"Thực tập di truyền Y Học 🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Thực tập di truyền Y Học Ebooks Nhóm Zalo TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN THỰC TẬP DI TRUYỀN Y HỌC (SÁCH DÀNH CHO SINH VIÊN) + حل NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN THỰC TẬP DI TRUYỀN Y HỌC (SÁCH DÀNH CHO SINH VIÊN NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC HÀ NỘI - 2006 HIỆU ĐÍNH GS. TS. Trịnh Văn Bảo NHÓM BIÊN SOẠN TS. Phan Thị Hoan PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương ThS. Hoàng Thị Ngọc Lan PGS.TS. Trần Đức Phấn ThS. Nguyễn Văn Rực TS. Nguyễn Thị Trang ThS. Lương Thị Lan Anh Có sự tham gia của tập thể cán bộ Bộ môn Y sinh học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội MỤC LỤC Trang Bài 1. Nếp vân da bàn tay 1. Mục tiêu 2. Phương pháp học 3. Phương tiện, dụng cụ 4. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành Bài 2. Vật thể giới - cách làm tiêu bản để xét nghiệm vật thể Barr 1. Mục tiêu 2. Phương pháp học 2. Phương tiện dụng cụ 4. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành 17 7 7 7 8 8 11 12 12 12 12 12 13 15 Bài 3. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho mẫu ngoại vi để làm tiêu bản nhiễm sắc thể người 16 1. Mục tiêu 16 2. Phương pháp học 16 3, Phương tiện dụng cụ 16 4. Câu hỏi lý thuyết 18 a. Nội dung 18 6. Đánh giá kết quả thực hành 21 Bài 4. Phương pháp xếp bộ nhiễm sắc thể người (lập karyotyp người) 22 1. Mục tiêu 22 2. Phương pháp học 22 3. Phương tiện dụng cụ 22 4. Câu hỏi lý thuyết 23 3 5. Nội dung 6. Tra đánh giá kết quả thực hành Bài 5. Phân tích karyotyp của một số bệnh di truyền và một số dạng đột biến nhiễm sắc thể }. Mục tiểu 2. Phương pháp học 3. Phương tiện dụng cụ *. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành Bài 6. Một số kỹ thuật sinh học phần tử thông dụng ứng dụng trong y học I. Mục tiêu 2. Phương pháp học 3. Phương tiện dụng cụ 4. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành Bài 7. Phương pháp con sinh đội, di truyền quần thể, di truyền sinh hoá 1. Mục tiêu 2. Phương pháp học 4. Phương tiện dụng cụ 4. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành Bài 8, Nghiên cứu các bệnh di truyền đơn gen bằng phương pháp gia hệ 1. Mục tiêu 2. Phương pháp học 3. Phương tiện dụng cụ 23 24 26 26 26 26 26 26 31 32 32 32 32 34 34 38 39 39 39 39 40 40 46 47 47 47 47 *. Câu hỏi lý thuyết 6. Nội dung 6. Đánh giá kết quả thực hành Bài 9. Hình ảnh một số bất thường bẩm sinh, hội chứng và bệnh di truyền 1. Mục tiêu 2. Phương pháp học 3. Phương tiện dụng cụ 4. Câu hỏi lý thuyết 5. Nội dung 6. Tra đánh giá kết quả thực hành 47 48 54 13 13 13 55 55 55 55 55 55 55 5 Bài l NẾP VẬN DA BÀN TAY 1. MỤC TIÊU In được xếp vẫn đa bàn tay đúng tiêu chuẩn. Sử dụng đúng các thuật ngữ chính của phương pháp nếp vân da để phân tích nếp vẫn da bàn tay và ngón tay. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước phần lý thuyết về nếp vẫn da. Tự in nếp vân da của hai bàn tay mình. Tự đánh giá và ghi kết quả trên bản in nếp vẫn da bàn tay mình. Quan sát một số hình ảnh nếp vẫn da bàn tay hiếm gặp. 3, PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ 3.1. Cho một sinh viên 1 kính lúp cầm tay. 1 thước kẻ. 3.2. Cho cả tổ sinh viên Matth 1 bàn để in xếp vân da. Mực in. Miếng mút xốp để lấy mực. Kẹp để bãi mực. 1 bánh xà phòng hoặc 100g xà phòng bột. Nước sạch để rửa tay. Giấy và khăn lau tay. Một số hình ảnh nếp vẫn da một số bàn tay hiếm gặp và một số hình ảnh về các hội chứng di truyền có nếp vẫn da bàn tay hiếm gặp. 7 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Định nghĩa các thuật ngữ: Nếp hay rãnh là gì Đường vân là gì ? Hoa văn là gì? Ngã ba là gì? 2. Nếp vẫn da bàn tay của các cá thể có giống nhau không, vì sao? 3. Nếp ngang duy nhất là gì? 4. Hoa vẫn cung là gì? 5. Nói vị trí của ngã ba t" trên lòng bàn tay. 5. NỘI DUNG 5,1. Cách in nếp vẫn da bàn tay Dùng kẹp kẹp miếng mút xốp đã thấm mực in Ronéo bôi nhẹ nhàng một lớp mỏng và đều lên toàn bộ bàn tay và ngón tay, bởi mực hơi lan ra mép của bàn, ngón tay và xuống dưới nếp lằn cổ tay. Khi in, bàn tay để một cách tự nhiên, không xoè quá, không khép quá. Áp sát bàn tay xuống mặt giấy, dùng tay bên kia ấn vào kẽ các ngôn tay, dùng cổ hoặc mu bàn tay kia ấn phần mu bàn tay đang in để các vân ở lòng bàn tay cũng được in rõ trên giấy. Nhắc bàn tay lên bắt đầu từ phía ngón rồi tới lòng bàn tay, ấn cổ tay lên mặt giấy để lấy được nếp lằn cổ tay. In ngón tay của từng bàn tay ngay phía dưới bàn tay theo thứ tự tương ứng với các ngăn trên bàn tay đã in. Khi in ngón không đay ngắn mà chỉ lăn nhẹ một lần từ phía cạnh này sang cạnh bên kia từng ngón tay để lấy cho đủ các ngã ba vân trên đất ba của ngón tay. 5.2. Phân tích đặc điểm nếp vẫn tay Sử dụng bản in nếp vân da bàn tay của mình: 5.2.7. Ghi chú tên và nhận xét về 3 nếp (rãnh) lớn trên lòng bàn tay: nếp dọc, nếp ngang gần, nếp ngang xa (có thể có nếp ngang duy nhất). 2.2.2. Xác định và ghi chú các miền gần, miền xa lòng bàn tay, bờ quay R. bờ trụ U của bàn tay, 5.2.3. Xác định và đánh số các gò: Gà 1 (gò cái), gà II (nằm giữa đáy ngón trỏ và ngón giữa), gò III (giữa hai đây ngón giữa và nhẫn), gò IV (giữa hai đây ngón nhẫn và út) và gò V nằm rải dài dưới đáy ngón út ở bờ trụ. 5.2.4. Xác định và đánh số các miền xung quanh bàn tay từ 1 đến 13 (hình 1.1). 52.5. Xác định các ngã ba lòng tay và ghi chú tên của chúng trên hình in hai bàn tay của mình (hình 1.2). 8 Tiền Tên các ngã ba được quy định như sau: - Ngã ba a (đáy ngón trỏ). Ngã ba b (đáy ngón giữa). Ngã ba c (đáy ngón nhẫn). 6 miền oud so ban 164 3 od ad syn Al iog ids out groub inb Sau 5 năm Du sd car vo dạng TÊN THÔNG Trong sd hạn nhấn dasd NÀY THÔNG 3.5 Ngã ba d (đáy ngón út). oại như grout ad ba noim tej std Jeased sau Bu datdo nav grбub tub Voù fod on ém nôim not Nếu không có thì gọi là ngã ba không, ví dụ đáy ngón nhẫn không có ngã ba thì ký hiệu Co. Lưu ý: Một số ít trường hợp bên cạnh ngã ba a và d còn có các ngã ba phụ, ngã ba phụ được ký hiệu a' và d'. Trên gò cái còn có thể có 2 ngã ba: a (ở phía trên), f (ở phía dưới) hoặc chỉ có một trong hai ngã ba ấy. Trên gò út cũng có thể có ngã ba h nhưng rất hiếm. Các ngã ba f, h chỉ xuất hiện ở ô mô cái hoặc ô mô út có hoa vân. Dọc theo trục lòng bàn tay trên đường thẳng kéo từ giữa nếp cổ tay tới phía các ngón tay có các ngã ba trục (hình 1.2): - Nếu ngã ba trục nằm cách nếp cổ tay không quá 1/8 chiều dài đường trục thì gọi là ngã ba trục t. 10 11 9 12 8 7 Nếp ngang xa Nếp ngang gần II III VI 13 5 Bo quay Bo trụ I V 4 Anim you Hoga i6um BUD NAV B ad Ban S ved I do gnos 33 maju nie joM Nep doc ney BOH X.S.E daim daldo sin yet 380 mIT :mál doo ad An oo grodd ved ABU Do ni dib X nov idd 160.(68.I did) A 6f oid v 2 an ad syn.do good bob you nevidi ipo sv sig daido 6 men işi guda ed egn to do au "A él võid va vel gnus ál fog Hình1.1. Các nếp, các miền, các gò trên lòng bàn tay BV (dƐ.I did) de 50 g om d ny ya no es una en tisol ind do som 09 Nếu ngã ba trục nằm ở giữa đường trục hoặc trên dưới không quá 1/8 chiều dài đường trục thì gọi là ngã ba trục t". (öri non vàb) в вd Nếu ngã ba trục nằm ở vị trí trung gian giữa t và t"gọi là ngã ba trục t’. 5.2.6. Đường vân chính: Đường vân chính là đường vẫn dài nhất và rõ nhất trong số ba đường vân tạo thành ngã ba. Đường vẫn chính được gọi tên bằng chữ số chỉ tên miền mà nó kết thúc. Ví dụ: đường vân chính của ngã ba a kết thúc tại miền 4 thì ký hiệu là A4 (hình 1.2). Liệu từ nuôi ad ses học tài làm muôn nôn ad aga udq ad Agn o 6)1.(and sidq 6) s :ad dad Agn do art do gro3 IỀU BỞI CÓ Và ông ở tr striq iot yet do qên suig Yu our groub isb neido 8 A 1581 b a 2 t' JI red quilt oв JOM uda ido oğod (idub sinq out oedt oo d И Bgn él fog id 68 sup Hình 1.2. Các ngã ba đường vân Mỗi sinh viên tự xác định một đường vân chính của hai bàn tay mình 5.2.7. Hoa vân tại đầu ngón tay: Nhận biết và gọi đúng tên hoa vân của mười ngón tay của chính mình. Cách làm: Tìm các ngã ba: từng ngón có ngã ba hay không, có 1 hay 2 ngã ba hay không có ngã ba. Xác định tên hoa vân: Không có ngã ba nào: vân cung, ký hiệu là A (hình 1.3a). Đôi khi vân cung có một ngã ba nhưng lại nằm ở chính giữa và cụt thì vẫn cung được gọi là cung lều ký hiệu là A". 