vào việc mã hóa protein. Chúng thường xuất hiện trong các sinh vật eukaryote và không được tìm thấy trong các sinh vật prokaryote (đôi lúc được tìm thấy trong các loài vi khuẩn cổ). 7. Khuẩn lạc (Colony): Một dòng tế bào được sinh ra trên môi trường đặc nhờ sinh sản vô tính phân đôi từ tế bào ban đầu, có thể nhìn thấy khuẩn lạc bằng mắt thường. 8. Nội bào tử (endospore) là dạng nghỉ của tế bào khi gặp điều kiện không thích nghi. Nội bào tử có lớp vỏ dày và chứa Calcium dipicolinate (C12H8CaN2O4). 9. Nucleoid: Thể nhân, nhân sơ chưa có màng nhân bao bọc. 10. Plasmids: (thường) là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể chứa thông tin cho một đặc điểm nào đó, ví dụ tính kháng thuốc. Chúng thường hiện diện trong vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật có nhân thực (eukaryote) (ví dụ như vòng 2 micrometre ở S. cerevisiae). Chúng có kích thước khoảng từ 1 đến hơn 400 kilobase pairs (kbp). Chúng có thể hiện diện chỉ một bản sao, đối với plasmid lớn, cho tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào. 11. Xạ khuẩn (Actinomycetes): Vi khuẩn Gram dương, trong chu trình sống hình thành hệ sợi phân nhánh không vách ngăn, đầu cuống bào tử có thể hình thành bào tử riêng lẻ hoặc chuỗi. Các xạ khuẩn hình thành bộ xạ khuẩn (Actinomycetales, Bergay’s Manual, 1989). 51 Chương 2 VI SINH VẬT NHÂN THỰC Mục tiêu − Nắm được đặc điểm đặc trưng của các nhóm vi sinh vật nhân thực. − Hiểu được chức năng của các nhóm vi sinh vật nhân thực. − Vận dụng những hiểu biết về đặc điểm của vi sinh vật nhân thực để ứng dụng trong xử lý chất thải, nước thải cải tạo và bảo vệ môi trường. Vi sinh vật nhân thực bao gồm các vi sinh vật nhân có màng nhân, tế bào có hiện tượng xoang hóa, có các bào quan có màng bao quanh như ti thể, lưới nội chất, bộ máy Golgi. Các nhóm vi sinh vật có nhân thật bao gồm vi nấm (nấm men, nấm sợi), vi tảo và một số nguyên sinh động vật. 2.1. VI NẤM (Microfungi) VÀ NẤM MŨ (Crimini) Vi nấm gồm nấm nem và nấm sợi (hay nấm mốc) là những sinh vật nhân thực có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn vi nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số vi nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào, phần lớn, không có lục lạp, không có lông và roi. Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh, hay cộng sinh. Sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Nấm mũ là các loài nấm thuộc ngành Basidiomycota và Agaricomycetes. Các cơ thể nấm với cấu tạo thành tế bào, kiểu trao đổi chất và hệ enzyme khác biệt với các cơ thể nhân thực khác (thực vật, động vật) và khác xa với cơ thể nhân sơ nên từ lâu đã được xếp thành một giới riêng − đó là giới nấm (Regnum fungi). Có bốn đặc tính khác biệt giữa nấm và thực vật: + Nấm thiếu chlorophyll, trong khi thực vật có chứa chlorophyll. + Thành tế bào nấm chứa carbohydrate được gọi là chitin, thành tế bào thực vật chứa cellulose. + Phần lớn nấm không có dạng đa tế bào thực như ở thực vật. + Nấm là loài dị dưỡng, thực vật tự dưỡng. Theo phương pháp truyền thống, định danh loài nấm thường dựa vào hình thái, cấu trúc bào tử và cấu tạo màng acid béo. Có khoảng 75 000 loài được miêu tả trong số 1,5 triệu loài nấm có thể tồn tại. Tuy nhiên, với việc sử dụng phương pháp giải trình tự DNA hiện đại (High-throughput sequencing) thì số lượng loài có đến 5,1 triệu loài. 52 Dựa vào đặc điểm hình thái, vi nấm được phân thành hai nhóm chính: nấm men (Levures, Yeasts) và nấm sợi (Moisissures). Trong đất, vi nấm có vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ thành các chất dinh dưỡng cho thực vật, cấu trúc nên lớp mùn màu mỡ của đất, tham gia vào sự chuyển hoá các chất vô cơ trong đất. Một số loài nấm có khả năng lên men thực phẩm như lên men rượu (Saccharomyces cerevisiae), một số có khả năng sinh chất kháng sinh (Penicillium sp.), enzyme, các acid hữu cơ và nhiều chất khác. Hình 2.1. Một số chi vi nấm (M.H. Cениюкова, 2015). a – Rhizopus; b – Mucor; c – Aspergillus; d – Penicillium. 1 – Túi bào tử; 2 – Cuống bào tử; 3 – Rễ giả; 4 – Bào tử đính; 5 – Thể bình; 6 – Cuống sinh bào tử đính; 7 – Sợi bò lan. Màng nấm và thành tế bào nấm là cấu trúc phức tạp có vai trò thẩm thấu chọn lọc và bảo vệ. Như sinh vật nhân thực, nấm có màng bao quanh các bào quan và được cấu tạo bởi hai lớp phospholipid bên ngoài và lớp protein chèn ở giữa. Thêm vào lớp phospholipid, màng nấm còn chứa sterol, glycolipid và sphingolipid, có thể dùng làm khóa để phân loại nấm. Thành tế bào nấm là cấu trúc nhiều lớp bao gồm chitin, N-acetylglucosamine gốc đường, cellulose, galactosan, chitosan và mannan. Một số thành tế bào còn chứa protein và lipid (Xem hình màu 2.2 trang 361). Glycoprotein β-glucan α-glucan Màng bào tương Hình 2.2. Cấu trúc thành tế bào nấm (Pepper et al., 2015). 53 Vi nấm không có một chu trình phát triển chung. Tùy loài mà có một trong năm kiểu chu trình phát triển: (1) chu trình lưỡng bội; (2) chu trình hai thế hệ; (3) chu trình đơn bội; (4) chu trình đơn bội – song nhân và (5) chu trình vô tính. Vi nấm có nguồn gốc chưa rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau, các ngành, thậm chí các lớp trong một ngành đã bắt nguồn từ các tổ tiên khác nhau. Người ta cho rằng nấm cổ có tổ tiên từ trùng roi nào đó. Các dạng nấm hiện nay đã xuất hiện rất lâu. Các bào tử của chúng rất giống với bào tử của những loài nấm trong lớp đất của các kỷ xa xưa. Trong đất thuộc Mezozoi (cách đây 70 – 185 triệu năm) tìm thấy di tích của nấm rất giống với nấm thuộc bộ Mốc, nước của nấm noãn và nấm túi chưa hoàn chỉnh thuộc chi Diplodia… Vi nấm là những loài sinh vật hóa dị dưỡng, phân giải đường đơn tạo thành carbon và năng lượng, tuy nhiên, nguồn đường đơn giản trong môi trường hạn chế. Vì vậy, nhiều loại nấm tiết ra enzyme ngoại bào để phân hủy các đại phân tử phức tạp thành các hợp chất carbon đơn giản cho tế bào sử dụng. Nấm đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy và tuần hoàn xác thực vật, côn trùng và động vật, đặc biệt là các đại phân tử cấu thành nên chúng như cellulose và lignin ở thực vật, chitin ở côn trùng. Nhờ khả năng phân hủy các đại phân tử, các chất thải trong môi trường được phân hủy và tuần hoàn. Loài nấm men Aureobasidium pullulans có khả năng phân hủy nhựa PVC. Sợi nấm Penicillium, Stachybotrys, Allescheriella và Phlebia có khả năng phân hủy các hydrocarbon thơm trong sản phẩm dầu mỏ và thuốc trừ sâu. Nấm Mycorrhizae hay nấm vùng rễ (khuẩn căn) sống cộng sinh ở nhiều thực vật làm tăng bề mặt hấp thụ của rễ lên hàng trăm đến hàng nghìn lần, giúp cho rễ cây tăng khả năng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng, đặc biệt phosphate. Ngược lại, rễ cây cung cấp đường từ quá trình quang hợp cho nấm. Một số loài nấm sống cộng sinh ở thực vật có khả năng tạo ra hợp chất hữu cơ có thể tiêu diệt được các mầm bệnh ở thực vật như: Pythium ultimum và ở người như: Mycobacterium tuberculosis và Staphylococcus aureus. 