🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Thực Hành Ứng Dụng Gen Trị Liệu Ebooks Nhóm Zalo PGS.TS Nguyễn Văn Kình (Chủ biên) TS Nguyễn Quốc Tuấn – BS Nguyễn Tuấn Anh Thực hành ứng dụng G E N T R Ị L I Ệ U Nhà xuất bản Y Học 2007 LỜI GIỚI THIỆU Úng dụng công nghệ sinh học trong Y Học là nhiệm vụ trọng tâm của ngành Y tế hiện nay. Gen trị liệu thể hiện rõ ràng là một phương pháp chữa bệnh mới với những tính năng vượt trội, nó có thể chữa khỏi các bệnh nan y như ung thư, HIV-AIDS, viêm gan B, C mà các phương pháp truyền thống đã tỏ ra bất lực. Cuốn sách “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” của các tác giả PGS.TS Nguyễn Văn Kình (Chủ biên), TS. Nguyễn Quốc Tuấn, BS. Nguyễn Tuấn Anh - những người đã và đang công tác nhiều năm tại Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã đề cập tới những vấn đề nóng bỏng nhất trong lĩnh vực gen trị liệu. Cuốn sách chẳng những đưa ra những luận chứng khoa học hịện đại mà còn gợi ra những ý tưởng cần được quan tâm nhằm phát triển công nghệ này trong điều kiện hoàn cảnh Việt Nam, phục vụ lợi ích cho toàn dân. Các tác giả cuốn sách cũng là những người đầy tâm huyết muốn xây dựng một cơ sở nghiên cứu ứng dụng gen trị liệu với phương châm “khoa học, dân tộc, đại chúng”. Chắc rằng ý tưởng này mau chóng trở thành hiện thực. “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” mang đến bạn đọc đầy đủ các thông tin khoa học cập nhật nhất. Thực chất đây là một cuốn sách Y Học Phân tử hiện đại, cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin bổ ích mà các sách khác chưa đề cập tới. Thực hành ứng dụng gen trị liệu chắc chắn là tài liệu hữu ích cho các bác sĩ thực hành, những người làm công tác nghiên cứu thực nghiệm Y Học. Sách cũng thực sự có ích cho các sinh viên Y, Dược, các nghiên cứu sinh và tất cả những ai quan tâm tới lĩnh vực gen trị liệu. Nhà xuất bản Y Học trân trọng giới thiệu cuốn sách “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” tới các bạn độc giả. NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC 2 LỜI NÓI ĐẦU Những người mắc các bệnh nan y như ung thư, HIV-AIDS, u não hay viêm đa khớp dạng thấp v.v..có thể được cứu sống. Câu chuyện tưởng như viễn tưởng, nhưng nó lại là hiện thực ở thời đại ngày nay. Trong cuốn sách này chúng tôi muốn chuyển tải tới bạn đọc những thành quả mới nhất của gen trị liệu. Sách bao hàm đầy đủ thông tin về các thí nghiệm tiền lâm sàng, lâm sàng thuộc nhiều chuyên khoa từ những năm khởi đầu của gen trị liệu (1990) cho tới thời điểm cuốn sách ra đời. Phần thứ nhất của sách đề cập tới các phương pháp vận chuyển gen. Đây là vấn đề mấu chốt nhất quyết định sự thành công của gen trị liệu. Ngoài các vec tơ thông thường như retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno liên hợp, những phương thức chuyển gen khác hoàn toàn mới cũng được đề cập như liposome cationic, nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú hay những vec tơ thiết kế đặc biệt để chuyển gen tới hệ thần kinh v.v.. Phần thứ hai của sách là các phương pháp điều trị cụ thể các bệnh di truyền như bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (SCID), bệnh xơ nang, bênh đau cơ Ducchenne, các bệnh thuộc hemoglobin, các bệnh liên quan tới lysosome. Một số bệnh “nhạy cảm” được đặc biệt quan tâm cũng được đề cập như: điều trị thâm nhiễm HIV (chương XIV), điều trị các bệnh ung thư (chương XV), điều trị các bệnh gan (chương XVI), điều trị các bệnh tim mạch (chương XVII), điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh (chương XVIII), điều trị bệnh u não (chương XIX), điều trị viêm đa khớp dạng thấp (chương XX). Sách dẫn chứng đầy đủ các thông tin cần thiết, những kết quả đã đạt được và cả những khó khăn phải đương đầu trong hiện tại và tương lai. “Thực hành ứng dụng gen trị liệu” có thể giúp ích cho các bác sĩ lâm sàng, các nhà nghiên cứu Y, Sinh, Dược học, các nghiên cứu sinh ngành công nghệ sinh học, các sinh viên Y , Dược và nó cũng bổ ích cho bất kỳ ai muốn tìm hiểu về một bệnh nào đó mà mình quan tâm. Để đỡ mất thời gian tra cứu của độc giả, phần cuối của sách chúng tôi có ghi chú những vấn đề liên quan tới sự chuyển và biểu hiện gen như sinh học virus, các tế bào gốc, sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Đây là những khía cạnh khoa học hiện đại mới chỉ xuất hiện trong những năm gần đây nhất nhưng lại rất cần thiết để lý giải các khía cạnh khoa học đương thời. Điều đặc biệt lưu ý là những kết quả bước đầu trong lĩnh vực khoa học non trẻ này đã khẳng định những khả năng vượt trội của nó và rõ ràng gen trị liệu là một vũ khí tinh nhuệ nhất của Y học thế kỷ 21. Những kết quả đạt được có thể là những định hướng quan trọng cho các nhà nghiên cứu. Hy vọng những thành quả mới đạt được trong tương lai sẽ giải quyết tận gốc các vấn đề bệnh tật, nâng cao tuổi thọ của con người. Để hoàn tất cuốn sách này chúng tôi xin trân trọng cám ơn các nhà khoa học trong và ngoài nứớc đã động viên, khích lệ và cung cấp cho chúng tôi những tài liệu quý báu trong quá trình biên soạn. Chúng tôi xin trân trọng cám ơn Nhà Xuất bản Y Học đã tạo điều kiện tốt nhât để cuốn sách sớm đến tay độc giả. Vì thời gian biên soạn gấp và trình độ của các tác giả có hạn nên những sai sót trong sách là không thể tránh khỏi. Chúng tôi mong nhận được sự đóng góp từ các độc giả, các nhà khoa học và các đồng nghiệp. Một lần nữa chúng tôi xin trân trọng cám ơn. Hà Nội ngày 19 tháng 5 năm 2007 Các tác giả 3 MỤC LUC Lời giới thiệu Lời nói đầu Phần thứ nhất: NHỮNG PHƯƠNG TIỆN CHUYỂN GEN Chương I. Liposome cationic 1.1 Mở đầu 1.2 Cơ chế tyác động của các liposome cationic 1.3 Chuyển gen qua trung gian lipid tới biểu mô bì phân cực 1.4 Phát hiện các lipid cationic 1.5 Lipid thải chậm 1.6 Nâng cấp các plasmid 1.7 Các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng 1.8 Vấn đề điều hòa phức hợp DNA-lipid Chương II. Cô đặc DNA và sự vận chuyển gen qua trung gian receptor 2.1 Mở đầu 2.2 Vận chuyển gen qua tẻung gian receptor 2.2.1 Đích ligand 2.2.1.1 Receptor asialoglycoprotein 2.2.1.2 Receptor transferrin 2.2.1.3 Receptor Ig tổng hợp 2.2.1.4 Receptor mannose 2.2.2 Sự cô đặc và hình thành phức DNA 2.2.3 Sự lưu chuyển và tẩu thoát theo kiểu tiêu hóa nôị bào 2.2.4 Xác định đích và sự chuyển vị nhân 2.3 Kết luận Chương III. Nhiễm sắc thể động vật có vú- viễn cảnh của gen trị liệu 3.1 Mở đầu 3.2 Sự cần thiết phải kiến tạo một nhiễm sắc thể nhân tạo 3.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú lý tưởng (MAC) 3.4 Các chiến lược tạo NST nhân tạo động vật có vú (ĐVCV) 3.4.1 Cách tiếp cận từ trên xuống (top-down) 3.4.2 Cách tiếp cận từ dưới lên (bottom-up) 3.5 Các vấn đề thực tiễn tồn tại 3.6 Kết luận Chương IV. Các vec tơ retrovirus 4.1 Mở đầu 4.2 Chu kỳ (vòng) sao chép của retrovirus 4.2.1 Những dữ kiện kinh điển 4.2.2 Sự hợp nhất của DNA virus vào trong hệ gen tế bào chủ 4.2.3 Sự sao chép, phiên dịch và lắp ráp 4.3 Phát hiện các vec tơ retrovirus 4.3.1 nguyên lý 4 4.3.2 Những bước cải tiến 4.4 Đích thâm nhiễm 4.5 Sự biểu hiện gen từ các vec tơ retrovirus 4.5.1 Xem xét chung 4.5.2 Đích thâm nhiễm 4.5.3 Các promoter có thể cảm ứng được 4.6 Độ chuẩn và tính ổn định của các vec tơ retrovirus 4.7 Các vec tơ lentivirus 4.8 Viễn cảnh và kết luận Chương V. Các vec tơ lentivirus 5.1 Mở đầu 5.2 Các cấu trúc gen của lentivirus 5.2.1 Lợi thế của các vec tơ lentivirus 5.2.2 Những bất lợi của các vec tơ lentivirus 5.3 Các vec tơ cơ sở lentivirus 5.3.1 Các ảnh hưởng khác nhau đối với sự đóng gói 5.3.2 Chuyển gen trực tiếp 5.3.3 Virus trợ giúp trung gian 5.3.4 Các hệ thống cộng nhiễm 5.3.4.1 Bổ sung vỏ 5.3.4.2 Sự cộng nhiễm khi sử dụng vec tơ độc lập và các cấu trúc đóng gói 5.3.4.3 Cộng nhiễm với 3 plasmid 5.3.5 Các donmg tế bào đóng gói 5.3.5.1 Các vấn đề protein 5.3.5.2 Các cấu trúc có thể cảm ứng được 5.3.6 Sự giả vỏ 5.3.7 Sự chuyển giao protein 5.3.8 Độ chuẩn virus 5.4 Phạm vi ứng dụng 5.5 Độ an toàn Chương VI. Các vectơ adenovirus 6.1 Mở đầu 6.2 Cấu trúc và tổ chức của adenovirus 6.3 Thiết kế và cấu trúc vec tơ adenovirusnguwowif khiếm khuyết sao chép 6.4 Sự nhân giống và làm tinh khiết các vec tơ adenovirus 6.5 Chuyển gen in vivo qua trung gian adenovirus 6.6 Đánh lừa đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với sự chuyển gen adenovirus in vivo. Chương VII. Các vec tơ adenovirus liên hợp (AAV) 7.1 Mở đầu 7.2 Tính chất sinh học của AAV 7.2.1 Phân lại và lịch sử rự nhiên của AAV 7.2.2.Cấu trúc AAV và hệ gen của nó 7.2.3 Chu kỳ sống của AAV 5 7.2.4 Tính đặc hiệu vị trí của sự hợp nhất AAV 7.3 Các vec tơ tái tổ hợp từ AAV 7.3.1 Cấu trúc của các vec tơ AAV tái tổ hợp 7.3.2 Chiến lược đóng gói các vec tơ AAV TÁI TỔ HỢP 7.3.3 Sự tồn tại của DNA vectơ trong các tế bào đích 7.3.4 Các yếu tố của tế bào vật chủ tác động tới sự tải nạp vec tơ AAV 7.3.5 Tóm tắt những tiện lợi và bất tiện của các vec tơ tải nạp AAV 7.4 Ứng dụng của vec tơ AAV 7.4.1 Ứng dụng in vitro 7.4.2 Ứng dụng in vivo 7.5 Vấn đề an toàn 7.5.1 Những vấn đề liên quan tới tính an toàn 7.5.2 Vấn đề an toàn môi trường Chương VIII. Những tiến bộ đạt được trong các vec tơ HSV công nghệ hóa dùng để chuyển gen tới hệ thần kinh 8.1 Mở đầu 8.2 Đặc điểm sinh học của HSV 8.3 Phát triển các vec tơ HSV cho hệ thần kinh 8.3.1 Loại trừ các chức năng phụ để nâng cao khả năng của gen ngoại lai 8.3.2 Độc tính tế bào cảu các vec tơ hợp nhất 8.3.3 Hệ thống promoter đối với sự biểu hiện gen chuyển 8.3.3.1 Sự biểu hiện tức thì 8.3.3.2 Sự biểu hiện dài hạn 8.3.3.3 Điều hòa sự biểu hiện gen chuyển 8.3.4 HSV amplicon 8.3.5 Các vec tơ lai HSV-AAV mới 8.4 Tóm tăt chung và triển vọng của các vec tơ dùng trong hệ thần kinh Phần thứ hai: GEN TRỊ LIỆU LÂM SÀNG Chương IX. Gen trị liệu bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng (SCID) 9.1 Mở đầu 9.2 Bệnh lý phân tử của SCID 9.2.1 Thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng liên quan tới NST giới tính 9.2.2 Khiếm khuyết JAK-3 9.2.3 Thiếu hụt adenosine desaminase và purine nucleoside phosphorylase 9.2.4 Khiếm khuyết gen hoạt hóa tái tổ hợp (RAG1 và RAG2) 9.2.5 Khiếm khuyết ZAP 70 9.2.6 Thiếu hụt MHC lớp I (hội chứng lympho trần type I) 9.2.7 Thiếu hụt miễn dịch MHC lớp II (hội chứng lympho trần type II) 9.2.8 Những bất thường TCR-CD3 9.3 Gen trị liệu soma đối với bệnh thiếu hụt miễn dịch tổ hợp trầm trọng trong SCID 9.3.1 Gen trị liệu lâm sàng đối với ADA-SCID 9.3.2 Gen trị liệu lympho T đopói với ADA-SCID 6 9.4 Cải tiến các hệ thống vec tơ 9.5 Đánh giá tiền lâm sàng sự chuyển gen tế bào gốc của sự tạo máu Chương X. Điều trị bệnh xơ nang 10.1 Mở đầu 10.2 Đặc trưng di truyền của bệnh xơ nang 10.3 Protein CFTR và bệnh học của bệnh xơ nang (CF) 10.4 Điều trị bệnh xơ nang 10.5 Hệ thống chuyển gen và bệnh xơ nang 10.5.1 Cơ sở lý luận 10.5.2 Chuyển gen qua trung gian retrovirus 10.5.3 Chuyển gen qua trung gian adenovirus 10.5.4 Chuyển gian qua trung gian virus adeno liên hợp 10.5.5 Chuyển gen qua trung gian lipid cationic 10.6 Kết luận Chương XI. Điều trị các bệnh thuộc hemoglobin 11.1 Mở đầu 11.2 Vec tơ retrovirus cho globin 11.3 các vec tơ virus adeno liên hợp 11.4 Tái tổ hợp tương đồng và sự sửa chữa 11.5 Trị liệu gen gián tiếp bệnh thiếu máu vùng biển 11.5.1 Hiệu ứng ghép nối bất thường 11.5.2 Hoạt hóa các gen bù 11.5.3 Chuyển gen tạo hồng cầu 11.5.4 Giảm biểu hiện gen globin 11.5.5 Các kiểu GTL khác 11.6 Điều trị bệnh tế bào liềm 11.7 Viễn cảnh tương lai Chương XII. Điều trị bệnh đau coe Ducchenne 12.1 Mở đầu 12.2 Các đặc trưng bệnh lý và lâm sàng 12.3 Gen dystrophin và các sản phẩm của nó 12.4 Sự định vị và chức năng của dystrophin 12.5 Các hệ thống mô hình của bệnh đau cơ Ducchenne (DMD) 12.6 Những cách tiếp cận đối với việc điều trị bệnh DMD 12.7 Điều trịo bệnh DMD: Ghép nguyên bào cơ 12.8 Gen trị liệu bệnh DMD 12.8.1 Tiêm trực tiếp DNA 12.8.2 Các vec tơ retrovirus 12.8.3 Các vec tơ adenovirus 12.9 hay đổi các chiến lược trị liệu 12.10 Kết luận Chương XIII. Điều trị những bệnh liên quan tới lysosome 7 13.1 Mở đầu 13.2 Xác định quần thể bệnh nhân 13.3 Điều trị chuẩn và điều trị “thực nghiệm” 13.3.1 Chăm sóc chu đáo 13.3.2 Thay thế enzyme 13.3.3 Ghép tủy xương 13.4 Các mô đích của GTL 13.4.1 Ghép các tổ chức mới 13.4.2 Thao tác với các tế bào lympho 13.4.3 Ghép tủy xươngb tự thân 13.4.4 Đích trực tiếp của hệ TKTƯ 13.5 Kết luận Chương XIV. Điều trị thâm nhiễm HIV 14.1 Mở đầu 14.2 Tổ chức gen HIV 14.3 Chu kỳ sống (vòng đời) và bệnh lý học của thâm nhiễm HIV 14.4 Những cách tiếp cận nhằm ức chế sự sao chép của HIV 14.4.1 Những protein không trans trội 14.4.2 Các kháng thể chuỗi đơn 14.4.3 Các protein tế bào nội sinh và các tác nhân kháng HIV 14.5 Các cáh tiếp cận GTL vopứi cơ sở acid nucleic 14.5.1 Bẫy RNA 14.5.2 Antisense DNA và RNA 14.5.3 ribozyme (antisense RNA xúc tác) 14.6 Các cách tiếp cận nhằm kích thích đáp ứng miễn dịch đặ hiệu HIV 14.6.1 Các vaccine DNA 14.6.2 Các lympho T gây độc tế bào đặc hiệu HIV 14.7 Các khía cạnh thực tiễn của gen trị liệu HIV 14.7.1 Các đích tế bào của GTL 14.7.2 các hệ thống chuyển gen 14.7.3 Các thử nghiệm lâm sàng GTL kháng HIV 14.7.3.1 Đánh dấu các tế bào T đồng gen 14.7.3.2 Đánh dáu các tế bào T độc tế bào 14.7.3.3 Rev trans trội 14.7.3.4 Rev trans trội trong sự tổ hợp với antisense TAR 14.7.3.5 Các ribozyme kháng HIV 14.7.3.6 Vaccinne gen 14.7.3.7 Các kháng thể nội bào 14.8 Kết luận Chương XV. Điều trị các bệnh ung thư 15.1 Mở đầu 15.2 Cơ sở di truyền của gây ung thư 15.2.1 Chu kỳ tế bào 15.2.2 Sự chết theo chương trình của tế bào –apoptosis8 15.2.3 Sự biến nạp tế bào 15.2.4 Các gen gây ung thư 15.2.5 Các gen kiềm chế ung thư 12.5.6 Các gen sử chữa DNA 15.3 Gen trị liệu ung thư 15.3.1 Tăng cườngkiềm chế ung thư 15.3.1.1 Retriovirus 15.3.1.2 Adenovirus và virus adeno liên hợp 15.3.1.3 Các hệ thống chuyển gen không phải là virus 15.3.2 Làm bất hoạt biểu hiện quá mức các gen ung thư 15.3.3 Trị liệu với tiền thuốc đích (targeted prodrug) 15.3.4 Cải biến đáp ứng miễn dịch kháng u 15.3.4.1 Miễn dịch khối u qua trung gian tế bào 15.3.4.2 Các cytokine 15.3.4.3Sự kiềm chế miễn dịch 15.4 Các vaccine kháng ung thư DNA 15.4.1 Các vaccine cơ sở vec tơ 15.4.2 Tiêm chủng vaccine cơ sở tế bào 15.4.2.1 Các vaccine khối u cải biến gen 15.4.2.2 Tiêm chủng với các tế bào phân nhánh (dendritic) 15.4.3 các vaccine cơ sở idiotype 15.5 Tóm lại Chương XVI. Điều trị các bệnh gan 16.1 Mở đầu 16.2 Nguyên lý chung của GTL với gan 16.3 Các vec tơ virus 16.3.1 Retrovirus 16.3.2 Adenovirus 16.3.3 Virus adeno liên hợp 16.3.4 Các vec tơ không virus 16.3.4.1 Liposome 16.3.4.2 Các phức hợp protein-DNA 16.4 Những ứng dụng lâm sàng của GTL trực tiếp bệnh cholesterol cao có tính chất gia đình 16.4.1 Bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình 16.4.2 Bệnh ưa chảy máu hemophilia B 16.4.3 Bệnh thiếu hụt 1-antitrypsin 16.4.4 Hội chứng Crigler-Najjar 16.5 Gen trị liệu với thâm nhiễm virus 16.5.1 Bệnh viêm gan virus mạn 16.5.2 Virus gây viêm gan B 16.5.3 Virus gây viêm gan C 16.6 Ung thư tế bào gan 16.7 Bệnh gan do alcohol 9 Chương XVII. Điều trị các bệnh tim mạch 17.1 Mở đầu 17.2 Thao tác gen đối với mô tim mạch 17.2.1 Sự điều biến biểu hiện gen trong các mô tim mạch 17.2.2 Vec tơ chuyển giao DNA tim mạch 17.2.2.1 Plasmid 17.2.2.2 Các vec tơ retrovirus không sao chép tái tổ hợp 17.2.2.3 Adenovirus tái tổ hợp 17.2.2.4 Virus adeno liên hợp (AAV) 17.2.3 Kiểm soát sự biểu hiện gen trong mô tim mạch 17.3 Gen trị liệu hẹp van tim tái phát 17.3.1 Sinh lý bệnh học của hẹp van tim tái phát 17.3.2 Các cách tiếp cận để kiềm chế tế bào và gây độc tế bào 17.4 Gen trị liệu sự tạo mạch 17.4.1 Sự tạo mạch và các yếu tố của sự tạo mạch 17.4.2 Gen trị liệu sự tạo mạch 17.5 Gen trị liệu sự ghép mạch 17.5.1 những cải biến sinh học đối với ghép tĩnh mạch 17.5.2 Công nghệ sinh học và gen trị liệu 17.6 Gen trị liệu các bệnh tim 17.6.1 Suy tim xung huyết 17.6.2 nhòi máu cơ tim 17.6.3 Thiếu máu cục bộ và sự tưới nước (tái truyền dịch) 17.7 Tóm lại Chương XVIII. Điều trị các bệnh thuộc hệ thần kinh 18.1 Mở đầu 18.2 Sự phức tạp của hệ thần kinh 18.3 Những lệch lạc trong hệ thần kinh 18.4 Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh và gen trị liệu 18.4.1 Các yếu tố dinh dưỡng thần kinh 18.4.2 Các mô hình động vật GTL về sự thoái hóa thần kinh 18.4.3 Khai thác các đặc tính của HIV trong việc chuyển gen trong hệ thần kinh 18.4.4 Sự chết theo chương trình của các tế bào và sự thoái hóa thần kinh 18.5 Cấy ghép neuron và các tế bào gốc 18.5.1 Từ cấy ghép thực nghiệmtới các ứng dụng trong lâm sàng 18.5.2 Các tế bào gốc ở não người trưởng thành 18.5.3 Chuyển gen ung thư tới các tế bào thần kinh 18.6 Các bệnh thopái hóa thần kinh trên lâm sàng 18.6.1 Bệnh Alzheimer 18.6.2 Bệnh Parkinson 18.6.3 Bệnh Huntington 18.6.4 Bệnh xơ cứng cột bên teo cơ 18.6.5 Bệnh đa xơ cứng 18.7 Các thử nghiệm lâm sàng test các tế bào biến đổi gen và các yếu tố dinh dưỡng thần kinh đối với thoái hóa thần kinh 10 18.8 Những vấn đề cần quan tâm trong tương lai Chương XIX. Điều trị bệnh u não 19.1 Mở đầu 19.2 Nhân tố cơ bản của các thí nghiệm trị liệu gen với u não 19.3 Các thử ngfhiệm GTL đã được phê chuẩn với việc sử dụng gen HSV-TK đối với các u não 19.3.1 Gen nhạy cảm HSV-TK 19.3.2 Khảo sát các phương pháp chuyển gen cho các khối u ở thần kinh trung ương 19.3.3 Chuyển gen nhạy cảm HSV-TK qua trung gian retrovirus in vivo 19.3.4 Chuyển gen nhạy cảm HSV-TK in vivo qua trung gian adenovirus 19.3.5 Tải nạp ex vivo gen IL-2 và IL-4 của người vào trong nguyên bào cơ hoặc trong các khối u với các vec tơ retrovirus 19.3.6 Chuyển gen antisense IGF-1 ex vivo với một vec tơ plasmid vào các tế bào khối u bản thân 19.3.7 Chuyển gen antisense TGF- ex vivo vào trong các tế bào khối u 19.3.8 Chuyển gen MDR-1 ex vivo vào trong các tế bào gốc tạo máu với các vec tơ rẻttovíu chuột 19.4 Tóm lại Chương XX. Điều trị viêm đa khớp dạng thấp 20.1 Mở đầu 20.2 Những vấn đề cần xem xét vè GTL trong viêm đa khớp dạng thấp 20.3 Bệnh lý học của viêm đa khớp dạng thấp 20.4 Chuyển gen tới các tế bào hoạt dịch 20.5 Các mô hình động vật dùng để test gen trị liệu 20.6 Những đích hiện nay của gen trị liệu viêm đa khớp dạng thấp 20.7 Hiện trạng lâm sàng và triển vọng của viêm đa khớp dạng thấp PHỤ LỤC Phụ lục I. Một số khia cạnh sinh học virus liên quan tới sự chuyển gen 1.1 Hệ gen của virus 1.2 Virus chỉ thâm nhiễm những tế bào xác định 1.3 Sự nhận diện tế bào vật chủ của thực khuẩn thể 1.4 Các thực khuẩn thể đưa acid nucleic của chúng vbào các tế bào vật chủ 1.5 Sự nhận diện tế bào vật chủ của những virus động vật 1.5.1 Sự gắn kết qua các virus trần 1.5.2 Sự gắn kết qua các virus có vỏ 1.6 Các virus động vật vào trong các tế bào vật chủ và sự lột vỏ acid nucleic của chúng Phụ lục II. Những khái niệm cơ bản về tế bào gốc và những ứng dụng của chúng trong gen trị liệu 11 2.1 Mở đầu 2.2 Thế nào là tế bào gốc và tầm quan trọng của chúng như thế nào? 2.3 Những đặc tính độc quyền của tất cả các tế bào gốc 2.3.1 Các tế bào gốc không chuyên hóa 2.3.2 Các tế bào gốc có khả năng phân chia và tự phục hồi dfài hạn 2.3.3 Các tế bào gốc có thể sản sinh ra các tế bào chuyên hóa 2.4 Các tế bào gốc của phôi 2.4.1 Các giai đoạn phát triển sớm giữ vai trò quan trọng trong việc sản sinh các tế bào gốc 2.4.2 Phát triển các tế bào gốc của phôi trong phngf thí nghệm 2.4.3 những test trong phòng thí nghiệm để xác định các tế bào gốc của phôi 2.4.4 Kích thích sự biệt hóa các tế bào gốc của phôi 2.5 Các tế bào gốc trưởng thành 2.5.1 Nơi cư trú của các tế bào gốc trưởng thành và những nhiệm vụ của chúng 2.5.2 Các test cần dùng để xác định các tế bào gốc trưởng thành 2.5.3 Những điều đã biết về sự biệt hóa tế bào gốc trưởng thành 2.5.3.1 Những cách biệt hóa bình thường của các tế bào gốc trưởng thành 2.5.3.2 Tính mềm dẻo hay sự chuyển biệt hóa của các tế bào gốc trưởng thành 2.5.4 Một số câu hỏi chủ chốt về các tế bào gốc trưởng thành 2.6 Những điểm giống nhau và khác nhau giữa các tế bào gốc của phôi và tế bào gốc trưởng thành 2.7 Tiềm năng của việc sử dụng các tế bào gốc người và những trở ngại cần phải vượt qua trước khi tiềm năng này trở thành hiện thực Phụ lục III. Sự chết theo chương trình của tế bào 3.1 Chức năng cơ bản của apoptosis 3.1.1 Sự cân bằng nội mô 3.1.2 Sự phát triển và biệt hóa 3.1.3 Chức năng miễn dịch 3.1.4 Sự tiêu hủy tế bào 3.2 Apoptosis ở giun tròn Caenorhabditis elegans 3.3 Các thành phần của chương trình apoptosis ở động vật có xương sống 3.3.1 Caspase: sự chết do ly giải protein 3.3.2 Họ protein Bcl-2 3.3.3 Các đồng yếu tố của sự hoạt hóa caspase 3.3.4 Điều hòa nội bào 3.4 Apoptosis qua trubg gian stress: con đường cytochrome c/Apafl 3.5 Apoptosis phát sinh bởi receptor chế 3.6 Apoptosis và con đường tín hiệu tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH 12 Phần Th ứ nhất NHỮNG PHƯƠNG TIỆN CHUYỂN GEN 13 Chương I LIPOSOME CATIONIC 1.1 Mở đầu Liposome cationic là các vec tơ tổng hợp làm trung gian cho việc chuyển giao và biểu hiện các gen chuyển (transgene) bên trong các tế bào động vật. Vec tơ này ra đời nhờ những tiến bộ đáng kể đã đạt được trong một số lĩnh vực khoa học. Một điều đã được xác nhận là những cơ chế tác động của thuốc thử đã được hiểu rõ hơn và người ta đã hoàn thiện được phân tử lipid ứng dụng trong việc vận chuyển các gen đặc hiệu in vivo. Tuy nhiên, trong chiến lược này có sự linh hoạt trong việc tiếp cận mới nhằm cải tiến các kỹ thuật điều trị bệnh cho con người. Phức hợp DNA-lipid đã được ứng dụng trong lâm sàng và tiền lâm sàng. Với các kết quả ban đầu đã tạo nên vô số các mô hình có thể ứng dụng được trên người. 