旧 - Có một ngã ba trục trên ngón tay: vẫn móc ký hiệu là L (hình 1.3b). Vân móc có hai loại: 10 + Vân móc quay: chiều mở của bó đường vân quay về phía bờ quay. + Vân móc trụ: chiều mở của bờ đường vân quay về phía bờ trụ. - Có 2 ngã ba trên một ngón tay: vân vòng (hay vẫn cuốn). Ký hiệu là W. Có nhiều loại vân vòng (hình 1.3c). Pill + Vòng kín đồng tâm (1) HUỆ MÁI HOẶC - TÔI N TÂN MÀU UŽIT - 1013 ỀNT TẬV + Vòng hở đồng tâm (2) + Vòng xoắn + Vòng móc kép + Vòng ra- két rush or tây môi anh 5.2.8. Đếm số đường vân đầu ngón (3) (4) (5) (hình ra-két nhỏ bên trong và các quanh không liền kín). quanh không liền kín). Tôi cạnh trái ti tay và tính tổng số đường vân bao Để xác định độ thưa hay mau của đường vân, người ta dùng các công thức về số lượng. Muốn làm được phải biết đếm đường vân. Có thể dùng kính lúp cầm tay để đếm tổng số đường vân. DOH AH UHS S Cách đếm: Kéo một đường thẳng nối tâm ngã ba đến tâm của hoa vân móc hoặc vòng cắt ngang qua các đường vẫn của hoa vân. Đường được đếm là đường bị đường thẳng ấy cắt ngang qua (trong trường hợp có 2 tâm ngã ba thì tính số đường vân bên nào nhiều hơn). phan guội oga mỗin ond 33 ngd vật đậm mà và sb gaşim Chỉ số về tổng số đường vân là tổng số các đường vân của các đầu ngón tay được đếm. Ví dụ: xem hình 1. 3. 19 UT A O L 14 nov doW isd néd lom on 15 ε (a)pròn húb ôn tậy év TreƐ (b) V:mel noix iv noid dab (c) Hình 1.3. Các loại hoa vân và tính số đường vân měl nồix nồid nhỏ để 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH Thả Tôi mộ tin mới lo go ghi l S 1. Ghi chú các nếp, các miền, các gò, các ngã ba của đường vân trên bản in nếp vân da bàn tay. 2. Xác định vị trí của ngã ba trục. 3. Xác định các loại hoa vân, tính tổng số đường vân của các ngón tay. 11 Bài 2 VẬT THỂ GIỚI – CÁCH LÀM TIÊU BẢN ĐỂ XÉT NGHIỆM VẬT THỂ BARR 1. MỤC TIÊU Tự làm được tiêu bản tế bào niêm mạc để xét nghiệm vật thể Barr. Sử dụng được vật kính đầu để tự tìm, quan sát và vẽ được vật thể Barr. Quan sát được vật thể dùi trống và vật thể Y. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học bài lý thuyết về vật thể giới và đọc lại phần sử dụng vật kính đầu ở bài thực tập số 1 (phần nguyên lý sinh học), Tự làm một tiêu bản tế bào niêm mạc miệng để quan sát vật thể Barr. Quan sát và vẽ hình ảnh các loại vật thể giới. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ 3,1. Cho mỗi bản hai sinh viên 2 kinh hiển vi có vật kinh x 10, x 40 và x 100 hoặc x 90. I lạ đầu bách hương. 2 phiến kính có dán nhãn. 2 que lấy tế bào đã hấp sấy vô trùng. 2 tiêu bản tế bào niêm mạc miệng có vật thể Barr đã làm sẵn. 3.2. Cho cả tổ sinh viên Các kính hiển vi triển lãm: Vật thể Barr và vật thể dùi trống. Bộ ảnh và tranh về vật thể giới. 2 bộ dụng cụ để làm nhuộm tiêu bản vật thể Barr 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Kể tên các dạng vật thể giới? 2. Trình bày nguồn gốc của vật thể Barr 12 3. Trình bày nguồn gốc của vật thể Y? 4. Nói ý nghĩa của việc xét nghiệm vật thể giới 5. NỘI DUNG 5.1. Làm tiêu bản tế bào niêm mạc miệng để xét nghiệm vật thể Barr Bộ dụng cụ làm tiêu bản: Thiếu kính sạch có dân nhân. Que lấy tế bào niêm mạc miệng; Que có thể làm bằng tre, gỗ hoặc kim loại dài 15 cm, rộng làm vát một đầu tù nhẵn để lấy tế bào, đầu kia có thể vật hoặc bằng để phân biệt hai đầu. Qua phải xử lý vô trùng (lấy riêng cho từng bệnh nhân). Chén và nước sôi để nguội để súc miệng. 1 lọ dung dịch định hình cồn ether 1:1 1 cốc đựng thuốc nhuộm. Giấy thấm. ở cốc nước sạch để rửa tiêu bản Cách làm: Ghi nhãn tên bệnh nhân. Cho bệnh nhân súc miệng. Lấy bệnh phẩm: Tay phải cầm que lấy tế bào, yếu cầu bệnh nhân há to miệng nạo nhẹ niêm mạc miệng ở mặt trong má. Đàn mỏng tế bào trên phiến kính thành một hình tròn đường kính khoảng 1,5 cm ở phía không dán nhãn. Định hình. Để cho tiêu bản se mặt rồi định hình bằng cồn ether 1:1. Nhuộm: Đặt tiêu bản trong ống thuốc nhuộm theo chiều thẳng đứng sao cho nhãn không bị ngấm thuốc nhuộm. Thời gian 10 phút với thuốc nhuộm xanh tolidin, 15 phút với thuốc nhuộm hematoxylin oxyd thuỷ ngân. Rửa tiêu bản: Rửa những lần lượt qua 3 cốc nước sạch, dụng tiêu bản trên giấy thấm, lau khô mặt trái để khô tự nhiên. Quan sát, đánh giá. 5.2. Quan sát, đánh giá tiêu bản vật thể Barr Phải sử dụng vật kính đầu để quan sát, đánh giá: Ôn lại cách sử dụng vật kính dầu (vật kính x 90, × 100). Điều chỉnh kính để quan sát được hình thể tế bào niêm mạc miệng ở vật kính x 10. 13 - Khi thấy rõ được tế bào và nhân thì giữ nguyên độ cao mâm kính, quay vật kính x 10 ra phía trước, xoay vật kính dầu vào trục quang học vật kính dầu ngập vào giọt dầu là được (có thể quan sát từ vật kính x 10, vật kính x 40, sau đó quan sát ở vật kính dầu). Mắt nhìn vào thị kính, tay chỉ được điều chỉnh ốc nhỏ và xe đẩy tiêu bản để tìm và nhận biết vật thể giới. Quan sát và đánh giá trên tiêu bản tự làm: - ở Chỉ đánh giá vật thể Barr ở những tế bào có nhân đứng riêng rẽ, bắt mầu đồng đều, bờ nhân rõ nét và đều. Không đánh giá vật thể Barr ở những tế bào có các nhân chồng lên nhau, bờ nhân gấp, rách, nhân bắt mầu quá đậm hoặc màu nhạt. Chú ý phân biệt vi khuẩn và cặn thuốc nhuộm với vật thể Barr. Cần phân biệt vật thể Barr với các khối chất nhiễm sắc thể ở các loại tế bào khác. Vật thể Barr là một nhiễm sắc thể X dị kết đặc, bắt màu đậm, hình chóp hoặc hình thấu kính nằm áp sát mặt trong màng nhân tế bào, kích thước 1,2 micromet. Tỷ lệ vật thể Barr trong nhân tế bào từ 10 – 25% vì vậy phải di chuyển tiêu bản để quan sát trên nhiều tế bào. Có thể quan sát 50 tế bào để rút ra tỷ lệ vật thể Barr. 160 சகர் Hình 2.1. Tế bào với vật thể Barr 5.3. Quan sát vật thể dùi trống (drumstick): Xem tiêu bản triển lãm em sao Ở tiêu bản máu đàn của người phụ nữ, một số bạch cầu nhân múi có phần phụ nhỏ hình tròn hoặc bầu dục, có đường kính 1 - 1,5 micromet, bắt màu đậm, nối với nhân bằng một sợi mảnh màu hơi nhạt. Phần phụ này gọi là vật thể dùi trống. Thường đánh giá vật thể dùi trống ở bạch cầu nhân 3 hoặc 4 múi. 14 IV 1ADOM VLADAR ST YAJ TAUHT ÝN И เงินสด MAJ 3G 10 dim odqmyl oád s dugod udtag loun Hình 2.2. Bạch cầu nhân múi với vật thể dùi trống 5.4. Vật thể Y: Xem ảnh (Hình 2.3) a add one ma b da ООН ЧАНЯ о oša m Hình 2.3. Với phương pháp nhuộm huỳnh quang a. Vật thể Y ở kỳ giữa b. Vật thể Y ở nhân gian kỳ ยว อ niv dnia jom or 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 1. Trình bày các bước làm tế bào niêm mạc miệng để xét nghiệm vật thể Barr. 2. Đưa vào đầu que chỉ ở vật kính dầu hình ảnh vật thể Barr ở tiêu bản tự làm. 3. Đưa vào đầu que chỉ một hoặc một vùng tế bào niêm mạc miệng không đủ tiêu chuẩn để đánh giá ở tiêu bản tự làm. id 4. Đưa vào vị trường vùng tế bào có đủ tiêu chuẩn để đánh giá vật thể Barr. 15 Bài 3 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO LYMPHO MÁU NGOẠI VI ĐỂ LÀM TIÊU BẢN NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI 1. MỤC TIÊU Trình bày được các phương tiện, dụng cụ, hoá chất và nguyên tắc xử lý dụng cụ để nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi Trình bày được tiến trình kỹ thuật nuôi cấy, thu hoạch tế bào lympho máu ngoại vi và làm tiêu bản nhiễm sắc thể. Nhỏ được tế bào lên tiêu bản, nhuộm được tiêu bản, quan sát được tiêu bản nhiễm sắc thể của người. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Chuẩn bị lý thuyết: Học trước phần về nguyên tắc làm tiêu bản nhiễm sắc thể người, đặc điểm bộ nhiễm sắc thể người. Quan sát phỏng cấy, các dụng cụ hoá chất để nuôi cấy, thu hoạch, làm tiêu bản nhiễm sắc thể. Quan sát tiến trình kỹ thuật nuôi cấy, thu hoạch tế bào máu ngoại vi để làm tiêu bản nhiễm sắc thể Tự nhỏ tế bào lên tiêu bản, nhuộm tiêu bản, quan sát tiêu bản ở vật kính x10, x40, phân biệt các dạng nhiễm sắc thể ở vật kính x10, x40. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ 3.1. Cho mỗi sinh viên; Một kính hiển vi quang học 3.2. Cho cả tổ sinh viên 3.2.1. Một lọ chứa dịch treo tế bào sau thu hoạch 3.2.2. Các phương tiện, dụng cụ hoá chất để nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vị để làm tiêu bản nhiễm sắc thể 3.2.2.1. Trang thiết bị 16 Buồng cấy tế bào: Thường sử dụng buồng cấy thổi. Trong buồng cấy phải có hệ thống lọc khí tiệt trùng, có hệ thống thổi không khí với áp lực mạnh để chỉ cả các không khí đã được tiệt trùng lưu thông trong buồng cấy, ngoài ra thanh còn có đèn tím để tiệt trùng, các giá để ống nghiệm, ống ly tâm, đèn cồn, (Im00s hộp đựng bông đã tiệt trùng, lọ đựng cồn 90° - 100°... Chai đựng môi trường (250ml - 500 ml - 1000ml). Chai cấy 30 ml - 60 ml. ar o62 moldo Bơm tiêm 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml. Các dụng cụ thuỷ tinh phải là thuỷ tinh trung tính. Hộp nhôm đựng các dụng cụ để sấy tiệt trùng. — Nút bông, nút cao su, giấy bọc, dây cao su... — Áo quần, mũ, khẩu trang vô trùng. Kính hiển vi quang học. Tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm 37°C để nuôi cấy (Nếu có tủ ấm CO, 37°C thì tốt). 