🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Thực Hành Hóa Sinh Học Ebooks Nhóm Zalo Đ A I H O C Q U Ố C G I A H A N Ô I NGUYẾN V À N MÙI f f i a ! (Ị}G Hểl NỌI NHÀ XUẢT B á n đ ạ i h ọ c q u ố c g i a h à n ộ i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI • • • NGUYỄN VẢN MỪI THỰC HÀNH ■ HOÁ SINH HỌC NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001 Lời nói d ầ u ...................................................................................................................................... ~ Chương 1. Hoá c h ấ t và d u n g d ịc h .............................................................................................9 I. Khái niệm vê hoá c h ấ t................................................................................................................ 9 II. Dung dịch................................................................................................................................. 13 III. Nồng độ dung dịch................................................................................................................ 14 IV. Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn độ.............................................................................. 22 V. Cách tính hệ số điều ch ỉn h .....................................................................................................25 VI. Bài t ậ p ....................................................................................................................................... 26 Chương 2. P hư ơng pháp lấy m ẩu phản t í c h .....................................................................29 I. Lấy m ẫ u ....................................................................................................................................... 29 II. Chuẩn bị mẫu phán tích..........................................................................................................31 III Cỏ định m ẫ u .............................................................................................................................. 31 Chương 3. P hư ơng pháp so m a u ............................................................................................ 34 I . Phương pháp so m àu.................................................................................................................34 II. Định luật Lambert-Beer......................................................................................................... 35 III. Màu dung dịch và chọn hước sóng ánh sáng (hay chọn kinh lọc m àu) ......................37 Chương 4. P h ư ơ n g pháp q u a n g ph ố k ế ................................................................................43 I. Hấp thụ tử ngoại của các loại cuvet khác n h a u ................................................................ 44 II. Quang phổ hấp thụ tử ngoại của NAD* và N A D H ..........................................................44 III. Ước tính khôi lượng NADH...................................................................................................45 C hương 5. Đ inh lượng g lu x it.....................................................................................................46 I. Định lượng đường khứ theo phương pháp B ertrand ......................................................... 46 II. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich..............................50 III. Định lượng glucozd trong máu bằng phương pháp N elson .........................................52 rv. Định lượng fructozd trong (lung dịch có lản đường khử khác ................................................ 53 V. Định lượng đường khử bằng phường pháp axit. dinitro-salicylic (DNS) ......................55 VI. Định lượng sacarozd theo phương pháp thuỷ phân bằng axit........................................56 VII. Đinh lượng tinh bột theo phương pháp thuỷ phân bằng a x it.......................................57 VIII. Định lượng xenlulozơ.......................................................................................................... 59 IX. Định lượng pectin bằng phương pháp canxi p ectat....................................................60 X. Định lượng dextrin bằng phương pháp kết tủa vối cồn ................................................. 61 Chương 6. Đ ịnh lượng lipĩt........................................................................... ......................... 63 I. Định lượng lipit bằng máy Soxhlet ...................................................................................... 63 II. Xác định các chỉ sô của lipit................................................................................................ 