2.1.1. Nấm men (Yeasts, Levures) 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của nấm men Nấm men là tên gọi thông dụng để chỉ một nhóm vi nấm cơ thể đơn bào, nhân có màng, sinh sản chủ yếu theo kiểu nảy chồi. Nấm men không phải là một nhóm nấm riêng biệt mà thuộc nhiều nhóm khác nhau trong giới nấm. Nấm men có thể thuộc về ba lớp nấm là nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm (Basidiomycetes) và nấm bất toàn (Deuteromycetes). Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, có thể hình cầu, hình bầu dục, hình elip, hình ống. Kích thước tế bào thay đổi từ 1,5 – 12 μm. Nếu tế bào dạng sợi thì chiều dài có thể tới 20 μm hay hơn nữa, thường là sợi nấm giả gồm nhiều tế bào dính lại với nhau theo chiều dài một cách lỏng lẻo. Trong số 75.000 loài nấm hiện đã biết có hơn 500 loài nấm men thuộc khoảng 50 giống. 54 Thành tế bào nấm men thường dày khoảng 100 – 250 nm, cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất mannan – glucan hay mannan – chitosan. Bên dưới thành tế bào là màng sinh chất có cấu tạo không khác gì mấy so với ở tế bào sinh vật khác. Màng tế bào chất nấm men thường chứa 39% lipid, 49% protein, 5% carbohydrate và 7% nucleic acid. Khác với vi khuẩn, nấm men đã có nhân phân hóa, nhân có màng nhân, lỗ thủng và nhân con. Trong tế bào nấm men có các cơ quan nhỏ như ti thể, lưới nội chất, bộ máy Golgi… Ti thể nấm men có dạng hình cầu, hình bầu dục hay hình sợi được bao bởi hai lớp màng, giữa hai lớp màng là cơ chất bán lỏng. Từ lớp màng trong lại tạo ra vô số những vách nối vào phía trong gọi là vách ngang để tăng diện tích bề mặt của màng. Ti thể là trung tâm tạo năng lượng của tế bào. Trong ti thể còn gặp cả một lượng nhỏ DNA, gọi là DNA của ti thể. Bộ máy Golgi gồm những túi, những không bào cấu tạo bởi các lớp màng xếp song song hình cung. Bộ máy Golgi tham gia vào hoạt động bài tiết các chất cặn bã, các chất độc hại ra khỏi tế bào. Lưới nội chất là hệ thống các ống, các xoang phân nhánh với cấu trúc màng tương tự như màng sinh chất. Trên màng lưới nội chất có rất nhiều ribosome, cơ quan tổng hợp protein của tế bào. Nấm men sinh sản vô tính bằng đâm chồi hoặc phân chồi, giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính. Nấm men có ba dạng chu trình sinh học: − Chu trình đơn bội – lưỡng bội như loài Saccharomyces cerevisiae. − Chu trình ưu thế lưỡng bội như loài Saccharomycodes ludgyzii. − Chu trình ưu thế đơn bội như ở loài Schizosaccharomyces octosporus. Nhờ kính hiển vi điện tử, các nhà nghiên cứu đã thấy có sự khác nhau về thời gian hình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men nảy chồi. Hình 2.3. Nảy chồi (trái) và cấu trúc của tế bào nấm men (phải). 55 2.1.1.2. Đặc điểm của nấm men loài Saccharomyces cerevisiae Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thuớc nhỏ, từ 5 – 6 đến 10 – 14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn carbon, chúng sử dụng amino acid và muối ammonium như nguồn nitơ. Sinh sản hữu tính bằng cách hình thành nang bào tử. Nang bào tử có 4 – 8 bào tử. Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, nấm men phát triển bằng cách tạo cặn lắng ở đáy. Có khả năng lên men đường saccharose, glucose, fructose, maltose, không lên men lactose. 2.1.1.3. Vai trò sinh học của nấm men Nấm men có giá trị dinh dưỡng cao vì giàu protein (45 – 55% khối lượng khô) và vitamin (tiền vitamin D và các loại vitamin nhóm B). Nấm men lại có tốc độ phát triển nhanh, có thể đồng hóa trực tiếp muối vô cơ (N, P, K) và hầu như các hợp chất carbon hữu cơ đều có thể (trực tiếp hoặc gián tiếp) dùng làm thức ăn nuôi cấy nấm men (rỉ đường, farafin, dầu mỏ... Bảng 2.1. Bảng phân nhóm đơn giản các nấm men Lớp (Classes) Bộ Họ Họ phụ Chi Nấm túi (Ascomy cetes) Endomy cetales Saccharomycetaceae Spermophthoraceae Schizosaccharum – vcetoideae Nadsonioideae Lipomycetoideae Saccharomycetoideae Schizosaccharomyces Hanseniaspora Lipomyces Debaryomyces Hansenula Kluyveromyces Pichia Sacharomyces Coccidiascus Nấm đảm (Basidiomy -cetes) Ustilagi nales Tremell ales Filobasidiaceae Leuvures Sirobasidiaceae Tremellaceae Filobasidium Leucospiridium Sirobasidium Tremalla Nấm bất toàn (Deuteromy -cetes) Blastomy cetales Cryptococcaceae Sporobolomycetaceae Cryptococcoideae Rhodotoruloideae Trichospororoideae Brettanomyces Candida Cryptococcus Torulopsis Rhodotorula Trichosporon Sporobolomyces 56 Nấm men chiếm một vị trí đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm: làm nở bột mì, nấu rượu, làm rượu vang, làm phomat, sản xuất sinh khối để tinh chế protein. Riêng sản xuất bánh mì, hằng năm thế giới đã tiêu thụ 1,7 triệu tấn nấm men bánh mì. Một số nấm men khác là nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm. Trong số này có những loài nấm men có thể phát triển được cả trong môi trường có nồng độ đường rất cao, chúng làm hỏng mứt hoa quả, mật ong, siro, một số khác gây bệnh ở người, động vật và cây trồng. 2.1.2. Nấm sợi (Molds) Nấm sợi (hay còn gọi là nấm mốc) là tên để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men, cũng không phải là nấm lớn có quả thể (nấm mũ). 2.1.2.1. Cấu tạo của nấm sợi Nấm sợi thường tạo thành những khối sợi có nhánh gọi là khuẩn ti hay sợi nấm. Sợi nấm là một ống hình trụ dài, thường phân nhánh, có loại có vách ngăn ngang như các lớp nấm bậc cao (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes) hoặc không vách ngăn thuộc về các nấm bậc thấp như Oomycetes và Zygomycetes. Một số loại nấm sợi thường dùng trong thực phẩm như Mucor, Rhizopus..., sợi nấm thường không có vách ngăn. Toàn bộ hệ sợi có thể coi là một tế bào phân nhánh, người ta gọi đấy là cơ thể đa nhân. Phần lớn sợi nấm có vách ngăn tạo nên cơ thể đa bào. Đường kính sợi nấm vào khoảng 0,3 – 5 μm, cũng có khi đạt tới 10 μm hay lớn hơn (mắt thường có thể nhìn thấy). Trên cơ chất tự nhiên hoặc trên môi trường nuôi cấy đặc (thạch đĩa, thạch nghiêng...), sợi nấm phát triển thành một hệ sợi (khuẩn ti thể) có dạng hình tròn và được gọi là khuẩn lạc nấm sợi. Nhân Thành tế bào Lỗ thông Vách ngăn Sợi nấm có vách ngăn Sợi nấm không có vách ngăn Hình 2.4. Hình dạng sợi nấm có vách ngăn và không có vách ngăn (Jeffrey et al., 2011). 