1.2 Cơ chế tác động của các liposome-cationic Felgner và cộng sự là những người đầu tiên sử dụng các phân tử lipid có nhóm tích điện dương ở đầu để chuyển gen vào các tế bào nuôi cấy. Một phân tử lipid trung tính chẳng hạn như dioleoyl phosphatidyl ethanolamin (DOPE) đã tạo hiệu quả cho sự chuyển gen. Về mặt hiệu quả, phương pháp này có thể so sánh được với hầu hết các phương pháp chuyển gen khác không phải là vius in vitro và đã thể hiện có hiệu quả với hầu hết các tế bào đã được nghiên cứu. Về cơ chế của quá trình cũng như các đặc tính làm giới hạn sự chuyển gen trung qua lipid thì vẫn chưa rõ hòan toàn. Không giống như các hệ thống chuyển giao thuốc dựa trên cơ sở lipid khác, DNA plasmid không được đóng gói trong lõi của liposome hình cầu, thay vì là DNA cô đặc hơn do các lipid cationic đã phủ lên toàn bộ hoặc một phần plasmid. Dạng bọc áo và cô đặc này của DNA có thể xác định được bằng hiển vi điện tử hoặc đo bằng tính khó nóng chảy của DNA khi xử lý với nuclease in vitro . Mặc dù lúc đầu người ta nghĩ rằng phức hợp DNA-lipid thấm trực tiếp vào màng sinh chất rồi đi vào tế bào chất. Nhưng hiện nay người ta lại cho rằng trong nhiều trường hợp sự tiếp nhận DNA plasmid phải đòi hoỉ quá trình tiêu hòa nội bào (endocytosis) và có thể được tăng cường bởi các thuốc nội thậm thấu (endosomolytic) như chloroquine hoặc thêm vào các virus (adenovirus) có khả năng nội thẩm thẩu trung gian. Những cố gắng nhằm nâng cao hiệu lực sự vận chuyển gen qua trung gian lipid in vitro cũng tập trung vào việc phát triển các mẫu thuốc thử (reagent) lipid mới nhằm tăng sự gắn kết với màng tế bào. Hiệu quả của việc chuyển một dạng tế bào đặc biệt vào trong môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi một tỷ lệ thích hợp lipid:DNA hoặc tỷ lệ của các cationic để trung hòa lipid. Tuy nhiên, vẫn chưa tìm được một hợp chất có hiệu lực để chuyển plasmid vào tế bào chất. Đó là một khía cạnh quan trọng làm hạn chế toàn bộ quá trình. Sự chuyển giao với hiệu lực cao của các phân tử plasmid huỳnh quang hoặc nucleotide huỳnh quang đã được thực hiện ở một vài dạng tế bào và đã chuyển giao gần như 100% DNA vào trong các tế bào nuôi cấy. Việc giải phóng bào chất DNA khỏi liposome là một đặc trưng quan trọng về tính hiệu quả của toàn bộ quá trình. Hiệu lực ấn tượng của sự chuyển giao DNA plasmid tới các tế bào nuôi cấy không phân cực là tương đối thấp. Thậm chí, dưới các điều kiện thích hợp nhất cũng chỉ phát hiện có 1-5% các tế bào đã được chuyển với nhiều dạng 14 khác nhau, như trường hợp chuyển gen -galactosidase (nếu được xét đoán bằng một thử nghiệm tương đối nhậy chẳng hạn như hóa tế bào X-gal). Những trái ngược này dẫn đến giả thuyết cho rằng việc giải phóng các phân tử plasmid khỏi lipid cationic và việc plasmid vào nhân đã làm trở ngại thật sự cho sự biểu hiện gen khi có mặt liposme cationic. Điều đó cũng có thể nghĩ rằng việc chuyển gen cơ sở plasmid đòi hỏi phải vào lúc có sự phân chia tế bào và sự hòa tan đồng thời của màng nhân. Và trong nuôi cấy tế bào thì chỉ có một phần nhỏ tế bào có sự phân bào nguyên nhiễm tích cực vào đúng thời điểm có chuyển giao plasmid, tức là có khả năng chuyên chở các plasmid từ tế bào chất tới nhân để thực hiện sự phiên mã. Người ta đã thử nghiệm các phân tử plasmid được gắn các tín hiệu định vị nhân qua các lỗ nhân (một cải tiến hiện đại nhất làm tăng hiệu lực chuyển gen ở các tế bào không phân cực in vitro). Tuy nhiên, vai trò của màng nhân trong sự chuyển gen qua trung gian lipid quả là phức tạp vì khi kéo dài sự tiếp cận tế bào với phức hợp DNA-lipid (để cho phép một lượng lớn tế bào qua giai đoạn phân chia trong khi chuyển plasmid tới tế bào chất) thì chưa chắc đã làm tăng được hiệu ứng chuyển gen hoặc biểu hiện gen. Hơn nữa, thử nghiệm chuyển các tế bào đồng bộ lại không làm tăng hiệu lực vận chuyển. Khi dùng các phương pháp nhậy để xác định sự biểu hiện gen thì thấy hầu hết các tế bào trong quần thể lại tiềp nhận và biểu hiện gen ngoại lai. Nhưng cũng có một số tế bào xác định trong quần thể lại được chuyển gen ở mức cao, lý do của sự biểu hiện cao này vẫn chưa được rõ. 1.3 Chuyển gen qua trung gian lipid tới biểu mô bì phân cực Khả năng chuyển các liposome cationic tới các tế bào biểu mô bì đã phân hóa là tương đối yếu đã gợi ý rằng sự phân cực và hình thành các ghép nối vững chắc đã làm giới hạn sự chuyển giao các phân tử DNA plasmid. Sự tăng trưởng của các tế bào biểu mô bì in vitro thường được dùng để mô hình hóa in vivo ở phổi, ruột hoặc các biểu mô khác. Dưới các điều kiện này, sự tiếp nhận và chuyển giao DNA là rất hạn chế và khối plasmid đã vào trong tế bào chất sau này có thể sẽ can thiệp vào hiệu lực chuyển gen. Các chất thấm trung gian như sodium glycholate có thể làm tăng sự tải nạp gen (gene transduction) của phổi chuột, nhưng những tác nhân này cũng làm tăng độc tính. Ít nhất đã có một mô hình chỉ rõ có sự phụ thuộc rất nhiều vào tiêu hóa nội bào (endocytosis) ở các tế bào đã phân hóa và phân cực. Tuy nhiên có thể thu được kết quả nếu sử dụng một liều rất cao phức hợp DNA-lipid in vivo, cơ sở lý luận của vấn đề này vẫn chưa được rõ. Tuy nhiên, việc tạo ra các lipid thế hệ mới hơn có thể sẽ nâng cao được khả năng vận chuyển tới các lớp đơn của biểu bì. Những kết quả này vạch ra một điểm quan trọng là phải lựa chọn cẩn thận các mô hình thích hợp để kiểm tra hiệu lực của lipid cationic in vitro, hoặc phải dự đoán trước các hiệu ứng sinh học in vivo. Với biểu mô bì đã phân hóa (trong các mô như phổi, đường tiêu hóa hoặc trong các khối u đặc) đòi hỏi phải có sự xem xét đặc biệt vì nó có thể là một đích hiệu quả cho sự chuyển gen qua trung gian lipid in vivo. 1.4 Phát hiện các lipid cationic Việc phát hiện các lipid cationic tân tiến cho sự chuyển gen phụ thuộc vào các test thực nghiệm của phòng thí nghiệm về các hợp chất mà mỗi hợp chất lại được sàng lọc cho các ứng dụng đặc biệt. Nhìn chung lợi thế cuối cùng thuộc về lipid trung tính có công thức là DOPE. Các hợp chất thuộc thế hệ đầu tiên như DOTMA và DOTAP đã chưa vứt bỏ được 15 các lipid có chứa các nhóm có tiếp đầu là polyamin. Dưới các điều kiện đặc biệt, các chất mới hơn rõ ràng đã làm tăng hiệu lực chuyển giao. Tuy nhiên, công thức tối ưu đặc hiệu vẫn chỉ cho từng dạng tế bào, tức là phải có rất nhiều công thức liposome cationic. Để áp dụng in vivo phải sàng lọc một lượng lớn các vec tơ liposome để xác định được một hợp chất có hoạt tính cao. DMRIE (1,2-dimyristyloxypropyl-3- dimethylhydroxyethylamminium bromide) được xác định là một hợp chất chuyển hiệu quả và các gen trị liệu đã được thiết lập ở các khối u đặc trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng. GAPDLRIE cũng được chứng minh là có tiềm năng trong các nghiên cứu in vivo, chẳng hạn như trong việc chuyển và biểu hiện gen trong các tế bào nội mạc mạch (intimal) và các tế bào giữa (medial) động mạch lợn. Một số lipid (gồm DOTMA và các hợp chất thuộc thế hệ sau nữa) đã được công thức hóa đặc biệt cho chuyển giao trong các tĩnh mạch, điều đó đã gợi ra các tín hiệu gen với các mô như phổi và gan. Trong các mô hình thiết kế thì các tế bào Kuffer của hệ thống lưới nội mô ở gan được chú ý hơn cả. Người ta đã xác định được các liposome có công thức đặc biệt phù hợp với việc chuyển gen tới phổi của chuột. Ví dụ như GL-67 là một phức hợp khí dung DNA plasmid dùng để chuyển gen tới phổi chuột hiệu quả cao hơn gần 1000 lần DNA đơn và 100 lần so với các đối tượng khác. Như vậy, lipid tối ưu hóa đã được dùng để chuyển gen tới phổi. Mặc dù vậy, lớp hợp chất này vẫn phải được xác định qua sự sàng lọc chặt chẽ của các phòng thí nghiệm lớn về liposome cationic và người ta đã bắt đầu phân tích hoạt tính – cấu trúc của chúng. Các nghiên cứu về các chất tương tự lớp này như GL-67 thì nhóm cationic đầu hình chữ T có phần mỏ neo của cholesterol gắn với spermine đã làm tăng đáng kể khả năng chuyển gen tới phổi chuột in vivo. Việc cải biến các vùng đặc biệt trong phân tử GL 67 cho phép nâng cao hơn nữa khả năng hoạt động của thuốc khi sử dụng các phương pháp y hóa học truyền thống. Các lipid cationic guanidium – cholesterol cũng đã được thông báo là các chất chuyển gen trung gian hiệu lực tới phổi động vật. Tuy nhiên, một lipid đặc hiệu lại chỉ có hoạt tính ở các mô đặc hiệu (tức GL-67 chỉ dùng cho phổi và không có tiềm năng cao đối với các mô khác). Điều đó chỉ ra rằng việc phát triển các liposome cationic dùng cho in vivo đòi hỏi phải có sự sàng lọc rất kỹ và phải có các test thực nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. 1.5 Lipid thải chậm Thất bại của việc gắn phức hợp DNA-lipid với các tế bào đích rồi việc plasmid kém hoặc không hiệu lực đi vào tế bào chất là một vấn đề quan trọng làm giới hạn sự chuyển gen qua trung gian lipid in vivo. Việc cải tiến các phức hợp liposome bằng cách hợp nhất với protein virus Sendai đã được ứng dụng trong chuyển gen in vitro và in vivo trong một số trường hợp như biểu hiện insulin tái tổ hợp để điều chỉnh hạ thấp mức glucose huyết ở chuột, hay chuyển phân tử antisense oligonucleptide để ngăn chặn sự nhân lên của tân nội mạc (neointimal) hoặc chuyển gen tới võng mạc động vật hay tới các khối u não. Enzyme chuyển đổi angiotensin của người (human angiotensin converting enzyme –ACE) cũng được chuyển bằng phương pháp này vào trong động mạch cảnh chuột để ACE được biểu hiện cả trong tế bào cơ trơn giữa (medial smooth muscle) và trong các tế bào biểu mô nội mạc mạch. Những thay đổi tăng sinh mạch máu cũng quan sát thấy ở các động mạch, mô hình biểu hiện trong thành động mạch thỏ cũng đã được công bố. Cách tiếp cận tương tự cũng thấy trong chuyển gen superoxyde dismutase với tỷ lệ % rất cao các tế bào cơ tim trong mô hình ghép tim trên chuột. Đích của các lipid cationic tới các receptor 16 đặc hiệu theo con đường nội bào (endocytic) cũng đã được thông báo. Chẳng hạn như trong thử nghiệm nhằm tránh sự bất hoạt của lipid cationic trong tuần hoàn thì DNA sẽ được phức hợp với lipopolyamin hoặc các ligand khác. Mẫu hình này cũng được sử dụng đối với receptor asialoglycoprotein và cũng đã áp dụng mô hình theo cơ chế này in vitro. Lipid cationic có thể được làm ổn định khi chuyển gen in vivo bằng cách gắn với các polyamin hay polyethylen glycol phospholipid. Tương tự như vậy, các thí nghiệm gắn lipid cationic vào các virus tổng hợp nhân tạo cũng đã được dự định cho các vec tơ không phải virus. 1.6 Nâng cấp các plasmid Hai vấn đề chính cần đặt ra trong việc nâng cao chất lượng của sự chuyển gen là do: (1) mức độ biểu hiện còn thấp và (2) thời gian biểu hiện ngắn. Một vài chiến lược đã được thử nghiệm in vitro hướng vào các vấn đề này. Các trình tự đích của nhân liên kết đồng hóa trị với plasmid đã làm tăng đôi chút hoạt tính gen. Cũng tương tự như vậy, T7 polymerase cũng làm tăng khả năng biểu hiện gen in vitro mặc dầu thời gian tồn tại của plasmid vẫn chưa kéo dài đáng kể. Sự lựa chọn một cách khôn khéo các yếu tố điều hòa gen có thể làm tăng thật sự hiệu quả chuyển gen như với liposome cationic chẳng hạn. Để chuyển gen vào phổi in vivo người ta đã cải tiến một promoter trên cơ sở cytomegalovirus (CMV). Theo như thông báo, mức độ biểu hiện gen cao hơn 100 lần các cấu trúc thế hệ thứ nhất theo cùng một thiết kế. Vùng phía 5’ của c-erb B-2 được sử dụng để hướng dẫn đặc hiệu cho gen thymidin kinase của virus herpes simplex (HSV-tk) vào trong các khối u mới phát triển ở chuột. Các plasmid cơ sở các trình tự virus Efstein Barr được chuyển tới gan bằng các liposome cationic có thể tồn tại vài tháng, rõ ràng là do sự định hướng của plasmid có thể tự sao chép được của episome. Các plasmid có thể tự sao chép lâu dài trong các tế bào biểu mô do có sự hợp nhất virus gây u nhú trên người (human papilloma virus –HPV) E1, E2 và vùng điều hòa trên (upstream). Các yếu tố HPV này là các chất hoạt hóa vận chuyển mạnh, nó làm tăng 10.000 lần tín hiệu gen ở các tế bào biểu mô trong môi trường nuôi cấy. 1.7 Các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng Một vài công trình nghiên cứu trên người với việc sử dụng liposome cationic đã cho những kết quả khích lệ sau khi đưa plasmid DNA vào mũi để điều hòa độ dẫn điện vận chuyển màng tế bào bệnh xơ nang (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR). Các thử nghiệm nhằm: (1) theo dõi sự phân phối luồng khí của phức hợp DNA lipid khí dung và (2) tái phân phối và theo dõi luồng khí qua mũi với DNA-lipid. Cả hai công việc đó đều đã hoàn tất. Nói chung, những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các chỉ số đo được về sự vận chuyển gen cho thấy với quy trình qua mũi có ít tác dụng phụ nhất và khí dung cũng gây độc cho hệ thống. Những tiến bộ đạt được trong kỹ thuật liposome dẫn đến việc phát triển các test lâm sàng với nhiều ứng dụng khác nhau của gen trị liệu trên người. Việc chuyển và biểu hiện gen adenomatous polyposis coli (APC) thể hoang dã ở đường tiêu hóa, chuyển gen -1 antitrypsin tới gan, chuyển yếu tố IX tới gan chuột và các tổ chức khác, sự biểu hiện gen nghiên cứu trong các tế bào gốc của máu và phôi động vật nguyên vẹn cũng đã thành công trong các mô hình động vật nhờ sử dụng liposome cationic. Gen -1 antitrypsin được chuyển tới gan có thể tồn tại trên 5 tháng nếu kết 17 hợp cắt bỏ một phần gan. Các gen được chuyển qua trung gian liposome (ex vivo) vào trong các tế bào tủy xương chuột có thể có hoạt tính tới 4 tuần lễ nếu việc truyền được tái lập lại. Các lposome cationic cũng được sử dụng để ức chế sự tăng sinh của cơ trơn nội mạc mạch (chẳng hạn như vận chuyển các bẫy vị trí gắn E2F) in vivo trong các thí nghiệm gây tổn thương động mạch cảnh chuột hoặc chuyển các gen mã cho interleukin 10 (IL-10) hoặc các domain receptor yếu tố alpha hoại tử u trên người (human tumor necrosis factor alpha -TNF receptor) để làm giảm nhẹ các nội độc tố nguy hiểm. Sự biểu hiện qua trung gian liposome của gen luciferase ở động mạch vành lợn cũng được nâng cao do hoạt hóa tăng sinh tế bào mạch máu. Trong mô hình ở động mạch chủ thỏ, DOTMA/DOPE đã được dùng để chuyển cDNA hormone tăng trưởng của người, mặc dù chỉ có một phần nhỏ các tế bào động mạch (< 1%) biểu hiện là sản phẩm gen in vitro. Đối với mô mắt bao gồm các tế bào giác mạc, tròng đen, lông mi và võng mạc cũng đã được vận chuyển in vitro và in vivo với các lipid cationic, đó cũng là một trong những cách tiếp cận mới đối với các bệnh về mắt. Những chiến lược phát triển sự chuyển gen trong lâm sàng như thế đang trên đà phát triển. Theo sau các nghiên cứu ban đầu của Canonico và cộng sự, việc chuyển gen tiền lâm sàng tới mũi động vật cũng đã thu được kết quả trong một số trường hợp. Những nghiên cứu này bao gồm cả việc thiết lập các lipid thế hệ cũ (DOTMA, DOTAP, DMRIE, DC cholesterol) và các thuốc thử (chất phản ứng) thế hệ sau như GL-67. Việc chỉnh sửa các khiếm khuyết điện sinh học đường dẫn khí trong mô hình xơ nang ở chuột cũng áp dụng cách chuyển gen qua trung gian lipid. Chẳng hạn như việc phân phối các phức hợp DNA lipid ở tĩnh mạch cũng sử dụng DOTMA/DOPE để biểu hiện gen in vivo ở các tế bào biểu mô trên bề mặt đường dẫn khí. Các tín hiệu biểu hiện gen trong một số trường hợp cũng được thông báo là có thể kéo dài được tới vài tháng bằng kỹ thuật này. Các lipid cationic hay các chế phẩm khác cũng có thể làm tăng thêm hoạt tính trong máu in vivo, trừ trường hợp hình thành phức hợp với DNA làm giảm hiệu lực của quá trình. Sự chuyển giao các plasmid đánh dấu phóng xạ có thể thực hiện được bằng các mô hình trên động vật với phóng xạ tự ghi trên toàn bộ cơ thể. Các liposome cationic đã được sử dụng để chuyển gen trị liệu tới một số khối u xác định hoặc được sử dụng trong vaccine kháng u có các chất phụ trợ. Với một lượng nhỏ HLA-B7 (khoảng vài microgram DNA được chuyển tới các mô bị u) đã phức hợp với DMRIE/DOPE hoặc DC-cholesterol có thể tiêm chủng an toàn cho các khối u hắc tố trong các nghiên cứu tiền lâm sàng ở người. Chiến lược này được thiết kế nhằm kháng lại các kháng nguyên gây khối u. Sự thoái lui một cách khách quan của các khối u cũng quan sát thấy ở một số bệnh nhân và hiệu lực kháng u đã đạt đựợc ở một mức nào đó. Một bệnh nhân bị u hắc tố trong phổi (intrapulmonary melanoma) có biểu hiện đáp ứng sau khi HLA-B7 cDNA phức hợp với liposome cationic được chuyển vào qua động mạch phổi phải. Cần lưu ý rằng chính các liposome cationic cũng có hiệu lực kháng u trong một số mô hình in vivo. Trên cơ sở các phát hiện trước của Nabel và cộng sự, nhiều thử nghiệm tiền lâm sàng vaccine đối với khối u hoặc các nghiên cứu tạo ra các mô hình nhằm nâng cao đáp ứng kháng khối u khi sử dụng lipid cationic phức hợp với DNA plasmid cũng đã khởi đầu. Một plasmid liên hợp các trình tự từ adeno-asociated virus (AAV) mã cho IL-2 cDNA của chuột đã được tiêm vào các tế bào khối u tuyến tiền liệt của người. Liposome cũng đã được sử dụng để chuyển giao hiệu quả HVS-tk hoặc p53 tới các khối u mới hình thành ở chuột. Mặc dù có sự thoái lui của khối u, nhưng cơ chế của hiệu ứng kháng khối u thì vẫn còn phải nghiên cứu tiếp tục. 18 1.8 Vấn đề điều hòa phức hợp DNA-lipid Mỗi công thức của phức hợp DNA-lipid đều đòi hỏi một tỷ lệ lipid:DNA xác định và các chế phẩm lipid tối ưu thường gồm cả lipid trung tính và lipid cationic. Các thử nghiệm tiền lâm sàng có thể được dùng trong việc xác định xem thuốc thử nào là tốt nhất cho một mục tiêu đặc biệt nào đó. Các nghiên cứu thuộc nhiều dạng ở pha I (pha I type) nhằm chứng minh cho các khái niệm khoa học cũng đã được đặt ra hoặc đang trên đà tiến triển. Một vài nghiên cứu còn đề cập tới cả sự tăng tiến của liều lượng. Một mô hình nghiên cứu lâm sàng với một công thức đã cho sẽ phải ước lượng được mức tăng của liều lượng. Phải tập hợp đầy đủ các số liệu thử nghiệm về hiệu lực, độ an toàn tiền lâm sàng để phục vụ cho các công việc sau này. Mặt khác, nếu một nghiên cứu lâm sàng theo mô hình nhằm thay đổi thành phần của một công thức đặc hiệu (chẳng hạn như thay đổi tỷ lệ lipid:DNA) thì mỗi sự thay đổi đều phải được nhìn nhận từ các thử nghiệm tiền lâm sàng về độ an toàn và hiệu lực của nó. Vì thế, trước hết phải sớm xác định một công thức tối ưu với các thành phần cố định trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và sau đó đánh giá thật cẩn thận độ an toàn và hiệu ứng sinh học của của công thức đặc hiệu này. Những tiếp cận như thế sẽ làm đơn giản hóa cho các nghiên cứu trên lâm sàng. 19 Chương II CÔ ĐẶC DNA VÀ SỰ VẬN CHUYỂN GEN QUA TRUNG GIAN RECEPTOR 2.1 Mở đầu Việc phát triển các chiến lược để đưa các yếu tố ngoại sinh, các gen chức năng đến các tế bào soma có lẽ là rất quan trọng cho việc điều trị bệnh, với điều kiện là các phương pháp này phải an toàn, hiệu quả và phải được chọn lọc. Những tiến bộ đạt được trong lĩnh vực này rất ấn tượng. Hiện nay có một số hệ thống chuyển gen đã được kiểm tra (làm test) trên các thử nghiêm lâm sàng. Các virus tái tổ hợp khiếm khuyết sao chép đã được sử dụng làm trung gian vận chuyển gen cho nhiều loại tế bào trong các thử nghiệm in vitro và in vivo. Mặc dầu các virus tái tổ hợp có sự lôi cuốn rất lớn, nhưng các vector này vẫn có những giới hạn đáng kể khi áp dụng vào thực tế. Ví dụ, các retrovirus tái tổ hợp có thể đưa được các gen vào trong tế bào nuôi cấy, nhưng các vector này lại không chuyển được gen vào trong các tế bào không sao chép (nhân lên) và nhìn chung thiếu hiệu quả trong việc chuyển gen in vivo. Tính hướng của các virus tái tổ hợp có thể làm hạn chế tác dụng của chúng, và khả năng đóng gói của nhiều virus đã làm giới hạn kích cỡ các trình tự ngoại lai có thể được cài vào trong các vec tơ này. Một vài vector virus có thể gây độc tế bào hay kích thích các phản ứng dị ứng, làm giảm hiệu quả sự chuyển gen và biểu hiện gen chuyển nếu sử dụng lặp lại các virus tái tổ hợp. Cũng có vấn đề liên quan là một vec tơ virus bất hoạt có thể trở nên hoạt hóa sau khi thâm nhiễm các virus hoang dã hoặc virus trợ giúp và có thể tạo nên một virus tái tổ hợp có khả năng sao chép cao. Vì còn nhiều điều cần cân nhắc nên việc phát triển các phương pháp chuyển gen không virus vẫn cần được quan tâm nhiều. Các gen chức năng có thể được đưa tới các tế bào nhân chuẩn in vitro bằng nhiều phương pháp vật lý, không gây thâm nhiễm. Tế bào của động vật có vú có thể được thâm chuyển bằng cộng tủa calcium phosphate, liposome, DEAE-dextran, vi tiêm, thả bom các hạt gene và electroporation. Một số kỹ thuật đã được mở rộng để chuyển DNA vào các tế bào động vật thực nghiệm in vivo. Ví dụ, cộng tủa calcium phosphate (co-precipitation) được dùng để chuyển DNA vào trong các tế bào nuôi cấy bằng tiêu hóa nội bào (endocytosis) đặc hiệu và kỹ thuật này đã trở thành cách tiếp cận chuẩn cho sự chuyển gen in vitro. Các nhà nghiên cứu đã tiêm plasmid tủa calcium phosphate vào khoang màng bụng của chuột, kết quả là biểu hiện được gen chuyển ở gan với mức thấp. Mặc dầu những phương pháp thâm chuyển như thế có thể chuyển được DNA vào tế bào, nhưng it hiều quả hơn so với các vector virus và những kết quả thu được có thể thay đổi rất lớn. Thêm vào đó, những quy trình này chỉ cho kết quả biểu hiện ngắn hạn và thường là không đặc hiệu, hầu hết các kỹ thuật này là không thực tế đối với việc chuyển gen vào các động vật. Tuy nhiên, một vài hệ thống không virus thể hiện như những phương thức tiếp cận tiềm năng đưa các gen chức năng vào đông vật. Quả thực là những phương pháp chuyển gen không virus tiềm năng này có thể được sử dụng trong gen trị liệu trên người nếu những kỹ thuật này thật sự đáng tin cậy và có hiệu quả trong chuyển gen in vivo. Trong phạm vi chương này, chúng ta sẽ bàn đến sự phát triển và những tiến bộ đạt được trong sự 20 chuyển gen qua trung gian ligand-receptor. Một cách tiếp cận khác là chuyển gen qua trung gian liposome, đã được bàn đến ở chương 1. 2.2 Vận chuyển gen qua trung gian receptor Môt số nghiên cứu đã chỉ ra rằng có thể chuyển được gen tới tế bào in vitro và in vivo bằng tiêu hòa nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor (receptor-mediated endocytosis). Sự hòa nhập của các receptor bề mặt là một đáp ứng phổ biến của tế bào, và nhiều lớp receptor này có khả năng tiềm ẩn trong việc chuyển các gen chức năng vào trong tế bào. Việc chuyển các chức năng của ligand vào trong các tế bào nhờ tiêu hóa nội bào qua trung gian receptor rất đa dạng, và sự dịch chuyển của các receptor cũng rất thay đổi như receptor asialoglycoprrotein được thiết kế để đưa các ligand của nó tới lysosome - nơi sau này chúng sẽ được giáng hóa. Các receptor khác lại quay vòng các ligand trở lại bề mặt tế bào (receptor transferrin) hay vận chuyển ligand của nó sang bên kia tế bào và được giải phóng ở đó (rcepetor Ig tổng hợp). Việc chuyển gen qua trung gian receptor là tận dụng lợi thế về khả năng của các receptor bề mặt tế bào để liên kết và hòa nhập các phức hợp lớn có chứa gen cần nghiên cứu và tạo nên tính đặc hiệu cho các vec tơ là không gây thâm nhiễm và không có độc tính. Mẫu thiết kế cơ bản của các cộng hợp phân tử trung gian cho sự chuyển gen gồm 2 yếu tố: ligand và polycation (Hình 2.1). Cấu trúc của cộng hợp phân tử được bắt đầu với việc lựa chọn một ligand thích hợp với đích là một receptor trên một dạng tế bào đặc hiệu. Tùy thuộc vào receptor mà nhiều ligand khác nhau đã được thêm vào cộng hợp như monosaccharide, disaccharide, peptide/protein, folate, glycoprotein, lectin và các kháng thể. Các ligand được liên kết đồng hóa trị với polycation (như polylysine), chúng tương tác điện với nhóm phosphate tích điện âm của khung DNA và tạo nên một phức DNA-cộng hợp ổn định thích hợp cho sự chuyển gen. Một khi ligand đã vào vào được bên trong tế bào thí sẽ trốn thoát được thể tiêu hóa nội bào (endosome) để được vận chuyển tới nhân. Vì thế một số nhà nghiên cứu đã hợp nhất nhiều tác nhân của endosome vào trong các cộng hợp phân tử (Hình 2.1). Những cộng hợp phân tử này bắt chước chiến thuật sử dụng thật nhiều virus cùng đưa vào tế bào . Ở đây acid nucleic được cô đặc lại thành những hạt nhỏ nhờ các polycatiopn, giống như sự đóng gói của hệ gen virus với protein vỏ của chúng. Sự nhận diện và hòa nhập của các virus cũng giống như sự hấp thu các cộng hợp phân tử vào trong tế bào động vật có vú. Như trường hợp các protein của adenovirus gắn với các receptor (V5 integrin) trên bề mặt tế bào vật chủ và sau đó virus được hòa nhập bởi các hốc đươc bao với clathrin trong thể tiêu hóa nội bào (endosome) riêng biệt. Trái ngược với các vec tơ virus, hệ thống chuyển gen này không có sự ràng buộc về đóng gói và cho phép hướng đích tới các DNA plasmid kích thước lớn, cho phép vận chuyển được chẳng những các gen chuyển mà còn cả các promoter và các yếu tố tăng cường. 21 Hình 2.1 Cấu trúc cơ bản của một phức hợp thâm chuyển. Các ligand đích liên kết đồng hóa trị với một polycation, chẳng hạn như poly-L-lysine sẽ cho phép cộng hợp (không cần liên kết đồng hóa trị) với DNA plasmid và tạo ra một phức hợp DNA- cộng hợp thích hợp cho sự chuyển gen. Các tác nhân thể tiêu hóa nội bào như các adenovirus bất hoạt hoặc các peptide hình que được thêm vào phức hợp thâm chuyển sẽ làm gián đoạn sự vận chuyển thể tiêu hóa nội bào (endosome) và kích thích sự biểu hiện các gen chuyển trong các tế bào tiếp nhận. (Theo Assem Ziady và Thommas Ferkol. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999) 2.2.1 Đích ligand Tính mới lạ của phương pháp chuyển gen này là khả năng đưa được DNA plasmids vào trong các tế bào đặc hiệu. Đích lựa chọn của các tế bào có lẽ là vấn đề rất quan trọng đối với GTL, vì nếu biểu hiện gen chuyển một cách bừa bãi thì rất bất lợi. Việc chuyển DNA ngoại sinh qua receptor bề mặt phụ thuộc vào một số yếu tố như sự hiện diện và số lượng các receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào đích, ái lực ligand –receptor và sự tương tác, tính ổn định của phức hợp DNA-cộng hợp cũng như quá trình tiêu hóa nội bào (THNB) 22 của phức hợp (Hình 2.2). Các receptor tế bào khác nhau được coi là những mục tiệu tôt cho sự chuyển gen (Bảng 2.1) và sự lựa chọn ligand là vấn đề then chốt cho tính đặc hiệu tế bào của sự chuyển gen. Trong chương này, chúng ta xem xét lai một vài receptor đặc hiêu được dùng để chuyển gen trực tiếp. 2.2.1.1 Receptor asialoglycoprotein Do tầm quan trọng của nó trong sự chuyển hóa nên từ lâu gan đã được coi như là một đích hấp dẫn đối với GTL, và một số receptor biểu lộ ở gan đã được sử dụng để chuyển gen trực tiếp tới các tế bào gan (Bảng 2.1). Trong một công trình tương tự Wu và Wu đã mô tả một chất mang DNA đích hòa tan đã chuyển được plasmid tới các tế bào gan thông qua con đường receptor asialoglycoprotein. Receptor asialoglycoprotein là một glycoprotein hợp nhất màng có liên quan tới sự thanh thải các glycoprotein có đầu tận là galactose khỏi máu bởi THNB thông qua con đường hầm/ túi bao (coated pit/coated vesicle pathway) trong các tế bào gan. Mặc dầu với các tế bào gan, phần lớn đều được vận chuyển tới lysosome, nhưng vẫn có sự vận chuyển DNA thông qua receptor asialoglycoprotein và vì sự biểu hiện của receptor này chỉ giới hạn với các tế bào gan nên hệ thống tiềm năng này vẫn có khả năng được lựa chọn. Để tạo được một ligand gắn với receptor các nhà nghiên cứu đã xử lý orosomucoid với neuraminidase để bộc lộ các galactose đầu tận và liên kết đồng hóa trị với glycoprotein desialate. Sự biểu hiện plasmid có chứa gen mã cho chloramphenicol acetyltransferase có sự phức hợp với cộng hợp phân tử và phức hợp tạo thành sẽ đích đặc hiệu tới các tế bào u gan người (HepG2) biểu hiện receptor asialoglycoprotein. Khi truyền phức DNA-cộng hợp vào chuột thấy có sự hấp thu và thanh thải nhanh của gan đối với DNA được tiêm vào. Một ngày sau khi xử lý với phức DNA-cộng hợp thì chloramphenicol acetyltransferase chỉ có hoạt tính ở gan và sự biểu hiện gen chuyển kéo dài được nhiều tuần khi động vật được cắt bỏ một phần gan ở thời điểm thâm chuyển. Theo cách tiếp cận này, chuột không có albumin huyết thanh Nagase sẽ được đưa vào tĩnh mạch phức hợp có chứa gen cấu trúc albumin người. Gen chuyển được phát hiện như một episome ở gan động vật sau 2 tuần được xử lý và đã xác định được có một lượng thấp albumin người trong máu động vật trong 4 tuần. Cộng hợp với cơ sở asialoorosomucoid đã được sử dụng để hiệu chỉnh một phần những khiếm khuyết chuyển hóa liên quan tới gan. Wilson và cộng sự đã chuyển một gen chimeric có chứa cDNA của receptor lipoprotein tỷ trọng thấp tới gan thỏ Watanabe – một mô hình động vật về sự tăng cao cholesterol có tính chất gia đình. mRNA của receptor lipoprotein tỷ trọng thấp được phân lập sau một ngày được xử lý với phức DNA cộng hợp, tuy nhiên không có bản phiên mã nào được phát hiện sau 3 ngày thâm chuyển. Mức cholestrol toàn phần trong máu thỏ được thâm chuyển cũng giảm 30% sau 2 ngày xử lý, nhưng hiệu ứng này chỉ là tức thì và nồng độ cholestrol lại trở lại mức trước khi xử lý sau thâm chuyển 5 ngày. 23 Hình 2.2 Sự chuyển gen qua trung gian receptor. Gen ngoại lai được cô đặc trong phức hợp thâm chuyển bởi cộng hợp phân tử, nó gắn với một receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào. Phức hợp receptor sau đó sẽ phải trải qua quá trình tiêu hóa nội bào và khi đã ở bên trong tế bào rồi thì nó trốn thoát được bộ máy THNB, dịch chuyển tới nhân và biểu hiện ở đó. Như vậy, sự biểu hiện của gen chuyển phụ thuộc vào sự hiện diện và số lượng receptor đặc hiệu trên tế bào tiếp nhận, tính ổn định của phức DNA-cộng hợp, sự tương tác ligand- receptor, tốc độ DNA tiến vào nhân, sự sống sót của gen chuyển và các tế bào công nghệ hóa, tốc độ phiên mã, dịch mã và quá trình sau dịch mã- tất cả đều liên quan chặt chẽ với hiêu quả của sự chuyển gen. (Theo Assem Ziady và Thommas Ferkol. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999) 24 Bảng 2.1 Các receptor đích cho sự chuyển gen Receptor Ligand Con đường tiêu hóa nội bào Tế bào đích Receptor Asialoorsomucoid Lysosome Tế bào gan asialoglycoprotein Polylysine glyccosyl hóa Histone glycosyl hóa Carbonate Kháng kháng Lysosome Các tế bào nguyên Tn ung thư, Lympho T C-kit Kháng thể Lysosome Các tế bào gốc kháng CD3 tạo máu CD Yếu tố Steel Lysosome TB lympho (SLF) Glycocalyx Lectin Lysosome Mọi nơi bề mặt TB Receptor yếu Kháng thể Lysosome Mọi nơi tố tăng trưởng bì kháng EGF (EGF) Receptor Folate Lysosome Mọi nơi folate Integrin Peptide Lysosome Mọi nơi Receptor Polylysine Lysosome Đại thực bào mannosase glycosyl hóa Receptor Kháng thể Transytotic TB biểu mô, Ig tổng hợp kháng pIgR TB gan Phức hợp Peptide Lysosome TB gan, neuron Phức hợp enzyme đại thực bào -serpin (SEC) Receptor Surfactant A Lysosome TB biểu mô surfactant A đường hô hấp Receptor transferrin Quay vòng Mọi nơi transferrin Stankovics và cộng sự cũng thông báo rằng việc biểu hiện plasmid có chứa gen mã cho methylmalonyl CoA mutase có liên quan tới cộng hợp phân tử asialoorosomucoid polylysine, nó làm tăng hoạt tính enzyme ở gan tới mức trị liệu cho các bệnh nhân có những sai lệch bẩm sinh về chuyển hóa acid niệu methylmalonic (methylmalonic aciduria). Tuy nhiên sự biểu hiện ở gan rất ngắn, sau khi được xử lý nó chỉ kéo dài chưa tới 2 ngày. Khi tiêm cộng hợp phân tử và phức hợp DNA-cộng hợp vào chuột thì nảy sinh đáp ứng kháng thể kháng ligand asialoorsomucoid, điều đó có thể làm giới hạn việc sử dụng của nó 25 trong các bệnh mạn tính. Nhưng không phát hiện thấy đáp ứng huyết thanh với DNA plasmid ở chuột sau khi tiêm. Đó là điều rất khích lệ vì nếu có các kháng thể kháng trực tiếp DNA thì khó có thể tiếp cận được với sự chuyển gen. Một số nhà nghiên cứu lại sử dụng các ligand khác nhau đích vào các receptor asialoglycoprotein. Các cộng hợp phân tử bao gồm polylysine lactosyl hóa, histone galactosyl hóa và polylysine-albumin galactosyl hóa đã được sử dụng để chuyển các gen nghiên cứu tới các tế bào gan in vitro. Công trình gần đây của Perales và cộng sự đã chỉ rõ rằng một cộng hợp phân tử gồm có môt polylysine đã được biến đổi hóa học với -D galactopyranonyl phenylisothiocyanate có thể đưa các gen chức năng vào các tế bào gan in vitro và in vivo. Và rõ ràng là một plasmid chứa cDNA yếu tố IX của người được cô đặc với polylysine galactosyl hóa đã được tiêm vào hệ tuần hoàn chuột. Các gen chuyển được đưa đặc hiệu vào gan chuột trưởng thành bằng cách cho hấp thu qua trung gian receptor, kết quả là kéo dài được sự biểu hiện của gen chuyển. mRNA yếu tố IX của người và protein chức năng phát hiện thấy trong nhiều tuần sau khi xử lý với phức hợp DNA-cộng hợp. Những kết quả tương tự cũng thấy ở thỏ Watanabe được tiêm phức hợp có chứa cDNA mã cho receptor lipoprotein tỷ trọng thấp. Mặc dầu các kết quả thu được vẫn chưa ổn định nhưng mức cholesterol nói chung là có giảm trong nhiều tuần ở một số thỏ sau khi tiêm phức hợp này (M.Molas, J.C. Perales và R.W. Hanson) 2.2.1.2 Receptor transferrin Một đích tiềm năng khác cho sự chuyển gen là receptor transferrin – một glycoprotein dimer 180 kDa. Receptor này gắn với ligand tự nhiên của nó - transferrin, phức hợp được hòa nhập nhanh chóng rồi sau đó quay vòng ligand trở lại bề mặt tế bào. Receptor transferrin rất phổ biến, nó có ở hầu hết các màng tế bào nhân chuẩn đang phân chia như nguyên hồng cầu, các tế bào gan và đại thực bào. Con đường gây độc nội bào (endocytotic) đã được khai thác để chuyển thuốc và các độc tố tới các tế bào khối u in vitro. Brinstiel và cộng sự đã chỉ rõ rằng plasmid có thể được vận chuyển qua receptor transferrin tới các tế bào dòng hồng cầu của chim và người in vitro. Các dạng tế bào khác tăng trưởng trong nuôi cấy sơ cấp cũng đã được chuyển giao. Sự hấp thu DNA bởi receptor này đạt hiệu quả rất cao và sự biểu hiện gen chuyển trong một số dòng tế bào có thể được nâng lên do được xử lý cùng với các tác nhân hướng lysosome. Việc chuyển và biểu hiện gen nghiên cứu ( P. Photinus pyralis luciferase) sẽ bị ngăn chặn nếu cho dư transferrin vào môi trường và nó sẽ được tăng cường khi xử lý các tế bào vật chủ với các tác nhân (như desferroxamine) làm tăng biểu hiện receptor transferrin. Khi thêm các hạt adenovirus bất hoạt vào phức DNA - cộng hợp cũng làm tăng sự biểu hiện gen chuyển. Kích cỡ của plasmid cũng ảnh hưởng phần nào tới hiệu ứng vận chuyển. Cotten và cộng sự đã thông báo rằng, các plasmid lớn khoảng 48 kilobase có thể chuyển được vào các tế bào thông qua receptor transferrin. Mới gần đây, cũng nhóm nghiên cứu này đã chuyển được các NST nhân tạo của vi khuẩn 160 kilobase với một hiệu ứng có thể so sánh được với các plasmid nhỏ hơn (A. Baker và Cotten). Kích cỡ của các phức hợp được xây dựng từ các cộng hợp cơ sở transferrin là rất quan trọng đối với sự chuyển gen và thường là với kích cỡ nhỏ hơn 100nm là tối ưu. Receptor transferrin như là đích cho sự chuyển gen vào các động vật nguyên vẹn, nhưng khi tiêm phức hợp thâm chuyển này bao gồm cả adenovirus bất hoạt thì lại làm hạn chế 26 kết quả. Có thể là các đáp ứng viêm cùng với sự xâm nhập của adenovirus có ảnh hưởng tới sự tồn tại của các tế bào tương tự cũng tiềm ẩn khả năng được sử dụng trong các vaccine. Tuy nhiên, Zatloukal và cộng sự đã dùng cộng hợp cơ sở transferrin để chuyển gen interleukin-2 (IL-2) vào các tế bào u hắc sắc tố của chuột và đã tạo được cytokine với mức cao trong nuôi cấy. Trên cơ sở các dẫn liệu này thì các tế bào khối u đã được thâm chuyển ex vivo được ghép lại trên các mô hình động vật sẽ tác động như một vaccine do cảm ứng đáp ứng miễn dịch kháng u. Các thử nghiệm lâm sàng pha I nhằm kiểm tra lại khả năng ứng dụng của các quy trình này trên các bệnh nhân u hắc sắc tố ác tính. Khi tiêm cục bộ phức DNA-cộng hợp cơ sở transferrin vào gan đã biểu hiện với mức cao gen nghiên cứu. Biểu mô đường dẫn khí của động vật nguyên vẹn cũng được thâm chuyển nhờ cộng hợp phân tử polylysine-adenovirus-transferrin và polylysine-transferrin người. Trong các thí nghiệm này, Gao và cộng sự sử dụng transferrin hoặc adenovirus đã vô hiệu hóa như là một ligand cũng như là một tác nhân ly giải endosome. DNA được phun qua khí quản gắn với cộng hợp này sẽ biểu hiện tức thì gen nghiên cứu mà đỉnh điểm là một ngày sau thâm chuyển và sẽ trở lại mức trước khi xử lý ở ngày thứ 7. 2.2.1.3 Receptor Ig tổng hợp Phổi giữ vai trò chủ chốt như một tổ chức tiềm năng GTL với nhiều bệnh có liên quan tới gen cũng như không liên quan tới gen. Một số phương pháp chuyển gen có thể đưa được các gen vào trong TB đường hô hấp của động vật. Đáng tiếc là những cách tiếp cận này vẫn bị hạn chế và lại cần phải có các kỹ thuật khác để chuyển gen tới các TB biểu mô đường hô hấp qua trung gian các loại vec tơ, trong đó có receptor Ig tổng hợp (Bảng 2.1). Receptor Ig tổng hợp thích ứng đặc biệt cho việc hòa nhập và vận chuyển không giáng hóa các đại phân tử (như dimer IgA, pentamer IgM) qua biểu mô và các tế bào gan. Đặc biệt là sự phân phối của các receptor này trong biểu mô đường dẫn khí và trong các tế bào chủ chốt tuyến dưới niêm mạc của người đã dẫn đến sự suy đoán rằng receptor này có thể là một đích hấp dẫn cho việc điều trị các bệnh về phổi giống như bệnh xơ nang chẳng hạn. Rõ ràng là các plasmid liên kết không đồng hóa trị với mảnh Fab của kháng thể kháng trực tiếp thành phần tiết của người, các domain ngoại bào tương (ectoplasmic) của receptor đã được đưa vào các tế bào biểu mô khí quản người. Ferkal và cộng sự đã chỉ rõ rằng đích của các receptor Ig tổng hợp là vận chuyển đặc hiệu và biểu hiện tức thời các gen nghiên cứu tới các tế bào biểu hiện receptor này in vitro ngay cả khi có một lượng dư ligand tự nhiên của receptor. Tuy nhiên, việc chuyển giao các plasmid lại bị ức chế nếu cho dư thành phần tiết của người, có lẽ do thành phần này đã choán chỗ vị trí nhận biết trên mảnh Fab và vì thế mà ngăn chặn sự tương tác của nó với receptor. Hiệu ứng thâm chuyển các tế bào biểu mô khí quản người phát triển bằng nuôi cấy rất biến đổi và những biến đổi này đều có liên quan tới những khác biệt về mức độ biểu hiện của receptor. Receptor Ig tổng hợp đã đưa được plasmid vào các mô biểu hiện receptor này in vivo. Trái ngược với đích của các tế bào biểu mô đường dẫn khí thông qua receptor transferrin, phức DNA-cộng hợp được phân phối trong hệ tuần hoàn vì receptor Ig tổng hợp định vị chủ yếu trên bề mặt phía kiềm tính của các tế bào biểu mô. Khi sử dụng luciferase và (lacZ) -galactosidase của E. coli như là chất nghiên cứu thì thấy mô hình biểu hiện gen 27 chuyển cũng tuân theo sự phân phối không gian của các tế bào biểu hiện receptor này. Đây là sự biểu hiện tức thời, kéo dài dưới 12 ngày sau khi tiêm. Tuy nhiên, đã xuất hiện một đáp ứng huyết thanh thật sự kháng trực tiếp mảnh Fab của phức hợp, bằng chứng là giảm sự biểu hiện gen ở phổi và gan ở các lần xử lý tiếp theo. Rõ ràng là những chướng ngại miễn dịch này cần phải được tháo gỡ trước khi ứng dụng các vec tơ này trong lâm sàng. 2.2.1.4 Receptor mannose Các đại thực bào mô cũng là một mục tiêu tiềm năng để biến đổi gen, các gen được chuyển trực tiếp tới các tế bào này thông qua mannose receptor. Receptor mannose biểu lộ ở nhiều tiểu type (subtype) đại thực bào và các glycoprotein được hòa nhập với các gốc mannose, glucose, fucose và N-acetylglucosamine. Cũng giống như receptor asialoglycoprotein, các ligand hòa nhập bởi receptor mannose được chuyển tới lysosome. Cộng hợp glycoprotein nhân tạo được cấu trúc theo kiểu polylysine được glycosyl hóa với các monosaccharide và được dùng để chuyển gen qua trung gian receptor tới các đại thực bào của người và chuột trong nuôi cấy sơ cấp. Hiệu ứng thâm chuyển rất biến động, nhưng sự biểu hiện gen chuyển luôn gắn với các dấu chuẩn của các tế bào đơn nhân/đại thực bào (monocyte/macrophage marker). Sự hấp thu gen nghiên cứu được thực hiện qua trung gian tương tác đặc hiệu giữa phức hợp với receptor mannose, vì thế nếu cho thừa albumin huyết thanh bò đã mannosyl hóa vào môi trường nuôi cấy trước khi thâm chuyển thì sẽ làm ức chế sự biểu hiện gen nghiên cứu. Các plasmid phức hợp với cộng hợp glycoprotein có mannose đầu tận đã được đưa vào các đại thực bào của bọn gặm nhấm thông qua receptor mannose. Phức hợp này được tiêm vào hệ tuần hoàn chuột trưởng thành. Các gen nghiên cứu đã được chuyển tới tổ chức lưới nội mô chuột mặc dầu hiệu ứng thâm chuyển là thấp và thời gian biểu hiện gen chuyển ngắn, hiệu ứng cao nhất ở ngày thứ 4 sau thâm chuyển. 2.2.2 Sự cô đặc và hình thành phức DNA Theo các báo cáo ban đầu, sự chuyển gen qua trung gian receptor asialoprotein phụ thuộc phần nào vào kích thước các hạt DNA cô đặc. Thật vậy, polycation có thể được coi như một phương tiện kết dính ligand với DNA của plasmid. Phương pháp cô đặc được sử dụng trong những thí nghiệm này có liên quan tới các kỹ thuật, trong dó DNA được ủ với một lượng dư polycation, sau đó được thẩm tích kháng gradient NaCl. DNA cô đặc dần dần thành những hạt đa phân tử tích điện dương kích cỡ đường kính khoảng 150-200 nm. Kích cỡ của phức DNA-cộng hợp có thể là rất quan trọng đối với sự chuyển gen vì nhiều receptor THNB kháng lại rõ ràng các ligand với các kích cỡ xác định. Wagner và cộng sự đã chỉ rõ rằng độ cô đặc của phức hợp có liên quan tới mức độ biểu hiện gen chuyển. Đặc biệt là phức hợp DNA-cộng hợp đã được cô đặc thành những cấu trúc hình phỏng xuyến (toroid structure) với đường kính 80-100 nm là hiệu lực nhất đối với sự chuyển gen vào các tế bào phát triển trong nuôi cấy. Parales và cộng sự lại phát triển một phương pháp cô đặc khác để plasmid thể hiện là các hạt nhỏ, phù hợp với sự chuyển gen, và đã xác định rằng các điều kiện này rất quan trọng cho sự ổn định của phức hợp được tạo nên từ DNA nồng độ cao. Hệ thống này có liên quan với việc thêm dần một lượng rất nhỏ cộng 28 hợp polycation-ligand vào DNA plasmid. Nhờ việc điều chỉnh nồng độ NaCl trong dung dịch mà những phức hợp “đơn phân tử” (unimolecular) được tạo thành chỉ có đường kính chừng 10-20 nm. Phức hợp này có bề mặt trung hòa điện nên có thể tránh được sự hoạt hóa bổ thể và tạo nên một vec tơ hiệu ứng cao hơn cho sự chuyển gen vào động vật. Độ cô đặc DNA của phức DNA-cộng hợp phụ thuộc vào một số biến cố như nồng độ NaCl, độ dài của chuỗi polylysine cũng như kích cỡ, trình tự và trạng thái sinh lý của DNA. Độ dài của polylysine tác động tới nồng độ NaCl cần cho sự hình thành và duy trì các phức hợp này. Cấu trúc bậc hai của polycation cũng ảnh hưởng tới cấu trúc phức hợp. Các peptide tổng hợp được sắp đặt trong các cấu hình khác nhau (uốn khúc ngẫu nhiên, xoắn và các cấu trúc tấm ) gắn với DNA sẽ tạo nên tổng thể đa phân tử có thể không thích hợp cho sự hấp thu qua trung gian receptor. Cuối cùng là, cấu trúc của cộng hợp phân tử cũng tác động tới việc gắn nó vào DNA. Sự tương tác của polycation với DNA có thể mất ổn định do tăng thay thế ligand. Nếu thay thế nhiều polycation sẽ làm thấp đi ái lực của nó với DNA, có lẽ do sự cản trở không gian và kết quả là phức hợp được nới rộng ra quá lớn gây khó khăn cho sự hòa nhập. Các gen muốn được vận chuyển một cách hiệu quả qua phức hợp enzyme-serpin in vitro thì chỉ được thay thế một ít polycation. Tuy nhiên, chỉ riêng poly-L-lysine cũng đã tạo được các phức nhỏ nhất, nhưng lại không có hiệu ứng với các tế bào thâm chuyển. Ngoài ra, mẫu và thời gian biểu hiện gen chuyển cũng có sự thay đổi, nó phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi polycation mặc dầu các cộng hợp phân tử đều có cùng độ cô đặc DNA. Wagner và cộng sự đã phát hiện rằng cộng hợp phân tử với các ligand bán phần ít hơn thì hiệu ứng hơn đối với sự chuyển gen nghiên cứu bằng THNB qua trung gian receptor. Các cộng hợp có chứa khoảng 1 transferrin/100 gốc lysine thì biểu hiện được tối đa gen chuyển trong các dòng tế bào hồng cầu người. Tuy nhiên, việc thay thế từng phần cộng hợp cơ sở transferrin với polylysine đã tạo được các cấu trúc hình phỏng xuyến và hoạt tính của luciferase được nâng lên cao hơn. Sự cô đặc DNA plasmid bởi polycation có thể làm tăng thêm lợi thế vì DNA cô đặc rất quan trọng đối với sự ổn định của nó trong máu và trong tương bào của các tế bào đích. Trong lượng phân tử cao của DNA ảnh hưởng đặc biệt tới việc làm giảm bớt lực liên kết hydro và đời sống bán phần của nó trong máu ngắn có lẽ do bị phân giải bởi nuclease. Polycation có thể ảnh hưởng tới sự tồn tại của DNA ngoại sinh trong các bể endosome tương bào, bởi vì DNA plasmid được làm cô đặc với polylysine kháng mạnh hơn với sự phân giải của nuclease nội bào (endonuclease). Một số polycation khác cũng đã được sử dụng trong chuyển gen. Chất được sử dụng rộng rãi nhất là tác nhân cô đặc DNA (poly – L-lysine), nhưng poly-L-ornithine và ploly-L-lysine chỉ được sử dụng đối với các tế bào thâm chuyển in vitro. Điều thú vị là các plasmid không liên kết đồng hóa trị với poly-L-lysine thì biểu hiện rất nghèo nàn, có lẽ nó liên quan tới việc poly-L-arginine liên kết DNA với ái lực lớn hơn poly L-lysine và nó có thể ngăn ngừa được sự tương tác của các yếu tố phiên mã với các gen chuyển (A. Ziady, T. Ferkol và P.B Davis). Các acid poly-L-amino có thêm lợi thế là nó được coi như như là các phương tiện chuyển gen. Vì các acid poly-L-amino không phải là kháng nguyên, nó bị phân hủy và chuyển hóa tức thời. Trái lại, các peptide được cấu tạo từ các D-isomer của các amino acid thì lại kháng một cách tương đối với sự phân giải. Cuối cùng, người ta đã thừa nhận rằng poly –L-lysine có thể hoạt động với tư cách như một tín hiệu định vị nhân và có thể có hiệu ứng hơn trong việc đích các phức DNA-cộng hợp tới nhân khi nó đã được hòa nhập. 29 Nhiều polymer cationic tổng hợp đã thể hiện rõ ràng là trung gian cho sự chuyển gen vào trong tế bào. Các polymer nói theo cách khác là các dendramer vượt trội trong việc chuyển các gen nghiên cứu tới các dạng tế bào khác nhau in vitro. Khi tạo các phức chỉ gồm các điện tích dương, Szoka và cộng sự đã thu được hiệu ứng thâm chuyển tối ưu nhờ việc sử dụng các dendramer có đường kính 6.8 nm, và sự cộng hợp của các polymer với một protein màng không ổn định sẽ nâng cao hơn nữa hiệu ứng chuyển gen. Polyethylenimine, một polymer hữu cơ phân nhánh cao được tổng hợp bởi sự trùng hợp aziridine đã được sử dụng như một protein gắn DNA cũng như một tác nhân làm phân rã lysosome. Bousif và cộng sự sử dụng chúng để đưa các plasmid có chứa gen nghiên cứu lucuferase vào trong các tế bào của hệ thần kinh trung ương. Nhưng polyethylenimine tác động như một “lớp thấm proton” (proton sponge) trong thể THNB (endosome). Các phân tử gắn DNA đã được sử dụng để gắn plasmid với các ligand và chuyển gen vào các tế bào động vật có vú. Các nucleoprotein cũng giống như histone và protamine đã được sử dụng như là một polycation trong một số cộng hợp phân tử. Tác nhân tương tác bisacridine đã được cải biến hóa học có chứa các gốc galactose tận cùng được sử dụng để chuyển DNA vào trong các tế bào biểu hiện receptor asialoglycoprotein. Nhờ việc sử dụng các cấu trúc đã được đổi mới mà Forminaya và Wels đã tận dụng ái lực cao của chất hoạt hóa phiên mã của nấm men GAL4 đối với các trình tự DNA đặc hiệu để gắn các plasmid vào các cộng hợp phân tử và các tế bào thâm chuyển in vitro. Kích cỡ và cấu hình của DNA có thể là các biến số quan trọng đối với việc chuyển gen, tuy thế DNA plasmid thì không cần phải cô đặc thành những hạt nhỏ để được hấp thu vào một số mô. Wolff và cộng sự đã chứng minh rằng việc chuyển trực tiếp DNA tinh khiết vào cơ sẽ kéo dài được sự biểu hiện của các gen nghiên cứu trong sợi cơ. Các plasmid vẫn còn duy trì một NST phụ (extrachromosome) trong nhân vật chủ và nó tồn tại nhiều tháng với tư cách là các episome không sao chép. Mặc dầu các dạng tế bào khác đã được thâm chuyển với cách tiếp cận này, nhưng nó chỉ tương đối đặc hiệu với cơ. Vì thế việc ứng dụng tiêm trực tiếp DNA có thể vẫn bị hạn chế. 2.2.3 Sự lưu chuyển và tẩu thoát theo kiểu tiêu hóa nội bào Các vectơ không virus đưa gen chuyển vào tế bào bằng THNB qua trung gian receptor đơn giản là thâm nhập qua lớp hàng rào của màng tế bào để đưa các gen ngoại sinh tới tương bào của tế bào đích. Sự biểu hiện của các gen chuyển đòi hỏi chúng phải tẩu thoát khỏi các bể endosome để rồi được chuyển tới nhân. Trong trường hợp receptor assialoprotein thì sự lưu chuyển của các ligand bị sút kém. Mặc dầu vậy lycoprotein có galactose đầu tận đã được chuyển tới lysosome các tế bào gan chuột sơ cấp, nhưng vẫn chưa bị thoái hóa hoàn toàn và một số asialoglycoprotein đã hòa nhập nhưng vẫn không bị phân hủy. Các phức DNA-cộng hợp được đưa vào qua receptor này có thể cũng tránh được sự phân hủy tương tự như thế. Mặc dầu các phức DNA-cộng hợp bắt chước các quá trình tiến vào của virus, nhưng chúng vẫn không được giải phóng khỏi bộ máy endosome. Trên thực tế, sự biểu hiện gen chuyển bị giới hạn bởi việc bẫy hoặc giáng hóa của các phức hợp trong các thể THNB (Hình 2.2). Hiệu ứng của sự chuyển gen thông qua THNB trung gian receptor có thể được nâng cao bằng cách ngắt sự lưu chuyển nội bào của phức DNA-cộng hợp. Có thể sự hiện diện của polycation trong cộng hợp phân tử đã cho phép các phức DNA-cộng hợp tẩu thoát khỏi thể THNB. Cotten và cộng sự đã chỉ rõ rằng chloroquine - một tác nhân hướng lysosome đã can thiệp vào sự acid hóa các 30 lysosome và ức chế enzyme thủy phân do đó đã nâng cao đáng kể sự biểu hiện gen chuyển trong các tế bào dòng hồng cầu (dòng tế bào K562) thâm chuyển với cộng hợp polylysine-transferrin. Chloroquine cũng làm tăng sự biểu hiện của các gen chuyển đã được chuyển tới các dạng tế bào khác như các tế bào gan và đại thực bào người bằng sự THNB qua trung gian receptor. Tác nhân dược lý khác là colchicine cũng làm tăng sự tồn tại của các gen chuyển in vivo do nó can thiệp vào sự lưu chuyển của các endosome bằng cách phá vỡ các vi ống. Một số nhà khoa học đã dùng các adenovirus để kéo dài sự tồn tại của đại thực bào nhờ quá trình THNB qua trung gian receptor. Việc điều hòa pH của THNB là rất cần thiết cho sự lưu chuyển thích hợp của các ligand trong các chặng đường nội bào và pH các bể của thể THNB sẽ trở nên acid hơn khi nó tới lysosome. Sự acid hóa của các thể THNB (endosome) muộn sẽ làm thay đổi cấu trúc các protein capsid của adenovirus và gây nên sự tương tác protein và màng bể, vì thế mà phá vỡ thể THNB. Từ quan sát này đã dẫn đến giả thuyết cho rằng sự phá vỡ thể THNB bởi adenovirus có thể sẽ kéo dài sự tồn tại và biểu hiện của gen chuyển. Curiel và cộng sự đã khai thác đặc tính này của virus và cho tăng gấp đôi số adenovirus khiếm khuyết sao chép vào các cộng hợp phân tử cơ sở transferrin. Những cộng hợp phân tử gắn adenovirus đã làm tăng đáng kể sự biểu hiện của các gen chuyển ở nhiều dạng tế bào in vitro. Hơn nữa, các gen nghiên cứu cũng đã được đưa vào các tế bào biểu mô đường dẫn khí in vivo qua đường khí quản nhờ việc sử dụng polylysine-adenovirus và các vec tơ polylysine-adenovirus-transferrin. Cristiano và cộng sự đã cải tiến các cộng hợp phân tử cơ sở asialoorsomucoid bằng cách cho thêm các adenovirus bất hoạt vào vectơ và đã chứng minh rằng việc tăng gấp đôi adenovirus ở các phức DNA-cộng hợp đã làm tăng sự vận chuyển gen nghiên cứu vào các tế bào gan nuôi cấy. Các virus khác (như virus làm chết phôi gà –chicken embryo lethal orphan virus) cũng được sử dụng để làm tăng sự biểu hiện của gen chuyển. Protein bề mặt của các virus khác cũng có hiệu ứng tương tự đối với sự tồn tại và biểu hiện gen chuyển vì nó cho phép thể THNB hòa với màng virus. Wagner và cộng sự đã chỉ rõ rằng các trình tự peptide từ hemaglutinin HA2 của influenza gắn với cộng hợp phân tử polylysine transferrin làm tăng đáng kể mức biểu hiện gen chuyển ở các tế bào nuôi cấy. Các nhà khoa học khác lại thiết lập các peptide tổng hợp bắt chước chức năng THNB của các protein virus. Các peptide khác như protein hòa nhập của virus hợp bào đường hô hấp hay các peptide giải phóng thể THNB tổng hợp cũng có hiệu ứng tương tự đối với việc giải phóng và tồn tại của các DNA ngoại sinh. Tuy nhiên, với việc cho thêm các protein này sẽ làm hạn chế tiềm năng của phức hợp, vì sự liên kết của peptide với cộng hợp có thể lại sinh ra tính miẽn dịch của phức hợp. 2.2.4 Xác định đích và sự chuyển vị nhân Mục tiêu cuối cùng của sự chuyển gen là đưa DNA ngoại sinh vào nhân, ở đó gen chuyển có thể trải qua sự phiên mã (Hình 2.2). Quá trình lưu chuyển nhân của các phức hợp DNA xảy ra khi chúng đã thoát khỏi sự THNB. Tuy nhiên, quá trình vận chuyển gen qua trung gian receptor vẫn còn biết đến rất ít. Việc tiến vào nhân của các phức DNA-cộng hợp có thể là một quá trình ngẫu nhiên, thụ động và đơn giản là có liên quan tới tổng số các bản phiên mã của gen chuyển có ở tương bào. Có lẽ sự vận chuyển gen tới nhân đòi hỏi phải có sự phân chia tế bào và không có sự hợp nhất của vỏ nhân khi phân bào (mitosis), và cho phép DNA của NST phụ (extrachromoisome) vào trong nhân. Hiệu ứng của sự chuyển 31 gen thông qua receptor asialoglycoprotein rõ ràng được tăng lên khi gan được tái sinh do cảm ứng bởi việc cắt bỏ một phần. Tuy nhiên, vẫn chưa xác định được mức độ quan trọng của sự phân chia tế bào đối với việc xác định đích của gen chuyển tới nhân. Thực tế là các gen nghiên cứu có thể được vận chuyển hiệu quả vào các tế bào không phân chia, điều đó chứng tỏ rằng nó không tuân theo cơ chế này. Sự biểu hiện gen chuyển ở gan cũng kéo dài đáng kể ở các động vật được cắt bỏ một phần gan, mặc dầu vẫn chưa xác định được liệu các gen ngoại sinh có hợp nhất được vào hệ gen tế bào vật chủ hay không. Thực vậy, nhiều DNA được vận chuyển bởi cộng hợp phân tử này vào trong tế bào, nó tồn tại như các episome trong nhân nhưng trong các tế bào thâm chuyển lại không thấy sự tồn tại này. Việc kéo dài sự tồn tại của gen nghiên cứu có thể có liên quan tới sự tẩu thoát gen chuyển khỏi con đường receptor asialoglycoprotein, vì thế mà tránh được sự phân giải trong lysosome và cho phép DNA duy trì được trong các bể tương bào mà không bị thủy phân. Một giả thuyết thuyết phục khác là thành phần polylysine của chất mang có thể đã trợ giúp cho sự lưu chuyển nhân của các DNA. Nòng cốt nhất là một số protein virus đáp ứng sự chuyển vị hệ gen virus tới nhân, có các trình tự giầu lysine. Trình tự amino acid Phe-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val được dùng để vận chuyển kháng nguyên T virus -40 của khỉ (simian virus-40 (SV-40) large T antigen) tới nhân các tế bào động vật có vú và trình tự Lys-Lys-Lys-Tyr-Lys-Leu-Lys tác động như một tín hiệu định vị nhân đặc hiệu cho các protein chất nền của HIV-1. Các nucleoprotein cũng được sử dụng như một polycation hoặc một tín hiệu định vị nhân trong một số cộng hợp phân tử. Đặc biệt những dạng khác nhau của histone và protamine đã được sử dụng để chuyển các gen chức năng. Khi thêm histone H4 vào các cộng hợp cơ sở transferrin đã làm tăng sự biểu hiện gen chuyển trong tế bào in vitro. Histone H1 cải biến hóa học có gốc galactose đầu tận đã được sử dụng để đưa các gen nghiên cứu vào trong các tế bào u gan thông qua receptor asialoglycoprotein. Cơ chế của việc protein này kích thích sự chuyển gen thì vẫn chưa được xác định. Trong hệ thống này, DNA plasmid không hợp nhất vào hệ gen tế bào vật chủ và các gen chuyển vẫn duy trì ở dạng episome. Bởi vậy gen này hầu như không tồn tại ở nhân các tế bào thâm chuyển và đó chỉ là sự biểu hiện tức thời. Thời gian biểu hiện của gen chuyển cũng thay đổi, nó phụ thuộc vào mô và dạng tế bào tải nạp, và có thể liên quan tới sự tồn tại của các tế bào tiếp nhận. Rõ ràng là các gen có thể được đưa vào vật chủ khi tế bào đích đã chết. Chính sản phẩm của gen chuyển cũng có thể tác động tới sự tồn tại của các tế bào đã được công nghệ hóa. Sự biểu hiện của một gen nghiên cứu có thể cảm ứng đáp ứng miễn dịch tế bào, gây thải loại các tế bào thâm chuyển và làm hạn chế sự biểu hiện của gen chuyển. Chất tạp exotoxyn của các chế phẩm plasmid đã được Cotten và cộng sự chỉ rõ là sẽ làm tổn thương các tế bào sơ cấp in vitro và tác động lên sự biểu hiện của các gen nghiên cứu. Vì thế việc sử dụng DNA tinh khiết như một dược phẩm là rất cần thiết. Sự mất mát DNA trong quá trình vận chuyển tới các tế bào vật chủ đã làm hạn chế rất nhiều cho các hệ thống này. Một số nhà khoa học đã thiết kế các vec tơ DNA nhằm kéo dài sự tồn tại của gen chuyển. Vec tơ episome tự sao chép được có chứa các trình tự virus tác động như gốc sao chép (origin of replication) có thể cho phép gen chuyển tồn tại được trong các tế bào đang phân chia. Ngoài ra, các NST nhân tạo cũng được phát triển để chuyển giao và biểu hiện liên tục chẳng những các gen chuyển (cDNA hoặc gen nguyên vẹn) mà cả với các promoter và yếu tố tăng cường. 