6 6 Chương 7. Định lương axỉt am in và p r o te in ................................................................... 72 I. Định lượng axit amin bằng phương pháp chuẩn độ íbrmol (phương pháp Sorensen) ............................................................................................ *..........................................................72 II. Định lượng axit amin bằng n inhiđnn................................................................................74 III. Định lượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Pope và S t e v e n s ) ......................................................................................................................................... 76 IV. Định lượng nitd bằng phương pháp Kjeldahl.................................................................. 78 V. Định lượng protein bằng phương pháp Lowrv.................................................................83 VI. Định lượng protein tỏng sỏ, albumin và globulin trong huyêt thanh máu hằng phương pháp Biure......................................................................................................................84 VII. Định lượng protein bằng Coomasie Brilliant Blue G-250 ......................................... 8 6 VIII. Định lượng protein bằng phương pháp quang phô.....................................................89 Chương 8. Đ ịnh lượng axit n u c le ic ......................................................................................92 I. Phương pháp Schimidt và Thannhauser............................................................................ 92 II. Phương pháp Schneider........................................................................................................ 94 III. Phương pháp Ogur và Rosen.............................................................................................95 IV. Phướng pháp quang phố......................................................................................................97 V. Định lượng hợp chất photpho trong mô ruột theo phương pháp Schmidt và Thannhauser có sửa đổi.............................................................................................................98 VI. Định lượng photpho theo phương pháp Horecker và các cộng sự..............................101 VII. Định lượng photpho vỏ cơ có nguồn gốc từ photpholipit theo phường pháp Delorv ....................................................ĩ............................................ .............................101 VIII. Định lượng ARN bằng orxinol ...................................................................................... 102 IX. Định lượng ADN bằng phướng phấp điphenylamin ..................................................104 Chương 9. Xáo định hoạt đô của m ột sô e n z im ............................................................106 I. Định nghĩa (lơn vị hoạt độ của enzim...............................................................................106 II. Chú ý khi xác định hoạt độ enzim .................................................................................... 106 III. Xác định hoạt độ của ascorbat oxidaza .......................................................................... 107 IV. Xác định hoạt độ của a- amylaza theo Rukhliadeva Geriacheva........................................108 V. Xác định hoạt độ của catalaza...........................................................................................112 VI. Xác định hoạt độ cholinesteraza của huyết thanh (ChE) - phương pháp sửa đổi của H e s t r i n ......................................................................................................................................... 113 VII. Xác định hoạt độ của glucoamylaza...............................................................................114 VIII . Xác định hoạt độ lipaza.................................................................................................116 IX. Xác định hoạt độ papain....................................................................................................118 X. Xác định hoạt độ pepsin bằng phương pháp Anson ......................................................121 4 XI. Xác định hoạt độ peroxidaza............................................................................................ 123 XII. Xác định hoạt độ photphataza kiếm và photphataza axit theo phương pháp King - A r m s t r o n g ................................................................................................................................... 