3.2.2.2. Hoá chất - Môi trường nuôi cấy thông dụng là TC 199 (Parker) hoặc F12, F10... - Huyết thanh: Có thể là huyết thanh tự thân (huyết thanh của chính người lấy tế bào lympho để nuôi cấy) hoặc huyết thanh bào thai bê, hoặc huyết thanh AB, huyết thanh máu dây rốn. PHA (phytohemaglutinin). - Heparin. Môi trường nuôi cấy mab flojb SIGMA Maro,0 10x good poda dotb am/0 daid daib doib gru HOOO HO :iuos bialy HO HO lonadt M mél -Huyết thanh oda IAL MED GEAGLE UÃO A 3581350 nev SIRMA PHA Colcemid loun uo Đậu để làm PHA Mẫu tế bào đang nuôi cấy Junq OS sur vet jod gost soul non uab nal grub iom dait vurub 66 use su fodo BUT Hình 3.1. Một số hoá chất nuôi cấy thông dụng và mẫu tế bào nuôi cấy those Bl 17 3.2.3. Chuẩn bị dụng cụ hoá chất để thu hoạch tế bào nuôi cấy và làm tiêu bản nhiễm sắc thể 3.2.3.1. Phương tiện dụng chi Giá để ống ly tâm. Ống ly tâm (tốt nhất là đáy nhọn) 10ml. Các chai đựng dung dịch nhược trương, dung dịch để cố định (100 - 200ml). Các chai đựng Giêmsa, đựng dung dịch đệm để nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể. Các ống để nhuộm. Pipet Pasteur. Bam tiêm (10ml). Cốc thuỷ tỉnh. Phiến kính. Sạch, không bị xước. Máy ly tâm tốt nhất là loại ly tâm theo hướng thẳng đứng để cặn tế bảo lắng ở đáy. Tủ lạnh, tủ ấm, cân phân tích, kính hiển vi quang học... 2 Hoá chất Dung dịch nhược trương KG10,075M. Dung dịch định hình: + Acid acetic: CH,COOH. + Methanol: CH2OH. Hoá chất dùng làm dừng tế bào ở kỳ giữa: Colcemid. Thuốc nhuộm: Giámga, các dung dịch đệm để nhuộm: dung dịch đệm phosphat: Na2HPO, KH2PO14 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Trình bày nguyên tắc làm tiêu bản nhiễm sắc thể người? 2. Trình bày đặc điểm nhiễm sắc thể người? 5. NỘI DUNG 5.1. Giới thiệu quy trình xử lý dụng cụ nuôi cấy Các dụng cụ thuỷ tinh mới dùng lần đầu nên luộc trong bột tẩy rửa 20 phút, sau đó dùng chổi lông cọ kỹ. Những lần sau chỉ cần cọ kỹ trong bột tẩy rửa sau đó rửa sạch bằng nước máy nhiều lần. 18 7 Ngâm trong NaOH IN (40g/ lít) x 24 giờ sau đó rửa kỹ bằng nước máy nhiều lần. J Ngâm trong HCl 1% x 24giờ ... rửa kỹ bằng nước máy nhiều lần. Ngâm nước cất 1 lần x 2 giờ suc sạch. Ngâm nước cất 2 lần x 2 giờ một súc sạch. Để khô, đậy nút bóng (các nút bông làm bằng bông không thấm nước). Các pipet và bơm tiêm cần bơm rửa nhiều lần, xử lý theo các bước tương tự như trên. Đối với các kim tiêm cần phải thông, rửa thông trong bột tẩy rửa; sau đó rửa sạch bằng nước máy nhiều lần. Ngâm trong ethanol 96 % 30 phút, Ngầm trong nước cất 1 lần x 2giờ. Ngâm trong nước cất 2 lần x 2giờ sau đó để khô. Các dụng cụ thông thường cho vào hộp nhôm để sấy ở nhiệt độ 120 - 150 C trong 1 giờ. Đối với các nút cao su: Nếu dùng lần đầu luộc trong bột tẩy rửa hoặc NaOH 0,5N x 15 phút (dung dịch phải ngập các nút cao su). Những lần sau chỉ cần cọ kỹ bằng bột tẩy rửa; cọ từng chiếc nhất là mặt dưới của nút. Rửa nước thưởng nhiều lần; ngầm nước cất 1 lần x 2giờ; nước cất 2 lần x 2giờ, đóng gói từng chiếc hấp ẩm với áp lực 1 atmotphe x 30 phút hoặc luộc bằng nước cất 2 lần x 30 phút, sau đó đổ hết nước, rồi để khô. Quần áo, khẩu trang hấp ẩm, sấy nhẹ ở nhiệt độ 60 C. 5.2. Tiến trình kỹ thuật nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi để làm tiêu bản nhiễm sắc thể người 5.2.1. Chuẩn bị buồng cấy để nuôi cấy Lau chùi buồng cấy, bàn ghế, sàn nhà, tường của phòng cấy bằng dung dịch chloramin 196. Bật đèn tím trước khi cấy 30 - 40 phút. Vệ sinh cá nhân theo nguyên tắc vô trùng. Các dụng cụ, hoá chất đã được xử lý theo nguyên tắc nuôi cấy, để đầy đủ trong buồng cấy. 5.2.2. Lấy máu để nuôi cấy Lấy máu tĩnh mạch 1. mì cho vào ống trắng heparin (100 NE ml). Nếu dùng huyết thanh tự thân có thể lấy 8ml - 10ml (lượng máu này cho vào một lọ tráng heparin hoặc cho vào 2 ống (một ống gồm 2ml có tráng heparin dùng để cấy; một ống gồm 8. 10 ml không có heparin để lấy huyết thanh). 19 5.2.3. Một số phương pháp nuôi cấy có thể áp dụng Nuôi cấy theo phương pháp Lejeune (1965) 1 lọ cây gồm: 6ml môi trường, 2ml huyết thanh. 0,3 - 0,5ml máu toàn phần. 0,1ml dung dịch PHA, Nuôi cấy theo phương pháp Moorhead (1960) 1 lọ cấy gồm: - 6 -8ml môi trường. 2 - 2,5ml huyết thanh. 0,5ml dịch huyết tương có bạch cầu. 01ml dung dịch PHA. Phương pháp nuôi cây trong bơm tiêm Phương pháp này thích hợp với điều kiện đi thực địa. Một bơm tiêm thể tích 10ml tráng heparin, lấy 0,2 - 0,5ml máu tĩnh mạch, về phòng thí nghiệm bổ sung 4mh môi trường + 1ml huyết thanh và 0,1ml dung dịch PHA Người ta có thể dùng picoll paque hoặc các hoá chất khác để tách riêng bạch cầu để nuôi cây. Đặt lọ cấy vào tủ ấm BTC x 72giờ, trong quá trình cấy có thể lắc nhẹ để tránh hiện tượng đóng văn hồng cầu. 5.3. Tiến trình thu hoạch tế bào nuôi cấy và làm tiêu bản nhiễm sắc thể 20 Đối với kỹ thuật làm tiêu bản thực tập, thu hoạch vào giờ thứ 72: Trước khi thu hoạch 2 giờ (giờ thứ 70) cho Colcemid nồng độ 0,1 microgam/ml (cho 2 giọt dung dịch colcemid vào 1 lọ cấy). Ly tâm 800 - 1000 vòng / phút x 10 - 15 phút, giữ lại cặn chửa tế bào (khoảng 2ml). Nhược trương bằng KC1 0,075M ở nhiệt độ 37C x 30 phút, Ly tâm: 800 vòng/phút, giữ lại cặn có tế bào (khoảng 2ml/phút). Cố định bằng Carnoy lạnh (ở methanol: 1 acid acetic): 1 ống ly tân bổ sung khoảng 4 - 6ml Carnoy, cho từ từ, trộn kỳ. Ly tâm 800 vòng/phút x 10 phút, giữ lại cặn tế bào. Cố định như vậy từ 4 - 6 lần. Từ lần thứ 2 trở đi có thể để qua đêm. Ông để qua đêm phải bổ sung đầy đủ dung dịch Carnoy và bịt kín miệng ống. Nhỏ tiêu bản: Chuẩn bị lam kính sạch không mở, không xước (các phiến kính này đã được xử lý bởi NaOH IN x 24giờ. HCl 1% x 24giờ và ngâm trong cồn 90° x 24 giờ). Các lam kính để lạnh 1 - 2 giờ trước khi nhỏ tiêu bản + Ly tâm lần cuối để lại 0,5ml cặn. + Nhỏ tiêu bản. + Để khô tự nhiên. + Nhuộm Giêmsa (tỷ lệ 20%) x 30 phút hoặc nhuộm Giêmsa (5%) trong dung dịch đệm phosphat x 15 phút. + Để khô tự nhiên. | MÉT THỨ 08 ĐỀN SÀNG ĐƯƠUNG + Gắn tiêu bản bằng bôm Canada. ( HAY HẬU) Các dung dịch cần chuẩn bị — KH,PO 9,1g+ nước cất vừa đủ 1000ml. Na,HPO, 11,9g + nước cất vừa đủ 1000ml. Pha dung dịch đệm phosphat theo tỷ lệ: NaHPO4: 49,2ml. UBIT OUM. ourt gnoo toivot soup sou yup oedd fougn KH,PO: 50 x x Giêmsa mẹ. By doel m nul jod év Ba Pha dung dịch Giêmsa tỷ lệ 20% (2ml Giêmsa mẹ + 8ml nước cất). ing dịch Giêmsa 5% trong dung dịch đệm phosphat với tỷ lệ: Pha dung Na2HPO4: 47,5ml KH2PO4: 47,5ml Giêmsa: 5ml usb mit ЗОН ЧАНЯ ДИН. moib b év od novu ib ond et qèda gaburq ov toyun y nên do ĐH. Y HÀ NỘI ibugn art one msida ộd NST người nữ ổid ộc gần noso grty miền qd Doi DỌC (Bình thường) mel net daíd év Råd oÀ AMBUS BM. SINH HỌC 8 noiv knizni tom od.. Jgn in igoga usm orgy who nos on bus muda dad weit & Siv dnia of .. quoise by man iбuga su od one moida my das quois é un iбugn suo ant one moida mu dast Hình 3. 2. Tiêu bản NST - Hình ảnh NST người ở kỳ giữa ground and Un av men rou 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH tây ibub suig c and oe mỗirin mự Đưa vào đầu que chỉ một nhiễm sắc thể tâm giữa (hoặc tâm lệch, tâm đầu) ở vật kính x 40 trên tiêu bản nhiễm sắc thể mà mình tự tay nhỏ tiêu bản và nhuộm. 21 Bài PHƯƠNG PHÁP XẾP BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI (LẬP KARYOTYP NGƯỜI 1. MỤC TIÊU Xếp xong một bộ nhiễm sắc thể người theo quy ước quốc tế, viết công thức karyotyp và kết luận. Quan sát được cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa của người ở vật kính x 40. Đếm số lượng và phân biệt các dạng nhiễm sắc thể tằm giữa, tâm lệch và tâm đầu. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước phần lý thuyết về phương pháp tể bào di truyền học và đặc điểm bộ nhiễm sắc thể người. Đọc trước bài thực tập để nắm vững cách xếp bộ nhiễm sắc thể. Quan sát các tiêu bản và hình triển lãm. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ 3.1. Cho mỗi bàn 2 sinh viên 2 lọ hồ dán, hộp petri 2 bản in các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa của người nam và nữ. 2 tiêu bản nhiễm sắc thể bạch cầu lympho máu ngoại vi người. 12. Cho cả tổ sinh viên Tranh cụm nhiễm sắc thể của người nam và karyotyp. Tranh cụm nhiễm sắc thể của người nữ và karyotyp. 