32 2.3 Kết luận Nói tóm lại, nhiều cộng hợp phân tử đã được sử dụng để chuyển các gen ngoại lai, các gen chức năng vào trong các tế bào động vật có xương sống bằng quá trình THNB trung gian receptor. Sự chuyển gen qua trung gian receptor là một phương pháp không gây thâm nhiễm, linh hoạt, chuyển được DNA cô đặc tới các tế bào đích đặc hiệu in vitro và không có sự hợp nhất các tác nhân ly giải endosome vào trong các cộng hợp phân tử nên nâng cao đáng kể sự biểu hiện gen chuyển. Mặc dầu có các lợi thế tiềm ẩn (Bảng 2.2), nhưng các hệ thống chuyển gen này lại cho các kết quả rất biến đổi in vivo. Khi đưa các gen nghiên cứu vào gan đã kéo dài sự biểu hiện và dường như là nó có liên quan tới kích thước và cấu hình của DNA plasmid. Mặt khác, các gen được vận chuyển bằng cộng hợp phân tử đã biểu hiện tức thời trong các mô với mức thấp in vivo mặc dầu đã có những cải biến trong các phức hợp nhằm thúc đẩy sự tồn tại của các gen chuyển trong các tế bào tiếp nhận. Bảng 2.2 Sự chuyển gen qua trung gian receptor Những tiện lợi Không thâm nhiễm Chuyển hiệu quả DNA plasmid tới các tế bào in vitro Chuyển được các gen ngoại lai tới các tế bào có receptor thích hợp Không bị bó buộc về kích cỡ trong việc chuyển DNA ngoại lai Có thể chuyển được nhiều gen tới tế bào Sự thâm chuyển hay biểu hiện gen chuyển không đòi hỏi phải có sự sao chép tế bào Thêm các tác nhân ly giải THNB sẽ làm tăng sự tồn tại của gen chuyển Các gen chuyển vẫn duy trì NST phụ Những bất tiện Ít hiệu quả trong việc chuyển DNA plasmid tới các mô in vivo Thời gian biểu hiện gen chuyển ngắn Sự biểu hiện của gen chuyển ở mức thấp và biến động Ligand hoặc các bán phần ly giải THNB có thể là tác nhân gây miễn dịch. Một số nhà nghiên cứu đang hướng tới việc giải quyết các giới hạn này bằng cách hợp nhất các đặc tính phức hợp phân tử vào trong các phương tiện vận chuyển gen như liposome chẳng hạn. Sự cô đặc DNA plasmid với các protein cơ sở như polylysine cho thấy, để nâng cao việc chuyển gen bởi các liposome cationic thì phải nâng cấp sự nang hóa của DNA và khả năng THNB của phức hợp. Các liposome có xu hướng hòa nhập với tất cả các tế bào và khi thêm ligand vào phức DNA -lipid sẽ cho phép vận chuyển chọn lọc các gen tới tế bào đích. Các vec tơ chimera cũng được thiết kế để gắn với các yếu tố của hệ thống có virus cũng như không virus. Một số nhà nghiên cứu đã gộp các protein virus vào trong các cộng hợp phân tử để tăng cường sự chuyển giao và biểu hiện gen chuyển. Cũng có thể là các virus tái tổ hợp cải biến có thể gộp được các ligand sẽ làm cho chúng hướng được đích tới các tế bào biểu hiện receptor. Virus gây bệnh bạch cầu ở chuột ecotropic Moloney được cải 33 biến hóa học với lactose đã hướng đích tới receptor asialoglycoprotein các tế bào u gan Hep G2. Sau chót phải kể đến là Kasahara và cộng sự đã công nghệ hóa vỏ của retrovirus ecotropic có chứa erythropoietin và vec tơ lai này đã được sử dụng để vận chuyển các gen chuyển tới các tế bào của chuột và người biểu hiện receptor erythropoietin. Retrovirus của chim cũng được cải biến để biểu hiện được integrin trên bề mặt của chúng và được dùng để thâm nhiễm các tế bào nhân chuẩn. Những chimera này có thể cho phép xác định được đích đặc hiệu mô của các virus tái tổ hợp nhờ sự tương tác của ligand với các receptor bề mặt tế bào và có thể sẽ là đại diện cho sự chuyển gen qua trung gian receptor trong tương lai. Chương III NHIỄM SẮC THẺ ĐỘNG VẬT CÓ VÚ – VIỄN CẢNH CỦA GEN TRỊ LIỆU 3.1 Mở đầu Hiệu lực của GTL đối với việc điều trị bệnh sẽ phụ thuộc rất lớn vào việc thiết kế một cách thích hợp các chất mang (carrier) để chuyển gen in vivo. Trong tế bào, một thành phần tự nhiên đã được thiết kế cho mục đích này đó là nhiễm sắc thể. Vì thế cách tiếp cận logic là bắt chước cách thức làm việc của tự nhiên, tức là phải tạo ra được một NST nhân tạo của động vật có vú (mammalian artificial chromosome – MAC). Những hiểu biết của chúng ta hiện nay về các thành phần di truyền tạo nên một NST có chức năng đầy đủ còn rất hạn chế. Mặc dầu vậy, dưới đây chúng ta cũng sẽ đề cập tới nhứng tiến bộ đạt được trong việc xác định các thành phần này cũng như các chiến lược cần phải phát triển để tạo nên các NST nền tảng cho các vec tơ MAC. 3.2 Sự cần thiết phải kiến tạo một NST nhân tạo Có rất nhiều lý do mong muốn xây dựng một NST nhân tạo động vật có vú (MAC). Trước tiên là cần phải tạo được một hệ thống thí nghiệm để khám phá sự tổ chức và cơ chế của NST động vật trong gián phân. Tuy nhiên, khi đưa MAC vào chuột chuyển gen thì nó đòi hỏi phải là DNA chức năng của MAC và phải có tính ổn định trong thời gian phân bào giảm nhiễm. Công việc khẩn yếu của chúng ta là phải sửa chữa và tái tổ hợp NST một cách chính xác. Ngoài các nghiên cứu về cách vận hành NST thì NST nhân tạo động vật có vú phải được phân tích chức năng gen, các lớp gen và các vùng của hệ gen vô cùng lớn để xử lý được dễ dàng trong các hệ thống vec tơ hiện hành. Chẳng hạn như, chúng phải được phân tích về những yếu tố điều hòa xa trong sự biểu hiện gen và phải phân tích trình tự bất hoạt của NST và in (imprinting) hệ gen. Lợi thế của cách tiếp cận MAC vượt hẳn NST nhân tạo nấm men (yeast artificial chromosome – YAC) là nó không có hiệu ứng về vị trí và các gen đột biến được cài vào từ sự hợp nhất của các phân tử DNA lớn vào trong hệ gen vật chủ. 34 Về mặt thực tiễn, MAC có thể tạo tiềm năng cho sự lựa chọn các cách tiếp cận cơ sở virus để hiệu chỉnh các bệnh di truyền bằng GTL soma. Lợi thế chính của các vec tơ MAC cho GTL là nó nới rộng thêm các giới hạn về kích cỡ của DNA được cài vào, có thể đạt tới mức mười triệu cặp base (kích thước của NST người nguyên bản từ 45 megabasepairs [Mbps] đến 250 Mbps). Việc điều hòa gen bình thường luôn phụ thuộc vào các yếu tố điều hòa có nhiều intron lớn tới 10, thậm chí 100 kilobase (kb). Vì thế, trong nhiều trường hợp các yếu tố này không có đầy đủ khả năng đưa gen vào hệ gen đảm bảo chính xác cũng như biểu hiện gen một cách đầy đủ. Đây là vấn đề cực kỳ quan trọng với GTL vì mục tiêu của nó là tái tạo lại chức năng gen nguyên bản mà sự biểu hiện đặc hiệu mô, sự kiểm soát thời gian một cách thích hợp và liều lượng chuẩn xác là những yếu tố cơ bản trong sự vận hành của gen. Ngoài ra, các MAC lớn còn mang một nhóm gen đầy đủ sẽ tạo được tiềm năng cho việc hiệu chỉnh hội chứng loại trừ gen kề nhau (contiguous gene deletion syndrome), hội chứng này có liên quan tới sự khiếm khuyết của hơn một gen. Để ứng dụng được, cần đòi hỏi một DNA lớn được đưa vào và tồn tại mãi bên cạnh tế bào ở trạng thái NST phụ (để tránh gây đột biến các gen cài) với sự rủi ro nhỏ nhất về các phản ứng miễn dịch không mong muốn kháng lại protein ngoại lai của MAC ở các vec tơ. 3.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú (MAC) lý tưởng Nhiễm sắc thể của tế bào nhân chuản đơn giản nhất cũng phải có tâm động (centromere), các gốc sao chép, và 2 khúc cuối (telomere). Những cấu trúc này đủ để tạo nên một NST nhân tạo của nấm men YAC (Hahnenberger và cộng sự., 1989; Murray và Szostak, 1983). Các bản phiên mã của động vật có xương sống liệu đã đủ để tạo được một NST nhân tạo (MAC) hay chưa? điều này vẫn chưa được rõ. Chúng ta có thể hiểu rằng, trong hệ thống động vật có xương sống vẫn còn đòi hỏi phải có các yếu tố khác nữa. Chẳng hạn như theo những số liệu hiện tại thu được càng nhiều đã chứng minh rằng các tương tác NST vi ống kiểm soát vị trí và sự di động của NST chẳng những làm giới hạn tâm động mà còn phân bố nó dọc theo cánh tay NST (Afshar và cộng sự., 1995; Murphy và Karpen, 1995; Vernos và cộng sự., 1995). Ngoài ra, chất nhiễm sắc của tế bào nhân chuẩn cao hơn ở vùng trung tâm có thể có chức năng sinh học rất quan trọng trong việc đảm bảo cho sự phân ly thật chính xác (Barton và Goldsstein, 1996; Dernburg và cộng sự., 1996). Nếu chúng ta có ý định muốn tạo nên một MAC lý tưởng thì các đặc trưng của chúng là gì ? Các NST động vật có xương sống nguyên bản là các phức hợp nucleoprotein không lớn lắm, nhưng lại mang tới hàng nghìn gen. Để phù hợp với thực tiễn thì MAC cần phải gọn nhỏ hơn. Khi thao tác in vitro với chiều dài hàng vài triệu base thì phần hữu dụng của một vec tơ MAC chỉ dưới vài trăm kilobasepair (kbp). Đối với vấn đề này, để đạt được lợi ích tối đa người ta có thể đưa thêm DNA cần thiết vào với bất kỳ kích cỡ nào. Như vậy, một NST nhân tạo động vật có vú (MAC) ổn định về phân bào và có kích cỡ chừng vài trăm kbp thì mới phù hợp với một gen lớn như locus dystrophy của bệnh đau cơ Ducchenne 2400 kbp (Heus và cộng sự., 1996) hoặc phải mang đoạn NST có chiều dài hàng 10 triệu cặp base. Tính ổn định phân bào ở đây có nghĩa là NST được truyền lại cho các tế bào con cháu phải khỏe khoắn như là NST nguyên bản với xu hướng được sắp xếp lại ( như sự chuyển vị, sự loại bỏ hay đảo ngược) xảy ra ở tần số không lớn hơn NST nguiyên bản. Những đảo ngược dù nhỏ của MAC cũng không được hợp nhất vào các NST nguyên bản lớn hơn ở bất kỳ tỷ lệ thích ứng nào. 35 MAC lý tưởng sẽ “che mắt” được hệ miẽn dịch, nó không mang bất kỳ kháng nguyên nào được mã bởi virus hoặc bất kỳ protein ngoại lai nào kích thích hệ miễn dịch. Theo lý thuyết, một MAC được kiến tạo từ các thành phần di truyền của người thì ngoài các thành phần được mã trong DNA cài vào, không có các thành phần khác có thể tạo cơ sở cho các phản ứng miẽn dịch. Đặc trưng cuối cùng cần phải quan tâm ở đây là những nghi vấn về công nghệ của MAC. Tức là MAC phải được chuyển giao tới các quần thể tế bào đích, cả dạng phổ thông cũng như các dạng đặc biệt. Việc chuyển giao DNA hiện nay là một quá trình rất kém hiệu lực. Trái lại MAC lại giữ vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển giao tuy nó là sự vận chuyển thụ động bởi các tác nhân khác có cơ sở virus hoặc hóa học. Khó khăn lớn nhất cần phải vượt qua là làm thế nào để chuyển được những phân tử DNA lớn tới tế bào một cách nguyên vẹn. Các phương pháp cô đặc và đóng gói các phân tử DNA lớn vào trong các cấu trúc phải được quản lý một cách dễ dàng, chắc chắn nhưng có thể đảo ngược lại được, đó là các vấn đề quan trọng cần phải nghiên cứu. Hơn nữa, khi màng tế bào bị phá vỡ thì việc vận chuyển hiêu quả DNA tới nhân lại là một quá trình khác, đó cũng là một vấn đề cần phải nghiên cứu. 3.4 Các chiến lược tạo NST nhân tạo ĐVCV (MAC) Một câu hỏi đặt ra là còn bao xa nữa thì chúng ta sẽ tạo được một NSTNTĐVCV (MAC) ? Mặc dù chưa thật sự có MAC, nhưng đã có những tiến bộ đạt được trong việc tạo ra các đặc tính của nhiều yếu tố chức năng. Những tiến bộ này đạt được cả trong thao tác các NST người đang tồn tại (gọi là các tiếp cận từ trên xuống: Top-down) và cả việc lắp ráp các thành phần khác nhau (cách tiếp cận từ dưới lên: Bottom-up). 3.4.1 Cách tiếp cận từ trên xuống (top-down) Sự phân cắt bằng cảm ứng bức xạ tạo ra các NST nhỏ đã được sử dụng để nghiên cứu những yêu cầu về DNA với chức năng của tâm động trong nấm men và ruồi giấm (Murphy và Karpen, 1995; Niwa và cộng sự., 1986; Sun và cộng sự., 1997). NST tế bào động vật có vú được cắt nhỏ bằng cảm ứng và các NST bị cắt xén sẽ được hồi phục lại về dạng bán trật tự (semi-orderly) thông qua việc đưa vào các đoạn ngắn trình tự lặp (TTAGGG)n của telomere động vật có xương sống (Barnett và cộng sự., 1993; Farr và cộng sự., 1991; Hanish và cộng sự., 1994). DNA telomere vì thế có thể được sử dụng như một công cụ giải phẫu NST ĐVCV và công việc ở đây là tập trung vào việc phân lập DNA tâm động người trên các NST nhỏ đang sao chép. Lợi thế của cách tiếp cận này là không đòi hỏi trước tiên phải am hiểu kỹ lưỡng cấu trúc của NST ĐVCV và tránh được các yếu tố của NSTĐVCV vẫn còn chức năng khi được đưa vào các ĐVCV như DNA trần hay chất nhiễm sắc của nấm men. Bất lợi chính là thao tác NST trong các ĐVCV là kém hiệu quả. Một giới hạn nữa là những hậu quả của việc tạo nên các cấu trúc không ổn định trong phân bào có tơ có thể không được tái hồi phục. Nhìn chung, chiến lược này là việc thao tác một NST không thiết yếu vẫn tồn tại trong lai tạo tế bào soma thông qua việc sử dụng DNA telomere đã phân dòng cùng với các thành phần hóa sinh để phân lập các yếu tố có liên quan tới NST nghiên cứu. 36 Năm 1992 Farr và cộng sự đã mô tả việc tạo ra dòng tế bào nguyên bào sợi chuột bạch Trung Hoa mang phiên bản đã cắt xén của NST người, trong đó toàn bộ cánh tay dài đã được loại bỏ. Nhiễm sắc thể này được thiết lập bằng cách hợp nhất cấu trúc telomere vào trong vệ tinh alpha (alpha sattelite array) và telomere mới được nuôi dưỡng ở đây. Để làm ổn định sự hợp nhất phải loại mất 750 kbp DNA vệ tinh alpha, rõ ràng là đã loại đi khoảng ~ 2.5 Mbp có chức năng phân bào. Điều này phù hợp với sự mô tả rằng thể biến dị nảy sinh một cách tự nhiên muốn có sự ổn định về mặt phân bào phải loại đi rất nhiều DNA vệ tinh alpha (Wevrick và cộng sự., 1990). Tuy nhiên không thấy điều hòa xuống sự biểu hiện gen thông qua hiệu ứng vị trí (Bayne và cộng sự., 1994). Điều này chứng minh rằng sự gần gũi vật lý của các dấu chuẩn chọn lọc ngoại sinh (exogenous selectable marker) và sự cần thiết của các yếu tố NST chức năng không phải là một đặc trưng cho sự giới hạn của hệ thống. Vậy các gen và promoter khác có áp dụng giống như thế hay không thì còn phải xem xét sau. Mới gần đây, một NST tương tự đã được ráp nối thành một NST cuả người dạng thẳng và nhỏ, kích cỡ < 10 Mbp, trong đó tâm động được xếp dọc sườn 2 cấu trúc telomere đã được cài vào. Nhiễm sắc thể nhỏ này ổn định về phân bào vì toàn bộ nhiễm sắc thể X đã được chuyển vào (Far và cộng sự., 1995). Một phiên bản cải tiến của của chiến lược này đã được sử dụng để cắt cả cánh tay ngắn và cánh tay dài nhiễm sắc thể Y của người nhờ sự hướng đích của DNA telomere tới DNA vệ tinh alpha ở tâm động nhiễm sắc thể Y (Brown và cộng sự., 1994). Rất nhiều thông tin về trình tự của tâm động người thu thập được từ những phân tích về sự nảy sinh tự nhiên của nhiễm sắc thể Y đã được sắp xếp lại. Rõ ràng là, những trình tự cần thiết cho chức năng của tâm động Y có thể định vị ở khu vực chứa khoảng ~ 200 kbp vệ tinh alpha và 300 kbp trình tự cánh tay ngắn giáp ranh (Tyler-Smith và cộng sự., 1993) – một kết luận được rút ra từ sự giải phẫu tâm động Y. Các nghiên cứu trên các tế bào nhân chuẩn khác (Schizosaccharomyces pome và Drosophila melanogaster) cũng chứng minh rằng cần phải có các trình tự DNA nằm bên sườn các NST nhỏ để phân ly phân bào hoàn toàn (Braun và cộng sự., 1994; Murphy và Karpen, 1995). Mới gần đây, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Oxford đã thao tác nhiễm sắc thể Y có kích cỡ khoảng 9 Mbp – 3 Mbp. Các nhiễm sắc thể nhỏ hơn từ Yq và DNA vệ tinh alpha của chúng đã được sắp xếp lại rất nhiều. Một nhiễm sắc thể nhỏ chừng 4 Mbp thể hiện ổn định về mặt phân bào trong vài tháng ở các tế bào CHO, trong khi đó một NST nhỏ hơn (2,5 Mbp) lại có những tín hiệu cho thấy không được ổn định (Brown và cộng sự., 1996; Heller và cộng sư., 1996). Khi đưa các tế bào gốc phôi chuột vào các NST nhỏ của người (từ 4-15 Mbp) thì thấy có sự sắp xếp lại hoặc phân ly lầm lạc và nó sẽ mất đi một cách không chọn lọc (Shen và cộng sự., 1997; Loupart và cộng sự., 1988). Lý do sự phân ly nghèo nàn này vẫn chưa rõ, nhưng có khả năng là trong các dòng tế bào thiết lập thì việc kiểm soát chức năng của tâm động dễ hơn và sự phân ly NST cũng cao hơn các tế bào phôi. Rõ ràng là tính ổn định về phân bào của bất kỳ NST nào trong các tế bào sơ cấp bình thường cũng khác với các dòng tế bào được thiết lập bằng nuôi cấy mô, đó là một khía cạnh đặc biệt cần phải lưu ý. Hiện nay các nhà di truyền học ĐVCV đang nghiên cứu cách vận hành của NST trong các tế bào sống. Tuy nhiên vẫn còn phải đầu tư nhiều thời gian nữa mới đi đến những kết quả đột phá. Một phương pháp thâu tóm được các khía cạnh hạn chế của thao tác NST trong các dòng tế bào ĐVCV thiết lập đó là việc sử dụng virus gây bệnh bạch cầu của chim (avian leukosis virus – ALV) để cảm ứng dòng tế bào DT40 u lympho tế bào B. DT40 khác với các tế bào ĐVCXS là nó biểu lộ rất cao tái tổ hợp tương đồng (Buerstedde và Takeda, 1991). Hiệu 37 ứng đích ở DT40 đạt 10- 100% và cao hơn các tế bào ĐVCV. Bằng việc chuyển NST ĐVCV vào trong DT40 người ta có thể thao tác được hệ thống đích (Dieken và Fournier, 1996; Dieken và cộng sự., 1996). Khi phân đoạn NST đích người ta đã được một NST nhỏ cơ sở nhiễm sắc thể X của người ~2,5 Mbp, ổn định trong các tế bào DT40 trong vài tháng (Mills và cộng sự., 1999). Các NST nhỏ sau đó có thể được đưa trở lại các dòng tế bào ĐVCV để kiểm tra hiệu ứng của các cải biến đối với tính ổn định phân bào. Áp dụng chiến lược này, người ta có thể cải tiến xa nữa các NST nhỏ trong DT40 mà không cần phải lắp ráp thêm một MAC từ các cấu trúc đã phân dòng. Dựa trên các nhận thức từ các dòng tương tự, một nhóm nghiên cứu đã xác định được các NST dot nảy sinh một cách tự nhiên có thể là cơ sở cho các thao tác xa hơn. Mặc dầu một số dấu chuẩn NST đã được mô tả trong các tài liệu, nhưng việc phân tích chúng thường không phải ở mức di truyền tế bào, với các thông tin thiếu xác thực về tính ổn định phân bào và kích thước của các cấu trúc cũng chưa chính xác. Gần đây, một nhóm các nhà nghiên cứu Italia đã mô tả một dấu chuẩn từ NST 9 của người. Nhiễm sắc thể này đã được vận chuyển bằng MMCT vào một dòng tế bào loài gặm nhấm. Nhiễm sắc thể này được xác định có kích cỡ 5-10Mbp (Raimondi và cộng sự., 1995). Những khó khăn chính của cách tiếp cận này là, thứ nhất – cần phải xác định được nguồn gốc các trình tự DNA có mặt ở dấu chuẩn mà thực tế nó có thể đã trải qua nhiều lần sắp xếp lại trong quá trình tiến hóa. Thứ hai là cần phải xác định được kích cỡ và bản chất của NST ( dạng thẳng hay dạng vòng…) 3.4.2 Cách tiếp cận từ dưới lên (bottom-up) Cách tiếp cận từ dưới lên dùng để thiết kế YAC vì yếu tố này đảm nhiệm một chức năng đặc biệt mà người ta đã biết rõ và đã phân lập được (Hahnenberger và cộng sự., 1989; Muray và Szostak, 1983). Tuy nhiên, ở ĐVCV thì cho tới nay chỉ có tâm động mới xác định được ở mức DNA. Người ta có thể đặt một đoạn ngắn ( khoảng vài trăm cặp base) các đoạn lặp [ TTAGGG]n của tâm động ĐVCXS vào trong vec tơ, chúng sẽ “gieo” thông tin cho các NST mới và cuối cùng là đưa nó vào các dòng tế bào thiết lập (Barnett và cộng sự., 1993; Farr và cộng sự., 1991; Hanish và cộng sự., 1994; Tay lor và cộng sự., 1994). Vậy như thế đã đủ để tạo được chức năng của tâm động trong các tế bào sơ cấp hay chưa? Điều đó vẫn còn phải kiểm định lại. Mặc dầu có vẻ như là các gốc sao chép (origin of replication) thường phân bố dọc theo NST (mỗi gốc chừng 50-300 kbp). Những đòi hỏi về trình tự chính xác của DNA các gốc sao chép ĐVCV (nếu tồn tại), hoặc ở thời điểm như thế nào thì sự khởi đầu sao chép DNA sẽ bị ảnh hưởng bởi các locus của NST bên cạnh, tất cả những cái đó đều chưa xác định được một cách rõ ràng. Và cũng giống như bất kỳ đoạn DNA nào của ĐVCV với kích cỡ > 100kbp thì cũng có khả năng sao chép được trong NST (Calos, 1996; Coverley và Laskey, 1994; Tyler-Smith và Willard, 1993). Chướng ngại lớn hơn là chúng ta chưa hiểu đầy đủ về cách bài trí của một tâm động ĐVCV loại nhỏ. Ứng cử viên sáng giá nhất cho vấn đề này là trình tự DNA giữ vai trò quan trọng cho chức năng tâm động người – đó là DNA vệ tinh alpha có ở thắt sơ cấp (primary constriction) tất cả NST người bình thường. Lượng DNA vệ tinh alpha ở vùng tâm động thay đổi rất lớn (từ 300 kbp trên một số nhiễm sắc thể Y đến nhiều Mbp ở các NST thường) (Tyler- Smith và Willard, 1993; Willard, 1990). Sự sắp xếp lại mảng vệ tinh alpha cho thấy số lượng DNA đòi hỏi cho một tâm động chức năng loại nhỏ trên thực tế là 38 tương đối ít. Chẳng hạn như, một NST nhỏ từ nhiễm sắc thể Y của người đã được tạo ra bằng thực nghiệm chỉ có 140 kbp DNA vệ tinh alpha (Brown và cộng sự., 1994; Heller và cộng sự., 1996). Một cách tiếp cận khác về tâm động là thâm chuyển DNA vệ tinh alpha vào trong các dòng tế bào ĐVCV thiết lập như các tế bào CHO, các tế bào HT1080 của người và các tế bào L của chuột (Haaf và cộng sự., 1992; Larin và cộng sự., 1994; Taylor và cộng sự., 1996). Có rất nhiều quan sát đã được báo cáo trong đó có cả các báo cáo về những yếu tố NST phụ không ổn định, tính không ổn định của NST, cấu trúc bậc hai, sự gắn kết kháng huyết thanh CREST và các cầu nối hậu kỳ (anapha). Điều đó chứng minh rằng DNA alphoid có khả năng bắt chước được ít nhất là một số đặc tính của tâm động người, nhưng chưa thực hiện được việc tạo chức năng cho cả tâm động. Tuy nhiên, mới gần đây 2 nhóm nghiên cứu đã mô tả việc kiến tạo các NST nhỏ de novo ổn định với tần số thấp trong các tế bào nuôi cấy mô (Harrington và cộng sự., 1997; Ikeno và cộng sự., 1998). Trong báo cáo thứ nhất , một đoạn DNA tổng hợp của vệ tinh alpha phân dòng từ BAC (có ở NST số 17 của người hoặc tâm động của nhiễm sắc thể Y) đã được gắn với DNA đoạn lặp của tâm động cùng với bộ phận chuyên chở gen và được thâm chuyển bằng liposome (lipofected) (không có bước gắn trước) vào trong các tế bào HT1080 của người. Điều này dẫn đến việc tạo được một số ít NST nhỏ, thẳng 6-10 Mbp, phân ly tốt và tồn taị ở dạng bản phiên mã đơn (single copy). Những phân tích chi tiết về di truyền tế bào sau này đã vạch rõ rằng trong hầu hết các trường hợp, những NST nhỏ này đều được tạo bởi DNA có nguồn gốc từ hệ gen người nhận cùng với các trình tự thâm chuyển (thường thông qua sự cắt xén trung gian tâm động). Tuy nhiên, có một trường hợp NST nhỏ này lại không chứa DNA alphoid nào ngoài DNA đã được đưa vào trong hỗn hợp thâm chuyển, điều đó chứng tỏ rằng nó có thể được tạo ra de novo. Trong báo cáo thứ hai. các YAC mang DNA vệ tinh alpha từ nhiễm sắc thể 21 của người đã được làm tái thích hợp với các đoạn lặp của tâm động ĐVCXS và dấu chuẩn chọn lọc kháng blasticidin. DNA của YAC được làm tinh khiết bằng điện di xung điện trên gel và được thâm nhiễm bằng liposome (lipofected) hoặc vi tiêm vào các tế bào HT 1080. Đã quan sát thấy một số NST nhỏ thâm chuyển (transfectant). Những NST nhỏ này có kích cỡ vài Mbp, và rõ ràng bao gồm các multimer của YAC, nhưng có cấu trúc thẳng hay vòng thì vẫn chưa rõ. Mới gần đây, dựa trên cách tiếp cận YAC để tạo NST nhân tạo người cũng đã được lặp lại bởi các tác giả khác ( Hunning và cộng sự., 1999). Với các thí nghiệm này đã chứng minh một cách chắc chắn rằng DNA vệ tinh alpha đã tạo được chức năng tâm động phân bào trong các tế bào người. Tuy nhiên, tần số các dữ kiện còn thấp và vẫn còn rất nhiều khó khăn trong việc xác định đầy đủ các thành phần của NST nhỏ, tức là vai trò của DNA vệ tinh alpha và những đòi hỏi cho một MAC. Tất cả những vấn đề đó cần phải được sáng tỏ hơn nữa. Cách tiếp cận khác là phát hiện các tâm động ĐVCV loại nhỏ mà đi tiên phong là Vos và cộng sự. Các nhà khoa học đã tận dụng khả năng của virus Epstein-Barr (EBV) mã cho protein EBNA-1 để tương tác với trình tự oriP cùng nguồn gốc nhằm giữ các DNA đã được gắn trong nhân tế bào ĐVCV. Sau khi đã thiết lập được các vòng lớn nó sẽ gắn vào oriP (kích thước 100-300 kbp) và duy trì ổn định các episome này trong các tế bào biểu hiện EBNA-1 ( Sun và cộng sự., 1994). Mới gần đây người ta đã thông báo rằng phần được cài vào người có chứa YAC được làm tái thích với trình tự oriP đã cho phép nó duy trì được trong các dòng tế bào thích ứng (Simpson và cộng sự., 1996). Theo lý thuyết, ta có thể thiết lập được một thư viện các đoạn hệ gen để làm giầu DNA vệ tinh alpha và 39 có thể kiểm tra chức năng của tâm động sau khi đã loại bỏ EBNA-1 bằng recombinase đặc hiệu vị trí (Klby và cộng sự., 1993). Thật hấp dẫn là một số NST có dấu chuẩn của người đã được thông báo là tương đối ổn định về phân bào khi thiếu DNA vệ tinh alpha. Nhưng sự kiện hiếm gặp này có thể do sự hoạt hóa tự phát các vùng ở cánh tay NST mà tạo được chức năng cho tâm động chứ không có bất kỳ thay đổi nào ở mức trình tự DNA (Choo, 1977; du Start và cộng sự., 1997). Bằng chứng về ảnh hưởng biểu sinh (epigenetic) đối với tính ổn định của tâm động nảy sinh từ các nghiên cứu trên nấm men S. pome (Steiner và Clarke., 1994) và ruồi giấm (Williams và cộng sự., 1998). 