57 Nấm sợi chỉ tăng trưởng ngọn. Điều đáng chú ý là các vách ngăn không ngăn ngang (ở các nấm có vách ngăn) không làm cho sợi nấm có cấu tạo đa bào hoàn chỉnh, vì các vách ngăn này đều có lỗ thông (một hay nhiều lỗ). Qua các lỗ thông này, sinh chất có thể qua lại dễ dàng mà ngay cả nhân cũng có thể thót nhỏ lại để chui qua. Kết quả là có những tế bào có nhiều nhân (thường ở phần ngọn) và ngược lại cũng có những tế bào không có nhân. Ngoài ra trong hệ sợi nấm, khi có hai đầu sợi nấm tiếp cận sát với nhau, thì thành ở chỗ tiếp cận này có thể hóa nhầy, kết quả là hai sợi liên thông với nhau (hình 2.4). Chính vì vậy, có thể nói cả hệ sợi nấm là một ống thông suốt và chất dinh dưỡng cũng như chất nguyên sinh có thể lưu chuyển dễ dàng trong ống đó. Thành tế bào nấm sợi có cấu trúc khác nhau tùy từng nhóm, đa số chứa chitin, glucan, chitosan... Tế bào nấm sợi có chứa các thành phần tương tự như ở tế bào nấm men: nhân, ti thể, bộ máy Golgi, lưới nội chất… 2.1.2.2. Đời sống của nấm sợi Nấm sợi không chứa sắc tố quang hợp, vì vậy chúng chỉ có thể có đời sống hoại sinh (trên chất hữu cơ chết), ký sinh (trên cơ thể người, động vật, thực vật) hoặc cộng sinh (với tảo trong địa y, với rễ cây trong nấm rễ). Nấm sợi sinh sôi nảy nở bằng cách đứt đoạn sợi nấm, vừa bằng cách tạo ra rất nhiều bào tử vô tính hay hữu tính (xem hình màu 2.5 trang 361). Hình 2.5. Hình ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử quét màu sợi nấm mang bào tử. (A) – Nấm mốc Rhizopus; (B) – Penicillium roquefortii (Jeffrey et al., 2011). Bào tử vô tính như: Bào tử kín, bào tử màng dày, bào tử trần, bào tử đốt, bào tử phấn.... Bào tử hữu tính (tạo thành sau quá trình sinh sản hữu tính) như: bào tử noãn, bào tử tiếp hợp, bào tử đảm. 58 Một số nấm có thể sinh ra các động bào tử một roi (chytridiomycetes) hoặc hai roi (Oomycetes) trong chu trình sinh sản của mình. Các nấm bậc cao như loài Aspergillus và Penicillium có thể hình thành cầu tiếp hợp giữa hai tế bào của hai sợi (+ và –), đó là hiện tượng sinh sản cận tính (hình 2.6). Hình 2.6. Nấm Rhizopus (trái) bào tử tiếp hợp ở Rhizopus hai sợi (+) và (–) (phải). 2.1.2.3. Vai trò của nấm sợi Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, không khí nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc khép kín các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các chất hữu cơ phức tạp. Có một số loại nấm thường có trong bùn như Geotrichum, Penicillium, Cephalosporium, và Alternaria, chúng chỉ sống ở điều kiện độ pH thấp, độc chất, chất thải thiếu nitơ. Trong bùn người ta thấy có rất nhiều Geotrichum khi ở điều kiện độ pH thấp trong nước thải acid. Hầu hết nấm sợi có đời sống dị dưỡng. Một số sống cộng sinh với thực vật, khi cộng sinh với tảo đơn bào hoặc tập hợp đơn bào thì hình thành địa y (Lichens). Nấm sợi đã được ứng dụng trong nhiều ngành kinh tế quốc dân. Trong công nghiệp dược phẩm, nấm sợi được sử dụng để sản xuất các thuốc kháng sinh như penicillin, cephalosporin, nhiều loại vitamin như B2... Trong công nghiệp hóa chất và công nghiệp thực phẩm, nấm sợi được sử dụng để sản xuất formage, citric acid, nucleic acid, gibberellin, indoleacetic acid. Nhiều nấm sợi được ứng dụng trong quá trình chuyển hóa các hợp chất steroid và alkaloid (dùng để làm thuốc). Nhiều loài nấm sợi là sinh khối rẻ tiền và có thể sản xuất dễ dàng ở quy mô công nghiệp tạo ra nguồn thức ăn bổ sung giàu protein và vitamin cho người, cho gia súc, gia cầm. Nấm sợi thường có những enzyme phân giải rất mạnh như hệ enzyme phân giải cellulose, phân giải pectin, các enzyme amylase, protease, lipase... Từ xa xưa, nhiều loài 59 nấm sợi đã được nhân dân ta sử dụng để sản xuất tương, chao, nước chấm, tạo các enzyme... Tuy nhiên, có rất nhiều loài nấm sợi ký sinh gây nên nhiều bệnh khó chữa ở người và gia súc, nhiều loại nấm gây tổn thất lớn lao cho cây trồng và cây rừng. Các bệnh nấm ở người như hắc lào, lang ben, nấm tóc... ở lúa như đạo ôn, đốm nâu, mốc sương, khô vằn... Phân loại nấm sợi chủ yếu dựa vào các tính trạng hình thái: cấu tạo sợi mang bào tử, cấu tạo bào tử và một số tính trạng sinh lý sinh hóa. Bảng 2.2. Bảng phân loại đơn giản một số giống nấm sợi Ngành Ngành phụ Lớp Bộ Chi Amastigomycota Zygomycotina (Zygomycetes) Zygomycetes Mucorales Mucor Rhizopus Ascomycotina Plectomycetes Pyenomycetes Hemiascomycetes Eurotiales Spahaeriales Endomycetales Emericella (A. nidulans) Neurospora (N. grassa) Eremothecium Basidiomycotina (Basidiomycetes) Hemibasidiomycetes Urenidales Ustilaginales Puccinia Ustilago Candida Geotrichum Deuteromycotina (Deuteromycetes) Hyphomycetes (dạng nấm men = Blastomycetes) Hyphomycetes Moniliales Aspergillus (A. flavus, A. niger) Penicillium P. votatum, P. camenbertii, P. roquefortii) 2.1.3. Nấm mũ (Crimini) Nấm mũ hay nấm quả thể thường để chỉ những loại nấm thuộc ngành Basidiomy cota và Agaricomycetes. Nấm quả thể được biết đến với hai dạng: nấm ăn được và nấm độc. Nấm ăn được sử dụng rộng rãi làm thực phẩm, chúng có thể sử dụng trong rất nhiều món ăn, ở nhiều nền ẩm thực khác nhau. Nấm là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có độ đạm cao và ít chất béo, chứa nhiều vitamin nhóm B và C. 60 Các loài nấm đảm bảo ăn được như các giống nấm mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvacea), mộc nhĩ (Auricularia), nấm hương (Lentinus), ngân nhĩ (Tremella)… đang trở thành đối tượng chủ yếu trong công nghệ nuôi trồng nấm ăn. 2.1.3.1. Đặc điểm sinh học của nấm mũ Nấm mũ là vi sinh vật nhưng không gọi là vi nấm. Phần mũ là cơ quan sinh sản, phần thân dạng sợi có kích thước như sợi nấm mốc. Nấm nói chung và nấm mũ nói riêng có nhiều đặc điểm khác với thực vật: + Nấm không có khả năng quang hợp, nghĩa là nấm không tự tổng hợp các chất hữu cơ từ nước và khí CO2 nhờ ánh nắng mặt trời. Nấm lấy chất hữu cơ từ các nguồn hữu cơ khác. + Vách tế bào nấm chủ yếu là chitin và glucan. + Nấm dự trữ đường dưới dạng glucogen thay vì tinh bột. Vì lý do đó, người ta tách nấm ra khỏi giới thực vật và thành lập một giới riêng, gọi là giới nấm. Thực tế, nấm sinh trưởng gồm hai giai đoạn: a) Hệ sợi nấm hay "thân, rễ" của nấm Các sợi nấm mảnh, nhỏ, dễ nhìn thấy ở bịch giống nấm. Khi cấy giống nấm vào nguyên liệu, những sợi nấm mọc dài mãi và phân nhánh. Trong lúc mọc dài, các nhánh ngang gặp nhau nối lại thành mạng nổi, đó là hệ sợi nấm (tương ứng với thân của cây). Nhờ tạo mạng nổi mà hệ sợi nấm thành một khối thống nhất, các chất dinh dưỡng bên trong khối hệ sợi nấm có thể vận chuyển từ chỗ này tới chỗ khác, ví như cây trồng có thể hút nước và muối khoáng từ đất đưa lên ngọn. b) Quả thể nấm và bào tử nấm Khi nấm trưởng thành, dưới mũ nấm có các phiến mỏng (phiến nấm) hay ống tròn nhỏ li ti. Các phiến nấm hay ống nhỏ là phần để sinh ra các bào tử, bào tử tương tự như hạt cùa cây trồng. Bào tử là những hạt nhỏ tròn hay bầu dục có đường kính vài phần nghìn millimet giữ vai trò sinh sản giống như hạt của cây. Nấm có vô số bào tử, một quả thể nấm trưởng thành có hàng tỉ bào tử. Khi nấm già mà không được hái, cây nấm sẽ nứt bao, xòe ô và phát tán bào tử, các bào tử rơi vào không khí hay bay đi xa, bám vào rơm rạ, gỗ, đất. Gặp điều kiện thuận lợi như độ ẩm, nhiệt độ thích hợp, chúng nảy mầm tạo nên sợi tơ nấm. Sợi tơ nấm mọc thành hệ sợi, có đủ dinh dưỡng và điều kiện môi trường tốt sẽ mọc ra nấm. Điều này giải thích vì sao nấm mọc ngoài tự nhiên mà không cần cấy giống nấm. Sau khi tìm hiểu các vấn đề nêu trên, có thể nói như sau: nấm là một sinh vật, phần mà chúng ta thường nhìn thấy được gọi là "cây nấm" chính là quả thể của nấm. Nó tương đương với hoa, quả ở các loài thực vật thượng đẳng; trong quả thể có bào tử; các bào tử tương đương với hạt; còn thân, rễ là hệ sợi nấm. Chu kỳ và các giai đoạn sống của 61 nấm rơm được thể hiện trên hình 2.7 là chu kỳ điển hình của nấm ăn (nấm lớn có quả thể ăn được). Hình 2.7. Chu kỳ sống của (Volvariella volvacea – nấm Rơm). 