2 karyotyp mẫu của người nam và nữ bình thường. Cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa dưới vật kính dầu. 22 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Trình bày những tiêu chuẩn để xếp bộ nhiễm sắc thể người? 2. Trình bày đặc điểm nhiễm sắc thể nhóm A của người (nhóm B, C, D, E, F, G)? 5. NỘI DUNG 5.1. Quan sát cụm nhiễm sắc thể người bình thường 5.1.1. Cách làm tiêu bản Bình thường tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi không phân chia, khi nuôi cấy trong môi trường và nhiệt độ thích hợp có sự kích thích của PHA (phytohemagglutinin), bạch cầu lympho chuyển dạng và phân chia, sau 70 giờ nuối cấy, bổ sung Colcemid làm cho sự phần bảo dừng lại ở kỳ giữa. Thu hoạch các tế bào ở giờ thứ 72. Sau các bước xử lý với dung dịch nhược trương và định hình, các cụm nhiễm sắc thể và nhân tế bào được phân tán đều lên phiến kính, nhuộm bằng Giênga. 1.2. Quan sát Ở vật kính x 10: Di chuyển tiêu bản tìm cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa có các nhiễm sắc thể phân tán đều. Trên tiêu bản thấy các nhân bạch cầu bé hơn, màu tím đỏ là nhân của những tế bào chưa chuyển dạng và các nhân lớn hơn là nhân của các tế bào đã chuyển dạng. Xen vào đó có các cụm nhiễm sắc thể ở kỳ giữa, tìm những cụm có nhiễm sắc thể phân tán đều và đẹp. Ở vật kính x 40: Quan sát hình dạng nhiễm sắc thể và chú ý phân biệt được các loại nhiễm sắc thể tâm giữa, tâm lệch và tâm đầu. Có thể đếm số lượng nhiễm sắc thể trong cụm (46 nhiễm sắc thể). Chú ý: Xem hình ảnh triển lãm cụm nhiễm sắc thể ở vật kính dấu. 5.2. Xếp bộ nhiễm sắc thể người binh thường 5.2.1. Tiêu chuẩn xếp loại bộ nhiễm sắc thể người Dựa vào tiêu chuẩn chiều dài tương đối của nhiễm sắc thể vị trí phần tâm, nhiễm sắc thể, có hay không có eo thắt thứ hai, có hay không có vệ tinh, 46 nhiễm sắc thể của người được xếp thành 23 cặp, chia thành 7 nhóm theo kích thước giảm dần. Nhóm I (nhóm A): Gồm 2 cặp nhiễm sắc thể số 1, 2, 3, là các nhiễm sắc thể có kích thước lớn nhất, nhiễm sắc thể số 1 và 3 có tâm giữa, nhiễm sắc thể số 2 có tâm gần giữa. Nhiễm sắc thể số 1 có thể có thêm co thắt thứ hai ở nhánh dài gần tâm. Nhóm II (nhóm B): Gồm 2 cặp nhiễm sắc thể số 4, số 5 là các nhiễm sắc thể có kích thước lớn và có tâm gần đầu và khó phân biệt nhau bằng kích thước. Nhóm III (nhóm C): Gồm 7 cặp nhiễm sắc thể là nhiễm sắc thể số 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Các nhiễm sắc thể này có kích thước trung bình, tâm gần giữa. Trong đó các nhiễm sắc thể số 6, 7, 8, và 11 có tâm gần giữa hơn các nhiễm sắc thể số 9, 10, 12. Nhiễm sắc thể X giống nhiễm sắc thể số 6 và 7. 23 Nhóm IV (nhóm D): Gồm 3 cặp nhiễm sắc thể số 13, 14, 15 là các nhiễm sắc thể có kích thước trung bình, tầm đầu. Các nhiễm sắc thể này khó phân biệt nhau về kích thước, có thể thấy vệ tinh ở nhánh ngắn. Nhóm V (nhóm E): Gồm 3 cặp nhiễm sắc thể số 16, 17, 18 là các cặp nhiễm sắc thể tương đối ngắn. Nhiễm sắc thể số 16 tâm hầu như ở giữa, nhiễm sắc thể số 17 tâm gần giữa nhưng lệch hơn nhiễm sắc thể số 16, nhiễm sắc thể 18 tằm gần đầu. Nhiễm sắc thể số 16 có thể có eo thắt thứ hai ở nhánh dài gần tâm. Nhóm VÌ (nhóm F): Gồm 2 cặp nhiễm sắc thể số 19, 20, là các nhiễm sắc thể ngắn, tâm gần giữa, khó phân biệt nhau bằng kích thước. Nhóm VII (nhóm G): Gồm 2 cặp nhiễm sắc thể số 21, 22, là các nhiễm sắc thể rất ngắn, tâm đầu. Nhiễm sắc thể Y có tâm đầu, hình dạng và kích thước tương tự như nhiễm sắc thể thể nhóm G nhưng hai nhánh dài khép gần nhau hơn và trên nhánh dài có eo thắt thứ hai nằm ở phần giữa nhánh dài 5.2.2. Các bước lập karyotyp Kẻ vào vở (hoặc giấy) 4 đường kẻ ngang cách nhau 4 dòng kẻ (dòng 1 và đông 2 cách nhau rộng hơn). Đếm số lượng nhiễm sắc thể trong cụm đã được in sẵn trên giấy. Cắt rời từng chiếc nhiễm sắc thể. Xếp sơ bộ các nhóm nhiễm sắc thể vào 4 đường kẻ theo thứ tự: Nhóm A, B đường kẻ 1, nhóm 6 đường kẻ 2, nhóm D, E đường kẻ 4, nhóm F, G và cặp nhiễm sắc thể giới tính đường kẻ 4. Xếp nhánh ngắn của nhiễm sắc thể quay lên trên. Lưu ý: Muốn xếp cho nhanh nên xếp các nhóm lần lượt theo thứ tự sau: Á, B, D, G, E, F, C). Điều chỉnh các nhiễm sắc thể từng nhóm cho đúng. Dán nhiễm sắc thể theo nhóm sao cho tâm vào đúng dòng kẻ. Kết luận: Để kết luận, phải viết được số lượng nhiễm sắc thể và cặp nhiễm sắc thể giới tinh, ngăn cách nhau bằng dấu phẩu; sau đó kết luận về tình trạng của bộ nhiễm sắc thể đó. Ví dụ: 46,XX. Karyotyp người nữ bình thường. 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 1. Đưa vào đầu que chỉ 1 cụm nhiễm sắc thể đẹp ở kỳ giữa ở vật kính x 40. 2. Trình bày bộ nhiễm sắc thể đã xếp. 24 2168 02 TOM AVTO HEAD TO HIT MAHS DA2 ME ИАНЧ K-H 3 B UŽIT OUM -8888888XX888 5 B 6 7 8 66 10 11 12 6 7 8 10 11 12 -06 ——d XX-48-88- DA 13 14 15 D da ood dried 16 17 18 E Bodmin for not inév et soup bu fu odds- -8X- Ax 88 13 1614d 15 da 160 17 18 D E 19 20 21 22 G 19 20 F XX 21 22 G Hình 4.1. 46,XX. Karyotyp người nữ bình thường Hình 4.2. 46,XY. Karyotyp người nam g bình thường ood gasup iv neid daid S noid job done maida do med uoit ind anyb yard I of niv dnia ot so on.S.E (02-egmerloxe bitsmondo rataia) me into bitsmondo robot in rinid malash (Ogned moun qariq gabuda) ngob nudo od oša mõida das dail TBYUHT YJ IOH UÃO A feri örit ose moida,me ido bitsmoro fob ostanud neid neb nab oro bo u Seda ona moida пsob nudo gnóv daid adi še mord,mer proul oa ngol for oo or a mairin od obo ov noul fox év sig dnsb doit nén..a ground art oba meid ngol foЯ...e 25 Bài: PHÂN TÍCH KARYOTYP CỦA MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN VÀ MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN NHIỄM SẮC THỂ 1. MỤC TIÊU Viết được công thức nhiễm sắc thể theo qui ước quốc tế và gọi đúng tên hội chứng hoặc bệnh tương ứng với từng bộ nhiễm sắc thể Quan sát một số dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước phần lý thuyết về nhiễm sắc thể và bệnh học nhiễm sắc thể. Viết công thức nhiễm sắc thể theo qui ước quốc tế và gọi tên hội chứng hoặc bệnh tương ứng với từng karyolyp. Xem tiêu bản hình ảnh một số dạng đột biến nhiễm sắc thể. 3, PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ 3.1. Cho mỗi bàn 2 sinh viên 2 kính hiển vi quang học. 1 khay đựng hai tiêu bản có nhiễm sắc thể đột biến. 3.2. Cho cả tổ sinh viên Triển lãm hình ảnh trao đổi chromatid chị em (sister chromatid exchange-SCE). Hình ảnh nhiễm sắc thể chuyển đoạn (phương pháp nhuộm băng G). 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT Nêu cơ chế dẫn đến hiện tượng trao đổi chromatid chị em, nhiễm sắc thể hai tâm, nhiễm sắc thể hình vòng, chuyển đoạn nhiễm sắc thể 5. NỘI DUNG 5.1. Phân tích, đánh giá và kết luận về các bộ nhiễm sắc thể có rối loạn số lượng 5.1.1. Rối loạn nhiễm sắc thể thưởng 26 3 B -XX-XX-XX-XX-X8-88-88 rinit.big er ose main ngol toЯs.. 7 8 10 11 12 82-28-15- -10 80 13 14 15 16 17 18 13 14 D 40 -XX- 448-44 XX 19 20 21 22 19 20 XX G F ४४ 15 11-11- B 10 11 12 16 17 18 E 88 21 22 XX G Hình 5.1. Karyotyp số 1 a öz qvion 5.2. Kar Hình 5.2. Karyotyp số 2 H K H 3 5 B 11-11-1 5 -88-XX-X8—88-XX-XX- 6 7 8 10 11 12 6 10 11 12 160 65 13 14 15 16 17 18 13 14 15 D E D 16 17 18 E -XS- xx 88 -xx *X 88 19 20 21 22 19 20 21 22 F XX G F XX G Hình 5.3. Karyotyp số 3a cviove). Xe dre Hình 5.4. Karyotyp số 4 27 5.1.2. Rối loạn nhiễm sắc thể giới tính K-W B -88-XXXX-88-88 88-88- 28 11-X-"} 3 6 8 10 11 12 6 7 8 B 66 9 10 11 12 ሰለ -४४-४४-४६- - **-**-**- 13 14 47 15 16 17 18 13 14 15 16 17 18 D E -४४ -४x AA 19 20 21 22 19 20 21 22 F X G F XXY G Hình 5.5. Karyotyp số 5 XX-XX-IX 3 Hình 5.6. Karyotyp số 6 11-0 4 5 B ·XX-88-8X-XX-XX-XX-88- 6 8 10 11 12 AA XX-8A-14- 13 14 15 16 17 18 E XA 19 20 21 22 XYY G Aba gydovisX.A.2 dniH Hình 5.7. Karyotyp số 752 qylove) Eledaih 5.2. Quan sát một số dạng đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể hiện neld todas sta 5.2.1. Đột biến kiểu chromatid Gap: Trên một chromatid có một chỗ không bắt mầu và khoảng không bắt mầu này không vượt quá đường kính của một chromatid. Đứt đơn: Trên một chromatid có một đoạn đứt rời ra, khoảng đứt này lớn hơn đường kính của một chromatid và lệch trục so với chromatid. Trao đổi chromatid: Các chromatid của các nhiễm sắc thể khác nhau bị đứt ra và nối lại với nhau tạo nên các hình ảnh ba cánh hoặc bốn cánh. (D) TIN D geb prot a.Hiện tượng gap b. Hiện tượng đứt đơn D тги c. Hiện tượng trao đổi chromatid Hình 5.8. Hiện tượng gap (a), đứt đơn (b), trao đổi chromatid (c), (initi 29 5.2.2. Đột biến kiểu nhiễm sắc thể con vào nód 16b angh ba tom the usua bite Jub us of dabo nod k من ob dom oo bi Bil neid toG.s.a a. Hiện tượng isogap b. Hiện tượng đứt kép c. NST hai tâm d. Đoạn không tâm e. NST hình vòng bismoins job.osi gribui Hình 5.9. Hình ảnh isogap (a), đứt kép (b), nhiễm sắc thể hai tâm (c), đoạn không tâm (d), nhiễm sắc thể hình vòng (e). 