125 XII ỉ. Xác định hoạt độ proteinaza theo phương pháp Anson cai tiên ......................................... 127 XIV. Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuân độ...............................................130 Chương 10. Đ ịnh lượng v ita m in ..........................................................................................132 I. Định lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn đ ộ ........................................................132 II. Định lượng vitamin B 2 bằng phương pháp huỳnh quang ........................................... 135 III. Định lượng vitamin B 1bằng phương pháp huỳnh quang ............................................142 Chương 11. Đ ịnh lượng m ột sô" nguyên t ô ...................................................................... 144 I. Định lượng photpho.............................................................................................................. 144 II. Định lượng Kali tổng sô của thực vật bằng Natri Cobantinitrit ............................................150 III. Định lượng Canxi và Magie tống sô của thực vật bằng trilon B ...............................151 IV. Định lượng Canxi trong mô cơ theo phương pháp R e t i n x k i ......................................152 V. Định lượng sắt....................................................................................................................... 154 ("hương 12, Phụ lục.................................................................................................. 155 I. Các dung dịch đệm ................................................................................................................ 155 II. Dung dịch pH chuẩn............................................................................................................163 III. Nồng độ axit và amoniac thường g ặ p .............................................................................163 IV. Pha dung dịch phần trăm axit và amoniac....................................................................164 V. Khỏi lượng mol phân tử và tỷ khôi của một sô" a x it ...................................................... 165 VI. Kiêm tra nồng r* \ các dung dịch chuẩn độ đã pha bằng dung dịch chát gốc có nồng độ chính xác................................................................................................................................ 165 VII. Chỉ thị màu axit - bazơ.................................................................................................... 166 VIII. Cách pha và sử dụng một số thuốc thử chỉ thị màu thông thường ........................167 IX. Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn trong phòng thí nghiệm .........................................168 X. Nguyên tử khôi của một sô" nguyên tô"..............................................................................169 XI. Nồng độ dung dịch amoni sunfat băo hoà ở nhiệt độ khác nhau .......................................... 170 XII. Cách tính lực li t â m ..........................................................................................................170 XIII. Các ký hiệu quy định kích thưóc và các phần thập p h ân ........................................170 XIV. Các chữ cái Hy L ạp..........................................................................................................171 XV. Các tính chất của một sô đồng vị phóng xạ ứng dụng trong y sinh học .................171 XVI. Sự phụ thuộc của tỷ khổi và chỉ sô" khúc xạ vào nồng độ dung dịch.......................172 Tài liệu th am k h ả o .................................................................................................................... 173 5 L ờ i n ó i đ ầ u Giáo trình "Thực hành hoá sinh học” dùng cho sinh viên năm thứ ba, ngành Công nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quỏc gia Hà Nội. Sinh viên tiến hành làm 20 bài thực hành của 11 chương khác nhau, tùy thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép. Cán bộ phụ trách thực hành có thê lựa chọn các bài của các phần như: cách tính toán các loại nồng dộ, xứ lý mẫu till nghiệm, phương pháp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượng gluxit, định lưựng lipit., định lượng axit amin và protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ định lượng vitamin, định lương một sô' nguyên tô'kim loại ... Ngoài ra, quyên sách còn được dùng cho thực tập chuyên đề của sinh viên năm t hủ' tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá sinh học, trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Sách đả được sửa chửa và bố sung một sô phương pháp ở các chương định lượng protein, xác* định hoạt