2.1.3.2. Ý nghĩa của việc trồng nấm với bảo vệ môi trường Hoạt động sản xuất nói chung và sản xuất nông nghiệp nói riêng thường gây ô nhiễm môi trường do sử dụng phân bón hóa học, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, đốt bỏ sản phẩm phụ... dẫn đến môi trường ô nhiễm, khí hậu biến đổi. Việc tận dụng những phế phụ liệu của ngành nông nghiệp để nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu có ý nghĩa góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường, giảm biến đổi khí hậu. Nguồn phế thải của nông nghiệp rất lớn gồm: rơm rạ, thân, lõi ngô, thân cây lạc, bã mía... Những thứ này nếu thải ngay ra môi trường thì phải cần một thời gian khá dài để phân hủy, nếu đốt sẽ tạo ra nhiều khí CO2 và một lượng lớn tro ngấm xuống đất cũng gây bất lợi cho cây trồng. Phần lớn lượng phế phụ phẩm sau khi thu hoạch ở một số địa phương đều bị đốt bỏ ngoài đồng ruộng hoặc ném xuống kênh rạch, sông ngòi gây tắc nghẽn dòng chảy. Đây là nguồn tài nguyên rất lớn nhưng chưa được sử dụng hết, nếu đem trồng nấm không những tạo ra loại sản phẩm có giá trị cao mà phế liệu sau khi thu hoạch nấm cũng được chuyển sang làm phân bón hữu cơ tạo thêm độ phì nhiêu cho đất. 62 2.2. VI TẢO (Microalgae) 2.2.1. Đặc điểm chung Vi tảo (Microalgae) là tên gọi để chỉ tất cả các loài tảo có kích thước hiển vi có sắc tố quang hợp chlorophyll a, quang tự dưỡng, sống chủ yếu ở trong nước và những nơi có độ ẩm của nước, có ánh sáng. Chúng thuộc về nhiều nhóm phân loại khác nhau; tảo mắt, tảo vàng ánh, tảo lục, tảo silic, tảo giáp. Vi tảo có khả năng sinh sản vô tính lẫn hữu tính và với tốc độ hết sức nhanh. 2.2.2. Đời sống của vi tảo Nhiều loài vi tảo có đời sống trôi nổi. Chúng là thành phần chủ yếu của thực vật phù du. Chúng trôi nổi được trên bề mặt lớp nước và là mắt xích thức ăn đầu tiên của mọi sinh vật sống trong nước. Có những loài vi tảo suốt đời bám vào các hòn đá, các cành cây dưới đáy nước. Rất nhiều loài sống trên mặt đất (tảo silic, tảo mắt, tảo lục...). Chúng một mặt làm giàu thêm chất hữu cơ cho đất nhưng cũng có khi trở thành những kẻ cạnh tranh chất khoáng đối với cây trồng. Vi tảo đơn giản nhất là cơ thể đơn bào, hoặc tập hợp đơn bào, có thể có roi như Clamydomonas, Peridinium và Euglena (tảo mắt), hoặc không có roi như Chlorella (tảo lục), Diatomia (tảo silic) (hình 2.8). Peridinium Euglena Ectocarpus Hình 2.8. Hình dạng một số loài vi tảo. (Peridinum, US public Health pool# 657, 1959 Ectocarpus, http://pr–energy.info/usa/ectocarpus-life-cycle.usa). Các vi tảo thường gặp hơn là các cơ thể đa bào hoặc tập hợp đơn bào, như các tập đoàn Volvox, Pediastrum, Scenendesmus (thuộc nhóm Archethalle) hoặc phức tạp hơn có bộ phận đính bám và bộ phận dựng đứng như các sợi mảnh phân nhánh hoặc không (có thể có vách ngăn tạo thành các tế bào tương đối độc lập hoặc không có vách ngăn như một ống cộng bào (coenocytic)). Những tảo này sinh sản bằng cách phân chia những tế bào lạ ở giữa hoặc bằng cách rụng tế bào ở đầu cùng (Sphacelaria, Ectocarpus…), chúng 63 sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp đẳng giao (hai giao tử bằng nhau) hoặc dị giao (hai giao tử khác nhau). Các sắc tố quang hợp và hỗ trợ ở các nhóm tảo khác nhau thì khác nhau, hiện nay người ta đã biết sáu nhóm tảo với các sắc tố đã được nghiên cứu tương đối kỹ. Bốn giống tảo lục là Clamydomonas (đơn bào hai roi), Gonium (tập hợp đơn bào hai roi), Pandorina (tập hợp đơn bào, phía ngoài còn có hai roi, phía trong mất roi) và Volvox (tập hợp đơn bào, phía ngoài có hai roi làm chức năng di động cho cả tập đoàn, phía trong tế bào mất roi làm chức năng quang hợp, hô hấp) là một ví dụ rõ nét chứng minh sự tiến hóa từ tổ chức đơn bào lên tổ chức đa bào phân hóa thô sơ. Theo phân loại của Robert Edward Lee, 1999, tảo được phân thành nhiều ngành do sự khác nhau về sắc tố (pigment), chất dự trữ, cấu trúc đặc điểm của roi (flagella) và các dấu hiệu khác. Riêng ngành tảo lam (Cyanophyta) hay vi khuẩn lam (Cyanobacteria) gồm những cơ thể tế bào chưa có cấu trúc nhân hoàn chỉnh, vì vậy hiện nay khoa học xếp vào nhóm cơ thể tiền nhân (Procaryote). 2.2.3. Vai trò của vi tảo trong môi trường Lợi dụng tốc độ phát triển đặc biệt nhanh của các loài vi tảo và giá trị dinh dưỡng cao của chúng (giàu protein và vitamin), từ lâu người ta đã tìm cách cấy nuôi vi tảo theo quy trình công nghiệp và thủ công nghiệp. Các loài vi tảo được tuyển chọn vào sản xuất sinh khối làm thức ăn cho tôm cá có nhiều loài song đáng chú ý là các loài thuộc chi Chlamydomonas, Pinnularia và chi Scenedesmus (hình 2.9). Người ta cho rằng trên “các cánh đồng vũ trụ” dành cho các chuyến bay dài ngày, cây trồng lý tưởng nhất chắc chắn phải là vi tảo. Khả năng quang hợp của vi tảo vượt gấp 5 – 6 lần so với cây trồng (sau 24 giờ có thể tăng sinh khối lên 1 000 lần). Chúng có thể thải ra một lượng oxy mỗi ngày gấp 200 lần thể tích của chúng. Chỉ cần 50 lít dịch nuôi cấy tảo Chlorella có thể cung cấp đủ oxy cho một nhà du hành vũ trụ, mặt khác sinh khối Chlorella có thể coi là bổ hơn tất cả các loại thực phẩm thông thường khác. Một số vi tảo sống ở biển có độc tính cao và có thể gây chết hàng loạt động vật thủy sinh. a) Chlamydomonas reinhardtii b) Pinnularia opulenta c) Scenedesmus quadricauda Hình 2.9. Hình thái một số vi tảo dùng để sản xuất sinh khối protein. (Join Parltrees et al., 2013) 64 Vi tảo sinh trưởng trong điều kiện thích hợp tích lũy đến 50% lipid trong sinh khối. Trong công nghiệp, sinh khối tảo được sản xuất bằng sử dụng các bình nuôi sinh khối sử dụng ánh sáng mặt trời (hình 2.10). Lipid được chiết xuất và tinh chế để sản xuất nguyên liệu sinh học. Tảo là sinh vật tự dưỡng tạo ra oxy đầu tiên, mặc dù một số loài vẫn duy trì dị dưỡng hóa học bằng cách sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản để giúp quá trình trao đổi chất của tế bào. Quá trình quang hợp tạo ra oxy và năng lượng không những giúp cho tảo phát triển mà còn đóng vai trò như sinh vật sản xuất ở môi trường nước. Sinh vật sản xuất này là mắt xích trong lưới thức ăn ở môi trường nước như vai trò của thực vật. Hình 2.10. Sản xuất nguyên liệu sinh học từ nuôi sinh khối vi tảo (Raven et al., 2017). Một số loài trùng tảo ở vùng duyên hải có khả năng sản xuất hợp chất thứ cấp tạo thành độc chất và tiết ra môi trường. Hai loài trùng tảo Gymnodinium và Gonyaulax tạo ra độc chất sacidoxin tác động đến hệ thần kinh làm bại liệt cơ ở hệ hô hấp động vật có xương sống. Với nồng độ thấp (µg), độc chất không ảnh hưởng đến các loài tôm, cua và hai mảnh vỏ, nhưng lại có hại khi tiêu thụ chúng. Bệnh Ciguatera gây ra bởi tiêu thụ các loài hải sản trên đã tích lũy độc tố từ trùng tảo Gambierdiscus toxicus. Độc tố vẫn tồn tại sau khi nấu chín hải sản và gây bệnh rối loạn hệ thần kinh trung ương. Tích lũy độc tố ở hải sản thường xảy ra trong quá trình “tảo nở hoa”, “thủy triều đỏ”. Tảo nở hoa và thủy triều đỏ đang là vấn nạn của nhiều quốc gia và thế giới. Có nhiều nguyên nhân, trong đó có việc tăng chất dinh dưỡng, đặc biệt là N và P, từ nước thải và từ hoạt động sản xuất nông nghiệp. 