30 Isogap: Hiện tượng gap xảy ra trên hai chromatid ở vị trí tương ứng - Đứt kép: Hiện tượng đứt xảy ra ở hai chromatid ở vị trí tương ứng. Nhiễm sắc thể hai tâm: Hiện tượng đứt xảy ra ở cả hai nhiễm sắc thể, phần còn lại có tâm của hai nhiễm sắc thể này nối lại với nhau. Đoạn không tâm: Hiện tượng đứt nhiễm sắc thể và đoạn đứt không tâm rời xa nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể hình vòng: Nhiễm sắc thể bị đứt, phần còn lại có thể nối với nhau tạo nên nhiễm sắc thể hình vòng có tâm hoặc không tâm. 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 1. Viết công thức nhiễm sắc thể của 7 karyotyu: Xác định tên hội chứng hoặc tên bệnh tương ứng với từng karyotyp. 2. Đưa vào đầu qua chỉ hình ảnh một loại đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: loại đột biến kiểu chromatid hoặc đột biến kiểu nhiễm sắc thể. 31 Bài t MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ THÔNG DỤNG ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 1. MỤC TIÊU Trình bày được nguyên lý tách chiết ADN và tiến trình kỹ thuật tách chiết ADN từ bạch cầu mẫu ngoại vi. Trình bày được nguyên lý và tiến trình kỹ thuật nhân đoạn ADN invitro PCR (Polymerase Chain Reaction). Nêu được những ứng dụng của kỹ thuật sinh học phân tử trong y học và đời sống. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước phần lý thuyết về nguyên lý và tiến trình kỹ thuật tách chiết ADN, nguyên lý và tiến trình kỹ thuật PCR. Quan sát việc thực hiện tiến trình kỹ thuật tách chiết ADN và kỹ thuật PCR Quan sát hình ảnh điện đi ADN sau khi tách chiết ADN và hình ảnh điện di sản phẩm của PCR. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ Cho cả tổ sinh viên 3.1. Trang thiết bị Máy ly tâm thông thường trong phòng thí nghiệm với ống ly tâm ( 100ml) hoặc ly tâm ống nhỏ (0,5 - 2ul). Máy ly tâm lạnh. Tủ ấm. Bình cách thuỷ, tốt nhất là bình có lắc. Tủ lạnh từ 4°C đến - 20°C hoặc - 80°C: tuỳ mức độ bảo quản mẫu, có thể bảo quản ADN trong nitơ lỏng với thời gian dài hàng chục năm. Tú am 37°C. Máy đo pH. Máy lắc. 32 Máy sấy khô, hấp ẩm (tiệt trùng. Máy điện đi. Thiết bị soi tử ngoại. Căn: có thể cân được g, mẹ. Micropipet các loại: Đã - 100k. 20 - 100μl. 200 - 1000μl. Các loại đầu tip cho micropipet. Ong Eppendorf. Các loại ống đong. Các loại dụng cụ thông thường của phòng xét nghiệm sinh hoá như chai, cốc... Giấy thiếc, giấy chỉ thị cho hấp vô trùng. 3.2. Hoá chất EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic) Acid boric. NH HCO,. Tris - HCL. Tris base. NaCl. SDS (Natri Dodecyl Sulfat). Natri azid. Ethanol tuyệt đối. Glycerol. Xanh bromophenol. Ethidium bromid. Proteinase K. ADN marker. Agarose. Từ các hoá chất này pha thành các dung dịch đệm cần thiết: EDTA 0,4 M Tris - HCI 2M MgCl. NaCl 3M. NaCl 6M. SDS 10%. TE 10mM. Đệm pha hồng cầu: 1mM N,HCO2 115 mM NH,CI Đệm phá bạch cầu: 100 mM Tris-HCl. 40mM EDTA. 50 mM NaCl. 0,2% SDS 0,05% Natri azid Đệm THE 5 x Proteinase K 1mg/500μl 33 Trang thiết bị cơ bản của phòng thí nghiệm sinh học phân tử: Máy PCR (máy nhân ADN), máy tử ngoại soi ADN Caution HC AM gogm ut los bub mod MÁY PCR VÀ ỐNG EPPENDORF ĐỂ CHẠY PCR grob grio inol lado your gör m 500 indo da od dnia morriga tox gródq suo gat sol pite:A BIJ9T ni Ontlue lyosbod MÁY LI TÂM SIÊU TỐC na KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ BỘ CHỤP ẢNH NST Hình 6.1. Minh hoạ một vài trang thiết bị cơ bản của phòng thí nghiệm dnéda 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT mob 1. Trình bày nguyên lý của kỹ thuật tách chiết ADN. 2. Trình bày nguyên lý của kỹ thuật điện di ADN. M ая MS M 3. Trình bày nguyên lý của kỹ thuật nhân đoạn ADN invitro (PCR). 5. NỘI DUNG 5.1. Kỹ thuật tách chiết ADN Mm0A JOH-BITT Mm 001 И Mm Od 5.1.1. Nguyên lý của kỹ thuật tách chiết ADN Mm0I ST YT Nguyên liệu cho tách chiết ADN là các tế bào có chứa ADN. Ta có thể tách ADN tổng số hoặc tách ADN của tế bào chất riêng. Tế bào có thể dưới dạng tươi, sống hoặc đã chết... Màng tế bào được phá vỡ bằng biện pháp cơ học hoặc hoá học (dùng chất 34 tẩy mạnh). Dùng các chất proteinase K để phân huỷ protein, có thể dùng ARNase để phá huỷ ARN. Dùng các chất phenol, ethanol, isopropanol... để tủa ADN. ADN được tách không có chiều dài như ban đầu mà thường bị gẫy, thường có độ dài 20 Kb đến 200 Kb. Bộ gen bị gẫy ở những đoạn khác nhau, nên có đủ đại diện các gen của bộ gen. Tuy thế nếu ADN bị gẫy nhiều quá, quá ngắn có thể hạn chế kết quả nghiên cứu tiếp theo. Để tách ADN từ máu ngoại vi Dùng các dung dịch phá vỡ hồng cầu để tách riêng bạch cầu. Phá vỡ màng tế bào, màng nhân bạch cầu, ADN được giải phóng cùng các chất khác: protein... Ở giai đoạn này cần có những chất ức chế hoạt động enzym nuclease, vì vậy người ta thường hay dùng EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetic) làm cho nuclease mất hoạt tính để ADN không bị phá huỷ. Các dung dịch phá vỡ màng tế bào thường dùng SDS, tiếp theo dùng proteinase K để phân huỷ phần lớn protein trong dịch chiết. Bên cạnh đó người ta có thể loại riêng ARN bằng cách dùng ribonuclease, chủ yếu phân huỷ ARN. Người ta hay dùng muối Na trước khi làm tủa ADN; của ADN với ethanol tuyệt đối lạnh tỷ lệ gấp 2 lần dịch chứa ADN hoặc isopropanol lạnh tỷ lệ 1:1. Với lượng ADN lớn có thể thấy ADN của dưới dạng “Con sửa” lơ lửng. Lấy ADN bằng dụng cụ thuỷ tinh. Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng ย ADN có thể bảo quản dưới dạng của khô - 20°C hoặc để trong dung dịch nước cất khử ion hay TE (Tris - HC1 0,01M; EDTA 0,001M) pHE Kiểm tra độ tinh khiết ADN: Dựa vào việc xác định tỷ lệ OD (Optical Density). Phổ hấp thụ cực đại của ADN tại bước sóng 260mm, protein 280nm; polysaccharid 230 nm. Nếu tỷ lệ: OD 260 OD 280 và OD 260 - 1,7 - 2 thì ADN được coi là sạch OD 230 Với phương pháp này cho phép phát hiện dịch chứa ADN có lẫn protein hay polysaccharid hay không. Kiểm tra ADN bằng phương pháp điện đi cho phép xác định có ADN không, có bị lẫn ARN không, ADN có bị gẫy nhiều không. Nguyên lý: Ở pH > 8, ADN mang điện âm, dưới tác dụng của dòng điện nó di chuyển về cực dương, tuỳ theo kích thước mà các đoạn ADN dài ngắn sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, thường điện đi với agarose gel. 35 Nhuộm ADN bằng ethidium bromid; dưới ánh sáng tử ngoại ADN gắn với ethidium bromid sẽ phát sáng. Qua hình ảnh điện đi ta có thể biết được mẫu tách chiết có ADN? Hình ảnh điện đi ADN là một vật đậm, to nhỏ tuỳ lượng ADN. Nếu ADN bị đứt gẫy nhiều và chưa sạch thì hình ảnh điện di gồm một dải băng không tạo thành một băng gọn. Chú ý: ethidium bromid là hoá chất có khả năng gây ung thư. Vì vậy khi làm việc phải đeo găng tay và thực hiện các quy định bảo vệ của phòng thí nghiệm. Dựa vào nguyên lý trên có nhiều quy trình tách chiết ADN từ máu ngoại vi. Ở đây chỉ giới thiệu một vài quy trình tách chiết ADN từ máu ngoại vi được áp dụng ở Bộ môn Y sinh học - Di truyền. 2.1.2. Quy trình tách chiết ADN Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống đã có sẵn EDTA 0,4M. trộn đều để máu không đông. Mẫu máu được bảo quản ở 4C cho tới lúc tiến hành kỹ thuật, Cho 5 ml dung dịch đệm phá hồng cầu vào ống máu trộn nhiều lần, ly tâm 2500 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ dịch nổi, giữ lại cặn của tế bào màu trắng. Mục đích chủ yếu là để phá huỷ hồng cầu, tách riêng bạch cầu. Có thể làm nhiều lần cho đến khi cặn tế bào có màu trắng sạch. Làm tan cặn tủa bằng cách dùng máy lắc. Cho tiếp vào ống chứa cặn của tế bào 900 đệm pha bạch cầu, phá vỡ tế bào bằng máy lắc trong 5 phút. Sản phẩm có thể dùng tách chiết tiếp ADN hoặc bảo quản ở 4°C trong vài tuần. Cho thêm vào ống 0,1 mg proteinase K lắc đều bằng máy lắc trong 5 phút. Ủ 50°C trong 2 giờ, 15 phút lắc một lần. Cho thêm 300 xl NaCl bão hoà 6M, lắc đều bằng máy lắc trong 5 - 10 phút, Ly tâm 2500 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cặn tủa protein, chuyển dịch nổi chứa ADN sang ống khác. Cho nhẹ nhàng ethanol tuyệt đối vào ống có dịch nổi chứa ADN, thể tích ethanol gấp 2 lần thể tích dịch nổi. Nghiêng ống nhẹ nhàng cho đến khi xuất hiện tủa ADN. Chuyển tủa sang ống Eppendorf đã có sẵn 200ul TE, lắc nhẹ. Để sản phẩm ở 37°C trong 2 - 3 giờ cho tới khi tủa ADN tan hoàn toàn. Kiểm tra chất lượng ADN bằng cách chạy điện di. Bảo quản ADN ở nhiệt độ 4°C. - 20°C hoặc - 80°C tuỳ thời gian cần giữ ADN ngắn hay dài. 36 5.1.3. Kiểm tra ADN sau khi tách chiết bằng phương pháp điện di (hình 6.2) dg độm út in ludo 08 Hình 6.2. Hình ảnh điện di ADN sau khi tách chiết ИСА ТЬ 5.2. Kỹ thuật nhân đoạn ADN (PCR) Mục đích: Từ một lượng ADN rất ít ban đầu, sau khi áp dụng phương pháp PCR sẽ có một lượng lớn ADN để sử dụng trong chẩn đoán, nghiên cứu. Các thành phần tham gia phản ứng. из + Enzym Taq polymeraseMTA joido dos sounds l + 4 loại nucleotid đã được hoạt hoá (dNTPs) + ADN mồi (Primer) + ADN khuôn (DNA template) Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: + Giai đoạn 1: Biến tính: nâng nhiệt độ lên 95°C. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của phân tử ADN khuôn đều được tách thành sợi đơn. Giai đoạn này thường từ 30 giây đến 1 phút. + Giai đoạn 2: Gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống 52°C. Ở nhiệt độ này hai đoạn mồi (mồi xuôi, mồi ngược) sẽ cặp đôi với hai sợi ADN theo hướng 5- 3. Giai đoạn này thường từ 30 giây - 1 phút + Giai đoạn 3: Tổng hợp ADN: nâng nhiệt độ lên 72°C, ở nhiệt độ này ADN Taq polymesase hoạt động để kéo dài các mạch ADN. Nguyên liệu ở đây là 4 loại dNTP. Thời gian tuỳ thuộc độ dài của trình tự ADN, thường từ 30 giây đến nhiều phút. 37 Cứ sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên một ADN khuôn được nhân thành hai. Sau khoảng 30 chu kỳ thì từ một phân tử ADN khuôn ban đầu có thể tạo ra một số lượng ADN gấp 230 lần. Toàn bộ quá trình trên được thực hiện nhờ máy “THERMOCYCLER” tự động. 1 2 3 4 5 Marker 10kb 547bp 400bp 360bp 1606p Tb neid nns IH Hình 6.3. Hình ảnh điện di ADN sau khi chạy PCR sau khi chay duds. 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 1. Nhận xét kết quả điện di ADN. gab ning sig 2. Ứng dụng kỹ thuật tách chiết ADN, kỹ thuật PCR trong y học và đời sống. (a¶TИb) sod isod obub sb (staigmet AИα) nouda obb iba dust do opub usb nõud Asid si ga šo dom Judq I nob varg 08 út grow yén ngob ici sob ind yén 65 35ida 0.0° groux ob sõida ad tiồm ne :S agobiolo Gd gnoud cans MCA ipa ind lov iôb qo sa (opugn iom loux iom) om sunq - vôig 08 god yn ngob ini п án ob 1ộida 60°ST nôl ob jinn yên MCA qodi gaoT :8 mpok ini All quaИ MCLA dogm o láb odd sb grob Jodi osseomyloq paт MA MUA 1 dan su isb ob soudt ut sig jódT ITИb isolél váb 6 A Jung usida nöb vaig 08 ús not me 38 Bài 7 PHƯƠNG PHÁP CON SINH ĐÔI, DI TRUYỀN QUẦN THỂ, DI TRUYỀN SINH HOÁ 1. MỤC TIÊU Sử dụng được các công thức để tính hệ số sinh đôi một hợp tử, hai hợp tử, độ di truyền và kết luận. Tính được tần số kiểu hình, tần số gen dựa trên số liệu điều tra quần thể. Phân biệt được hình ảnh điện di hemoglobin (Hb) người bình thường, người bệnh và quan sát hồng cầu người mắc bệnh hemoglobin, 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước lý thuyết về phương pháp con sinh đôi, định luật Hardy Weinberg, bệnh học hemoglobin (Hb). Tại phòng thực tập: + Tính hệ số con sinh đôi các loại, độ di truyền và rút ra kết luận về tính di truyền của bệnh. + Quan sát so sánh hệ số sinh đa phải một hợp tử và sinh đã phối khác hợp tử ở một số chủng tộc khác nhau. + Phải tính được tần số các loại kiểu hình, tần số các loại gen. + Quan sát các mẫu điện đi đã làm sẵn: Hồ người bình thường và Hồ người bệnh. + Quan sát hồng cầu người bệnh Hồ. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ 3.1. Mỗi sinh viên nên chuẩn bị một máy tính cầm tay 3.2. Cho cả tổ sinh viên Các bảng về các số liệu điều tra quần thể các cặp con sinh đôi với một số bệnh. Bảng các công thức dùng trong nghiên cứu con sinh đôi. Các mẫu điện di Hà người bình thường và người bệnh. Tiêu bản hồng cầu người mắc bệnh beta thalassemia. 39 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Phương pháp nghiên cứu con sinh đôi có ứng dụng gì trong di truyền y học 2. Có mấy loại sinh đa phôi ở người? Bản chất và đặc điểm của từng loại sinh đa phổi? 3. Trong phương pháp con sinh đôi độ di truyền (H) được tính theo công thức nào? Ý nghĩa của độ di truyền (H)? 4. Nếu công thức Hardy - Weinberg và nói rõ từng thành phần trong công thức 5. Trình bày nguyên nhân, cơ chế của bệnh thalassemia, HỌC HEE? 5. NỘI DUNG 5.1. Tính hệ số sinh đôi một hợp tử và sinh đôi hai hợp tử 5.1.1. Các hệ số sinh đôi một hợp tử và hai hợp tử ở từng quần thể được tính trên 1000 cá thể theo 2 công thức sau Hệ số sinh đôi một hợp tử (m) được tính theo công thức: L. 2U m x 1000 N Trong đó: U là số cặp sinh đôi khác giới. N là tổng số cá thể điều tra. L. là tổng số cặp sinh đôi trong nghiên cứu, Hệ số sinh đôi hai hợp tử (d) được tính theo công thức: 2U d= x 1000 N Trong đó: L là số cặp sinh đối khác giới. N là tổng số cá thể điều tra. 5.1.2. Bài toán Trong một điều tra trên 10.910 trẻ sơ sinh đã gặp 114 cặp sinh đôi, trong đó 21 cặp khác giới, 50 cặp cùng giới nam và 43 cặp cùng giới nữ. Tính hệ số sinh đôi một hợp tử và hệ số sinh đôi hai hợp tử ở mẫu nghiên cứu này. 5.2. Tỉnh độ di truyền (H) và ảnh hưởng của môi trường Bài toán: Qua điều tra một số bệnh về tâm thần và tim mạch từ các cặp sinh đôi một hợp tử và sinh đôi hai hợp tử trong đó có những cặp sinh đôi tương hợp (cả hai cùng bị bệnh) và những cặp sinh đôi không tương hợp (một cá thể mắc bệnh, 40 còn cá thể kia không mắc bệnh) theo các số liệu của Harvald và CS (năm 1965) liệt kê dưới đây (Bảng 7.1), Bảng 7.1. Số liệu điều tra về bệnh tâm thần và tim mạch từ các cặp sinh đôi một hợp tử và hai hợp tử Dạng sinh đôi Sinh đòi một hợp tử Sinh đòi hai hợp tử Bệnh và số cặp sinh đôi quan sát Bệnh tâm thần phân liệt Số cấp sinh đôi được khảo sát bệnh Số cặp sinh đòi mà cả hai cùng mắc Bệnh loạn tâm thần thao cuống trầm uất - Sở cặp sinh đôi được khảo sát 9 33 15 23 . Số cặp sinh đôi mà cả hai cùng mắc 12 2 Thiểu năng trí tuệ - Số cặp sinh đôi được khảo sát bệnh 18 12 - Số cặp sinh đòi mà cả hai cùng mắc 12 0 Bệnh động kinh - Số cặp sinh đôi được khảo sát bệnh 27 43 - Số cặp sinh đôi mà cả hai cùng mắc 10 Tăng trưởng lực EMM Số cặp sinh đôi được khảo sát bệnh - Số cặp sinh đôi mà cả hai cùng mắc 80 106 20 10 Nhồi máu các loại - Số cặp sinh đôi được khảo sát bệnh 102 155 - Sổ cặp sinh đôi mà cả hai cùng mắc 20 24 Cơn đột quỵ khởi phát cấp tỉnh Số cặp sinh đôi được khảo sát bệnh 98 148 - Số cặp sinh đội mà cả hai cùng mắc 22 16 41 5.2. Tính độ di truyền (H) và ảnh hưởng của môi trường với một số dị tật hoặc bệnh di truyền đa nhân tố như liệt kê ở bảng 7.2. Bảng 7.2. Các số liệu điều tra trong nghiên cứu con sinh đôi về một số dị tật hoặc bệnh di truyền đa nhân tố Tật hoặc bệnh Loại sinh đôi Số cặp quan sắt về bệnh Số cặp tương hợp n % Bản chân vẹo vào trong 1 hợp tử 35 8 22,9% 2 hợp tử 135 3 2,3% Trật khớp háng bẩm sinh 1 hợp tử 20 12 41,4% 2 hợp từ 109 3 W 2,8% Sứt môi, nứt khẩu cái 1 hợp tử 125 37 29,6% 2 hợp tử 236 11 4,7% Ung thư 1 hợp tử 196 34 17,4% 2 hợp từ 546 59 10,8% Bệnh mạch vành tim 1 hợp tử 21 19% 2 hợp tử 47 8,5% Đái tháo đường 1 hợp tử 181 101 55,8% 2 hợp tử 394 45 11,4% Cường tuyến giáp 1 hợp tử 49 23 47% 2 hợp tử 64 2 3.1% Bệnh vảy nến Thợp tử 31 19 61% 2 hợp tử 46 6 13% Bệnh sỏi mặt thợp tử 49 13 26,6% 2 hợp tử 62 6,5% Bệnh lao 1 hợp tử 381 202 51,6% 2 hợp tử 843 187 22,2% Bệnh sarcoid 1 hợp tử 4 2 50% hợp từ 11 1 8,5% 42 Dùng công thức Holzinger để tính độ di truyền: Trường hợp các tính chất định tỉnh: Độ di truyền (H) % Số cặp sinh đôi một hợp tử tương hợp Để Số cặp sinh đôi hai hợp tử tương hợp 100% ---- % số cặp sinh đại hai hợp tử tương hợp Trường hợp các tính chất định lượng: Số cặp sinh đôi Số cặp sinh đội hai hợp tử không tương hợp một hợp tử không tương hợp Độ di truyền (H)= H Số cặp sinh đôi hai hợp tử không tương hợp Ảnh hưởng của môi trường được tính theo công thức: E = 100% - H hoặc E= 1H; trong đó E là tác động của môi trường và (H) là độ di truyền. Nếu độ di truyền H từ 0 - 0,25 (E từ 1- 0,75): Bệnh không có tính chất đi truyền, chủ yếu do tác động của môi trường. Nếu độ di truyền H từ 0,25 - 0,5 (E từ 0,75 - 0,5). Bệnh có tính di truyền yếu, do tác động nhiều của môi trường. Nếu độ di truyền H từ 0,5 - 0,75 (E từ 0,5 - 0,25): Bệnh do di truyền mạnh, ít chịu tác động của môi trường. Nếu độ di truyền H từ 0,75 - 1 (E từ 0,25 - 0): Bệnh hoàn toàn do yếu tố đi truyền quyết định, ít chịu tác động của môi trường. 