3.5 Các vấn đề thực tiễn và tồn tại Mối quan tâm nhất đối với bất kỳ cách tiếp cận nào trong việc tạo ra các NSTNTĐVCV (MAC) là liệu có thể tạo được một NST ổn định chỉ gồm domain tâm động chức năng và các gốc sao chép nằm bên sườn các tâm động mới được tạo ra? Mật độ không gian của các yếu tố NST trong một cấu trúc nhỏ như vậy có thể sẽ ảnh hưởng tới chức năng của NST. Tuy nhiên, phần DNA không ở các cánh tay NSTcó cần thiết cho các tương tác bình thường của con thoi và hiệu chỉnh sự phân ly của NST hay không thì vẫn chưa rõ. Như đã đề cập ở trên, các bằng chứng gần đây đã chứng minh rằng các protein vận động được sắp xếp dọc theo chiều dài các cánh tay NST có thể có liên quan tới sự ổn định của con thoi lưỡng cực (biopolar spindle), sự sắp đặt vị trí đặc hiệu và sự phân ly của NST. Nếu sự hiện diện của các cánh tay NST là khẩn yếu cho sự ổn định thì có thể khẳng định rằng các NST ĐVCV dạng thẳng là có kích thước nhỏ nhất. Trong các nghiên cứu trước đây trên YAC người ta đã phát hiện rằng tính ổn định và sự phân ly của NST phụ thuộc rất nhiều vào kích cỡ NST và các YAC nhỏ hơn 100 kbp vẫn chưa có tính ổn định cao (NST bình thường của S. cereviciae có kích cỡ từ 245 kbp đến 2,2 Mbp) (Murray và cộng sự., 1986). Kết hợp các cách tiếp cận từ trên xướng và từ dưới lên sẽ cho phép xác định được kích cỡ nhỏ nhất của một NST ĐVCV dạng thẳng ổn định phân bào (Brown và cộng sự., 1996; Heller và cộng sự., 1996; Masumoto và cộng sự., 1998; Mills và cộng sự., 1999). Một vec tơ MAC cơ bản phải vượt qua hai thử thách lớn trước khi được dùng trong GTL soma: Thứ nhất, MAC được sản xuất phải đủ chất lượng cho mục đích trị liệu, thứ hai là phải chuyển được tới tế bào. Như chúng ta biết, các đoạn DNA lớn rất khó điều khiển và chuyển giao ở trạng thái nguyên vẹn. Tất cả các tế bào đều phải dùng polyethylene glycol để đưa các phân tử YAC lớn, nguyên vẹn vào trong các tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên cũng chỉ có thể áp dụng được với một vài dòng tế bào của loài gặm nhấm và nó cũng không thích hợp cho sự chuyển giao MAC in vivo (Huxley và cộng sự., 1991; Larin và cộng sự., 1994). Việc chuyển NST qua trung gian vi tế bào có thể được sử dụng cho nhiều dạng tế bào ĐVCV, nhưng nói chung ít hiệu quả và cũng chỉ mới được ứng dụng in vitro. Sự đóng gói DNA của virus cũng chỉ được giới hạn với các DNA có chiều dài vài trăm kbp thì mới có thể chuyển giao được. Một số phương pháp khác hiện có lại chưa thiết lập được giới hạn trên (upper size limit), chẳng hạn như sự chuyển giao bằng đánh bom các hạt (Cheng và cộng sự., 1993), các lipid cationic và sự hấp thu qua trung gian receptor (Crisrtiano và cộng sự., 1993; Curiel. 1994; Gao và cộng sự., 1993). Một lipid cationic như lipofectin đã được dùng để chuyển giao ít nhất vài trăm kbp DNA nguyên vẹn tới các tế bào trong nuôi cấy mô, nó ít gây độc tế bào và dường như có mặt trong hầu hết các hệ thống 40 chuyển giao được áp dụng in vitro và in vivo (Caplar và cộng sự., 1995; Strauss và cộng sự., 1993; Stribbing và cộng sự., 1992; Zhu và cộng sự., 1993). Một khía cạnh phức tạp khác là với sự có mặt của lipid cationic thì không rõ MAC sẽ được chuyển giao như là một chất nhiễm sắc (chrromatin) hay là được cô lập như một DNA trần. Một thách thức nữa là chất lượng của MAC được tạo ra. Mặc dầu một số dấu chuẩn chọn lọc có thể cho phép chọn lọc được nhiều bản phiên mã tế bào thông qua việc ứng dụng các thuốc khuếch đại đặc hiệu (như locus dhfr và sự chọn lọc methotrexate). Nhưng vẫn còn khó khăn là phải tưởng tượng như thế nào về sự hiện diện của các yếu tố hay các vấn đề về giới hạn của chất liệu cũng như sự thiếu hiệu quả của các phương pháp chuyển giao… khi tiến hành thiết lập MAC. Không nghi ngờ gì nữa, các vấn đề này đòi hỏi phải có nền công nghệ hiện đại và những đột phá về nhận thức trước khi nghĩ tới việc ứng dụng MAC trong gen trị liệu soma. 3.6 Kết luận Nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú có nhiều chức năng khác nhau. Không phải là các phiên bản phân dòng hay được tổng hợp nhân tạo mà chỉ các gen có dấu chuẩn thiết yếu mới được đưa vào như một bộ phận của vec tơ. Điều lý thú là liệu các cấu trúc này được tạo ra theo cách “cắt- dán” như khi ta tạo NST nhân tạo của nấm men hay là với các thao tác phức tạp cải biến các NST nhỏ trong hệ thống tế bào ĐVCXS ? Cả hai cách tiếp cận này đều giúp chúng ta hiểu sâu hơn nữa về cấu trúc của NSTNTĐVCV và mối quan với chức năng của nó. Tuy nhiên, tất cả vẫn còn ở phía trước và cần phải đầu tư nhiều thời gian và công sức cho lĩnh vực khoa học hấp dẫn và đầy tính thực dụng này. Chương IV CÁC VEC TƠ RETROVIRUS 4.1.Mở đầu Virus là các ký sinh bắt buộc, chúng không tự sao chép được nếu không có sự trợ giúp của các tế bào vật chủ. Vì thế, một cách tự nhiên nó thích nghi với việc vận chuyển hiệu quả các thông tin di truyền tới các tế bào. Một số virus đã có những chiến lược khác nhau về tiến hóa để cho phép chúng đi vào được các tế bào và thông tin di truyền của chúng cũng được chuyển đi với một phạm vi nào đó. Chính vì cơ chế này mà virus có thể được sao chép và sản xuất ra các hạt virus mới hay là các virion. Về khía cạnh này, retrovirrus được đặc biệt quan tâm bởi vì mặc dù chúng mang hệ gen RNA, nhưng hệ gen này lại đòi hỏi phải được phiên thành dạng DNA sợi kép trong các tế bào bị nhiễm, sau đó nó có thể hợp nhất được trong DNA tế bào vật chủ. Khi DNA virus đã được hợp nhất tức là các provirus thì việc sao chép cũng xảy ra giống như các gen khác của tế bào và RNA đặc hiệu virus được sử dụng để tạo ra các protein virus và RNA 41 hệ gen mới, và như thế tức là các virion mới được tạo thành. Các provirus hợp nhất là một bộ phận ổn định của hệ gen tế bào, nó quyết định sự sống của tế bào và có thể di truyền lại cho các thế hệ sau. Đặc tính thứ 2 này của retrovirus biến nó trở thành một ứng cử viên lý tưởng cho việc vận chuyển gen. Nó chính là một hệ thống vec tơ có khả năng biểu hiện gen dài hạn (long-term gene expression). Hơn nữa, trên 40 năm nay người ta đã hiểu rõ các đặc tính “vec tơ thân thiện” (vector friendly) của retrovirrus qua các nghiên cứu so sánh với các virus khác. Các đặc tính sinh học của các virus này cũng như sự tương tác của chúng với các tế bào vật chủ cũng được hiểu rất rõ. Người ta đã nhận ra rất sớm rằng những virus này có thể vận chuyển được các gen tế bào (Stehelin và cộng sự., 1976) và nó là một hệ thống vec tơ virus đầu tiên đã được sử dụng. Mặc dù hệ thống vec tơ này rất đơn giản, chỉ là một dạng virus hoang dã được dùng để chuyển hệ gen tái tổ hợp có mang dấu chuẩn gen (Shimotohno và Temin, 1982; Tabin và cộng sự., 1982). Các hệ thống này đã được nâng cấp và cuối cùng đã tạo được một vec tơ hoàn thiện. Trước khi thảo luận về hệ thống vec tơ này chúng ta hãy lướt qua đôi nét về chu kỳ sao chép của retrovirrus cũng như các khía cạnh về vec tơ retrovirus như thế nào. 4.2. Chu kỳ (vòng) sao chép của retrovirrus Chu kỳ sống của retrovirrus được tóm tắt trong Hình 4.1 4.2.1 Những dữ kiện kinh điển Retrovirrus là các hạt virus có vỏ bọc mang 2 bản phiên mã đồng nhất của hệ gen RNA chuỗi đơn (Varmus và Brown, 1989). Phần protein lớp vỏ ngoài cùng của virus (protein bề mặt hay là protein SU) gắn đặc hiệu với các receptor ở màng tương bào tế bào đích, làm cho virus thâm nhập được vào tế bào (Hình 4.1). Sau khi lột bỏ lớp vỏ chỉ còn lại phần capsid phía bên trong thì RNA hệ gen virus ở capsid chuyển thành dạng DNA chuỗi kép nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase-RT) gắn với capsid. Quá trình này khởi đầu bằng việc sử dụng chất mồi tRNA có trong capsid gắn đặc hiệu với RNA hệ gen retrovirrus. Khi sao chép ngược, các trình tự độc quyền ở các đuôi của RNA hệ gen virus được nhân đôi và cả 2 đuôi đều là DNA được tổng hợp mới, vì thế tạo nên một trình tự lặp tương đối dài ở các đuôi của phân tử DNA vì thế có tên là đoạn lặp tận dài (long terminal repeat - LTR). Bản phiên mã DNA chuỗi kép này đặt cạnh các LTR, sau đó được chuyển vị để vào bên trong nhân (Hình 4.1). 4.2.2 Sự hợp nhất của DNA virus vào trong DNA hệ gen tế bào chủ 42 Hình 4.1 Chu kỳ sao chép của retrovirus. Retrovirus là các virus có vỏ bọc mang 2 bản phiên mã đồng nhất của RNA hệ gen. Để gây nhiễm cho tế bào, protein SU vỏ virus tương tác với tế bào mã cho receptor bộc lộ trên bề mặt tế bào. Sự tương tác này dẫn đến sự “hòa nhập” của các hạt virus và làm mất đi lớp vỏ do sự hòa màng. RNA hệ gen virus được sử dụng như một khuôn sản xuất ra phân tử DNA chuỗi kép nhờ enzyme phiên mã ngược có ở phần lõi (hình phía trên). Trong quá trình này, các trình tự ở các đuôi của hệ gen virus được nhân đôi và định vị. Phức hợp này sau đó định vị vào nhân, ở đó phân tử DNA chuỗi kép được cài vào DNA hệ gen tế bào vật chủ nhờ enzyme integrase (hình phía dưới). Dạng DNA hợp nhất của hệ gen virus chính là provirus, sau này nó cũng sao chép giống như bất kỳ gen nào của tế bào nhờ cơ chế phiên mã của tế bào chủ với promoter virus. RNA virus được phiên mã mới dùng để tổng hợp protein cho các virus mới cũng như RNA hệ gen của các hạt virus. Protein virus và RNA được lắp ráp trong phần lõi hoặc capsid mới, nó tương tác với màng tế bào vật chủ nơi có chứa các protein vỏ virus mới được tổng hợp và tạo mới các hạt virus rồi ra khỏi tế bào thâm nhiễm, trải qua giai đoạn cuối cùng của sự đột biến để tạo nên dạng đầy đủ của hạt virus thâm nhiễm. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). Sau khi tới nhân, dạng DNA chuỗi kép được hợp nhất với DNA nhiễm sắc thể tế bào vật chủ bởi enzyme integase (IN) gắn virus (Hình 4.1). Dạng DNA hợp nhát này có tên là provirus. Sự hợp nhất của provirus là sự cần thiết ngẫu nhiên đối với DNA nhiễm sắc thể tế bào chủ mặc dù có thể có sự thiên lệch nào đó ở những vùng có sự sao chép tích cực. Có 2 đặc trưng chính của sự hợp nhất retrovirus thích hợp cho gen trị liệu. Thứ nhất, provirus luôn được thấy như là các DNA đồng tuyến tính với các gen cấu trúc LTR-gen retrovirus- LTR (structure LTR-retrovirus genes-LTR). Điều này rất trái ngược với các DNA hợp nhất khác do sự thâm nhiễm với các virus khác hoặc do sự truyền DNA trần mà ở đó 43 DNA đã được vận chuyển ở dạng hoán vị. Thứ hai, provirus được di truyền một cách ổn định vì tất cả các hậu thế của một tế bào thâm nhiễm gốc đều như thể là một gen tế bào bình thường mà chẳng có hiệu ứng loại trừ nào cả. Điều này trái ngược với các virus khác như adenovirus hay pox-virus. Các virus này không hợp nhất các thông tin di truyền của chúng và giết chết các tế bào bị thâm nhiễm. Sự thâm nhiễm retrovirus ở động vật thường đi cùng với sự cảm ứng gây khối u, như bệnh bạch cầu (leukaemias). Đây là kết quả của sự kiện hợp nhất được nhân lên dần dần dẫn tới sự hợp nhất ở bên trong hoặc ở vùng lân cận của các gen tế bào liên quan tới sự kiểm soát sinh trưởng (gen tiền ung thư hay gen ức chế khối u – proto –oncogene or tumour suppressorgene) do vậy dẫn đến việc làm mất chức năng, một quá trình được coi là đột biến điểm. Quá trình này đòi hỏi virus phải có khả năng nhân lên sự hợp nhất, tức là sao chép tích cực (replication –competent). Các vec tơ retrovirus khiếm khuyết về sao chép (xem dưới đây) chỉ hợp nhất một lần. Mà thời cơ để xảy ra sự hợp nhất retrovirus đơn trong một locus gen như thế thì cực kỳ thấp. Khi một gen tế bào đã bị tác động bởi sự hợp nhất retrovirus thì những tổn thương di truyền khác cũng chỉ có thể xảy ra khi các tế bào đã bị chuyển thành ác tính. Không có bằng chứng về sự hợp nhất retrovirus gây nên khối u ở người. Tuy nhiên, điều bắt buộc là không thể cho một virus sao chép cao nào có mặt trong các vec tơ retrovirus được dùng trong lâm sàng. 4.2.3 Sự sao chép, phiên dịch và lắp ráp Sự sao chép của provirus đã hợp nhất được hướng bởi promoter virus và các yếu tố kích thích (enhancer element) định vị ở 5’ LTR (bên trái) và 3’LTR (bên phải). Retrovirus mang 3 gen chính mã cho protein lõi virus (gen gag) tạo nên cấu trúc bên trong của virus, enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), integrase (gen pol) và protein vỏ virus (gen env). Bản phiên mã đoạn hệ gen (genomic) sơ cấp mang tất cả các thông tin di truyền của virus và được sử dụng như hệ gen của các virion mới và cũng được dùng để tổng hợp các protein Gag và Pol. Bản phiên mã ghép nối thứ 2 được dùng để tổng hợp các protein Env của virus. Một số retrovirus mà đãng chú ý là lentivirus như HIV lại tạo ra các bản phiên mã ghép nối khác dùng để tổng hợp các protein phụ trợ điều hòa sự sản sinh virus. Các protein Gag và Pol được tổng hợp như một polyprotein tiền thân từ bản phiên mã hệ gen và sau đó được cắt bớt đi để trở thành các protein chín (mature protein). Quá trình cắt bỏ vẫn còn tiếp tục trong khi lắp ráp virus, khi đâm chồi ở các tế bào chủ và ở phần ngoài của các tế bào chủ đã chín. Các domain của các protein tiền thân tương tác đặc hiệu với RNA virus (Zhang và Barklis, 1995), chắc chắn rằng RNA virus đã được đóng gói trong các virus hậu thế. Sự tương tác này đòi hỏi một hoặc nhiều trình tự RNA, đó chính là các tín hiệu đóng gói. Trên RNA hệ gen, bắt buộc phải có (Ψ) định vị ở đoạn đầu của vùng Gag, đúng vào 3’ RNA đoạn cho ghép nối (splice donnor-SD) dùng để sản xuất RNA tiểu hệ gen (subgenomic). Khi đó chắc chắn toàn bộ đoạn RNA virus đã được đóng gói. Protein Env (SU và TM) được phiên dịch từ RNA virus tiểu hệ gen ghép nối ( splice subgenomic). Những protein này được tổng hợp như một chất tiền thân có mang một peptide tín hiệu chuyển dịch nhanh ở các amino tận cùng vì vậy nó đi vào được hệ thống màng tiết của tế bào vật chủ. Khi đi qua hệ thống màng tiết thì chất tiền thân này được cải biến với các bước glycosyl hóa và cuối cùng thành các protein SU và TM chín nhờ 44 protease tế bào. Tuy nhiên, các protein này vẫn còn gắn với nhau bởi cầu disulphide và cuối cùng tới màng sinh chất tế bào vật chủ. Bước cuối cùng của sự hợp nhất và giải phóng virion hậu thế sẽ xảy ra ở màng tế bào. Ở đó các protein Gag gắn với RNA hệ gen retrovirus , với RT virus và enzyme IN để tạo thành các cấu trúc capsid (Hình 4.1). Capsid này nẩy chồi qua màng tế bào ở vùng tập trung nhiều protein Env trong virus. Các virion mới được giải phóng sẽ phải trải qua các bước đột biến xa hơn nữa với việc thay đổi cấu trúc protein cũng như tổ chức lại các protein virus ở phần lõi để được các virion hậu thế gây nhiễm chót. Cũng cần phải nhấn mạnh rằng, đối với hầu hết các retrovirus, toàn bộ quá trình thâm nhiễm và sản sinh virus không làm tổn thương tới sự sản sinh của tế bào vật chủ. 4.3 Phát triển các vec tơ retrovirus Hệ thống vec tơ retrovirus đầu tiên từ virus gây bệnh bạch cầu ở chuột (murine leukaemia virus-MLV) đã và đang được sử dụng trong các tiến trình lâm sàng. Có nhiều lý do để lựa chọn MLV làm hệ thống vận chuyển gen: (i) các đặc tính sinh học của retrovirus đã được hiểu rất rõ, (ii) hệ gen MLV là một trong những hệ gen retrovirus được tách dòng phân tử sớm nhất và (iii) những virus này có khả năng thâm nhiễm tốt các tế bào. Vì MLV chỉ có khả năng thâm nhiễm các tế bào loài gặm nhấm nên gọi là ecotropic. Các protein SU của ecotropic tương tác với một amino acid của một protein vận chuyển có ở màng sinh chất của các tế bào đích (Kim và cộng sự., 1991; Wang và cộng sự., 1991). Tuy nhiên, chức năng này không thể hiện được trên các tế bào của người, vì thế MLV ecotropic không có khả năng thâm nhiễm các tế bào người trừ phi nó đã được công nghệ hóa. Một MLV khác lại có khả năng thâm nhiễm nhiều loại tế bào kể cả người và gặm nhấm. Protein SU của virus lưỡng tính (amphotropic) này tương tác với một protein vận chuyển phosphate của tế bào (Miller và Miller, 1994; van Zeijl và cộng sự., 1994). Các MLV lưỡng tính đang được sử dụng nhiều trong các tiến trình gen trị liệu (GTL). Vỏ của virus gây bệnh bạch cầu trên vượn (gibbon ape leukaemia virus –GaLV) cũng được sử dụng bởi vì vỏ GaLV mang các vec tơ retrovirus rất thuận lợi cho việc chuyển gen tế bào máu (Bunnell và cộng sự., 1995). 4.3.1 Nguyên lý Các hệ vec tơ retrovirus bao gồm 2 thành phần: (i) một cấu trúc vec tơ mang các gen được chuyển giao và hệ gen cho virus tái tô hợp và (ii) một dòng tế bào cung cấp các protein virus cần thiết cho việc sản xuất virus tái tổ hợp, đó chính là các tế bào đóng gói (Hình 4.2). Nguyên nhân xuất hiện hệ thống 2 thành phần này là do có sự cài thêm các thông tin di truyền vào trong hệ gen MLV. Điều đó gây bất lợi cho việc sản xuất virus vì nó đã loại bỏ trình tự mã hóa gen cấu trúc và bắt buộc phải cung cấp các protein in trans này từ các tế bào đóng gói. Mặc dù có khả năng tạo được các vec tơ retrovirus một thành phần có khả năng sao chép cao (one-component replication-competent retrovirus vectors) chẳng hạn như HIV hay virus gây ung thư Rous (Rous sarcoma virus), nhưng dường như nó không giống như cách nhìn nhận trên mà lại liên quan tới một quá trình đột biến gây ra bởi trung gian retrovirus. 45 Hình 4.2 Nguyên lý sản xuất vec tơ retrovirus. Vec tơ này gồm có một provirus mang gen, chẳng hạn như một gen trị liệu (TG), thay cho thông tin di truyền của virus. Gen này được đưa vào dưới sự kiểm soát của phiên mã chẳng hạn như promoter virus được định vị ở đoạn lặp tận dài (long terminal repeat –LTR). Vec tơ được đưa vào một dòng tế bào (dòng tế bào đóng gói) có mang retrovirus đã được cải biến . Provirus này sẽ tạo ra protein virus mà vec tơ không tạo ra được bởi vì nó không có tín hiệu đóng gói thích ứng (Ψ- ). Cấu trúc của vec tơ này có mang tín hiệu đóng gói Ψ và vì vậy RNA được phiên mã từ cấu trúc này dễ dàng cài được vào các hạt virus mới được tạo thành (luôn luôn được giải phóng từ các tế bào đóng gói). Các hạt virus có mang hệ gen vec tơ sau đó được dùng để thâm nhiễm tế bào đích, hướng dẫn sự phiên mã ngược và rốt cuộc hợp nhất với hệ gen vec tơ có mang gen trị liệu (TG). Gen này sẽ được biểu hiện tạo ra protein trị liệu trong tế bào đích. Không có virus nào nữa được tạo thành bởi vì protein cấu trúc của virus không có ở trong các tế bào này. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). Để tạo ra các virion vec tơ retrovirus người ta phải thiết lập một vec tơ có mang các gen để vận chuyển, chúng được đưa vào các dòng tế bào đóng gói retrovirus bằng phương pháp vật lý (chẳng hạn như sự chuyển nhiễm (transfection) hay electroporation). Các tế bào đóng gói này sản xuất các protein cấu trúc virus (Gag và Env) và các enzyme (pol encoded RT, IN), nhưng chúng không đóng gói được RNA virus mã cho các protein này vì vùng Ψ cần cho capsid hóa (encapsidation) đã bị loại bỏ. Thay vào đó các protein làm nhiệm vụ nhận biết và gắn với RNA đoạn hệ gen từ các vec tơ được cài vào lại mang một vùng Ψ nguyên bản, do đó có thể tạo nên các hạt virus tái tổ hợp. Các hạt virus tái tổ hợp có mang hệ gen vec tơ retrovirus đâm chồi ra khỏi các tế bào đóng gói để vào môi trường 46 nuôi cấy tế bào. Môi trường chứa virus có thể được lọc trực tiếp để loại bỏ các tế bào và các mảnh vỡ của tế bào rồi dùng để thâm nhiễm cho các tế bào đích, hoặc virus sẽ được làm tinh khiết và cô đặc lại trước khi thâm nhiễm các tế bào đích. Sau khi virus đã gắn vào các receptor trên bề mặt tế bào thì capsid của virus sẽ được chuyển vào bên trong tế bào và RNA virus được phiên mã ngược thành DNA để hợp nhất vào DNA tế bào vật chủ. DNA virus đã hợp nhất (provirus) có chức năng như bất kỳ một gen nào khác của tế bào và nó chỉ đạo việc tổng hợp các sản phẩm của các gen đã được chuyển vào. Tuy nhiên, không giống như trường hợp virus hoang dã bình thường có khả năng sao chép cao (đã được trình bày ở Hình 4.2), không có virus thâm nhiễm nào lại có thể được sản xuất bởi các tế bào đã bị thâm nhiễm vì thông tin di truyền mã cho protein virus không có trong các tế bào này (Hình 4.2) Vấn đề mấu chốt với hệ vec tơ retrovirus 2 thành phần chính là hệ quả của một hiện tượng xảy ra một cách tự nhiên đó là sự tái tổ hợp xảy ra ở cùng vị trí (homologous). Nếu provirus vec tơ và provirus cung cấp các protein cấu trúc có trong sự tổ hợp các tế bào đóng gói thì có thể làm tăng khả năng của các virus sao chép cao (Hình 4.3; Miller và Buttimore, 1986; Muenchau và cộng sự ., 1990). Virus này chính là các retrovirus dạng hoang dã không mang các gen vận chuyển. Các virus sao chép cao thâm nhiễm nhanh chóng nhiều tế bào và có thể gây nên các trường hợp đột biến. Vì vậy nỗ lực lớn trong việc tạo ra mẫu hệ thống đóng gói tuyệt hảo là giảm thiểu khả năng xảy ra tái tổ hợp, cải tiến nâng cấp các vec tơ cũng như nâng cao tính an toàn của chúng bằng cách ngăn chặn sự sao chép ngay cả khi xảy ra sự tái tổ hợp. 4.3.2 Những bước cải tiến Cải tiến nâng cấp các tế bào đóng gói liên quan tới việc loại bỏ càng nhiều càng tốt các thông tin di truyền của retrovirus để giảm thiểu khả năng xảy ra tái tổ hợp tương đồng (Hình 4.4). Promoter và các trình tự kết thúc của retrovirus sẽ được thay thế bằng các promoter và các trình tự kết thúc tương đồng. Điều đó sẽ làm tăng hoạt tính của các promoter và sự sản xuất protein virus sẽ được tăng cường. Mã thông tin cho các protein có thể không cần phải loại trừ vì những protein này có thể được tổng hợp từ các cấu trúc tách biệt để thực hiện sự tái tổ hợp nhằm kiến tạo lại retrovirus có khả năng sao chép cao hoàn thiện. Thành quả này là do sự biểu hiện protein Gag và Pol từ một cấu trúc còn protein Env từ một cấu trúc thứ 2 (Markowitz và cộng sự., 1988). Để nâng cấp các tế bào đóng gói, các cấu trúc vec tơ retrovirus an toàn hơn sẽ được cài thêm một mã kết thúc nhân tạo ở khung đọc Gag. Điều này đảm bảo rằng nếu như virus sao chép cao có được sản sinh thì cũng không có khả năng biểu hiện các protein Gag và Pol và như vậy việc lắp ráp và tháo dỡ virus sẽ bị ức chế (Bender và cộng sự., 1991; Morgenstern và Land,1990; Scarpa và cộng sự., 1991). Một chiến lược khác tạo ra cơ chế tự phục hồi nhằm phòng ngừa nguy cơ thâm nhiễm của virus có khả năng sao chép cao chắc chắn là phải loại trừ các trình tự đóng gói. Phần lớn provirus vec tơ trong các tế bào đã bị thâm nhiễm với các vec tơ như thế thì đã loại trừ hết các trình tự đóng gói, có lẽ là do sự chuyển đổi khuôn mẫu trong khi phiên mã ngược (Julias và cộng sự., 1995) 47 Hình 4.3 Sự sản sinh cácvirus (hoang dã) sao chép cao theo phương pháp tái tổ hợp. Hệ thống vec tơ retrovirus khởi đầu này thường gây nhiễm bẩn rất nhanh bởi vì virus sao chép cao có ít nhất là một sự kiện tái tổ hợp tương đồng (dấu chấm) xảy ra giữa cấu trúc vec tơ và cấu trúc đóng gói trong tế bào đóng gói. Khả năng này phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa 2 cấu trúc này. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). Hệ thống Cre/lox P recombinase cũng hợp nhất với vec tơ virus và được sử dụng để cắt bớt một cách đặc hiệu các trình tự vec tơ trong các tế bào đích đã bị thâm nhiễm (Cholika và cộng sự., 1996; Russ và cộng sự., 1996). Các vec tơ cũng được thiết kế có mang vị trí gắn primer nhân tạo cải tiến (primer binding site) (Lund và cộng sự., 1997). Thông thường thì tRNA tế bào gắn vào RNA hệ gen và được sử dụng như một primer cho sự khởi đầu phiên mã ngược. Trong việc tổ hợp với các tế bào đóng gói cũng cần phải có tRNA nhân tạo. Tuy nhiên, bất kỳ một virus sao chép cao nào được sản xuất từ hệ thống này do sự tái tổ hợp tương đồng thì cũng không có khả năng sao chép trong các tế bào đã từng bị thâm nhiễm vì các tế bào thâm nhiễm thì không tổng hợp được tRNA nhân tạo mong muốn (Lund và cộng sự., 1997) 48 Hình 4.4 Cải tiến hệ thống vec tơ retrovirus. Để giảm bớt khả năng tái tổ hợp tương đồng dẫn đến việc hình thành retrovirus sao chép cao, hệ thống phải được thiết kế sao cho chỉ các trình tự virus thiết yếu nhất mới được tồn tại trong vec tơ cùng các cấu trúc đóng gói. Các promoter dị loại và các tín hiệu kết thúc đã tạo thuận lợi cho công việc này. Hơn nữa, với các hệ thống gồm 3 thành phần như thế, trong 2 cẩu trúc độc lập thì một biểu hiện các sản phẩm của gen Gag (g) và gen Pol (p) còn cấu trúc thứ hai biểu hiện protein Env (e). Để tạo ra các virus sao chép cao đòi hỏi ít nhất là có 3 sự cố tái tổ hợp xảy ra giữa vec tơ và các cấu trúc đóng gói. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 4.4 Đích thâm nhiễm Các receptor với SU (và GalV) lưỡng tính được biểu hiện ở nhiều dạng tế bào vì thế chúng ta cần phải thảo luận về phổ thâm nhiễm hỗn tạp trên các vec tơ retrovirus cơ sở MLV. Vì lý do về an toàn và hiệu lực nên người ta thường làm thay đổi hướng hoặc làm giới hạn lại phổ thâm nhiễm của các vec tơ retrovirus sao cho chỉ các tế bào đích mới bị thâm nhiễm. Để đáp ứng đòi hỏi này người ta phải cải tiến hoặc làm thay đổi protein vỏ MLV để cho chúng tương tác được nhiều hơn với các receptor tế bào riêng biệt. Có nhiều chiến lược đã được thực hiện nhằm đạt được mục tiêu này (Salmons và Günzber, 1993). Nhiều công trình nghiên cứu về các vec tơ MLV cải tiến đã xác định được đích của sự thâm nhiễm vì các retrovirus này không thể thâm nhiễm một cách bình thường các tế bào người hay các tế bào khác không phải là chuột. Để nghiên cứu đích thâm nhiễm, người ta sử dụng kháng thể kháng trực tiếp các protein biểu lộ trên bề mặt tế bào đích, chúng được gắn qua streptavidin tới các kháng thể đặc hiệu cho protein Env. Hệ thống kháng thể này kháng trực tiếp lớp I và II hệ thống hòa hợp tổ vhức chính (Roux và cộng sự., 1989) hoặc kháng lại receptor của các yếu tố tăng trưởng bì (epidermal growth factor) (Etienne- Julan và cộng sự., 1992). Qua hệ thống này người ta thấy đích của sự thâm nhiễm nằm trên bề mặt các tế bào biểu lộ các phân tử protein, nhưng hiệu lực còn thấp. Một trở ngại khác nữa là không phải tất cả các receptor đều thích hợp đối với virus hoặc có thể vẫn còn tác dụng ở các bước sau trong chu kỳ sống của virus (Goud và cộng sự., 1988). Mấy năm trước đây, chiến lược phổ biến nhất đối với việc cải tiến nâng cấp phổ thâm nhiễm các vec tơ retrovirus là công nghệ hóa gen env của virus trong các tế bào đóng gói retrovirus. Điều này đã tạo thuận lợi cho việc xác định các vùng của protein SU Env có liên quan tới sự nhận dạng receptor (Battini và cộng sự., 1992, 1995; Morgan và cộng 49 sự., 1993; Ott và Rein, 1992). Những vùng này được thay thế bằng các đoạn gen mã cho các epitope có thể nhận dạng được các receptor khác như erythropoeitin (Kasahara và cộng sự., 1994) hay heregulin (Han và cộng sự., 1995), do vậy nó cho phép kiểm soát một cách chọn lọc đích receptor của protein Env chimeric. Cuối cùng, các ligand đích đã được cài vào đầu tận amino của các protein nằm giữa amino acid 6 và 7 (Cosset và cộng sự., 1995; Marin và cộng sự ., 1996; Russell và cộng sự ., 1993). Theo hướng này, protein ligand – Env sẽ được sản xuất trong các tế bào đóng gói còn các protein vỏ retrovirus không bị cải cải biến sẽ giữ vai trò làm ổn định, bởi vì các protein Env là các trimer trên bề mặt virus. Các domain đã biến đổi của các kháng thể chuỗi đơn đặc hiệu cho một receptor xác định (protein bề mặt tế bào) cũng là đích thâm nhiễm của các vec tơ retrovirus (Chu và Dornburg,1995; Marin và cộng sự., 1996; Russel và cộng sự., 1993; Somia và cộng sự., 1995). Mặc dù đích thâm nhiễm của retrovirus mà phần protein lớp vỏ được cải biến đã thu được thắng lợi nhưng độ chuẩn vẫn còn giảm, lý do có lẽ giống như các vấn đề mà chúng ta đã đề cập ở trên. Những thao tác như vậy với protein SU virus cũng làm giới hạn giá trị sử dụng bởi vì sự tổng hợp cũng như xử lý tương đối phức tạp protein này phải đảm bảo cả về chức năng cũng như khả năng hợp nhất các hạt virus tổng hợp mới. Những đòi hỏi này bắt buộc phải thay thế hoặc cải tiến bởi vì cấu hình của các domain phải thật phù hợp. Rõ ràng là cần phải hiểu rõ hơn nữa về cơ chế điều khiển các chức năng bình thường của protein vỏ virus trước khi thiết lập lớp vỏ theo phương pháp hóa học thì mới có thể làm cho các protein này nhận dạng được các receptor và khởi đầu sự thâm nhiễm một cách hiệu quả. Gần đây, Steven Russell và cộng sự (Nilson và cộng sự., 1996) đã đưa ra một chiến lược mới gồm 2 bước, hy vọng cách mạng hóa đích các vec tơ retrovirus đối với các receptor xác định. Protein vỏ virus được cải biến bằng cách thêm vào một vị trí gắn protease và chọn lọc domain ligand receptor ở đầu cuối protein SU. Sau khi gắn đúng receptor trên các tế bào đích, receptor/ligand có thể được loại trừ bởi protease (Nilson và cộng tác., 1996). Sau đó retrovirus được gắn vào các receptor thông thường cũng như trên tế bào đích. Điều đó cho phép retrovirus đi vào đựoc bên trong tế bào theo cách tự nhiên, khắc phục vấn đề thường xảy ra là retrovirus lại sử dụng các receptor không phải của retorvirus (Etienne- Julan và cộng sự., 1992). Độ chuẩn đạt tới 106 đơn vị khuẩn lạc trên một mililit môi trường nuôi cấy tế bào (106 cfu/ml colony forming units per millilitrecell culture medium) nhờ việc sử dụng domain gắn EGF như một phương tiện xác định đích trong hệ thống gồm 2 bước này (Nilson và cộng sự., 1997). Việc sử dụng phage biểu lộ các thư viện cũng rất hứa hẹn đối với việc phát hiện các ligand có lợi. Những thư viện như vậy tạo thuận lợi cho việc sàng lọc nhanh các peptide có khả năng gắn vào các receptor trên các dạng tế bào đặc biệt. Những peptide được xác định bằng hệ thống sàng lọc này có thể hợp nhất với bầt cứ hệ thống chuyển gen nào kể cả các vec tơ retrovirus để có được các đích thâm nhiễm (Barry và cộng tác., 1996). Một hệ thống tương tự như vậy cũng được sử dụng để xác định sự thâm nhiễm đích, đó là việc ngăn chặn sự xâm nhiễm retrovirus với các tế bào đích không mong muốn. Theo cách này thì đầu tận cùng của protein SU sẽ được gắn với vị trí rãnh, thêm vào đó một peptide che khuất domain gắn SU cũng như một ligand đặc hiệu cũng phải có mặt trên tất cả các tế bào không phải là đích. 4.5 Sự biểu hiện gen từ các vec tơ retrovirus 50 4.5.1 Xem xét chung Các gen dị loại được chuyển giao bằng các vec tơ retrovirus có thể được biểu hiện theo nhiều cách khác nhau (Hình 4.5). Promoter retrovirus trong LTR có thể điều khiển sự biểu hiện cúa các gen dị loại khi các gen này đã được phân dòng trong các vị trí cũ của gag . Thật vây, lợi thế này đã được tận dụng để chuyển và biểu hiện đồng thời 2 gen chẳng hạn như một gen trị liệu và một dấu chuẩn gen. Gen thứ 2 này có thể được cài vào vị trí env và được biểu hiện từ RNA virus tiểu hệ gen (subgenomic). Nhưng điều bất lợi là promoter retrovirus không có năng lực đặc biệt và nó có thể bị đóng lại hoặc bị lặn sau một thời kỳ biến đổi ở nhiều dạng tế bào (Lund và cộng sự., 1996; Xu và cộng sự., 1989) hoặc ở trong các tế bào động vật chuyển gen (Richards và Huber, 1993; Vernet và Cebrian, 1996). Các biện pháp đề phòng sự sao chép câm ở một số dạng tế bào là sự methyl hóa, biến đổi LTR cũng như làm trôi dạt các trình tự ở một số dạng tế bào (Lund và cộng sự., 1996) Hình 4.5 Sự biểu hiện các cấu hình cấu trúc vec tơ retrovirus. Các gen trị liệu (TG) có thể được biểu hiện theo nhiều cách từ cấu trúc vec tơ. Ở (a) và (b) TG được biểu hiện trực tiếp từ promoter retroivirus như một bản phiên mã dài hệ gen – genomic length transcript- (a) hoặc như một bản phiên mã ghép. Các vec tơ retrovirus có thể điều tiết một hoặc 2 gen. Việc cài một lối vào bên trong ribosome đã cho phép gen thứ 2 được biểu hiện từ cùng một RNA hệ gen như ở (b). TG cũng có thể được biểu hiện từ một promoter dị loại đã được cài vào các vec tơ retrovirus (a) , bao hàm ý nghĩa là sự định hướng antisense. Các vec tơ tự bất hoạt (self- inactivating-SIN) và sao chép kép (double copy- CD) được chỉ trên (c) và (d) có mang 3’LTR, điều đó dẫn đến làm mất promoter retrovirus (SIN) hoặc nhân đôi của hộp biểu hiện (promoter dị loại gắn với TG) trong tế bào thâm nhiễm. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 51 Sự biểu hiện của các gen chuyển bằng các vec tơ retrovirus cũng phụ thuộc vào vị trí hợp nhất trong hệ gen tế bào chủ. Sự điều hòa đặc hiệu mô từ các promoter gen dị loại có thể bị suy yếu hoặc bị lấn át bởi các yếu tố điều hòa mạnh của tế bào định vị ở vùng lân cận vị trí hợp nhất. Các vùng kiểm soát locus (locus control regions – LCR), các yếu tố điều hòa tạo nên sự biểu hiện gen ở mức cao và độc lập vị trí (Dillon và Grosveld, 1993), điều đó giúp cho các vec tơ retrovirus hoạt động được. Khối trình tự dưới lõi LCR (LCR core sub sequence) gồm 36 cặp base của gen – globin người trong vec tơ retrovirus chuyên chở gen này nhằm nâng cao sự biểu hiện của gen – globin trong các tế bào hồng cầu chuột, nhưng mức biểu hiện vẫn còn dưới mức tối ưu đối với trị liệu (Chang và cộng sự., 1992). Tuy nhiên, một cấu trúc vec tơ retrovirus tương tự cũng làm biến đổi rất lớn mức độ biểu hiện ở các dòng tế bào thâm nhiễm (4-146%) (Sadelain và cộng sự., 1995). Như vây, có thể là có nhiều vùng LCR cần cho sự biểu hiện độc lập vị trí. Một chiến lược khác đảm bảo cho việc biểu hiện độc lập vị trí (position- independent expression) của các gen trong các vec tơ retrovirus là tránh cho chúng khỏi hiệu ứng nâng cao hoặc hạ thấp ở vùng lân cận vị trí hợp nhất (Duch và cộng sự., 1994). Có nhiều vật cách ly như vậy đã được xác định ở ruồi giấm (Gerasimova và Corces, 1996) và ở các tế bào động vật (Felsenfeld và cộng sự., 1996), những vật cách ly này có thể được hợp nhất vào trong các vec tơ retrovirus tương lai. Sự tự bất hoạt (self- inactivating- SIN) (Yu và cộng sự., 1986) và các vec tơ sao chép kép (double-copy-DC) (Hanztopoulos và cộng sự., 1989) đã tận dụng một đặc tính đặc biệt về chu kỳ sống của retrovirus, đó là sự phiên mã ngược của RNA hệ gen virus thành dạng sợi kép. Trong quá trình này, các trình tự từ đầu 5’ của RNA (U5) được nhân đôi và đặt thêm vào ở đầu 3’ của DNA, trong khi đó các trình tự từ đầu 3’ của RNA (U3) lại được sao chép về phía trên đầu 5’ của DNA. Quá trình này đã tạo được các cấu trúc LTR đồng nhất nằm bên sườn hệ gen virus. Promoter của retrovirus được định vị trong vùng U3, điều đó có nghĩa là promoter này đã có trong các tế bào thâm nhiễm từ vùng U3 ở đầu 3’ của RNA. Trong các vec tơ SIN, U3 bị loại trừ do đó dẫn đến một provirus đã hợp nhất lại không có promoter retrovirus trong các tế bào thâm nhiễm. Khối promoter dị loại bên trong sẽ chỉ là promoter để hướng dẫn sự biểu hiện của các gen đã được chuyển giao. Các vec tơ DC, bao gồm một promoter dị loại gắn vào gen đã được vận chuyển sẽ được cài vào vùng U3 trong 3’LTR của vec tơ và sẽ được nhân đôi sau phiên mã ngược, điều đó đảm bảo chắc chắn rằng hộp gen – promoter hiện diện 2 lần (tức là có sự sao chép kép) trong các tế bào đích. Vùng R cũng có thể là một vị trí để cài gen bởi vì các cDNA mã cho MyoD và nucleoside purin phosphorylase (PNT) đã cài được vào vùng này của LTR (Adam và cộng sự., 1995). Việc sử dụng các vị trí tiến vào bên trong ribosome (internal rebosome entry site – IRES) trong các vec tơ retrovirus cho phép 2 hoặc nhiều gen được biểu hiện từ cùng một bản phiên mã của một promoter đơn (Koo và cộng sự., 1992; Levine và cộng sự., 1991). Những vec tơ này có độ chuẩn cao hơn nên cho phép cài được các đoạn gen dị loại lớn hơn và làm ổn định hơn sự biểu hiện của các gen đã được vận chuyển (so với các vec tơ 2 gen, 2 promoter) và tránh được sự giao thoa giữa các promoter (multiple promoter) cùng có mặt trên cácvec tơ retrovirus (Li và cộng sự., ; Xu và cộng sự., 1989). 4.5.2 Đích thâm nhiễm 52 Cũng như sự thâm nhiễm đích, thông qua việc đổi hướng tính đặc hiệu thâm nhiễm có thể làm giới hạn biểu hiện của các gen trị liệu khi sử dụng các promoter từ các gen đã được biểu hiện một cách đặc hiệu hoặc biểu hiện ưu tiên hơn ở các dạng tế bào xác định. Như thế thì một vec tơ retrovirus có thể chuyển một gen tới nhiều dạng tế bào (nếu không có đích thâm nhiễm) nhưng điều đòi hỏi lại là gen này chỉ được biểu hiện trong một dạng tế bào mà thôi. Tính đặc hiệu nghiêm ngặt có liên quan với sự thâm nhiễm cũng như đích biểu hiện. Trong các vec tơ retrovirus người ta đã cho dư promoter tác động ưu tiên trong một số dạng tế bào đặc biệt. Chẳng hạn như các promoter đặc hiệu tế bào gan (và u gan) từ phosphoenolpyruvate carboxylase (Hafenrichter và cộng sự., 1994; Hatzoglou và cộng sự., 1990; McGrane và cộng sự., 1988), - fetoprotein (Huber và cộng sự., 1991), 1- antitrypsin (Hafenrichter và cộng sự., 1994; Rettinger và cộng sự., 1994), các gen albumin (Hafenrichter và cộng sự., 1994) và các promoter tác động một cách ưu tiên trong các khối u chẳng hạn như gen tyrosinase cho sự biểu hiện đích đối với u hắc tố (Vile và cộng sự., 1995) và erb B-2 cho các khối u ở vú (Harris và cộng sự., 1994). Các vec tơ biểu hiện sớm gen chuyển từ các promoter dị loại có thể gây cảm ứng hoặc đặc hiệu mô đã được cài vào vec tơ. Tuy nhiên, cấu hình này thường chịu tác động giao thoa của phiên mã vì có mặt cả promoter retrovirus và promoter dị loại. Hiệu ứng giao thoa này có thể làm mất sự biểu hiện của một hoặc cả 2 promoter hoặc mất tính đặc hiệu mô hay cảm ứng biểu hiện từ các promoter dị loại. Gần đây hơn, các vec tơ mang promoter dị loại /yếu tố tăng cường (enhancer) trong LTR được thay cho promoter retrovirus/ yếu tố tăng cường (Ferrari và cộng sự., 1995; Vile và cộng sự., 1995). Những vec tơ mà promoter được chuyển đổi từ MLV trong các dòng tế bào đóng gói đã được đưa vào promoter dị loại các tế bào đích thâm nhiễm được gọi là vec tơ chuyển đổi promoter (promoter conversion (ProCon) vectors) (Günzburg và cộng sự., 1995; Salmons và cộng sự., 1995). Vì thế vẫn còn tồn tại một số vấn đề cần xem xét về tính an toàn của các vec tơ này chẳng hạn (i) nếu như không có các trình tự promoter virus thì sẽ làm giảm tần số tái tổ hợp với các trình tự virus trong tế bào đích và (ii) chưa chỉ rõ được rằng promoter từ một gen tế bào có thể hoạt hóa hay làm bất hoạt các gen của tế bào trong retrovirus. 4.5.3 Các promoter có thể cảm ứng được Promoter glucocorticoid có thể cảm ứng được của virus gây khối u ở vú chuột (Günzburg và Salmons, 1992) đã được sử dụng trong vec tơ ProCon để điều hòa sự biểu hiện gen trong nuôi cấy tế bào (Günzburg và cộng sự., 1997; Mrochen và cộng sự., 1997). Promoter này có lẽ là ít tác dụng bởi vì nó là một promoter cảm ứng in vivo mặc dù nó có thể là đích biểu hiện gen đối với các tế bào tuyến vú và các tế bào lympho B (Günzburg và Salmons, 1992). Cannon và cộng sự đã dùng nguyên lý của ProCon để tạo ra MLV – một vec tơ từ retrovirus, vec tơ này sử dụng promoter HIV có thể cảm ứng Tat (Tat inducible HIV promoter) sau khi tế bào bị thâm nhiễm. Vec tơ này hữu dụng trong việc biểu hiện các gen trị liệu trong các tế bào bị nhiễm HIV. Tăng sự biểu hiện gen này sẽ làm hạn chế các tế bào bởi vì chỉ có các tế bào nhiễm HIV mới biểu hiện Tat (Cannon và cộng sự., 53 1996). Các vec tơ retrovirus mang promoter cảm ứng tetracyclin cũng đã được thiết lập để biểu hiện gen (Paulus và cộng sự., 1996). Hình 4.6 Sự chuyển đổi promoter của các vec tơ retrovirus. Cấu trúc của vec tơ có mang promoter retrovirus (Pr1; promoter 1) ở vùng U3 của 5’LTR hướng sự biểu hiện của RNA hệ gen virus trong dòng tế bào đóng gói. 3’LTR được lựa chọn để điều khiển việc biểu hiện gen trong các tế bào bị thâm nhiễm (Pr 2). Cần lưu ý rằng trình tự này chỉ là một promoter có mặt trong RNA hệ gen mà nó đã được đóng gói trong các hạt virus.. Trước khi thâm nhiễm các tế bào đích, RNA được chuyển đổi thành phân tử DNA sợi kép nhờ enzyme phiên mã ngược. Kết quả là nhân đôi Pr 2 và chuyển vị một bản phiên mã tới đầu 5’ của DNA provirus, đó là promoter duy nhất được dùng để điều khiển sự biểu hiện gen trong tế bào thâm nhiễm. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 4.6 Độ chuẩn và tính ổn định của các vec tơ retrovirus Độ chuẩn virus và các vec tơ virus thường được đo bằng hiệu lực tác dụng của virus trên các tế bào đích. Thông thường với các vec tơ virus thì đây là số tế bào nhận và biểu hiện một gen dấu chuẩn enzyme có khả năng sinh ra phản ứng màu chẳng hạn như – galactosidase, hoặc có thể lựa chọn một gen kháng kháng sinh cho phép phân biệt được các tế bào thâm nhiễm trên cơ sở là chúng có thể tồn tại được trong môi trường có chứa kháng sinh. Vì thế, độ chuẩn là đại diện của các đơn vị chức năng virus chứ không phải là con số tuyệt đối các hạt virus. Một bất lợi thường được đề cập với các vec tơ retrovirus là độ chuẩn của nó dường như thấp hơn các vec tơ virus khác chẳng hạn như adenovirus và các vec tơ adenovirus liên hợp (adeno-asociated virus vector) ngay cả khi độ chuẩn retrovirus đạt tới 107 cfu/ml. Gần đây đã có bằng chứng cho thấy độ chuẩn retrovirus cao hơn rất nhiều so với các thông báo trước đó vì trong môi trường nuôi cấy có chứa các virus vec tơ thì có một lượng đáng kể virus vec tơ thâm nhiễm sẽ chuyển dần dần các tế bào thành không thâm nhiễm (Tavoloni, 1997). Một câu hỏi lớn là liệu độ chuẩn chức năng được xác định trên một số giới hạn các dòng tế bào thiết lập (chẳng hạn như tế bào NIH3T3) trong môi trường có phản ánh trung thực hay không số virus vec tơ có khả năng chuyển giao một gen tới các tế bào sơ cấp hoặc tới các tế baò in vivo (Foresstell và cộng sự., 1995). Hơn nữa, nếu ta lạc quan về độ chuẩn virus trên các tế bào đã được thiết lập như thế thì có thể là chưa chính xác vì những tế bào này không phản ánh hết các đặc 54 tính sinh học của các tế bào đích thích hợp đối với gen trị liệu. Tuy nhiên, đã có nhiều phương pháp hóa lý được sử dụng nhằm làm tăng độ chuẩn in vitro. Công việc này bao gồm sự cô đặc (Kotani và cộng sự., 1994); Paul và cộng sự., 1993), tạo luồng thâm nhiễm trong đó các tế bào được phát triển trên các màng lọc có lỗ để virus có thể được đi qua các lỗ này ( Chuck và Palsso, 1996), xử lý các tế bào sản xuất vec tơ với sodium butyrate (Olsen và Sechelski, 1995; Pages và cộng sự., 1995; Soneoka và cộng sự., 1995). Chắc chắn là chúng ta cần phải nỗ lực nhiều hơn nữa mới biết được các yếu tố lý hóa và sinh học tác động tới tính ổn định và độ chuẩn virus. Thời gian bán sống của các vec tơ retrovirus MLV trong môi trường nuôi cấy tế bào đo được là 3,5 – 9 giờ ở 37˚C (Chuck và cộng sự., 1996; Kaptein và cộng sự., 1997; Paul và cộng sự., 1993; Russell và cộng sự 1995; Sanes và cộng sự., 1986; Tavoloni., 1997). Các polycation như polybren (hexadimethrinebromide) và protamine là các chế phẩm của vec tơ virus làm tăng hiệu lực thâm nhiễm của các tế bào. Các phân tử tích điện dương này tác động như “các phân tử tiếp nhận” (adaptor’ molecules) để làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các virus tích điện âm và màng tế bào cũng tích điện âm (Coelen và cộng sự., 1983; Hornby và Salmons, 1994). Tuy nhiên, polybren cũng tác động tới sự suy tàn retrovirus và có thể gây nên sự kết tủa các hạt virus vec tơ và như vậy sẽ làm cản trở sự thâm nhiễm tế bào của chúng (Andreadis và Palsson, 1997). Nhiệt độ cũng tác động tới độ chuẩn virus. Thật ngạc nhiên là các chế phẩm virus vec tơ retrovirus ở 32ºC lại có độ chuẩn cao hơn (Brunnell và cộng sự ., 1995; Kotani và cộng sự., 1994). Điều đó cho thấy thời gian bán sống của virus tái tổ hợp ở 32˚C tăng 4 lần so với ở 37˚C (Kaptein và cộng sự., 1997). Độ chuẩn cũng phụ thuộc vào sự có mặt và sự dư thừa của các tế bào mã cho các phân tử receptor trên bề mặt tế bào đích. Các receptor lưỡng tính được biểu hiện trên nhiều tế bào nhưng không phải là tất cả các tế bào. Các tế bào gan không phân chia hoặc phân chia chậm có biểu hiện chút ít receptor lướng tính và các tế bào gốc tạo máu cũng biểu hiện chút ít receptor lưỡng tính hơn là receptor GaLV (Bunnell và cộng sự., 1995). Ngược lại receptor cho các virus có vỏ khác, hay các virus gây sưng miệng (vesicular stomatitis virus-VSV) lại có rất nhiều trên các tế bào (Coll, 1995). Protein G vỏ VSV có thể hợp nhất vào trong các hạt retrovirus, một quá trình được gọi là sao chép giả (pseudotyping) (Weiss, 1993) kết quả là làm tăng cả độ chuẩn cũng như tính ổn định của các hạt virus hơn là các protein vỏ có mang MLV (Burns và cộng sự., 1993). Những hạt MLV/VSV giả này sẽ nới rộng thêm thang vật chủ và các dạng tế bào (Friedmann và Yee, 1995). Sự chọn lọc nhanh các tế bào thâm nhiễm sơ cấp hiện nay là không thực tế bởi vì các thí nghiệm đương thời dùng các gen dấu chuẩn thường lại tác động tới sự biến thiên của tế bào. Ngay cả việc phân loại tế bào cho sự biểu hiện – galactosidase khi dùng loại tế bào hoạt hóa huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS) cũng hêt sức khó khăn vì để ổn định độ nén tế bào đòi hỏi phải cung cấp cơ chất cho các tế bào. Vơí sự chọn lọc bằng kháng kháng sinh lại đòi hỏi phải nuôi cấy tế bào nhiều ngày trước khi loại trừ các tế bào chết do không được truyền gen kháng kháng sinh, mặc dầu hiện nay người ta đã phát triển được một thử nghiệm phát hiện nhanh G418 (Byun và cộng sự., 1996). Gần đây một dấu chuẩn gen mới đã được sử dụng trong các vec tơ retrovirus, nó tạo điều kiện cho việc chọn lọc FACS mà không có bất cứ độc tính tế bào nào. Gen này mã cho protein huỳnh quang xanh (green fluorescent protein- GFP) chúng phát ra một ánh sáng xanh dưới vùng cực tím (Chalfie và cộng sự., 1994). Các gen GFP sẽ được công nghệ hóa để biểu hiện tốt hơn trong các tế bào động vật, các gen hGFP và EGFP đã được cài vào các vec 55 tơ retrovirus (Klein và cộng sự., 1997; Muldoon và cộng sự., 1997) và được dùng để xác định nhanh chóng các tế bào thâm nhiễm. Hình 4.7 Các polycation tạo thuận lợi cho sự thâm nhiễm. Virus và các tế bào tích điện âm được các polycation như polybren làm trung hòa lực đảy tĩnh điện giữa 2 cấu trúc này do đó tạo thuận lợi cho sự thâm nhiễm. (Theo walter H. Gunzburg vaf Brian Salmons. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). Sự chọn lọc nhanh chóng các tế bào thâm nhiễm sơ cấp tới nay là không thực tế bởi vì các thí nghiệm đương thời dùng các gen dấu chuẩn thường lại tác động tới sự biến thiên của tế bào. Ngay cả việc phân loại tế bào cho sự biểu hiện – galactosidase khi dùng loại tế bào hoạt hóa huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorter-FACS) cũng hêt sức khó khăn vì để ổn định áp suất tế bào đòi hỏi phải cung cấp cơ chất cho các tế bào. Vơí sự chọn lọc bằng kháng kháng sinh lại đòi hỏi phải nuôi cấy tế bào nhiều ngày trước khi loại trừ các tế bào chết do không được truyền gen kháng kháng sinh, mặc dầu hiện nay người ta đã phát triển được một thử nghiệm phát hiện nhanh G418 (Byun và cộng sự., 1996). Gần đây một dấu chuẩn gen mới đã được sử dụng trong các vec tơ retrovirus, nó tạo điều kiện cho việc chọn lọc FACS mà không có bất cứ độc tính tế bào nào. Gen này mã cho protein huỳnh quang xanh (green fluorescent protein- GFP) chúng phát ra một ánh sáng xanh dưới vùng cực tím (Chalfie và cộng sự., 1994). Các gen GFP sẽ được công nghệ hóa để biểu hiện tốt hơn trong các tế bào động vật, các gen hGFP và EGFP đã được cài vào các vec tơ retrovirus (Klein và cộng sự., 1997; Muldoon và cộng sự., 1997) và được dùng để xác định nhanh chóng các tế bào thâm nhiễm. 