2.3. ĐỘNG VẬT NGUYÊN SINH 2.3.1. Đặc điểm chung Động vật nguyên sinh (ĐVNS) Protozoa là những sinh vật đơn bào có khả năng chuyển động. Động vật nguyên sinh có khoảng 20.000 đến 25.000 loài, trong đó một số có cả khả năng quang hợp. 65 Hình thái của Protozoa rất đa dạng do không có thành tế bào bao quanh. Độ cứng của tế bào do cấu tạo gelatin nằm bên ngoài màng tế bào. Màng tế bào kết hợp với màng gelatin tạo thành một lớp da mỏng bao quanh tế bào. Bên trong lớp da mỏng là dịch nội bào chứa các cấu tử. Protozoa là một dạng sống đơn giản, mặc dù cơ thể chỉ có một tế bào, nhưng có khả năng thực hiện đầy đủ các hoạt động sống như một cơ thể đa bào hoàn chỉnh, chúng có thể thu lấy thức ăn, tiêu hóa, tổng hợp, hô hấp, bài tiết, điều hòa ion và điều hòa áp suất thẩm thấu, chuyển động và sinh sản. Sở dĩ chúng có thể thực hiện được các hoạt động sống đó là vì trong cơ thể cũng có những cấu tử giống với các cấu tử ở tế bào của cơ thể đa bào như nhân, ty thể, mạng nội chất, hệ Glogi, không bào co bóp và không bào tiêu hóa. Một số nguyên sinh động vật còn có bào hầu nối liền bào khẩu với túi tiêu hóa, tiêm mao hoặc roi hoạt động được nhờ thể gốc. Động vật nguyên sinh thường có kích thước 0,01 – 0,05 mm. Những ĐVNS đầu tiên đã được Leeuwenhoek A.V phát hiện ra ngay từ thế kỷ XVII nhưng được nghiên cứu vào thế kỷ XVIII bởi Joblot L. và nhiều tác giả khác. 2.3.2. Các nhóm động vật nguyên sinh Theo hệ thống phân loại hiện nay thì ĐVNS được chia làm bốn nhóm: (1) Sarcomastigophora với các nhánh Sarcodina hay Rhizopodes (Rhizopodes và Actinopodes), nhánh Mastigophora hay Flagelles, nhánh Opalinata (cũng có tài liệu hợp nhất Rhizopodes và Flagelles vào dạng Rhizoflagelles). Chúng di chuyển và bắt mồi bằng cách tạo ra các giả túc. Điển hình của nhóm này là Amoeba proteus. Chúng dinh dưỡng bằng cách thực bào và phân bố rộng rãi trong đất và trong nước. (2) Sporzoa (ký sinh trên động vật, một hoặc nhiều vật chủ). (3) Cnidospora (ký sinh trên động vật có xương và không xương). (4) Ciliophora hay cilie (roi ngắn -cils, có hai loại nhân: nhân to và nhân bé). Với hơn 30.000 loài được mô tả, động vật nguyên sinh sống ở đất và nước, nhiều động vật nguyên sinh có vai trò quan trọng ở các lớp bùn hoạt tính tại các trạm lọc nước thải (hình 2.11). 2.3.3. Vai trò của động vật nguyên sinh trong môi trường Động vật nguyên sinh có nhiều vai trò quan trọng trong hệ sinh thái. Nhiều động vật nguyên sinh hóa tự dưỡng bằng cách hô hấp hiếu khí hoặc lên men. Điều ngạc nhiên là mặc dù động vật nguyên sinh hô hấp hiếu khí nhưng không sở hữu ty thể thực như sinh vật nhân thực. Vì vậy, chúng sử dụng cấu trúc màng bao được gọi là thể hydro (hydrogenosome) để tạo năng lượng. Thể hydro sử dụng proton như chất nhận điện tử để tạo nên phân tử H2 thay cho H2O. Động vật nguyên sinh có vai trò quan trọng trong phân hủy và tuần hoàn các hợp chất hữu cơ trong môi trường. Chúng tiết ra enzyme ngoại bào để phân hủy các hợp chất như cellulose của thực vật, peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn. Một số ĐVNS thực 66 bào vi khuẩn tiết enzyme giúp cho việc tiêu hóa vi khuẩn. Một số khác sau khi thực bào vi khuẩn thì phân hủy bằng các enzyme tiêu hóa có trong không bào thực bào. Khả năng phân hủy đại phân tử đóng vai trò quan trọng trong mối quan hệ giữa ĐVNS và động vật khác. Thực tế, ĐVNS tiêu hóa 1/3 chất xơ ở động vật nhai lại và cung cấp sinh khối vi sinh cho dạ cỏ. Trong môi trường kỵ khí của dạ cỏ, ĐVNS thực hiện quá trình lên men để tạo ra acid hữu cơ và cồn. Hình 2.11. Một số loại động vật nguyên sinh Giardia muris (trái) và Blepharisma japonicum (phải) (Raeky, 2009). ĐVNS đóng vai trò quan trọng liên quan đến chất lượng nước. ĐVNS gây ra các đại dịch thông qua nước uống và nước dành cho ngành giải trí. Các ĐVNS thường ảnh hưởng đến chất lượng nước bao gồm: Giardia (Mastigophora), Cryptosporidium (Apicomplexa) và Toxoplasma (Apicomplexa). Nguồn gốc là do các bao nang và noãn bào của những loài này có thể chống lại được nhiệt độ cũng như độ mặn của nước và có thể tồn tại dài ngày. Một số khác tồn tại trong đất và gây ra chứng viêm não ở người, có thể dẫn đến tử vong như Naegleria fowleri và Balamuthia mandrillaris. TÓM TẮT CHƯƠNG Vi sinh vật nhân thực có cấu trúc phức tạp hơn vi sinh vật nhân sơ, có nhân thực và xoang hóa (màng bao quanh các bào quan), có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh, nhân có màng nhân, có ti thể, có bộ máy Golgi và lưới nội chất tạo nên các ống và xoang dẹp thông với nhau ở bên trong tế bào. Nhóm này gồm: vi nấm, vi tảo và động vật nguyên sinh, thực vật và động vật. Vi nấm là những sinh vật nhân thực, hệ sợi, phần lớn có thành tế bào chứa chitin, không có lục lạp, không có lông và roi. Sống dị dưỡng hoại sinh, ký sinh, cộng sinh. Sinh sản chủ yếu bằng bào tử. Các cơ thể vi nấm có kiểu trao đổi chất và hệ enzyme khác biệt so với các cơ thể nhân thực khác (thực vật, động vật) và khác xa với cơ thể nhân sơ nên từ lâu đã được xếp thành một giới riêng − đó là giới nấm (Regnum Fungi). 67 Nấm men là tên gọi thông dụng để chỉ một nhóm vi nấm đơn bào, nhân có màng nhân, sinh sản chủ yếu theo kiểu nảy chồi. Thường tồn tại trong các môi trường có nồng độ đường cao, pH thấp. Nấm men không phải là một nhóm nấm riêng biệt mà thuộc nhiều nhóm khác nhau trong giới nấm: Nấm túi (Ascomycetes), Nấm đảm (Basidiomycetes) và Nấm bất toàn (Deuteromycetes). Nấm men được dùng nhiều trong công nghệ chế tạo các hợp chất hữu cơ quan trọng và để sản xuất sinh khối giàu protein làm thức ăn trong nuôi trồng thủy sản. Nấm sợi gồm những sinh vật nhân thực, dạng sợi, không có lục lạp, không có lông và roi, có đời sống dị dưỡng: hoại sinh, ký sinh hoặc cộng sinh. Nhiều nấm sợi có khả năng tiết kháng sinh, enzyme, chất kích thích sinh trưởng… Bên cạnh đó, nhiều nấm sợi gây bệnh, sinh độc tố gây ngộ độc thức ăn như Aspergillus flavus, gây tổn thất trong nuôi trồng thủy sản. Vi tảo (Microalgae) là tên gọi để chỉ tất cả các loài tảo có kích thước hiển vi có sắc tố quang hợp. Chúng thuộc về nhiều nhóm phân loại khác nhau; tảo mắt, tảo vàng ánh, tảo lục, tảo silic, tảo giáp. Vi tảo có khả năng sinh sản vô tính lẫn hữu tính và