5.4. Ứng dụng định luật Hardy - Weinberg p2 + 2pq + q2=1 Trong đó: p là tấn số cá thể có genotyp AA. gỡ là tần số cá thể có genotyp aa. 2pq là tần số cá thể có genotyp Aa Bài toán: Điều tra 1000 cá thể trong quần thể thấy 490 cá thể có kiểu hình của trạng thái đồng hợp tử lặn, 510 cá thể biểu hiện kiểu hình của alen trội (A). Tinh tần số alen a, alen A. Tĩnh tẫn số người ở trạng thái dị hợp Aa. Tính tần số người ở trạng thái đồng hợp AA. 5.5. Tính tần số alen trong quần thể Bài toán: Các locus chi phối các kiểu hemoglobin của một dân tộc ở châu Phi có các alen sau: BA, B3, BC, BE. Điều tra 1000 người của dân tộc đã thấy : Hemoglobin bình thường (HhAHbA Hemoglobin SS 562 người 6 người 43 Hemoglobin CC Hemoglobin DD Là người Ở người Hemoglobin AS 120 người Hemoglobin AC 24, ĐƯỜI Hemoglobin SC 26 người Hemoglobin AD 14 người Hemoglobin DS 2 người Hemoglobin DC 3 người Tính tần số alen B*, BỔ, BC. Bổ 56. Phương pháp điện di hemoglobin 5.6.1. Nguyên lý kỹ thuật điện di hemoglobin Ở môi trường dung dịch đệm pH số, phần tử Hb mang điện tích âm đa đó chuyển động về phía cực dương của điện trường. Mỗi loại Hồ có trọng lượng phân tử khác nhau nên có vận tốc chuyển động khác nhau, chuyển động nhanh hơn cả là các phân tử HbH rồi thử tự đến Hul. Hà Bart. HbF có vận tốc chuyển động chậm hơn HoA, một chút, chậm hơn nữa là các phần tử HbD, HS, HbO, cuối cùng là các phân tử HbA, (HbA và HbE có tốc độ di chuyển giống nhau). Trên chất giá điện di các loại hemoglobin sau cùng không thể phân biệt được với nhau. 5.6.2. Các bước tiến hành điện di hemoglobin Chuẩn bị dịch hemoglobin (hemolysat). Chất giá để chạy điện dí: băng cellogen. Trước khi chạy điện di, băng cellogen được ngâm trong dung dịch đệm, rồi vớt lên thấm bằng giấy thấm. Dùng bút chì đánh dấu vào nơi sẽ chấm mẫu hemoglobin cách mép băng cellogen từ 2 đến 5 cm. Chấm mẫu hemoglobin vào chỗ đã vạch sẵn bằng bút chì. Khi chạy điện di bao giờ cũng chạy một mẫu hemoglobin người bình thường để làm mẫu chứng bình thường so sánh với các mẫu hemoglobin người bệnh. Đặt băng cellogen vào mảng điện di, điều chỉnh cường độ và thế hiệu của bộ nguồn máy điện di và thời gian cho phù hợp. Đủ thời gian lấy băng cellogen ra và nhuộm băng cellogen bằng dung dịch ponceau 2%. Tại vị trí có hemoglobin sẽ hiện lên các băng màu đậm nhạt khác nhau tuỳ tỷ lệ hemoglobin. 44 5.6.3. Hình ảnh điện di hemoglobin 3d lined luan của ivigoprus dinh dính Nô 5.6.3.1. Hemoglobin người bình thường môn giáo nối nur did Bound Of d grôdal Ở người bình thường HbA, chiếm 97,5% tương đương với một băng đậm, HbA, khoảng 2% thể hiện là một băng rất mảnh bắt mầu hồng nhạt chạy dưới HbF, còn lại là HbF khoảng 0,5% không thấy được bằng mắt thường trên hình ảnh điện di (Hình 7.1). 5.6.3.2 Hemoglobin người bệnh Khi đọc kết quả hemoglobin người bệnh bao giờ cũng so sánh với hemoglobin người bình thường. Bệnh hemoglobin do rối loạn chất lượng mạch globin Người bệnh dị hợp HbE gồm có HbA, và HbE (trên hình ảnh điện di thể hiện 2 băng HbA, và HbE, HbE ngang với vị trí với HbA, nhưng tỉ lệ cao hơn nên băng tương đối đậm hơn HbA, ở người bình thường). Người bệnh beta thalassemia + Thể dị hợp tử kép P° thalassemia/HbE: Trên hình ảnh điện di thể hiện 2 băng HbF và HbE. int coil + Thể dị hợp tử kép B* thalassemia/HbE: Trên hình ảnh điện di thể hiện 3 rinin us on băng HbA,, HbF, HbE. & qèx ned sid rnir do uso proni usinin 3dH sid. andida day. Beta thalassemia thể nặng: Hình ảnh điện di có HbF và HbA, + Người bệnh dị hợp alpha thalassemia vẪN DỤ TÀU ĐIÊN ÀI HÀNH Trên hình ảnh điện di có thể thấy HbH và HbBart là những băng bắt mầu hồng chạy trước HbA, và có cả HbA,. nich fince on of Supe 06 0209) go tom sus groud das év (H) novu ib ou dos év (H) novit ib ob au fod vád dari S doam mit év mad mêj dined oa độm lov gnótt jom se độm löv ground tom suo noud daß év (H) oyun in ob hub for ved dofT 8 bo on) of nern ab novu ib dad osod 363 ib de H Bart b gril A -F A/E (S. gand 6 uşil o A nola da nes nele de net da prodaisW-vb (b. um 6 vộil õe A nab tom suo up пe ois de net dat a |this redo buột а dred av nộyl jön év ib nộib uam next dH up for doint isig av og a 1 2 3 4 5 nimosaslart obod ad died rough so good das daid ido cup unb OÁV BUG tây 6 (id sid denotoboundois dnin) |sinh Hình 7.1. Hình ảnh điện di hemoglobin bình thường và bệnh lý Đường 1:HbA, và HbA Đường 2: HbA, và HbE; Đường 3: HbA, và HbF, HbE; Đường 4:HbF và HbA Đường 5: HbH, HbBart1, HbA, HbA 45 5.7. Hình ảnh máu ngoại vi của người bệnh beta thalassemian bring dính có Ở người bình thường hồng cầu không bị biến dạng. Ở người bệnh HbE hoặc beta thalassemia bên cạnh các hồng cầu có hình thái bình thường, còn thấy các hồng cầu bị biến dạng có hình bia, hình giọt nước, hình nhẫn (hình chụp qua kính hiển vi giới thiệu một số dạng hồng cầu đó). bub vera grör 0,0 odd dH él isl hidol OBD 61 Cdned ion (IV daiH) AdH doo AdH no Bimozasledit blod dred fou 62.00 Snoid odd i a Sĩ mộ chôn Hình 7.2. Hình chụp qua kính hiển vi một số dạng hồng cầu bệnh lý a: Hồng cầu ở máu ngoại vi của người bệnh HbE: nhiều hồng cầu có hình bia bắn. AdH gard b: Hồng cầu ở máu ngoại vi của thể dị hợp tử kép B thalassemia/ HbE: nhiều hồng cầu hình bia bắn, hồng cầu hình giọt nước, hình nhẫn. AdH év IdH do ib nộib daß dai gan es simen 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH streeagled edgin god ib ringd porrsit um Jed gand gouda él sadн év HdH vedt odt da ib notb das daid gert. 1. Trình bày kết quả hệ số sinh đôi một hợp tử, hệ số sinh đôi hai hợp tử, độ di truyền (H) và ảnh hưởng của môi trường (theo số liệu ở mục 5.1). 2. Trình bày kết quả độ di truyền (H) và ảnh hưởng của môi trường với một số bệnh tâm thần và tim mạch. 3. Trình bày kết quả độ di truyền (H) và ảnh hưởng của môi trường với một số dị tật hoặc bệnh di truyền đa nhân tố (theo các số liệu ở bảng 7.2). 4. Ứng dụng định luật Hardy - Weinberg tính tần số alen a, tần số alen A, tần số người ở trạng thái dị hợp Aa, đồng hợp AA ( theo số liệu ở mục 5.4). 5. Tính tần số alen BA, BS, BC, BD qua điều tra di truyền quần thể của một dân tộc ở châu Phi (theo số liệu mục 5.5). 6. Đọc và giải thích kết quả Hb trên mẫu điện di và kết luận về bệnh. 7. Đưa vào đầu que chỉ hình ảnh hồng cầu người bệnh HbE hoặc thalassemia (hình giọt nước hoặc hình bia bắn) ở vật kính x 40. Vi ringd év prouri dinid nidolgomed ib näib rins dni AdH év RdH:A prouG AdH, AdH,the8dH HdH 2 prouG dol AdH év,AdH:t prouG 3dH sv,AdH:S prouG 3dH RdH év,AdH:& prouG 46 Bài 8 NGHIÊN CỨU CÁC BỆNH DI TRUYỀN ĐƠN GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIA HỆ 1. MỤC TIÊU Sử dụng được ký hiệu quốc tế để xây dựng được 3 gia hệ bệnh di truyền dựa trên các tình huống đã cho. Xác định được quy luật di truyền của các bệnh di truyền alen trội, di truyền alen lặn trên nhiễm sắc thể thưởng và bệnh liên kết trên nhiễm sắc thể X và nhiễm sắc thể Y qua phân tích các gia hệ đã được xây dựng. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước lý thuyết về ký hiệu xây dựng gia hệ theo hệ thống quốc tế, đặc điểm của các quy luật di truyền đơn gen, các bảng dự tính nguy cơ di truyền. . Xây dựng 3 gia hệ bệnh di truyền với các tình huống đã cho. Phân tích các gia hệ bệnh di truyền kết luận quy luật di truyền của bệnh ở từng gia hệ. Qua phân tích các đặc điểm di truyền, xác định người dị hợp tử và nguy cơ di truyền ở thế hệ sau. 3, PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ Tranh các ký hiệu theo hệ thống quốc tế dùng để xây dựng gia hệ. Tranh của 4 gia hệ sinh viên phải lập theo tình huống đã cho (chữa cuối giờ học). Tranh của 7 gia hệ đã lập sẵn kèm theo kết luận về quy luật di truyền của bệnh trong gia hệ. 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Trình bày tóm tắt đặc điểm của bệnh di truyền alen trội nhiễm sắc thể thường. 2. Trình bày tóm tắt đặc điểm của bệnh di truyền alen lặn nhiễm sắc thể thường. 3. Trình bày tóm tắt đặc điểm của bệnh di truyền alen trội liên kết nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. 47 4. Nếu tóm tắt đặc điểm của bệnh di truyền alen lặn liên kết nhiễm sắc thể X không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. 