độ một sô" enzim, định lượng một sô" nguyên tô" kim loại... so với lan xuàt ban đầu. Tác giả 7 C h ư ơ n g 1 HOA CHAT VA DƯNG DỊCH I. KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT 1. Các c h ấ t hoả học Các chất dùng đê phân tích hoá học, làm tiêu bản.... trong phòng thí nghiệm được gọi là hoá chất. Các hoá chất có thê là chất rắn, lỏng, khí có mức độ tinh khiết khác nhau. - Sạch kỹ thuật - Sạch phản tích * Sạch hoá học Hoá chất được-'đóng trong các chai lọ thuỷ tinh, nhựa... có nhãn ghi (Hình 1.1): - Tên hoá chất - Công thức hoá học - Mức độ sạch - Khôi lượng hoá chất - Phân tử khôi - Nơi sán xuất - Điều kiện bảo quản Ethyl acetate GPR CH3COOC2H5 M.W.88.11 g/ml 0.90 99% By IR spectrum Maximum Limits o f Impurities Water Non-volatile matter Acidity (CH 3COOH) Ethanol Heavy metals (as Pb) Hinh 1.1 - Nhãn hoá chất 9 0.1% 0.005% 0.05% 0.5% 0.0002% Tính chất nguy hiểm của hoá chất được cảnh báo bằng các ký hiệu in trên n h à n hoá chất (Hình 1.2). Chất ản mòn Chất kích thích Chất dễ nổ Chất dễ cháy Chất dễ oxi hoá Chất độc hại môi trường Chất độc Chất có khói độc Chất có phóng xạ Hình 1.2 - Các kỷ hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm Trong các cơ quan nghiên cứu và nhà máy sản xuất hoá chất có những vùng nguy hiểm được cảnh báo bằng các ký hiệu (Hình 1.3), các biển hiệu cấm (Hình 1.4) và các biên hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5). A A A A A AUAMOKH OLA t l 4k .4*. A*. Rủi 1 * 0sinh học <- Dễ cháy không mỏ INFECTION A <— Nguy hiểm nhiễm trùng <- Nguy hiếm nhiễm trùng <— Mẫu bệnh lý, chú ý dễ hỏng <” Tiệt trùng <- Cảnh báo nguyên liệu phóng xạ 0 BSBEBSpn [ I STERILE STERILE STÊRH A A u«>r. trj?' Vùng có chất độc Nguyên liệu dễ bốc cháy Nguyên liệu dễ nô Có tia laze Chất ăn mòn Rủi ro sinh học Hình 1.3 - Ký hiệu cảnh báo các vùng nguy hiểm Cấm hiit thuốc Câ'm lửa Cấm vào Cấm đi bộ Cấm dập lửa Nưốc không Cấm dùng găng tay bằng nước uống được bằng cao su Hình 1.4 - Các ký hiệu cấm II Mũ bảo hiểm Chông ồn Phải rửa tay trước Phải đi ủng cao su •> + * % Mù. kính báo hiêm, chông ôn Mủ che đâu và mặí Chỉ được đi bộ Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có khẩu trang Phải có găng tay cao su Phải có kính Phải có mặt nạ chống: độc Tire nearest first box 'm situated— > Person in c h a rg e flH . J.. . - . . . . . Dội nưóc khẩn cấp Hộp trợ cứu đầu tiên Rửa mắt TrỢ cứu đầu tién Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn 12 2. Cách sử d ụ n g hoá ch ất a) Cần g iữ hoá chất sạch - Chai lọ hoá chất phải cỏ nắp Trước khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cô lọ. - Không clùng lẳn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất. - Không dùng hoá chất đã rơi vãi. h) Hoá c h ấ t (tá p h a - Lọ hoá chất phải có nhăn ghi tên hoặc công thức hoá học. - Ghi n ồ n g độ dung dịch. - Ghi ngày pha. * Chai lọ đựng hon chất pha phải có nắp. - Không đê hoá chất rơ i vào nhăn. - Trước khi mớ nắp lọ phải lau sạch nắp và cô lọ. - Để nấp và dụng cụ lây hoá chất ở nơi sạch, không đế phan tiếp xúc vối hoá chất xuống bàn. c) B àn th í n g h iêm - Chỉ đê hoá chất dang dùng lúc đó. - Các ho á chất đê bốc hơi, có mùi... phải lấy nhanh hoặc lấy trong tủ hút, phải đậy kín, - Khi làm việc vói kiềm, axit và các chất độc phải theo đúng quy (lịnh. - Không được ngửi hay nếm thử hoá chất. - Các hoá chất dễ cháy, dễ nô không được để gần lửa. II. DUNG DỊCH Dung dịch là hồn hợp nhiều loại của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ vói nhau về lý, hoá học - thành phần đơn giản nhất của dung dịch có thê tách ra được ớ dạng t inh khiết, ngược lại có thể điểu chế dung dịch ấy theo một thành phần bất kỳ dược gọi là thành phần dư trong dung dịch so với thành phần kia là dung môi. Thành phần còn lại là chất hoà tan. Ví dụ: - Dung dịch NaOH 10% trong nước: NaOH là chất tan, nước là dung môi. 13 - Butanol bão hoà nước: Nước là chất tan. butanol là dung môi. 111. NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH Trong phép tính nổng độ dung dịch, các chất tan được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng, khôi lượng moi đương lượng gam (thường được sử dụng), còn sô lượng dung mòi hoặc dung dịch được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng mol hoặc đơn vị thê tích. Trong nghiên cứu thường dùng 3 nồng độ cơ bản. - Nồng độ phần trám (%). - Nồng độ mol/1 (mol - M). - Nồng độ đương lượng gam (N) Ngoài ra còn có: - Nồng độ gam trên lít: sô" gam chất tan có trong một lít - Nồng độ dung dịch bão hoà: là ở nhiệt độ nhất định, chất hoà tan không thê hoà tan thêm được nữa. Thường biểu thị bằng sô" gam chất tan trong 10 0ml nước. 1. N ồng độ phần trảm (được chia làm 3 loại