với tốc độ hết sức mạnh. Lợi dụng tốc độ phát triển đặc biệt nhanh của các loài vi tảo và giá trị dinh dưỡng cao của chúng (giàu protein và vitamin), từ lâu người ta đã tìm cách cấy nuôi vi tảo theo quy trình công nghiệp và thủ công nghiệp. Tuy nhiên, cũng có một số loài tảo khi gặp điều kiện thuận lợi phát triển quá nhanh do phú dưỡng hóa nguồn nước gây hiện tượng “nước nở hoa” độc hại, thủy triều đỏ khiến cá chết hàng loạt ở nhiều quốc gia trên thế giới như Mỹ, Mexico, Canada, Trung Quốc và Việt Nam... có thể sản sinh các độc tố tự nhiên, làm suy giảm oxy và gây ra các tác hại khác. Động vật nguyên sinh là một dạng sống đơn giản, chỉ có một tế bào; sống dị dưỡng, có đầy đủ các bào quan như nhân, ty thể, lưới nội chất, bộ máy Golgi, không bào co bóp và không bào tiêu hóa. Nhiều loài được dùng làm thức ăn cho động vật nhỏ, chúng là sinh vật chỉ thị về độ sạch của môi trường nước. Một số trong chúng là tác nhân gây bệnh ở người và động vật như bệnh sốt rét, bệnh lỵ… CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1. Các nhóm vi sinh vật nhân thực? Phân biệt vai trò của nấm men và nấm sợi? 2. Đặc điểm chung của các vi sinh vật nhân thực? 3. Vai trò của các loại vi sinh vật nhân thực trong bảo vệ môi trường? 4. Nêu một số nấm sợi có lợi và gây hại cho môi trường và con người? 5. Các nhóm tảo? Hiện tượng “nước nở hoa”? 6. Vai trò của động vật nguyên sinh trong xử lý và bảo vệ môi trường? 7. So sánh tổng quát sự khác biệt của nấm men và nấm sợi. 68 * Chọn một đáp án đúng nhất 8. Đặc điểm có ở giới nấm (fungi) và không có ở giới nguyên sinh (protista) a. Cơ thể đơn bào. b. Thành tế bào có chứa chất chitin. c. Cơ thể đa bào. d. Có lối sống dị dưỡng. 9. Protista gồm: a. Các VSV là tảo đơn bào, tập hợp đơn bào. b. Những VSV nhân thực. c. Không bao giờ là tác nhân gây bệnh. d. Những VSV có chân giả (pseudopods). 10. Điền vào bảng so sánh một số đặc điểm giữa vi khuẩn, vi nấm và vi tảo Đặc điểm so sánh Vi khuẩn Vi nấm Vi tảo a. Loại ribosome tế bào chất b. Chất đặc trưng ở thành tế bào c. Dạng dự trữ glucose d. Quan hệ với oxy * Điền vào các chỗ trống 11. Nấm là sinh vật thuộc dạng tế bào.....(a)......Cơ thể có thể đơn hay đa bào dạng sợi, có thành.......(b).......(một số ít có thành........(c).......), không có......(d)......sống dị dưỡng theo kiểu.......(e)....... Sinh sản bằng....(f)......không có.....(j)........và...........(i)........... GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ 1. Nhân tế bào (Nucleus): là bào quan tối quan trọng trong tế bào sinh vật nhân thực. Nó chứa các nhiễm sắc thể của tế bào, là nơi diễn ra quá trình nhân đôi DNA và tổng hợp RNA. 2. Sinh vật nhân thực (eukaryote), còn gọi là sinh vật nhân điển hình – nhân có màng nhân gồm có động vật, thực vật và nấm − hầu hết chúng là sinh vật đa bào − cũng như các nhóm đa dạng khác được gọi chung là nguyên sinh vật (đa số là sinh vật đơn bào). Sinh vật nhân thực có cùng một nguồn gốc và thường được xếp thành một siêu giới hoặc vực (domain). Eukaryote là chữ Latinh có nghĩa là có nhân thực sự. 3. Vỏ polysaccharide: một số chủng VSV có thể tạo vỏ polysaccharide. Vỏ này cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào. 69 Chương 3 VIRUS HỌC Mục tiêu – Nắm vững tính chất, hình thái cấu trúc của hạt virus. – Hiểu được lịch sử phát hiện virus và các thực thể dưới virus. – Trình bày được cấu tạo, đặc điểm, quá trình nhân lên của virus, phage. – Nắm được những lợi ích của các nhóm virus đã học để có thể vận dụng những hiểu biết này vào thực tế đời sống và bảo vệ môi trường. 3.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VIRUS Trước đây virus được coi là một chất độc luôn gắn liền với bệnh tật. Thuật ngữ “virus” cũng bắt nguồn từ tiếng Latinh “Virus” có nghĩa là chất độc. Vào năm 1883, nhà khoa học người Đức Adolf Mayer (1843 – 1942) khi nghiên cứu bệnh khảm cây thuốc lá đã nhận thấy bệnh này có thể lây nếu phun dịch ép lá cây bị bệnh sang cây lành, tuy nhiên ông không phát hiện được tác nhân gây bệnh. Năm 1884, Charles Chamberland đã sáng chế ra màng lọc bằng sứ để tách các vi khuẩn nhỏ nhất (hình 3.1). Năm 1892, nhà thực vật học người Nga Dmitri Iwanowski đã dùng màng lọc Chamberland để nghiên cứu bệnh khảm thuốc lá. Ông nhận thấy dịch ép lá cây bị bệnh đã cho qua màng lọc vẫn có khả năng nhiễm bệnh cho cây lành. Mặc dù không nhìn thấy bất kì VSV nào nhưng ông cũng thông báo rằng chính “virus qua lọc” là tác nhân gây bệnh. Hình 3.1. Dmitri Iwanowski (1864 − 1920); Màng lọc bằng sứ; Bệnh khảm thuốc lá. Giả thuyết về độc tố qua màng lọc đã bị bác bỏ vào năm 1898 khi nhà khoa học người Hà Lan Martinus Beijerinck chứng minh được rằng tác nhân lây nhiễm là chất độc sống (a contagious, living fluid) và có thể nhân lên được. Ông tiến hành phun dịch ép lá cây bệnh cho qua lọc rồi phun lên cây và khi cây bị bệnh lại lấy dịch ép cho qua lọc để 70 phun vào các cây khác. Qua nhiều lần phun đều gây được bệnh cho cây. Điều đó chứng tỏ tác nhân gây bệnh phải nhân lên nên không phải là chất độc vì nếu là độc tố thì năng lực gây bệnh sẽ phải dần mất đi. Chất độc sống không thể gây bệnh khi bị đun nóng. Năm 1901, Walter Reed và cộng sự của ông ở Cuba đã phát hiện tác nhân gây bệnh sốt vàng cũng là virus qua lọc. Tiếp sau đó, các nhà khoa học khác phát hiện ra tác nhân gây bệnh dại và đậu mùa. Tác nhân gây bệnh đậu mùa có kích thước lớn, không dễ qua lọc, do đó các tác nhân gây bệnh chỉ đơn giản gọi là “virus”. Năm 1915, nhà vi khuẩn học người Anh Frederick Twort và năm 1917, nhà khoa học người Pháp − Canada Felix d'Herelle thuộc viện Paster (Paris) đã phát hiện ra virus ký sinh vi khuẩn và đặt tên là Bacteriophage, gọi tắt là phage (thể thực khuẩn). Năm 1935, nhà khoa học người Mỹ Wendell Stanley đã kết tinh được các hạt virus gây bệnh đốm thuốc lá (TMV). Đến năm 1941, TMV và nhiều loại virus khác đều có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Như vậy, nhờ có kỹ thuật màng lọc đã đem lại khái niệm ban đầu về virus và sau đó nhờ có kính hiển vi điện tử đã có thể quan sát được hình dạng của virus, tìm hiểu được bản chất và chức năng của chúng. Cuối những năm 1950, Jonas Salk và Albert Sabin đã phát triển kỹ thuật để nhân số lượng lớn virus gây bệnh bại liệt dùng sản xuất vaccine bại liệt. Năm 1952, Herrskey đã chứng minh vật chất di truyền ở thể thực khuẩn là DNA. Năm 1955, Fraenkel Conrat lắp ráp thành công lõi acid nucleic vào vỏ capsid của virus khảm thuốc lá và 10 năm sau, năm 1965, Spiegelman lắp ráp thành công chuỗi DNA của thể thực khuẩn φX174. Năm 1970, Baltimore và Temin phát hiện enzyme phiên mã ngược ở virus Retro chứa RNA chuỗi đơn. Ngày nay, virus được coi là thực thể chưa có cấu tạo tế bào, có kích thước siêu nhỏ và có cấu tạo rất đơn giản, chỉ gồm một loại acid nucleic, được bao bởi vỏ protein. Muốn nhân lên virus phải nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào, vì thế chúng là ký sinh nội bào bắt buộc. Virus có khả năng gây bệnh ở mọi cơ thể sống từ vi khuẩn đến con người, là thủ phạm gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi, gây thất bát mùa màng và cản trở đối với ngành công nghiệp vi sinh vật. Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XX trở lại đây, ngày càng xuất hiện các dạng virus mới lạ ở người, động vật mà trước đó y học chưa hề biết tới, đe doạ mạng sống của con người. Sau HIV, SARS, Ebola, cúm A H5N1, có thể sẽ còn nhiều loại nữa xuất hiện để gây tai họa cho con người. Mặt khác, do có cấu tạo đơn giản và có bộ gene nhiều kiểu với cơ chế sao chép khác hẳn ở các cơ thể khác nên virus được chọn là mô hình lý tưởng để nghiên cứu nhiều cơ chế sinh học ở mức phân tử, dẫn đến cuộc cách mạng sinh học cận đại: sinh học phân tử, di truyền học phân tử. Vì những lý do trên, việc nghiên cứu virus đã được đẩy mạnh và trở thành một ngành khoa học độc lập rất phát triển. 71 3.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VIRUS Virus là một kết cấu đại phân tử vô bào, không có hệ thống sinh sản năng lượng, không có ribosome, không sinh trưởng cá thể, không phân cắt và không mẫn cảm với các chất kháng sinh, chỉ chứa một trong hai loại nucleic acid (DNA hoặc RNA), sống ký sinh nội bào bắt buộc. Ngày nay có khoảng 5000 loài virus được định danh, nhưng các nhà khoa học cho rằng có khoảng 400.000 loài tồn tại. Các đặc điểm của virus: − Không có cấu trúc tế bào, sống ký sinh nội bào bắt buộc ở vi khuẩn, ĐVNS, nấm, tảo, thực vật và động vật. Mỗi virus nhất định có một tế bào chủ đặc hiệu và gây ra một bệnh nhất định trong quá trình nhân lên. − Mỗi một virus chỉ chứa một loại acid nucleic, hoặc là DNA (sợi đôi hoặc sợi đơn) hoặc RNA (sợi đôi hoặc sợi đơn) mà không bao giờ chứa cùng một lúc cả hai loại acid nucleic như vi khuẩn. − Virus không có khả năng tự phát triển và tự nhân lên mà chỉ có thể nhân lên khi xâm nhập vào tế bào sống. Trong quá trình nhân lên chỉ có acid nucleic là có vai trò quyết định, còn các thành phần khác có vai trò hỗ trợ. − Virus không chứa những thông tin truyền cho việc tổng hợp ra những chất chuyển hóa cơ bản và năng lượng cần thiết cho nó. Chính vì vậy mà virus phải phụ thuộc vào các sinh vật khác, nhân lên bằng cách dùng hệ thống enzyme của tế bào, còn acid nucleic của virus điều khiển việc tổng hợp của tế bào để tạo ra những virus mới. − Chịu lạnh tốt, không chịu nhiệt, hóa chất và tia tử ngoại. Hầu hết virus không bị kháng sinh tác động đến. − Khi ở ngoài tế bào, virus ở trạng thái không hoạt động được gọi là virion. Hình 3.2. Cấu trúc của virion HIV1 (trái) và HIV2 (phải). (HIV có dạng cầu là vì có vỏ ngoài, còn capsid là hình khối không đều, giống hình nón cụt). 72 3.3. HÌNH DẠNG, KÍCH THƯỚC VÀ CẤU TRÚC CỦA VIRUS 3.3.1. Hình dạng và kích thước Virus có hình que, hình sợi, hình cầu, hình khối,... Một số virus trong quá trình phát triển, hình thành trong tế bào mà chúng ký sinh những khối gọi là thể bao hàm (tập đoàn virus), có thể dùng kính hiển vi thường cũng quan sát được. Virus DNA Virus RNA Poxvirus (300 nm) Paramyxovirus (150 – 300 nm) Rabdovirus (180 nm) Iridovirus (250 nm) Orthomixovirus Herpesvirus (250 – 300 nm) nm) Arenavirus (50 – 300 nm) (80 – 120 nm) Adenovirus (75 nm) Palovavirus (50 nm) Hepadnavirus (42 nm) Parvovirus (20 nm) Buniavirus Retrovirus (80 – 100 nm) (100 nm) Coronavirus (60 – 220 nm) Reovirus (60 – 80 nm) Togavirus (60 – 70 nm) Picornavirus (25 – 30 nm) Hình 3.3. Kích thước và hình dạng một số virus động vật điển hình. 73 Virus là một dạng sống đơn giản nhất hiện nay, có kích thước nhỏ bé so với tế bào chủ và chỉ quan sát được trên kính hiển vi điện tử. Virus có thể lọt qua lọc vi khuẩn. Hơn 2000 virus ký sinh vi khuẩn có thể chứa trong một tế bào chủ vi khuẩn và hơn 50 triệu virus bại liệt có thể chứa trong tế bào người. Virus động vật có kích thước nhỏ là parvovirus với đường kính chỉ 20 nm, bacteriophage MS2 chỉ 24 nm. Virus RNA Picoviridae có kích thước cỡ 20 – 30 nm, Retroviridae kích thước 100 – 120 nm, Parvoviridae kích thước 18 – 26 nm, Poxviridae 130 – 300 nm (hình 3.3). 3.3.2. Cấu trúc của virus Virus có cấu tạo rất đơn giản, bao gồm lõi là acid nucleic, tức genome nằm ở phía trong còn phía ngoài được bao bọc bởi vỏ capsid. Capsid và acid nucleic được gọi là nucleocapsid. 3.3.2.1. Vỏ capsid Tất cả các loài virus được cấu tạo bởi vỏ capsid bao quanh lõi acid nucleic tạo thành cấu trúc nucleocapsid. Capsid được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsomer. Capsomer lại được cấu tạo từ 5 hoặc 6 đơn vị cấu trúc gọi là protomer. Protomer được cấu tạo bởi đa phức hợp protein. Vỏ capsid bảo vệ bộ gene của virus bên trong bởi được cấu tạo bởi các amino acid chịu được nhiệt độ, pH và sự bất thường của môi trường. Ở một số loài virus có cấu trúc vỏ capsid đặc biệt chứa các phân tử glicoprotein được gọi là gai (spike), giúp virus gắn vào thụ thể đặc hiệu trên mặt tế bào vật chủ và thâm nhập vào trong tế bào. Virus không có vỏ ngoài Virus có vỏ ngoài Gai Gai (Spike) Capsid Vỏ ngoài Bộ gen Spike (Spike) Capsomer Capsid Bộ gen Nucleocapsid Capsid Vỏ ngoài Bộ gen Capsomer Hình 3.4. Cấu trúc cơ bản của virus không có vỏ ngoài (trần) và virus có vỏ ngoài. (Jeffrey et al., 2011). 74 Virus chỉ có lớp nucleocapsid gồm vỏ capsid và hệ gene được gọi là virus trần tức không có vỏ ngoài. Lớp nucleocapsid của một số loại virus có lớp protein mềm dẻo bao quanh được gọi là virus có vỏ ngoài. Vỏ ngoài được cấu tạo bởi lipid và protein như màng tế bào vật chủ. Loại virus này mất khả năng xâm nhiễm vào tế bào chủ khi vỏ ngoài bị phá hủy. − Trên vỏ capsid có pentamer (penton) tạo bởi 5 protomer nằm trên các đỉnh của khối đa diện, còn hexamer (hexon) tạo thành các cạnh và bề mặt hình tam giác. − Trên mặt capsid chứa các thụ thể đặc hiệu, hay là các gai glycoprotein, giúp cho virus bám vào các thụ thể trên bề mặt tế bào. Đây cũng chính là các kháng nguyên kích thích cơ thể tạo đáp ứng miễn dịch. − Virus được lắp ráp hoàn chỉnh để xâm nhiễm vào tế bào vật chủ gọi là Virion. − Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau. Có thể chia ra ba loại cấu trúc: hình trụ có đối xứng xoắn, hình khối đa diện và cấu trúc phức tạp (phối hợp) (hình 3.5). + Cấu trúc hình trụ đối xứng: các capsomer liên kết với nhau tạo thành khối trụ rỗng chứa bộ gene ở bên trong. Ví dụ virus không có vỏ ngoài: virus khảm thuốc lá; virus có vỏ ngoài: virus gây gây bệnh cúm, sởi và dại. + Cấu trúc khối: vỏ capsid cấu trúc hình khối 20 mặt tam giác đều. Sắp xếp của các protomer tạo thành vỏ capsid biến đổi tùy từng loại virus, có thể được tạo thành từ một đến nhiều loại capsomer khác nhau. Ví dụ: polyvirus có 32 loại, adenovirus có 252 loại. Capsid có cấu trúc hình khối đa diện (virus bại liệt) và khối cầu (HIV). + Cấu trúc phối hợp: vừa có dạng khối và