56 4.7 Các vec tơ lentivirus Các vec tơ đi từ MLV cũng giống như các MLV đều bị giới hạn thâm nhiễm với các tế bào đang phân chia bởi vì phức hợp tiền hợp nhất gồm có DNA virus và integrase không đi qua được màng nhân (Lewis và Emerman, 1994; Roe và cộng sự., 1993). Ngược lại, các lentivirus như HIV và virus gây thiếu hụt miễn dịch trên khỉ (simian immunodeficiency virus-SIV) lại có khả năng thâm nhiễm các tế bào không ở giai đoạn đang phân chia (Stevenson, 1996). Sở dĩ như vậy là do sự dư thừa các tín hiệu định vị nhân cả trong các protein MA của HIV (Bukrisky và cộng sự., 1993) cũng như trong các sản phẩm phụ của gen HIV gắn với protein MA (Heinzinger và cộng sự., 1994). Do đặc tính này của lentivirus nên người ta đã nghĩ tới việc xây dựng một hệ thống vec tơ với cơ sở lentivirus để chuyển gen tới các tế bào đang ở trạng thái bất động hoặc đã phân hóa. Trước hết, các thành viên retrovirus tiểu họ này như HIV không thể chấp nhận là các xe tải vận chuyển gen bởi vì chúng có khả năng gây nên trạng thái thiếu hụt miễn dịch. Tuy nhiên, nếu hệ vec tơ đó này được phát triển thì cũng khó dẫn đến việc sản xuất ra các HIV có khả năng sao chép cao. Nhưng các thành phần của virus cần để tạo nên các hạt vec tơ thì không chỉ có liên quan tới việc gây nên thiếu hụt miễn dịch mà còn gây ra các hiệu ứng khác chẳng hạn như kích thích đáp ứng tự miễn. Thuận lợi thứ hai để có thể tạo ra được các hệ vec tơ trên cơ sở lentivirus là cho tới nay chưa có bằng chứng nào về gây đột biến ghép bởi các virus này, mặc dầu chưa hiểu lý do tại sao điều đó lại không xảy ra. Có nhiều nhóm nghiên cứu đã thiết lập được các vec tơ cơ sở HIV và chẳng có gì đổi mới, các hệ thống này sử dụng các protein vỏ từ các virus khác chứ không phải là HIV rồi làm giảm khả năng tái tổ hợp và tạo nên các virus thâm nhiễm. Protein G của VSV và Env lưỡng tính của MLV đều được dùng như những vec tơ lentivirus giả. Người ta đã thông báo rằng các vec tơ HIV giả với protein vỏ của MLV hoặc VSV lưỡng tính có thể cho độ chuẩn tới 107 cfu/ml (Naldini và cộng sự., 1996; Page và cộng sự., 1990; Reiser và cộng sự 1996) hoặc ~ 105 cfu/ml với protein vỏ của virus gây bệnh bạch cầu tế bào T trên người (human T-cell leukaemia virus- HTLV) (Landau và cộng sự., 1991). Các gen phụ trợ HIV (chẳng hạn như vpr, vpu và nef) đã làm bất hoạt vec tơ HIV, điều đó góp phần làm an toàn cho các vec tơ này (Reiser và cộng sự., 1996). Mặt khác, một số sản phẩm gen chẳng hạn như Nef mặc nhiên đã được thừa nhận là làm tăng tính thâm nhiễm của virion và như vậy nó có lợi cho các vec tơ này (Naldini và cộng sự., 1996). Cũng phải một thời gian dài người ta mới hiểu được rằng các retrovirus (và các vec tơ retrovirus) bị bất hoạt trực tiếp bởi bổ thể trong huyết thanh người (Welsh và cộng sự., 1975). Người ta đã chứng minh được rằng sự bất hoạt qua trung gian bổ thể không phải là sự tiêu tố (non lytic) và nó phụ thuộc cả vào retrovirus trên các tế bào mà từ đó virus được sản sinh ra. Người ta sử dụng các dòng tế bào người theo thiết lập chẳng hạn như 293 (Pear và cộng sự., 1993) hoặc HT1080 (Cosset và cộng sự., 1995) để kiến tạo các tế bào đóng gói nhằm giảm nhẹ các vấn đề gây nên bởi bổ thể. Cuối cùng, con đường bổ thể cũng có thể được ức chế bởi các kháng thể đơn dòng với các thành phần đặc hiệu của bổ thể (Rother và cộng sự., 1995). Các vec tơ lentivirus cơ sở HIV ít bị ảnh hưởng do sự bất hoạt qua trung gian bổ thể hơn là các vec tơ đi từ MLV. 4.8 Viễn cảnh và kết luận 57 Các vec tơ retrovirus là những vật chuyển gen thông dụng nhất trong gen tril liệu lâm sàng, tính đến tháng 6 -1996 đã có 969 bệnh nhân được trị liệu với vec tơ này (Marcel và Grausz, 1996). Tuy nhiên, mới chỉ vài năm gần đây các vec tơ retrovirus vẫn chưa xây dựng được nền móng vững chắc trong khi đó các vec tơ adenovirus lại có độ chuẩn và phổ thâm nhiễm cao hơn. Nhưng với các thành tựu đương thời thì người ta lại quan tâm nhiều hơn tới các vec tơ retrovirus. Những thành tựu đã đạt được là (i) cải tiến nâng cấp mô hình thiết kế chung, (ii) đã thiết lập được các vec tơ cỏ sở lentivirus, (iii) đã thấu hiểu hơn về tính ổn định và sự sản sinh retrovirus, do đó hy vọng sẽ tạo được độ chuẩn cao hơn và (iv) các hệ thống vec tơ an toàn hơn đảm bảo chắc chắn rằng không sản sinh ra các virus sao chép cao. Tuy nhiên vẫn chưa thể đòi hỏi về một vec tơ retrovirus hoàn thiện và có lẽ phải phấn đấu nhiều nữa mới có được thành quả đó. Hệ thống vec tơ tổng hợp nhân tạo sẽ giải quyết được nhiều vấn đề có liên quan đến hệ thống vận chuyển như hiện nay. Nhưng chắc chắn trong tương lai trong thành phần của retrovirus sẽ có cả hệ thống vec tơ nhân tạo. 58 Chương V CÁC VEC TƠ LENTIVIRUS 5.1 Mở đầu Lentivirus là một phân họ của retrovirus, chúng thâm nhiễm cả động vật cao cấp cũng như các động vật khác. Đặc trưng của chúng là hướng động tới các tế bào bạch cầu đơn nhân (monocyte) và đại thực bào (macrophage). Virus của các động vật khác (không phải động vật cao cấp) thâm nhiễm các vật nuôi, virus maedi visna (MVV) thâm nhiễm cừu, virus gây viêm não của dê (caprine arthritis encephalitis virus –CAEV) thì thâm nhiễm cho dê và các virus gây bệnh thiếu máu cho ngựa ( equine infectious anaemia virus – EIAV) thì thâm nhiễm cho ngựa. Gần hơn là virus gây thiếu hụt miễn dịch của bò (bovine immunodeficiency virus – BIV) và virus gây thiếu hụt miễn dịch trên mèo (feline immunodeficiency virus – FIV) thì thâm nhiễm các thú nuôi và mèo. Các virus type I và type II (HIV-1 và HIV-2) gây thiếu hụt miễn dịch (THMD) trên người. Lentivirus và các virus gây THMD trên khỉ (simian immunodeficiency virus – SIV) thì thâm nhiễm cho người và khỉ, nó hướng vào các tế bào lympho. HIV-1 và HIV-2 gây bệnh AIDS ở người. Người ta thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa SIV và các phân dòng, theo các phân dòng và vật chủ thì nó có thể gây được bất kỳ triệu chứng nào giống như hội chứng thiếu hụt miễn dịch – AIDS. Mặc dầu đã phát triển được nhiều lentivirus không phải của động vật cao cấp như FIV và EIAV với tư cách là các vec tơ retrovirus, nhưng cho tới nay mới chỉ thu được những tiến bộ nhỏ với các virus như HIV-1, HIV-2 và SIV. Trong chương này chúng ta sẽ đề cập những kiến thức hiện đại về các vec tơ cơ sở HIV cùng với những chi tiết về SIV và các chimera virus. Chu kỳ sống của retrovirus được phác thảo trên (Hình 5.1). Lentivirus là các retrovirus phức hợp với các mẫu RNA nối nhiều tầng (multiple spiced RNA species) cùng với nhiều protein nhỏ với chức năng điều hòa, nó cho phép kiểm soát sự sao chép phức tạp của virus ở các pha sớm và muộn trong chu kỳ sống của chúng. 59 Hình 5.1 Chu kỳ sống của một retrovirus đặc biệt gây nhiễm tế bào, ở đây có sự chuyển đổi RNA hệ gen thành DNA sợi kép và hợp nhất vào nhiễm sắc thể của tế bào bởi quá trình phiên mã, protein virus lắp ráp với capsid và sự nẩy chồi của virus. (Theo Andrew M.L.Lever. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 5.2 Cấu trúc gen của các lentivirus Phần bổ cứu gen và mẫu RNA ghép nối của HIV giống như là một nguyên mẫu lentivirus được chỉ rõ ở Hình 5.2 và 5.3. Ở provirus, đầu 3’ và 5’ có các đoạn lặp tận dài đồng nhất (identical long terminal repeat- LTR), những vùng không mã có các trình tự tác động cis quan trọng. Có 3 khung đọc mở chính: gag mã cho các protein capsid của virus, pol mã cho enzyme virus và env mã cho glycoprotein lớp vỏ. Khi sử dụng HIV như một nguyên mẫu thì gen gag và pol được mã trên phần thông tin virus không ghép nối. Polyprotein Gag khởi đầu được tổng hợp như một tiền thân Pr55, sau đó được protease của virus cắt bỏ ít nhất 4 đoạn. Sự cắt bỏ này xảy ra khi đang hoặc sau khi nảy chồi. Đa số các đoạn tận N đều là các protein chất nền (matrix protein-MA) mà ở các hạt virus thì nó có liên quan tới việc neo protein vỏ vào virion. Khi virus vào trong tế bào thì MA có liên quan tới viẹc đưa phức hợp hợp nhất tới nhân tế bào và cho phép provirus hợp nhất trong các tế 60 bào không ở giai đoạn đang phân chia. Tín hiệu định vị nhân giả định được xác định bằng trình tự amino acid của nó. Đầu tận C đối với MA là capsid (CA), đó là một protein cấu trúc phần lõi virus. Nó cũng là một protein nhận dạng trong một số phản ứng ELISA của các hạt virus (p24 trong HIV-1). Nó đáp ứng cho việc hợp nhất cấu trúc phần lõi virus. Protein p9 hay protein nucleocapsid (nucleocapsid protein – NC) là sản phẩm đoạn thứ 3 của gag. Nó có mẫu thiết kế CCHC giống 2 ngón tay và có liên quan tới việc bọc RNA hệ gen bên trong virus để tránh bị hủy hoại. Protein này cũng tạo thuận lợi cho việc phiên mã ngược của RNA virus. Những công trình gần đây chứng minh rằng peptide “chêm” P2 giữa CA và NC có thể ảnh hưởng tới sự capsid hóa RNA. Hầu hết các đoạn tận C của gag là p6, nếu nó bị đột biến sẽ dẫn tới sự khiếm khuyết các nhân tố kết thúc sự đâm chồi của virus từ tế bào. Tuy nhiên cơ chế chính xác về sự ảnh hưởng tới các giai đoạn chót của sự lắp ráp và đâm chồi của virus thì vẫn chưa rõ, mặc dầu nó có thể có liên quan tới sự tương tác với các protein của tế bào. Hình 5.2 Phần bổ cứu gen của HIV như là một lentivirus nguyên mẫu hiện rõ các khung đọc chính và chức năng của các sản phâm gen (trang bên) (Theo Andrew M.L.Lever. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). Hình 5.3 Sơ đồ họ các phân tử mRNA từ provirus gồm 3 nhóm: không ghép nối, ghép nối đơn và đa ghép nối (trang bên) (Theo Andrew M.L.Lever. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 61 62 63 64 Các sản phẩm của gen pol đầu tiên như là một protein hòa trộn Gag/pol. Trong trường hợp HIV thì xảy ra sự xê dịch khung khi phiên dịch (tổng hợp protein) về phía khung đọc mở gag, kết quả là ribosome bắt đầu dịch ở khung đọc pol. Protein hòa trộn (fusion protein) được tạo ra từ một tiền thân Pr160 gag/pol. Các sản phẩm của gen pol còn bao gồm cả tận N, protease (PR) – phân cắt protein gag và gag/pol thành những bộ phận cấu trúc của chúng, enzyme phiên mã ngược – đáp ứng việc chuyển đổi hệ gen RNA thành phân tử DNA sợi kép và integrase (INT) – có khả năng cài provirus sợi kép vào trong nhiễm sắc thể của tế bào, nó phụ thuộc vào các trình tự nhận biết đặc hiệu trong LTR của virus. Protein env thì được phiên dịch từ một RNA ghép nối đơn. Ở đây vật cho ghép chính nằm ở vùng 5’gag không được phiên dịch và vật nhận ghép env lại nằm ở phía trên mã khởi đầu của env. Bản phiên mã ghép nối đơn cũng mã cho nef. Khi protein env được tổng hợp thì trước tiên nó tạo ra một tiền thân gp160 trên lưới nội chất (ER) gắn với ribosome. Gp160 sẽ tổng hợp ở khoang lưới nội chất, sau đó được xử lý bằng protease của tế bào để trở thành chất vận chuyển màng gp41 (transmebrane gp41- TM) và một protein bề mặt gp120 (surface gp120 (SU) protein). Sự gắn kết này không phải là liên kết đồng hóa trị mà phức hợp này phải trải qua quá trình glycosyl hóa và sau đó ra bề mặt tế bào với kết cấu là một phức hợp gồm 3 hay 4 thành phần. Hơn nữa, HIV còn có nhiều khung đọc mở nhỏ, vì thế mà có sự tương đồng ở hầu hết các lentivirus. Tat là một chất hoạt chuyển (transactivator) mạnh đối với phiên mã, nó mã hóa các thông tin ghép nối kép hoặc hoạt động ở dạng trans để tăng cường khả năng biến đổi của RNA polymerase thông qua cấu trúc vòng gốc RNA được hình thành ở vùng phía trên vị trí bắt đầu phiên mã trong LTR. Điều này được hiểu như là vòng gốc đáp ứng Tat (Tat responsive [TAR] stem loop). Tổ hợp Tat/LTR là một trong số các promoter mạnh nhất đã biết và nó làm tăng cường sự sản xuất tất cả các mẫu mRNA virus. Khi mới thâm nhiễm, có sự bất ổn định của các trình tự (INS) trong intron của env (tức là gag và pol) và ngay cả trong gen env thì RNA thông tin dài đầy đủ cũng nhanh chóng trở thành dạng ghép nối kép, vì vậy Tat là sản phẩm chính của gen được tạo ra sớm trong chu kỳ sống nhờ sự điều hòa dương. Protein Rev được mã bởi 2 exon gối lên nhau của Tat. Protein này cũng được tạo ra khá sớm trong chu kỳ sống và khi được tích lũy thì nó có khả năng tương tác với yếu tố đáp ứng Rev (Rev-responsive element – RRE) trong vùng mã cho env để tạo điều kiện cho sự xuất khẩu RNA thông tin không ghép nối và ghép nối đơn từ nhân ra tế bào chất. Tương tác Rev/RRE đã vượt qua hiệu ứng của INS – đặc ân của sự ghép nối. Điều này giúp cho việc kiểm soát biểu hiện của RNA virus, trong đó một số lớn RNA mã cho các protein điều hòa đã được tạo ra ở pha sớm hoặc nhờ sự chuyển đổi qua trung gian Rev để tạo nên các RNA thông tin nối đơn có chiều dài đủ để mã cho các protein cấu trúc và enzyme của virus. Bốn khung đọc nhỏ mở khác cũng rất đáng quan tâm. Gen nef ở đầu 3’ của virus có rất nhiều chức năng. Mặc dầu khởi đầu xác định nó như là một chất điều hòa âm của phiên mã, nhưng thực ra nó còn có các chức năng quan trọng khác in vivo, trong đó có sự điều hòa làm giảm CD4 trên bề mặt các tế bào thâm nhiễm và tới nay vẫn chưa xác định được những chức năng cần thiết dẫn tới các đột biến nhỏ ở nef (của SIV). Vif là một protein phụ trợ cần thiết trong một vài hệ thống thâm nhiễm tế bào. Hiệu quả của sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus phụ thuộc vào việc có hay không có Vif của virus. Nhiều dòng tế bào chỉ bị thâm nhiễm nếu có mặt Vif. Những bằng chứng gần đây chứng minh rằng Vif được đóng gói trong các hạt virus và nó có thể gây tác động lên các bước sớm của sự lột vỏ virus. 65 Vpu có chức năng làm tăng hiệu ứng xuất khẩu virus. Sở dĩ như vậy vì thứ nhất là Vpu làm tách rời phức hợp protein vỏ và protein CD4 của tế bào thâm nhiễm, điều này xảy ra ở lưới nội chất, khi xuất khẩu protein thì cũng xuất khẩu luôn cả protein vỏ virus. Thứ 2 là Vpu có chức năng xuất khẩu khá rộng, bằng chứng là các tế bào Hela không có khả năng xuất khẩu virus hoặc các hạt Gag tự do ở vỏ là do không có Vpu. Vpr đã được xác định là một protein có nhiều chức năng. Nó được hợp nhất vào trong các hạt virus (không giống Vpu). Khả năng hoạt hóa phiên dịch của nó kém hơn Tat. Tuy nhiên, sự có mặt của vpr tạo khả năng cho HIV hợp nhất hệ gen của nó vào trong các tế bào không ở giai đoạn đang phân chia. Nó cũng được chứng minh là gây cảm ứng để dừng chu kỳ tế bào ở G2 trong vài dòng tế bào. Vì thế viễn cảnh của các vec tơ này cũng có thể là rất to lớn và cũng có thể sẽ bị hạn chế. 5.2.1 Lợi thế của các vec tơ lentivirus Cũng giống như tất cả các vec tơ retrovirus, lentivirus cũng cho một tiềm năng cài các gen đơn ổn định - bản phiên mã gen vào trong nhiễm sắc thể tế bào chủ và xác định được đích của sự chuyển gen trong các tế bào có các receptor virus thích hợp. Lý do chính để người ta quan tâm tới lentivirus hơn các retrovirus khác là khả năng nhắm đích vào các tế bào ở giai đoạn Go. Nhiều quần thể tế bào được chuyển gen trị liệu như gan, cơ và não thì hầu hết hoặc hoàn toàn đều ở thời điểm Go. Lợi thế thứ 2 là khi sử dụng tổ hợp mạnh promoter Tat/LTR thì sự biểu hiện gen cao là có khả thi. Lợi thế thứ 3 là các gen phụ trợ tạo thêm các chức năng điều hòa, tức là các gen này có thể tạo nên sự cảm ứng. 5.2.2 Những bất lợi của các vec tơ lentivirus Những bất lợi hiển nhiên của các vec tơ cơ sở HIV là sự nguy hiểm của các sản phẩm tái tổ hợp của một virus hoang dã. Dĩ nhiên điều này chỉ có thể xảy ra nếu có mặt đầy đủ các thành phần cần thiết để kiến tạo lại đầy đủ hệ gen virus, vì vậy hệ thống này phải được thiết kế sao cho sự cố trên không được xảy ra. Bất lợi thứ hai là hệ thống vec tơ lentivirus có độ chuẩn tương đối thấp, không hiểu lý do tại sao lại như vậy. Tuy nhiên, khi nhìn nhận vấn đề này người ta thấy rằng dường như có sự phóng đại khi so sánh trực tiếp các vec tơ lentivirus với các vec tơ của các dọng tế bào biến nạp của chuột in vitro. Nhìn chung các nhà nghiên cứu đều cho rằng khi đánh giá về khả năng biến nạp đối với các tế bào sơ cấp in vitro thì thấy rõ ràng có sự khác biệt giữa lentivirus và các vec tơ của chuột, tức là các vec tơ của chuột là kém hiệu lực hơn. 5.3 Các vec tơ cơ sở lentivirus Hệ thống vec tơ retrovirus có 2 thành phần cơ bản: (i) hệ gen virus đã được cải biến có các gen ngoại lai với các trình tự tác động cis cần cho sự capsid hóa các hạt virus và cài ổn định vào các tế bào đích – vec tơ và (ii) một virus trợ giúp hoặc các cấu trúc virus cung cấp tất cả các cấu trúc ở dạng trans và các protein enzyme cần thiết cho việc kiến tạo một virion nguyên bản trong đó vec tơ có thể đã được đóng gói để chuyển giao. 66 Những thành phần tối thiểu cho một vec tơ là: tín hiệu đóng gói, nó cho phép sự capsid hóa chọn lọc RNA ở các hạt virus, vị trí gắn primer (primer binding site – PBS) dành cho sự khởi đầu phiên mã ngược, một đoạn polypurin để khởi đầu sự tổng hợp chuỗi cộng provirus (proviral plus strand synthesis) và các trình tự LTR tạo được cả promoter lẫn chức năng kích thích, các tín hiệu polyadenylate và các trình tự nhận biết cần thiết cho sự hợp nhất của provirus. Tất cả những thành phần này có thể bị bỏ sót ở hệ thống đóng gói. Ở lentivirus thì 5’LTR và vị trí gắn primer hầu như kề lên nhau và thường được cho là các trình tự nối tiếp trong vec tơ. Vị trí của tín hiệu capsid hóa Ψ ở HIV thì vẫn là một vấn đề tranh cãi. Các nghiên cứu đầu tiên đã xác định được tầm quan trọng của trình tự capsid hóa nằm giữa 5’ của vật cho ghép nối (5’ splice donnor) và mã khởi đầu gag. Những đột biến ở vùng này sẽ dẫn đến khiếm khuyết đóng gói 10-1000 lần ít hơn virus hoang dã phụ thuộc tế bào. Những nghiên cứu kế tiếp đã xác định thêm một vùng khác cũng có khả năng kích thích sự đóng gói. Tuy nhiên, mỗi nghiên cứu lại đưa ra một hệ thống khác hẳn nhau, vì thế khó mà đi đến kết luận cuối cùng. Đầu 3’ của gen env, kể cả RRE làm tăng sự đóng gói của một số cấu trúc. Vùng 5’ của gen gag cũng được xác định nhờ nó có tín hiệu kích thích đóng gói. Tín hiệu đóng gói được chứng minh là không liên tục và có tới vài dạng khác nhau. Trình tự tối thiểu hay trình tự cần cho sự đóng gói thì vẫn chưa được xác định. Tuy nhiên, trong một số trường hợp đầu 3 của env, toàn bộ gag và vùng TAR là không cần thiết cho sự đóng gói ở vùng mà giữa vật cho ghép nối và gag ATG có ảnh hưởng lớn nhất. Một trình tự pentanucleotide GGNGR thường thấy ở vùng tín hiệu đóng gói của các lentivirus của các động vật cao cấp. Trong thực tế, nhiều vec tơ có vùng 5’ đầy đủ từ vị trí bắt đầu phiên dịch, xuyên qua phần bắt đầu đi vào phần đầu tiên của gen gag cùng với đầu 3’ của env. Ở phần thứ 2 có thể bao gồm các tín hiệu đóng gói tách biệt hoặc các trình tự không ổn định khi hợp nhất đầu 5’ của gen gag vào trong cấu trúc này (Hình 5.6) 5.3.1 Các ảnh hưởng khác đối với sự đóng gói Sự đóng gói RNA trong HIV khá lộn xộn và ít hiệu quả hơn so với các hệ retrovirus của khỉ và chuột. Một vài tài liệu đã chứng minh khả năng của HIV đối với sự capsid hóa RNA ghép nối với cả dẫn xuất virus cũng như các vec tơ với hiệu ứng cao, mặc dầu so với thông tin không ghép nối dài đủ (full-length unpliced message) thì thấp hơn. Cũng chưa rõ là liệu kết quả này có phải là do sự hình thành heterodimer giữa các mẫu ghép nối và các mẫu đủ độ dài hay không. Dĩ nhiên có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới vấn đề này. Trong một số dạng được dùng cho sự thâm chuyển tức thì, chẳng hạn như các tế bào Cos thì thấy sự đóng gói nhiều RNA ghép nối, có thể là do nồng độ của mẫu này ở tế bào là cực kỳ cao. Sự đóng gói ở lympho T thì đặc hiệu hơn mặc dầu vẫn phát hiện thấy RNA ghép nối trong các hạt virion. Khi sử dụng các kỹ thuật thâm chuyển không có dòng tế bào nào được chỉ ra là có RNA đáp ứng đầy đủ cho việc capsid hóa. Điều đó có thể do mục đích của sự thâm nhiễm là muốn có sự biểu hiên cao với một thời gian ngắn do đó dẫn đến sự bão hòa hàm lượng RNA trong tế bào trong hệ thống. Trong các thí nghiệm thiết kế tín hiệu đóng gói thì các quy trình thâm nhiễm có liên quan tới tính đặc hiệu cao của sự đóng gói. Trùng hợp với vấn đề này là các quan sát thấy rằng nếu sự đóng gói mà không gắn với việc cắt bỏ một đoạn nhỏ ở đầu 5’ thì có sự thâm nhiễm cao hơn. Ở HIV-2 đã được chứng minh là có sự phân cấp tính đặc hiệu đóng gói trong đó sự đóng gói ở các tế bào 67 Cos thì tính đặc hiệu là thấp hơn các tế bào T, tức là tế bào T dễ bị thâm nhiễm hơn tế bào Cos. Ngay cả trong các dòng tế bào đóng gói cơ sở HIV thì cũng có bằng chứng cho thấy RNA ghép nối từ một cấu trúc provirus hợp nhất vẫn có thể đi vào lộ trình đóng gói và được hợp nhất trong các virion. Nếu là in vivo thì trước tiên nó gây bất lợi cho virus mà lẽ ra RNA ghép nối đã có thể hoàn tất sự đóng gói với hệ gen có độ dài mong muốn. Hơn nữa, chỉ với sự lộn xộn nhỏ cũng làm tác động tới việc kích thích tái tổ hợp capsid hóa heterodimer và nó có khả năng làm tăng sự đa dạng của virus. Cũng còn khả năng khác là hệ thống này đã được xem xét dưới các điều kiện nhân tạo và tính đặc hiệu có thể phụ thuộc vào sự khác nhau về lượng RNA cần cho sự capsid hóa khi đang lắp ráp các capsid virus. Lentivirus phải trải qua sự chuyển đổi biểu hiện gen từ sớm sang muộn, điều đó có thể trùng hợp với vịệc tăng RNA không ghép nối trong tế bào chất cùng với các protein cấu trúc được tạo ra để làm cân bằng nhằm chống lại việc đóng gói RNA đa ghép nối sớm gây nên sự dư thừa trong chu kỳ sống. Trong thực tế, cho tới nay chưa có dòng tế bào nào thỏa mãn với việc loại trừ sự capsid hóa của các RNA ghép nối. Những dòng tế bào lympho có vẻ khá hơn các các dòng tế bào biểu mô và các tế bào giống như nguyên bào sợi. Tuy nhiên, vẫn chưa có đủ các công trình nghiên cứu về các dòng tế bào để ra lời khuyến cáo. Một khuynh hướng xa hơn nữa đi từ các quan sát thấy rằng HIV-1 có thể đóng gói được các vec tơ cơ sở HIV-1 và HIV-2. Nhưng HIV-2 thì chỉ đóng gói được các vec tơ HIV-2. Điều đó dẫn đến HIV-2 được ưu tiên cho đóng gói RNA tịnh tiến (co-translationally), vì thế mà hạn chế được khả năng lựa chọn RNA vec tơ dị loại dạng trans. Khả năng của HIV-1 đóng gói được vec tơ có thể là do giảm sự phụ thuộc của nó đối với sự đóng gói ở dạng cis. Vì vậy khả năng tác động của nó với tư cách là một hệ thống đóng gói các RNA khác (Kaye và Lever). Có những điều khó hiểu không giải thích được với các gen dị loại trong việc đóng gói ở một số trường hợp. Chẳng hạn như gen chloramphenicol acetyl transferase (CAT) capsid hóa cực kỳ hiệu quả các hạt virion khi nó nằm trong hệ gen như một thành phần thay thế gen nef hoặc nằm chính giữa một gen của vỏ đã bị loại trừ. Gen CAT trong vùng gag cũng có hiệu ứng âm đối với sự capsid hóa, có thể là do khoảng cách giữa các trình tự dị loại và tín hiệu đóng gói quá gần do đó ảnh hưởng tới cấu trúc bậc 2 của tín hiệu đóng gói. Mục tiêu của một hệ thống vec tơ là chuyển giao một gen dị loại tới một dòng tế bào đích. Có nhiều phương pháp liên quan tới HIV đã được thử nghiệm nhằm thay thế gen virus trợ giúp sao chép cao ở các cấu trúc tách biệt được thiết kế truyền thống để giảm tối đa hoặc loại bỏ hoàn toàn sự phát sinh virus sao chép cao. Sự chuyển gen khi sử dụng lentivirus với vỏ virus nguyên bản được tóm tắt ở Bảng 5.1 5.3.2 Chuyển gen trực tiếp Thực hiện đầu tiên về sự chuyển gen trực tiếp là thay thế gen dị loại (CAT) cho khung đọc mở nef của HIV đủ độ dài (full- length HIV) (Hình 5.4). Một dãy các cấu trúc CAT với các chiều dài khác nhau được cài vào đầu 3’ của virus và một số cấu trúc không làm ảnh hưởng tới năng lực sao chép. Khi chuyển hệ gen đủ độ dài với nguyên bản gen CAT tới các tế bào đích thì gen CAT có lẽ là từ một bản phiên mã ghép nối. Trong các thí nghiệm in vitro năng lực sao chép của virus bị giảm xuống khi kích cỡ của gen cài vào tăng lên. Điều đó hoàn toàn có lý bởi vì muốn tăng kích cỡ của bản phiên mã đủ độ dài thì bắt buộc 68 phải gia tăng đóng gói. Mặc dầu đã có bằng chứng rằng RNA hệ gen có đủ độ dài lớn hơn nữa vẫn có thể được đóng gói (McCann và Lever), nhưng trong thực tế vẫn chưa phân tích được kích cỡ tối thiểu của RNA có thể “vừa khít” trong một lentivirus. Khi cài một gen CAT nhỏ nhất, năng lực sao chép của virus in vitro thực tế là có tăng lên đôi chút so với dạng hoang dã, có lẽ là do nef đã bị loại trừ - chính nó đã có hiệu ứng ức chế nhỏ đối với sự sao chép của virus in vitro. Vì thế, chuyển giao một dấu chuẩn gen có lẽ là hệ hiệu lực nhất. Tuy nhiên, tính độc hại của HIV thì vẫn không thể nào coi thường được. 5.3.3 Virus trợ giúp trung gian Theo các nghiên cứu sớm hơn, khi sử dụng HIV với các trình tự tác động chính xác cis để phân tích sự biểu hiện ổn định của các vec tơ test thì người ta đã sử dụng dòng tế bào có CD4 dương tính. Những tế bào này đã bị nhiễm HIV dạng hoang dã và phần dịch nổi từ môi trường nuôi cấy đã được phân tích bởi RNA slot blot và độ chuẩn vec tơ được đo bằng sự chuyển gen tới một quần thể thứ 2 của những tế bào có CD4 dương tính (Hình 5.5). Khi sử dụng một vec tơ như thế thì vec tơ sẽ có độ chuẩn là 103 và 104cfu/ml (số đơn vị khuẩn lạc tạo thành trên một mililit). Bởi vì bản chất của hệ thống này là sự hiện diện của một virus trợ giúp dạng hoang dã. 5.3.4 Các hệ thống cộng nhiễm 5.3.4.1 Bổ sung vỏ Về mặt phương pháp, đó là một vec tơ đơn có sử dụng một số nhóm của phần bổ trợ env. Ở đây một gen dị loại được đưa vào giữa khung đọc mở env (Hình 5.4). Các khung đọc mở cho các protein phụ trợ Tat và Rev thì vẫn giữ nguyên. Gen dị loại được cài vào là một dấu chuẩn gen như CAT hoặc - galactosidase. Plasmid này sau đó nhiễm vào tế bào cùng với gen biểu hiện vỏ để tạo nên các hạt virus trong đó RNA đủ dài có chứa gen dị loại ở vùng vỏ đã được bọc trong capsid. Plasmid này đặc biệt mạnh, khi nghiên cứu với chính protein vỏ (thường được dùng để phân tích chức năng của sự đột biến vỏ) thì thấy có một phần ngoài vòng đọc của virus lọt vào trong quần thể tế bào đích. Điều này cũng được áp dụng trong nghiên cứu bệnh lý học, trong đó hệ thống có động học sao chép đơn – tròn có thể chuyển giao được các gen dị loại thích hợp. Nó cũng có khả năng cung cấp thông tin về các vấn đề này vì quần thể tế bào thứ nhất có thể ảnh hưởng dễ dàng tới sự thâm nhiễm của virus thông qua các cách thâm nhiễm khác nhau. Ở phần gối nhau giữa các trình tự của vỏ trong 2 cấu trúc thì tăng cao độ tái tổ hợp và tái sinh virus dạng hoang dã đủ độ dài. Vì thế, hệ thống này không được áp dụng in vivo đối với người. Tuy nhiên, trên các mô hình ở động vật thì người ta lại dùng các lentivirus khác như visna và SIV, những virus này có giá trị trong việc nghiên cứu thâm nhiễm và bệnh lý học. 5.3.4.2 Sự cộng nhiễm khi sử dụng vec tơ độc lập và các cấu trúc đóng gói Một vài nhóm nghiên cứu đã công bố các số liệu thực hiện được cũng như hiệu lực của hệ thống này. Nhiều cấu trúc DNA tách biệt đã được cộng nhiễm vào trong tế bào cùng với cấu trúc đóng gói cộng vec tơ (2 thành phần) và với cấu trúc đóng gói bổ trợ công vec tơ (3 thành phần) (Hình 5.6). Trong trường hợp thứ nhất, hệ thống được thiết kế nhằm 69 giảm thiểu tối đa các trình tự trong vec tơ và các cấu trúc đóng gói bằng cách loại bớt đi LTR ở các cấu trúc đóng gói hay làm đột biến trình tự tín hiệu đóng gói ở đầu 5’, rời đi nguyên xi những khung đọc mở và các tín hiệu ghép nối thích hợp. Khi sử dụng hệ thống này phải có sự chuyển đổi tự do của các tế bào dương tính với CD4 với độ chuẩn 102 cfu/ml. Điều quan trọng là là nó không được kém hơn hệ thống vec tơ trên chuột khi đánh giá song song. Cộng nhiễm với 2 plasmid có sự gối lên nhau giữa vec tơ và virus trợ giúp, virus sao chép cao tất yếu là luôn được tạo ra ngay cả khi các trình tự tín hiệu đóng gói đã được loại khỏi virus trợ giúp. Thậm chí khi loại bỏ 35 cặp base trong các cấu trúc đóng gói/ trợ giúp ( phần cấu trúc này có hiệu ứng ức chế cao đối với sự đóng gói ở các tế bào T) thì vẫn chưa đủ để phòng ngừa sự tái tổ hợp. Những điểm yếu của hệ thống cộng nhiễm là hiệu ứng biểu hiện, hay sự lộn xộn của các tế bào được sử dụng (qua các nghiên cứu về đóng gói), hay RNA lại loại trừ những trình tự đóng gói quan trọng dạng cis. Sự tái tổ hợp giữa các heterodimer trong khi phiên mã ngược sau khi thâm nhiễm tế bào đích có lẽ sẽ tạo ra virus sao chép cao. 70 Hình 5.4 Những thay đổi trong việc cài các gen dị loại vào trong cấu trúc provirus. Phần trên cùng chỉ các provirus nguyên bản, phần giữa cho thấy các gen CAT đã được cài vào gen nef, đây là phần sao chép cao. Phần thứ 3 chỉ CAT hoặc gpt đã được cài vào gen của vỏ. Sự bổ sung này cần để biểu hiện vỏ. (Theo Andrew M.L.Lever. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 71 Hình 5.5 Sự chuyển gen qua trung gian virus trợ giúp được sử dụng hữu hiệu trong các nghiên cứu về sự capsid hóa. (Theo Andrew M.L.Lever. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 5.3.4.3 Cộng nhiễm với 3 plasmid Những thí nghiệm về nhiễm tức thời với 3 plasmid mà không nảy sinh virus sao chép cao đòi hỏi phải có ít nhất 2 sự kiện tái tổ hợp giữa 3 cấu trúc. Cấu trúc vỏ thường từ một promoter dị loại hoặc một LTR loại thải và phải có một tín hiệu polyadenylat hóa dị loại. Cho tới nay, cả LTR của HIV và promoter dị loại đều được sử dụng để tạo ra các protein Gag/pol. Chất biểu hiện vỏ thường có một promoter dị loại. Độ chuẩn cực đại theo các tài liệu cho tới nay về cộng nhiễm là 103 cfu/ml. Nhiều tài liệu lại cho các số liệu thấp hơn đôi chút, chỉ vào khoảng 102 cfu/ml. Một số tài liệu trước lại công bố với số liệu cực kỳ cao (105 cfu/ml). Hệ thống này phụ thuộc đặc biệt vào số tế bào đã thao tác thành thạo DNA thâm nhiễm và dung nạp với một nồng độ tương đối cao DNA thâm nhiễm, chẳng hạn như Cos-1. Theo lý thuyết thì không có lý do gì mà những dòng tế bào có thể biểu hiện một cách ổn định với bất kỳ một trong số 3 plasmid lại không được sử dụng vì nó sẽ giảm bớt được việc phải cài các cấu trúc DNA ở bất kỳ thời điểm nào. Chẳng hạn như, trong một dòng tế bào mà biểu hiện ổn định một vec tơ có chứa một dấu chuẩn chọn lọc thì chắn rằng bất kỳ tế bào nào trong quần thể này qua thâm nhiễm sẽ được cài vào những cấu trúc đóng gói vec tơ sao cho nó chỉ mã cho vùng vỏ và vùng gag/pol. Có một khoảng gối lên nhau rất rộng giữa bộ phận này với các các bộ phận nối tiếp trên các dòng tế bào đóng gói, nhưng có một nguyên lý chung là nếu có sự biểu hiện ổn định một cấu trúc mã cho protein gây độc cho tế bào đóng gói thì phải tránh xa và phải được thay thế mới nhờ sự thâm nhiễm tức thì vào hệ thống. 72 Hình 5.6 (a) các cấu trúc bổ trợ thường dùng bao gồm tất cả các protein retrovirrus. (b) cấu trúc đặc biệt của một vec tơ cơ sở HIV, ở đó gen dị loại có thể được kiểm soát bởi promoter của nó, nếu trong antisense thì được kiểm soát bởi promoter của nó và tín hiệu polyadenylate hóa.(Theo Andrew M.L Lever,1999) 73 5.3.5 Các dòng tế bào đóng gói Đối với HIV, hiện nay một số tài liệu có đề cập tới các dòng tế bào biểu hiện ổn định các protein cấu trúc của virus. Nói chung, chúng được mô hình hóa trên hệ thống của chuột, trong đó gen của vỏ được biểu hiện biệt lập với cấu trúc gag/pol. Điều lý tưởng là giới hạn được độ pha loãng của tế bào chỉ biểu hiện một cấu trúc. Những tế bào biểu hiện cao cấu trúc đặc biệt đó sẽ được tách dòng và được biểu hiện kế tiếp và rồi lại giới hạn độ pha loãng được biểu hiện và như thế một quần thể dòng biểu hiện cao sẽ được lựa chọn. Chính sự khác biệt rất lớn về khả năng của các dòng với sự biểu hiện các protein virus đã biện minh cho vấn đề này. Chẳng hạn như sự khác biệt trong biểu hiện p24 lên tới 103 ở các dòng khi biểu hiện gag của HIV. Nhiều nhóm nghiên cứu đã tạo được các dòng tế bào đóng gói trong đó cấu trúc gag/pol đã gây nhiễm được các tế bào với sự trợ giúp của một dấu chuẩn chọn lọc ổn định. Sự biểu hiện của gag phụ thuộc Rev (Rev-dependent) vì thế tế bào biểu hiện gag/pol cũng phải có RRE. Đây là một điểm yếu tiềm ẩn, trong đó chất biểu hiện (tế bào) protein vỏ cũng cần phải có RRE. Nhiều nhóm nghiên cứu chọn lọc các trình tự giống nhau trong các vec tơ của chúng để làm thích hợp nhất cho sự biểu hiện của cả 3 cấu trúc khi sản xuất các vec tơ thâm nhiễm có chứa RRE, điều này sẽ làm tăng độ mạo hiểm của tái tổ hợp. Nhứng đột biến điểm được nhóm Pavlakis thực hiện ở gen gag như thế thì các trình tự của acid nucleic đã biến đổi nhưng trình tự mã amino acid thì lại không biến đổi. Rõ ràng là sự chuyển dịch INS tác động ở dạng cis là rất hiệu lực và nó đòi hỏi gag phải được tạo ra với phương thức độc lập với Rev (Rev-independent manner). Đó có thể là một khả năng nhằm tránh việc gộp thêm vào cả RRE. Một chiến lược khác là gộp thêm cả trình tự tác động cis khác thay thế được RRE. Ở virus khỉ Mason Pfizer (Mason Pfizer monkey virus), một trình tự tác động dạng cis – yếu tố vận chuyển cấu trúc (constitutive transporter element – CTE) đã được chứng minh là có khả năng tác động một cách độc lập với Rev, nó cho phép RNA ra khỏi nhân. Vì thế tế bào biểu hiện gag/pol có thể bao gồm CTR hơn là RRE. Yếu tố biểu hiện vỏ đã được xác định là có chứa RRE, nó như là một bộ phận của trình tự env. Những công trình gần đây chứng minh rằng với các vec tơ thì RRE sẽ làm cho hiệu ứng vận chuyển tăng cao hơn là CTE. Tính phức tạp về mặt di truyền của HIV -1 là ở chỗ chẳng những gen env và gag/pol mà cả những gen điều hòa tat và rev cũng cần được biểu hiện. Các gen phụ như vpr, vpv, vif và nef có thể được bỏ qua khi chuyển gen vec tơ vào trong tế bào T khi các tế bào Cos 1 đã được dùng để sản xuất virus, nhưng trong các trường hợp khác thì vẫn đòi hỏi. Chẳng hạn như vif – là một đòi hỏi tuyệt đối đối với tính gây nhiễm của hạt virus, khi các tế bào sản xuất virus thiếu hụt vif thì sự thâm nhiễm sẽ bị hạn chế. Protein vpu kích thích đãng kể sự giải phóng các hạt virus khỏi tế bào và vpr cần thiết cho sự hợp nhất bên trong tế bào ở Go. Hệ gen HIV có thể được cắt nhỏ thành các đoạn mã cho 5’gag/pol, vif và 3’tat, rev, vpu và env. Tuy nhiên, việc làm cân bằng sự biểu hiện của tất cả các gen từ đoạn 3’ của hệ gen lại là một vấn đề khi chúng nằm ngoài ngữ cảnh di truyền của provirus. Hơn nữa, nếu một trong số đó được chọn lọc cho tế bào biểu hiện gag/pol thì hệ thống này lại cần sự có mặt của Rev. 5.3.5.1 Các vấn đề về protein 74 Các protein lentivirus đặt ra nhiều vấn đề rất đặc biệt như rất khó được biểu hiện ổn định trong một số dòng tế bào xác định. Enzyme protease của virus cần cho các tiến trình của các tiền thân gag và pol, nhưng nó lại là độc tố đối với một số dòng tế bào. Sở dĩ như vậy là vì protease có thể cắt nhỏ một số protein bộ khung tế bào. Các dòng tế bào có biểu hiện protease chỉ tăng lên khi có những đột biến điểm ở gen protease – nhằm trả lại sự thiếu hụt enzyme này. Một nhóm nghiên cứu khác lại phát hiện rằng thường thì khi sử dụng các dòng tế bào từ người sự biểu hiện protease có thể kéo dài hơn. Sản phẩm của gen env cũng là độc tố tiềm ẩn đặc biệt đối với các tế bào có CD4 dương tính. Cũng có trường hợp người ta lại mô tả cả những dòng tế bào có CD4 âm tính, một vài trường hợp còn có thể phát hiện thấy mRNA của CD4 cũng bị tác động. Điều đó có thể là do mức CD4 trên bề mặt tế bào thấp hơn giới hạn phát hiện bằng kỹ thuật nhuộm tổ chức truyền thống. Tuy nhiên, bất kỳ một biểu hiện nào của CD4 trong một quần thể tế bào mà kèm theo cả sự biểu hiện gp120 thì có thể dẫn đến sự liên hợp và chết của tế bào. Đáng chú ý là một số dòng tế bào sản xuất các hạt HIV tốt nhất lại từ các tế bào lympho có CD4 trên bề mặt. Vì thế lại một lần nữa khẳng định, về nguyên tắc thì tốt nhất vẫn là dùng một dòng tế bào đóng gói mà không có CD4 trên bề mặt vì như thế nó sẽ làm giảm tối đa cơ hội tái thâm nhiễm của dòng tế bào này bởi các vec tơ. Cũng có những vấn đề cần xem xét về vai trò quan trọng của protein vpr đối với các tế bào ở Go. Vpr của nhiều dòng tế bào có thể gây cảm ứng làm ngừng chu kỳ tế bào. Người ta đã chứng minh rằng, vpr cần được tạo ra ở những dòng tế bào mà từ đó virion được sản sinh để tạo điều kiện cho việc tạo capsid. Có nhiều thí nghiệm đã chứng minh rõ rằng dòng tế bào được cung cấp vpr dạng trans thì bất hoạt. Trong các vec tơ hệ 3 plasmid gag/pol, env, thì cách thực tiễn nhất là có 2 trong số các cấu trúc này biểu hiện ổn định còn cấu trúc thứ 3 sẽ được đưa vào bằng gây nhiễm tức thì với khung đọc mở vpr trong cấu trúc này. Vpr có tính đặc hiệu mẫu (species), chẳng hạn như vpr của HIV-1 có hiệu ứng cao nhất đối với các dòng tế bào người và vpr của SIV tôt nhất với các dòng tế bào của khỉ. Cả 2 protein này đều kém hiệu quả đối với các tế bào dị loại. Điều này vạch rõ phạm vi sử dụng các vec tơ dị loại để tránh việc làm ngưng trệ sự phát triển. Thật hiếm thấy các dòng tế bào đóng gói lentivirus lại biểu hiện một cách ổn định các protein. Cơ chế của vấn đề này vẫn chưa được rõ. 5.3.5.2 Các cấu trúc có thể cảm ứng được Để vượt qua các vấn đề này thì một dòng tế bào đóng gói phải có các thành phần có thể cảm ứng được. Vấn đề này đã thu được kết quả khi sử dụng hệ thống biểu hiện tetracycline (tet) mạnh để kiểm soát các sản phẩm Rev và Env. Hệ thống này cho phép biểu hiện cao nhưng ngắn hạn các protein mong muốn. Động học của việc sản xuất các protein cấu trúc trong hệ thống này thường là chậm (với hệ thống có cơ sở là tet, trong một số trường hợp cảm ứng tối đa là trên 5 ngày) . Mặc dù hệ thống này thuận tiện cho các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm, nhưng nó vẫn còn rất phức tạp và khó tiêu chuẩn hóa để có thể sản xuất đại trà. 5.3.6 Sự giả vỏ (envelope pseudotyping) 75 Nhiều nghiên cứu đề cập vấn đề lớp vỏ giả dị loại của lõi virus. Lõi HIV được chứng minh là có sự sao giả vec tơ chuột mặc dầu với độ chuẩn thấp hơn nhiều so với độ chuẩn lớp vỏ lưỡng tính nguyên bản của chuột. Gần đây hơn, người ta đã sử dụng lớp vỏ không phải của retrovirus đặc biệt là lớp vỏ (protein G) của virus gây bọng nước ở miệng (vesicular stomatitis virus – VSV). Những lớp vỏ này là do sự sao giả của các lõi HIV, nó tạo ra được các hạt virus ổn định khi đông khô và cho độ chuẩn CD34 cao ở quần thể tế bào gốc của tủy xương. Sự tổ hợp của lõi lentivirus và vỏ VSV rõ ràng là làm cho sự chuyển gen tới các tế bào Go có hiệu lực. Khi thí nghiệm song song với các vec tơ chuột thì thấy độ chuẩn của chúng rơi xuống gần số không. Ấn tượng hơn là tiêm trực tiếp vào não động vật các hạt virus HIV có VSV-G giả thì có khả năng ổn định tốt sự chuyển gen vào trong các neuron và các tế bào thần kinh đệm. VSV giả cho phép các hạt vec tơ qua đường nhân để vào được bên trong nên làm tăng hiệu quả chuyển gen. Thời đại đương thời người ta quan tâm rất nhiều tới sự chuyển gen đến nhiều mô in vitro. Tuy nhiên, rõ ràng là nếu độ chuẩn in vitro lên tới 109 thì vẫn là tương đối thấp đối với sự tải nạp các tế bào in vivo. Vẫn còn những bàn cãi về hiệu lực của các vec tơ này đối với sự chuyển gen tới các đích quan trọng như các tế bào gốc tạo máu chẳng hạn. 5.3.7 Sự chuyển giao protein HIV là một trong số các virus đầu tiên được mổ xẻ về sự tương tác protein – protein dẫn đến sự hợp nhất các protein phụ trong các hạt virus. Chẳng hạn như protein Vpr có trong các hạt virus dẫn tới sự tương tác đặc hiệu với phần P6 của Gag và trong sự tương tác này thì đột biến được xác định là có liên quan tới các amino acid. Tương tự như vậy, một protein của tế bào- cyclophilin tương tác trực tiếp với CA. Hiện tượng này đã được người ta tận dụng để đưa các vùng gắn với P6 vào trong các protein dị loại và cũng để chứng minh cho sự hợp nhất của các phân tử đầu tận trong các hạt virus. Mặc dầu gen trị liệu và hệ thống vec tơ với mục đích thông thường là chuyển các trình tự acid nucleic, nhưng rõ ràng là nó còn được ứng dụng nhiều trong việc chuyển giao các protein tới tế bào. 5.3.8 Độ chuẩn virus Khi các RNA virus đủ độ dài hợp nhất trong các hạt virus, thậm chí với các gen dị loại hợp nhất thay thế nef hoặc thay thế một phần trình tự của vỏ thì hiệu quả của sự đóng capsid và chuyển giao dường như là cực kỳ cao. Những vec tơ có độ dài ngắn hơn hệ gen thì không có kết quả. Thậm chí sự hợp nhất của tất cả các trình tự tín hiệu đóng gói trong một vec tơ gồm cả vòng gốc TAR, trình tự dẫn 5’ (5’ leader sequence), gen gag, đầu cuối 3’ của vỏ hay RRE đơn lẻ hiếm khi đạt được độ chuẩn lớn hơn 103 cfu/ml. Lý do tại sao thì vẫn chưa rõ và rõ ràng là các vec tơ lentivirus của chuột đối với sự đóng capsid (capsid hóa) đạt mức tương đương với RNA virus hoang dại. Điều này làm cho ta chú ý nhiều tới lentivirus đối với sự capsid RNA mã cho protein Gag. 5.4 Phạm vi ứng dụng Việc sử dụng các vec tơ có cơ sở lentivirus đã được nhắc tới ngay từ đầu chương. Vai trò hiển nhiên của nó là chuyển các gen tới các tế bào dương tính với CD4 để thực hiện 76 gen trị liệu đối với các thâm nhiễm HIV. Vấn đề này trước tiên là hướng tới các bệnh nhân đã có HIV dương tính, nhằm bảo vệ về mặt di truyền cho các tế bào CD4 trong cơ thể chưa bị nhiễm virus. Các bệnh khác có ảnh hưởng tới bạch cầu và các tế bào đơn nhân, đại thực bào cũng là những mục tiêu hướng tới. Việc sử dụng các lentivirus hay chimera lentivirus cho các tế bào không ở giai đoạn đang phân chia tuy đã được chứng minh nhưng vẫn còn phải kéo dài thêm một thời gian nữa. Hầu hết những người có liên quan tới việc nghiên cứu vec tơ đều có khái niệm cho rằng một vec tơ hoàn thiện sẽ phải là sự hòa trộn của các thành phần từ các virus khác nhau, mỗi thành phần có một đặc tính riêng và cuối cùng những thành phần này có thể sẽ được hợp nhất thành một hạt không phải là virus hoàn chỉnh. 5.5 Độ an toàn Ở Anh Quốc HIV và SIV được xếp vào hạng thứ 3 trong các tác nhân gây bệnh và tất cả các công việc có liên quan tới virus sống hoặc các cấu trúc phụ nhưng có thể nảy sinh virus sống đều phải được cách ly bảo vệ. Những công việc liên quan tới các lentivirus khác (MVV, EIAV) thì phải lưu ý tới sự tiềm ẩn của các yếu tố gây bệnh cho động vật. Cho đến bây giờ vẫn chưa có một quy trình thử nghiệm lâm sàng nào được phê chuẩn với việc sử dụng lentivirus toàn phần hay từng phần trong việc chuyển gen trên người. Dường như có sự khác nhau đôi chút về mức độ đòi hỏi về độ an toàn đối với một vec tơ bao hàm tất cả các thành phần của retrovirus chuột với một vec tơ là chimera trong đó một bộ phận của chimera có liên quan tới lentivirus. 77 Chương VI CAC VEC TƠ ADENOVIRUS 6.1 Mở đầu Các vec tơ adenovirus là một trong số các phương tiện chuyển gen trực tiếp hứa hẹn nhất in vivo trong gen trị liệu trên người điều trị các bệnh di truyền đơn gen như bệnh xơ nang, bệnh đau cơ Duchenne và bệnh ưa chảy máu A và B cũng như các bệnh mắc phải như ung thư (Trapnell và Gorziglia, 1994; Wilson, 1995). Hơn nữa, việc sử dụng các vec tơ adenovirus trong các trị liệu ex vivo cũng đã được đánh giá. Các vec tơ adenovirus có nhiều lợi thế vượt hẳn các hệ thống chuyển gen khác, nó có thể tải nạp được nhiều dạng tế bào và không đòi hỏi tế bào đích phải phân chia trong chuyển và biểu hiện gen. Nhiễm sắc thể của adenovirus còn duy trì được episome trong tế bào tải nạp, vì vậy tránh được khả năng đột biến ghép (Gingsberg,1984; Horowitz,1990). Adenovirus có thể hoàn trả những thiếu hụt về sao chép do các gen điều hòa đặc biệt của virus đã bị loại đi (Berkner, 1988; Gorziglia và cộng tác.,1996), điều đó cho phép các vec tơ điều tiết được việc cài DNA dị gen trên 8 kb - tùy thuộc vào độ dài đoạn gen đã bị loại trừ. Sau nữa, người ta vẫn chưa thấy sự thâm nhiễm adenovirus nào có liên quan tới việc tạo khối u trên người, vì thế adenovirus được coi như là một vaccine sống có trong hàng triệu con người (Straus, 1984). Bất lợi chính của các vec tơ adenovirus là gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ vì thế mà làm giới hạn thời gian biểu hiện của gen chuyển và khả năng tái sử dụng vec tơ. Những cố gắng hiện nay hướng trực tiếp vào việc làm giảm tính sinh miễn dịch của các vec tơ và phát triển các chiến lược đánh lừa đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Vài năm trước đây cũng có một số công trình thông báo đã chuyển giao thành công qua trung gian vec tơ adenovirus cũng như biểu hiện được nhiều gen dị loại ở một số động vật (Trapnell và Gorziglia, 1994; Wilson. 1995). Cho tới nay, các vec tơ adenovirus đã được sử dụng hoặc dự định sử dụng trong trị liệu lâm sàng trên người các bệnh xơ nang, bệnh thiếu hụt ornithine transcarbamolyse và các dạng ung thư như: ung thư vú, kết tràng, nguyên bào xốp, ung thư đầu và cổ, u hắc tố da, u nguyên bào thần kinh, u buồng trứng, u tuyến tiền liệt (Marcel và Grauz, 1996) và u phổi (Cohen – Haguenauer, 1996). Tuy nhiên, gen trị liệu qua trung gian vec tơ adenovirus đều phải thực hiện ở giai đoạn sớm, tất cả các nghiên cứu đều ở pha I với mục đích đảm bào an toàn hơn là tính đến hiệu quả. 6.2 Cấu trúc và tổ chức của adenovirus Adenovirus trên người là các virus DNA không vỏ, thuộc họ parvoviridae (Ginsberg, 1984; Horowitz, 1990). Đường kính của virion là 80-90nm với hình thái icosohedral nhọn, khối lượng nguyên tử 175-185 x 106 Da. Theo huyết thanh học, các adenovirus được phân 78 thành gần 50 serotype, với các dưới nhóm từ A tới G (Wadell, 1984). Các virus thuộc dưới nhóm A và B tiềm ẩn khả năng gây ung thư trên các loài gặm nhấm mới sinh, các virus dùng trong chuyển gen thuộc dưới nhóm C, không gây khối u. Adenovirus dưới nhóm C chỉ gây các bệnh hô hấp nhẹ trên người, chiếm khoảng 5-15% các trường hợp cúm thông thường (Straus, 1984). Adenovirus đã phân lập được cách đây trên 40 năm (Rowe và cộng sự., 1953), những hiểu biết về hệ thống di truyền của adenovirus cũng tăng lên không ngừng, một phần cũng vì adenovirus sớm được để ý tới như một mô hình biểu hiện gen với các tế bào nhân chuẩn (Ginsberg, 1984; Horowitz, 1990). Adenovirus thâm nhiễm các tế bào đích bằng cách gắn vào receptor của coxsackie và adenovirus (coxsackie and adenovirus receptor – CAR) trên bề mặt tế bào (Bergelson và cộng sự., 1997) nó được “hòa nhập” qua các lỗ bọc clathrine để đi vào thể THNB (endosome), virion được loại khỏi tế bào chất bằng cơ chế ly giải nội bào (endosomolysis), sự chuyển vị tới màng nhân qua các tín hiệu đích trong các polypeptide capsid, hệ gen virus được chuyển vào nhân tế bào, ở đó nó duy trì ở dạng episome. Hình 6.1.Sơ đồ đại diện của hệ gen adenovirus và sự điều hòa phiên mã. Hệ gen của adenovirus xếp thẳng hàng song song, các đơn vị phiên mã là các vùng có mũi tên. Các mũi tên trên chỉ hướng của phiên mã. Các mũi tên cong chỉ các con đường chuyển hoạt hóa. Các đơn vị phiên mã trung bình hoặc nhỏ là pIX, IVa và VA-RNA (I-III). Những vùng lặp tận cùng đảo ngược là các ITR cũng như các protein 55 kDa liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của hệ gen. Cả vùng ITR và sự có mặt của protein tận cùng đều cần cho việc sao chép của virus có hiệu quả. Phần chính của vec tơ adenovirus thế hệ thứ nhất (Av1) có cả những phần loại bỏ E1 và E3; tuy nhiên, một vài vec ơ Av1 chỉ chứa vùng loại bỏ E1. Loại bỏ vùng E1 sẽ làm cho sự sao chép của virus bị suy giảm vì các sản phẩm của gen E1 điều chỉnh lên các đơn vị phiên mã chính của virus như E2, E3 , E4 và promoter muộn chính (major late promoter-MLP) (được chỉ bằng mũi tên cong). E1, E2 và E4 được hoạt hóa bởi yếu tố phiên mã trong tế bào vật chủ. Các vec tơ thế hệ 3 (Av3) kiềm chế ngoài những phần cắt bỏ E1 và E3 còn thêm cả vùng E2a đã loại bớt một phần. Các vec tơ loại kết hợp E1/E3/E4 cũng đã được thiết lập. Những vec tơ được loại bớt sau này làm giảm được sự biểu hiện của các đơn vị phiên mã muộn do ngăn ngừa được vịệc điều chỉnh lên của MLP bởi các sản phẩm của gen E2a hoặc E4. Ghi chú: ()- prtein tận; ()-promoter. (Theo Sheila Connelly. Gene Therapy Technologies, Applications and regulations. John Wiley & Sons Ltd 1999). 79 Hệ gen adenovirus gồm các phân tử DNA chuỗi kép, thẳng với chiều dài 36 kb, có các liên kết đồng hóa trị gắn đầu 5’ với một protein tận cùng 55 kDa cần cho sự sao chép của DNA virus. DNA virus có chứa những đoạn lặp tận cùng đảo ngược, ngắn (short, inverted repeats –ITR) ở mỗi đầu cuối của hệ gen – cần cho sự sao chép DNA. Hệ gen virus được tổ chức với 4 vùng phân biệt sớm có tên từ E1 đến E4 và 5 vùng ghép muộn từ L1 đến L5 – cơ sở cho sự biểu hiện trước hay sau sự khởi đầu tổng hợp DNA virus, thêm vào đó còn có một vài trung gian phụ hoặc các đơn vị phiên mã muộn (Hình 6.1). Nói chung các sản phẩm sớm của gen đã làm thay đổi sinh học tế bào vật chủ để giúp cho việc sản xuất virus, còn những gen muộn lại mã cho hầu hết các protein cấu trúc là thành phần của virion và giúp cho sự lắp ráp của virus. Ngay khi hệ gen virus vào tới nhân, vùng E1 được phiên mã tích cực bởi các yếu tố phiên mã và mã hóa cho các protein có liên quan trực tiếp tới việc hoạt hóa các vùng E2, E3 và E4. Trong các tế bào nuôi cấy, các sản phẩm gen E1 được mã trong vùng E1a và E1b đã sao chép thông tin virus cảm ứng (Van der Eb và cộng sự., 1997). Vùng E2 mã cho các protein cần cho sự sao chép DNA virus bao gồm một protein gắn DNA chuỗi đơn (E2a) và polymerase DNA virus cũng như protein tận cùng 55 kDa. Vùng E3 là tập hợp của các đơn vị phiên mã liên quan tới việc lẩn tránh các cơ chế bảo vệ của vật chủ, loại trừ các tế bào đã bị nhiễm virus, và không thiết yếu đối với sự sao chép của virus (Wold và Gooding, 1991). Các sản phẩm của gen E4 có liên quan tới việc điều hòa biểu hiện protein của tế bào và virus, sự sao chép DNA của virus, sự tích trữ mRNA của virus và sự tổng hợp protein, điều chỉnh xuống một cách tương ứng sự tổng hợp protein vật chủ. Một công trình mới đây chứng minh rằng protein E4 mã trong khung đọc mở 6, có tiềm năng gây ung thư tương tự như gen E1b (Moore và cộng sự., 1996). Sự biểu hiện của các gen sớm dẫn đến sao chép DNA khoảng 8 giờ sau khi thâm nhiễm và sự hoạt hóa tiếp của các gen muộn dưới sự kiểm soát phiên mã của promoter muộn sẽ sản sinh ra các virus con cháu và cuối cùng là các tế bào vật chủ chết và virus được giải phóng. 6.3 Thiết kế và cấu trúc vec tơ adenovirus người khiếm khuyết sao chép Các vec tơ adenovirus khiếm khuyết sao chép cũng tương tự như những vec tơ virus khác, chúng gồm một cấu trúc virion bao quanh hệ gen virus đã cải biến. Cho tới nay, hầu hết các hạt vec tơ cơ sở cấu trúc capsid dạng hoang dã, ngoài nhiệm vụ bảo vệ DNA virus nó còn là phương tiện để gắn và đi vào bên trong tế bào đích (tải nạp). Tuy nhiên, hệ gen virus đã có những cải biến đáng kể. Những biến đổi này được thiết lập nhằm vô hiệu hóa sự phát triển của virus trong tế bào đích do đã loại trừ những chức năng đặc biệt của virus đối với sự điều hòa sao chép DNA và sự biểu hiện gen virus trong khi vẫn có thể phát triển trong tế bào đóng gói hoặc tế bào trợ giúp. Việc loại bỏ các trình tự như vậy tạo ra không gian trong hệ gen virus để DNA ngoại sinh vẫn cài vào được mà vẫn biểu hiện được các gen chuyển. Các adenovirus dưới nhóm C, serotype 2 và 5 (Ad2 và Ad5) là những adenovirus được nghiên cứu nhiều nhất và những virus này thường dùng như các vec tơ chuyển gen. Các vec tơ adenovirus được dùng cho gen trị liệu chủ yếu là các vec tơ thay thế E1, ở đó các gen chuyển được cài vào vùng E1. Vùng bị loại trừ của E1 bao gồm toàn bộ hệ gen E1a và khoảng 60% gen E1b. Ngoài phần còn lại của hệ gen virus, vec tơ này còn giữ lại đầu 80