5. Nêu tóm tắt đặc điểm của bệnh di truyền liên kết trên nhiễm sắc thể Y không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể X. 5. NỘI DUNG 5.1. Dùng các ký hiệu quốc tế để xây dựng các gia hệ bệnh di truyền dựa trên các tình huống đã cho 5.1.1. Gia hệ t Xây dựng gia hệ của đương sự a là nam giới bị tật dính ngăn ủ và ngón 4 của một bàn tay, đính ngôn 2 và ngăn 3 của một bàn chân, có lịch sử gia đình như sau: Đương sự a là con thứ năm của một gia đình cả 6 chị em. Hai người chị gái đầu bình thường, không bị tật dính ngón. Người chị thứ ba bị dính ngôn 3 và ngón Á của bàn tay. Người chị thủ từ bị đỉnh ngón 2 và ngón 3 của bàn chân người em trai của đương sự (em út) bị dính ngón 5 và ngăn 4 của bàn tay. Đương sự a có vợ bình thường, không bị tật dính ngón; cặp vợ chồng này có 4 người con. Người con trai cả bị tật dính ngón 3 và ngón 4 của bàn tay. Người con gái thứ hai và người con trai thứ ba bình thường, không bị tật dính ngón. Người con gái út bị tật dính ngôn 3 và ngón Á của một bàn tay, đình ngăn 2 và ngón ở của một bàn chán. Người em trai của đương sự (em út trong gia đình) lấy vợ không bị tật dính ngôn; họ có một người con trai bình thường, không bị tật dính ngôn. Bố của đương sự a sinh ra trong gia đình có 2 anh em trai. Bố đương sự a bị dính ngôn 3 và ngón 4 của một bàn tay văn ngón 2 và ngón 3 của một bàn chân. Người em trai của bố (chủ của đương sự bình thường không bị tật dính ngọn; vợ của anh ta cũng không bị tạt dính ngón và hạ có ý người con: 2 con trai đầu và hai con gái kế tiếp đều không bị tật dính ngón. Mẹ của đương sự bình thường, không bị tật dính ngắn. Ông nội của đương sự a bị tật dính ngón 3 và ngón 4 của một bàn tay, ngón 2 và ngăn 3 của một bàn chân. Bà nội của đương sự binh thường, không bị tật dính ngón. hữu văn gia hệ t Xây dựng gia hệ của đương sự b bị tinh hoàn nữ tính hoá. Đương sự là một trẻ nhỏ có giới tính được chứng thực lúc khai sinh là giới nữ. Xét nghiệm nhiễm sắc thể có công thức karyotyp 46,XY. Hai tinh hoàn nằm trong ổ bụng nhưng hiệu quả nam hóa của nhiễm sắc thể Y và hormon nam giới không có, vì vậy bộ phận sinh dục ngoài tương tự như ở nữ giới. 48 Khai thác tiền sử gia đình thấy hố mẹ của đương sự b có kiểu hình bình thường. Mẹ của đương sự b có một đời chồng trước và có với người chồng trước ba người con. Người con gái thứ nhất và người con gái út đều khoẻ mạnh, họ đều đã lấy chồng và chồng của họ đều là người khoẻ mạnh. Người con gái thứ nhất đã có hai con: một trai, một gái đều khỏe mạnh, người con gái út có hai con trai đều khoẻ mạnh. Người con thứ hai bị tinh hoàn nữ tinh hoa. Về họ ngoại được biết ông bà ngoại của đương sự b có 4 người con: người con gái thứ nhất khoẻ mạnh, người con thứ hai bị "tinh hoàn nữ tính hoa", mẹ của đương sự b là con thứ ba, Người em gái của mẹ đương sự b khoẻ mạnh. . Chống và hai con trai của chị gái người mẹ đương sự h khoẻ mạnh. Chồng và hai con (con gái đầu lòng, con trai thứ hai) của em út người mẹ đương sự b cũng khoẻ mạnh, không có gì phát triển lệch lạc về giới tính. Ông ngoại của đương sự b không bị phát triển lệch lạc về giới tính và đã chết từ lâu. Bà ngoại của đương sự b có kiểu hình bình thường và đã chết. Bố mẹ của bà ngoại (cụ ngoại) đương sự b không bị phát triển lệch lạc về giới tính và đã chết từ lâu. 5.1.3. Gia hệ Xây dựng gia hệ của đương sự c là nam giới 30 tuổi bị dị dạng ở da. Từ nhỏ, sau khi đẻ ít lâu, da của đương sự c trở nên sẫm màu và phủ những vẩy thô có những phần như khỏi mặt da hình trụ dài khoảng 2,5 cm phủ ở khắp người trừ ở bàn tay, gót chân, đầu và mặt. Vợ của đương sự c là người khoẻ mạnh, không có bệnh di truyền gì. Họ có một con trai 5 tuổi cũng bị dị hình ở da như bổ (đương sự c) và người vợ đang có thai. Gia đình đương sự c có 9 anh chị em mà đương sự c là con thứ tự trong gia đình. Ba người chị gái và bốn cô em gái kể sát đương sự c đều có kiểu hình bình thường. Em trai út của đương sự c cũng bị dị hình ở da như đương sự c. Mẹ đương sự c có kiểu hình bình thường, còn bố đương sự c và 6 người em trai của bố (các chú của đương sự c) cũng đều bị dị hình ở da như đương sự c. Những người chủ này không lập gia đình và không có con. Ông nội của đương sự c cũng bị dị hình da, còn bà nội có kiểu hình bình thường. Ông bà ngoại của đương sự c là những người khoẻ mạnh, không có bệnh di truyền. 5.2. Phân tích 7 gia hệ bệnh di truyền đã được lập sẵn. Lý luận để đưa ra kết luận về quy luật di truyền của bệnh trong gia hệ 5.2.1. Các căn cứ để phân tích gia hệ Tính chất biểu hiện của bệnh qua các thế hệ (liên tục hay ngắt quãng). 49 Tỉ lệ mắc bệnh của các thành viên trong từng gia đình, từng thế hệ và cả gia hệ. Tỉ lệ giới tính của những người bị bệnh trong gia hệ. Vai trò của hộ me trong việc truyền bệnh và gen bệnh cho con cái. Kết luận về quy luật di truyền của bệnh tật hay tính trạng trong gia hệ. Kiểu gen của đương sự và nguy cơ di truyền bệnh cho con cái sẽ có của đương sự. Viết ký hiệu của những người bắt buộc mang gen lặn trong gia hệ (nếu có). Viết ký hiệu số của đương sự. Ký hiệu số của đương sự được viết như sau: số thứ tự của thế hệ viết bằng chữ số La Mã và viết trước, số thứ tự của đương sự trong thế hệ được viết sau và viết bằng chữ Ả Rập, hai số được ngăn cách bằng dấu chấm. Ví dụ: đương sự thuộc thế hệ thứ tư và số thứ tự trong thế hệ là thứ bảy, ta sẽ có ký hiệu số của đương sự là IV.7. 5.2.2. Phân tích 7 gia hệ bệnh di truyền 5.2.2.1. Gia hệ t I II III 궁앙 6 6 10 11 12 13 14 15 16 17 IV 5 6 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 50 5.2.2.2. Gia hệ 2 1 1] 2 111 IV 3 5 10 11 1 3 4 5 6 7 10 5224. Gia hệ I II III IV V VI [] 12 3 10 51 5.2.2.4. Gía hê 4 I II III IV V 1 5.2.2.5. Gia hệ 5 I II 1 III 1 2 6 10 (11 IV 52 5 12 13 14 15 16 2 3 17 18 19 5.2.2.6. Gia hệ 6 I II III IV 3 요 Бъ 4 ठ 6 7 8 9 5227 Gia hệ t I II III IV V 1 3 3 отд 3 6 10 10 11 12 13 Бод 10 11 53 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 6.1. Đánh giá kết quả xây dựng 3 gia hệ đã cho (mỗi học sinh một gia hệ) Kết luận về quy luật di truyền của bệnh trong gia hệ, các căn cứ để rút ra kết luận độ. Nguy cơ di truyền bệnh cho thế hệ tiếp theo của đương sự. 6.2. Đánh giá kết quả phân tích 7 gia hệ bệnh di truyền đã cho Phân tích các đặc điểm biểu hiện của bệnh qua các thế hệ. 44 Kết luận về quy luật di truyền của bệnh trong gia hệ. Viết ký hiệu số của đương sự. Nguy cơ di truyền bệnh cho thế hệ tiếp theo của đương sự. 54 1. MỤC TIÊU Bài h HÌNH ẢNH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG BẨM SINH, HỘI CHỨNG VÀ BỆNH DI TRUYỀN Nhận biết được hình ảnh một số bất thường bẩm sinh. Nhận biết được hình ảnh một số hội chứng, bệnh di truyền thường gặp. 2. PHƯƠNG PHÁP HỌC Học trước phần lý thuyết về bất thường bẩm sinh, biểu hiện của các bệnh di truyền nhiễm sắc thể, di truyền đơn gen, đa nhân tổ và bệnh rối loạn chuyển hoá. Đạc trước bài thực tập. 3. PHƯƠNG TIỆN DỤNG CỤ Cho cả tổ sinh viên: Băng hình. + Video có sử dụng băng hình. 4. CÂU HỎI LÝ THUYẾT 1. Trình bày phân loại bất thường bẩm sinh theo sự hiểu hiện? 2. Trình bày những biểu hiện lâm sàng chính của hội chứng Down, Patau, Edwards, Turner, Klinefelter, bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne, bạch tạng, tạo xương bất toàn, loạn sản sụn. 5. NỘI DUNG Quan sát và phân tích các biểu hiện đặc trưng của: Các hội chứng di truyền. Các bệnh di truyền. Các dị tật. 6. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THỰC HÀNH 1. Mô tả các triệu trứng ngoại hình của người bị các tật: bàn chân vẹo (các tật của chỉ, đầu mặt, xương, tật lỗ đái lệch thấp, tinh hoàn chưa xuống bìu). 2. Mô tả các triệu trứng ngoại hình của người bị mắc hội chứng bệnh: Bạch tạng, Down, Patau, Edwards, Turner, Klinefelter, loạn dưỡng cơ Duchenne, tạo xương bất toàn, loạn sản sụn. 55 NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC THỰC TẬP DI TRUYỀN Y HỌC Chịu trách nhiệm xuất bản HOÀNG TRỌNG QUANG Biên tập: Sửa bản in: Trình bay bia: Kt vi tính BS. HẢI YẾN HẢI YẾN CHU HÙNG BÙI THỊ THƯƠNG in 1000 cuốn, khổ 19 x 27cm tại Xưởng in Nhà xuất bản Y học. Số đăng ký kế hoạch xuất bản: 23 - 2006/CXB/692 - 271H In xong và nộp lưu chiểu quý II năm 2006. Tìm đọc * Thực tập sinh học * Vi sinh y học * Cơ sở công nghệ sinh học * Dị dạng bẩm sinh * Thực tập hoá sinh * Bệnh mắt bẩm sinh và di truyền * Hoá sinh * Lý sinh y học * Sinh lý học (Tập 1 + 2) * Mô học NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC Địa chỉ: 352 Đội Cấn - Ba Đình - Hà Nội Tel: 04.7625922-7625934-7.627819 - Fax: 04.7625923 E-mail: Xuatbanyhoc@fpt.vn Website: www.cimsi.org.vn/nhaxuatbanyhoc GIÁ: 14.000Đ ¥0172211 """