dạng xoắn, thường thấy ở thực khuẩn thể (phage). Ví dụ phage T4 có đầu dạng khối và đuôi dạng xoắn. 3.3.2.2. Bộ gene của virus Bộ gene (genome) của virus rất đa dạng về cấu trúc, kích thước và thành phần nucleotide. Chúng có thể là DNA hoặc RNA, chuỗi đơn hoặc kép, thẳng hoặc khép vòng (bảng 3.1). Dựa vào kiểu bộ gene và dạng mạch, virus được chia thành hai lớp: virus DNA và virus RNA. Kích thước genome có thể từ 3500 nucleotide (ở phage nhỏ) đến 560.000 nucleotide (ở virus herpes). Các trình tự genome virus phải được đọc mã bởi tế bào chủ, cho nên các tín hiệu điều khiển phải được các yếu tố của tế bào chủ nhận biết. Các yếu tố này thường liên kết với protein virus. Do có kích thước nhỏ nên genomevirus đã tiến hóa để sử dụng tối đa tiềm năng mã hóa của mình. Vì thế, hiện tượng gene chồng lớp và hiện tượng cắt nối (splicing) mRNA ở virus là rất phổ biến. 75 Cấu trúc hình trụ Bộ gen Bộ gene Cấu trúc khối đa diện Nucleocapsid Capsomer Chóp đỉnh Sợi gai Virus không có vỏ ngoài: khảm thuốc lá Cấu trúc khối đặc trưng virus không có vỏ ngoài Nhân DNA Màng bao Nucleocapsid Màng bao Capsid Virus có vỏ ngoài: cúm, sởi, dại Virus có vỏ ngoài: Viêm gan B (trái) và Herpes (phải) Cấu trúc phối hợp Acid nucleic Vỏ capsid ở phần đầu Cổ Màng bao Lông Ghim đuôi Đĩa gốc Bacteriophage T4 Hình 3.5. Ba loại cấu trúc thường gặp ở virus (Marjorie Kelly Cowan et al., 2014). 76 Bảng 3.1. Các dạng genome virus Loại acid nucleic Cấu trúc Ví dụ DNA đơn Chuỗi đơn, dạng thẳng Chuỗi đơn, khép vòng Virus parvo Phage ФX174, M13, fd DNA kép Chuỗi kép, dạng thẳng Chuỗi kép, dạng thẳng, trên một mạch có những chỗ đứt ở cầu nối phosphodieste. Herpes, adeno, coliphage T, phage l. Coliphage T5 Vaccinia, Smallpox Chuỗi kép với hai đầu khép kín Chuỗi kép khép vòng kín Polioma (SV40), papiloma, phage PM2, virus đốm hoa lơ RNA đơn Chuỗi đơn, dương dạng thẳng Chuỗi đơn, âm, dạng thẳng Chuỗi đơn, dương, dạng thẳng, nhiều đoạn Chuỗi đơn, dương genome phân đoạn là 3 phân tử RNA (+) Chuỗi đơn, âm dạng thẳng, phân đoạn Picorna (polio, rhino), toga, phage RNA, MTV và hầu hết virus thực vật Rhabdo, paramyxo, (sởi, quai bị) Virus đốm cây kiều mạch (Bromus) (mỗi phần được bao bởi 1 capsid riêng). Retro (HIV, Sarcoma Rous) Orthomyxo (cúm) – gennom phân đoạn là 3 phân tử RNA (–) RNA kép Chuỗi kép, dạng thẳng, phân đoạn Reo (rota), một số virus gây u ở thực vật, NPV ở côn trùng, phage j6 và nhiều virus ở nấm (mycovirus), Reoviridae Kích thước genome thay đổi rất nhiều ở các virus khác nhau. Các genome nhỏ nhất (ví dụ Bacteriophage MS2,Qβ) có kích thước 1 × 106 Da đủ để mã hóa cho 3 − 4 protein. Một số virus khác tận dụng tối đa không gian của genome bằng cách sử dụng các gene chồng lớp, tức là các gene gối lên nhau trên cùng khung đọc, chỉ khác nhau ở điểm khởi đầu hoặc kết thúc. 77 Các genome của coliphage T chẵn, herpes, vaccinia có kích thước 1,6 × 108 Da có thể mã hóa cho 100 protein. Một số đặc điểm của genome virus cần lưu ý: − Genome DNA kép (ví dụ ở virus pox, herpes và adeno) thường có kích thước lớn nhất. − Genome DNA kép khép vòng (siêu xoắn hoặc không siêu xoắn) thường thấy ở phage. − Genome DNA kép ở virus vaccinia có hai đầu khép kín. − DNA đơn dạng thẳng (ví dụ virus parvo) có kích thước rất nhỏ. − Các DNA dạng thẳng thường có trình tự lặp lại ở đầu. − Tất cả genome RNA kép đều phân đoạn (chứa một số đoạn không giống nhau, mang thông tin di truyền tách biệt). − Genome RNA đơn được phân thành RNA dương (genome+) và RNA âm (genome–) dựa vào trình tự nucleotide của mRNA. Phần lớn genome RNA đơn đều không phân đoạn, trừ virus orthomyxo (virus cúm). − Virus retro có genome là hai phân tử RNA đơn giống nhau, nối với nhau ở đầu 5 nhờ cầu nối hydro. − Virus đốm cây Alfalfa (AMV) có genome gồm bốn đoạn RNA đơn, dương, dạng thẳng, được gói vào bốn vỏ capsid khác nhau nên còn gọi là virus dị capsid (heterocapsidic) để phân biệt với virus mà tất cả các đoạn đều được gói trong một hạt – virus đồng capsid (isocapsidic). 3.4. SỰ NHÂN LÊN CỦA VIRUS Virus không có hoạt tính trao đổi chất độc lập mà sử dụng bộ máy trao đổi chất của tế bào chủ để tổng hợp các thành phần thiết yếu của mình, sau đó lắp ráp tạo ra các hạt virus con giống như nguyên bản. Vì vậy, người ta thường sử dụng thuật ngữ nhân lên (nhân bản) của virus thay cho từ sinh sản. Sự nhân lên của virus có thể làm tan tế bào gọi là chu trình sinh tan hoặc có thể gắn genome của virus vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, tồn tại lâu dài dưới dạng tiềm ẩn mà không làm chết tế bào gọi là chu trình tiềm tan. Quá trình nhân lên của ở tất cả các virus độc đều diễn ra theo năm giai đoạn: 3.4.1. Hấp phụ − Gắn thụ thể đặc hiệu của virus lên thụ thể nằm trên màng sinh chất của tế bào. Vì có tính đặc hiệu cao của các gai (spike) hay protein trên vỏ ngoài của virus nên chỉ virus nhất định mới gắn lên được các tế bào nhất định. 78 3.4.2. Xâm nhập, cởi vỏ và phiên mã 3.4.2.1. Xâm nhập Sự hấp phụ được tăng cường khi có mặt của ion Mg2+ hoặc Ca2+. − Virus không có vỏ bên ngoài: Màng tế bào lõm vào bao lấy virus tạo không bào tạm thời endosome. Tiếp đó không bào dung hợp với lizosome. Bơm proton H+ vào lizosome, hạ pH 5 – 5,5. Enzyme trong lizosome hoạt động hóa phân giải nucleocapsid, giải phóng genome vào tế bào chất. Acid nucleic Capsid Gai (pike) Thụ thể Màng tế bào chất vật chủ Cởi vỏ (A) Cởi vỏ (B) Hình 3.6. Các phương thức xâm nhập của virus vào tế bào (Jeffrey et al., 2011). A. Virus có vỏ ngoài; B. Virus không có vỏ ngoài. − Virus có vỏ bên ngoài: vỏ bên ngoài của virus dung hợp với màng sinh chất rồi đẩy nucleocapsid vào tế bào. Vỏ bên ngoài virus hòa với màng sinh chất mà không chui vào tế bào chất. Ví dụ: virus HIV, virus paramyxo, herpes. − Màng tế bào lõm vào bao lấy virus tạo thể nội bào (endosom), Endosom dung hợp với lisosome. Bơm proton H+ vào lisosome, tạo pH 5 – 5,5. Ở pH này, enzyme trong lisosome hoạt hóa phân giải vỏ capsid, giải phóng acid nucleic vào tế bào chất. Ví dụ adenovirus reovirus và influenza virus. 79 3.4.2.2. Cởi vỏ Enzyme tiêu hóa của tế bào từ lysosome tiến hành phân giải vỏ protein của virus để giải phóng acid nucleic hoặc genome vào tế bào chất. 3.4.2.3. Phiên mã Tạo thành mRNA của virus hoặc phân tử dạng sao chép của genome. 3.4.3. Tổng hợp các thành phần của virus 3.4.3.1. Tổng hợp protein của virus mRNA của virus được phiên mã trên ribosome của tế bào tạo ra hai loại protein: − Protein cấu trúc là protein capsid, protein vỏ ngoài và protein trong lõi. − Protein không cấu trúc là enzyme cần cho sao chép genome. Protein không cấu trúc tìm thấy trong hạt virus, trừ một số trường hợp đặc biệt ví dụ enzyme phiên mã ngược có trong virus HIV hoặc virus viêm gan B chứa DNA polymerase, một số virus RNA chứa RNA polymerase. Hình 3.7. Các hình thức phiên mã và giải mã ở virus (Marjorie Kelly Cowoan et al., 2014). 80