n ồn g độ) - Phần trăm khỏi lượng - khối lượng (% w/w) là sô" gam ciia một. chất hoà tan trong 10 0gam dung dịch. - Phần trăm khối lượng - thể tích (% w/v) là sô" gam của một chất koà tan trong 10 0ml dung dịch. - Phần trăm thê tích - thê tích (% v/v) là sô" ml của một chất hoà tan trong 100ml dung dịch. Ngoài ra còn có loại nồng độ phần trăm chất hoà tan nhỏ 1000 lần được tính bằng: + Miligam phần trăm (mg%) là sô" mg của chất hoà tan trong lOOg hoặc trong 100ml dung dịch (rag/lOOml). + Microgam phần trăm (ng%) là sô" microgam (|ig) của chất hoà tan trong 10 0gam hoặc lOOml dung dịch (Ịig/100ml). và hai loại nồng độ thường được sử dụng là: + Dung dịch phần nghìn (%o) là sô" gam chất hoà tan trong 1000ml dung dịch. + Dung dịch phần triệu (ppm) là sô' gam chất tan trong 1.000.000ml dung dịch hay miligam trong 10 0 0ml dung dịch hoặc microgam trong lml. a) N ồng độ p h ầ n tră m khôi lương - kh ố i lương (% w /w ) • Chất rắn tan trong chất lỏng 14 + Chất rắn không ngậm nước Pha dung dịch từ chất rắn không ngậm nước được tính theo công thức sau: X = — (1.1) 100 Trong đó: X - sô gam chất tan lấy đê pha a - số phần trăm dung dịch muôn pha b - khối lượng dung dịch cần pha Ví dụ ỉ: Cần bao nhiêu gam NaCl và bao nhiêu ml nưốc để nhận được 300 gam đung địch NaCl 15% (w/w)? Giải: Áp dụng công thức trên ta có: x = l ^ -3-9° = 45(g) 100 Đáp so: Để nhận được 300 gam dung dịch NaCl 15% (w/w) cần cân 45 gam NaCl hoà tan trong 255 gam (ml) nước (300 - 45 = 255). + Chất rắn ngậm nước Muôn pha dung dịch này phải tính cả lượng nưốc ngậm trong phân tử của chất tan, sau đó tính khôi lượng tổng cộng (khôi lượng chất tan và khổì lượng nưốc ngậm). Công thức tính: X = — (1 .2 ) w Trong đó: X- sô" gam chất tan lấy pha a- khôi lượng mol ngậm nước b- phần trăm dung dịch cần pha w- khôi lượng phân tử không ngậm nước. Ví dụ 2: Pha dung dịch Cu s o 4 10% từ C uS0 4.5H 20 . Giẩi: Phải tính khôi lượng mol của C 1 1SO4và CuS0 4.5H20 C uS 04= 159,6 (-160); C uS 0 4.5H20 = 249,7 (-250). Lắp vào công thức: X = 25010 = 160 Đáp số: Cần phải cân lõ, 6g CuSO^.õH.^O và 84,4 gam (ml) nước (100 - 15,6 = 84,4) ta được dung dịch CuSO ị 10% (w/w). 15 Trong thực tê, khi pha những dung dịch có nồng độ) vài % thì người ta thường cân chất tan rối cho vào binh định mức hay ông đongr, sau đó thêm nước đên ngàn muôn pha (vi trong trường họp này thẻ tích mất đi khôrhg đáng kể), cỏng thức tính: (1.3) - Chất lỏng tan trong chất lỏng Chất tan ở đây là chất lỏng và được cân như chất tam và dung môi là nước. Tính theo công thức: X = 10 0- a Trong đó: a - sô gam chất tan X - số ml nước cần (lùng. (1.4) Ví dụ 3: Pha dung clịch HC1 10% trong nưôc: ta cân dung dịch HC1 rồi láy 100 gam trừ đi sô gam HC1 là lượng nước thêm vào. *Chú. ỷ: Các chất lỏng có nồng độ hoà tan tôi đa được tính theo phần trăm. Ví dụ: H.,SO | hoà tan tôi đa là 96%, HC1 là 37%, H.,PO.ị là 65% v.v... Vì vậy khi cân các chất lổng này phải tính sô gam chất đó trong dung dịch theo công thức: 100.a A — —------- *b Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần có a - nồng độ dung dịch cần pha b - nồng độ chất tan hiện có. Ví dụ 4: Pha dung dịch HC1 10%. Ta có HC1 đặc là 37%, vậy khối lượng HC1 được tính theo công thức(l.õ): Như vậy ta phải cân một lượng HC1 là 27,03g, sau đó thêm một lượng nước: 100 - 27,03 = 72,97 (hay 72.97ml nước vì clị|i() = 1) Đôi với chất lỏng ta có thê chuyến thành thế tích đe thuận lọi cho pha chê và đước tinh theo công thức sau: V P(ỉ (1.6) 16 Trong đó: V- thế tích cần lấy p - khôi lượng chất tan d - tỷ khôi chất tan Vậy thể tích của 27,03 gam HC1 37% có thê tính như sau: 97 0 ° , V = ^ ^ 2 3 ( m l ) (d„n;i7% = U 9 ) b) Phần tră m khôi lương - thê tích (% w/v) Cân sỏ" gani chất rắn bang sô nồng độ muôi pha cho vào bình định mức hay ông đong 100ml và cho dung môi đến vạch 100ml. Nếu chất rắn ngậm nước phải cộng thêm khôi lượng phân tử nước ngậm. Vi dụ: c ẩ n bao nhiêu gam NaCl đê nhận được 300ml dung địch NaCl 15% (w/v)? Giái: lOOml dung dịch có lõg NaCl 300ml dung dịch có Xg NaCl _ 3 00X lõ X = -------— = 45 (g) 100 Đáp sỏ: Cân 45g NaCl rồi dẫn nưốc đến 300ml. c) Phần tr ă m thê tích- t h ể tích (% v/v) - Tính theo nồng độ và th ể tích Áp dụng công thức: V1x%1 = v 2y%2 (1.7) Trong đó: Vì - thê tích dung dịch cần lấy pha V2 - thê tích dung dịch cần pha % J - phần trăm dung dịch lây pha %; - phần trăm dung dịch pha Vi dụ 1: c ầ n bao nhiêu ml dưng dịch NaCl 27% (w/v) để nhận được 3000ml dung dịch NaCl 0,9% (w/v). Giải: Thay vào công thức ta có: X m l . 27% = 3000ml. 0,9% Ị x = 3 0 0 0 x 0 9 27 i "■ . . . . ì 17 Cách pha: Lây 100ml dung dịch 27% pha với 2900ml H 2O (3000 — 100) hay dẫn nước đến 3000ml. Ví dụ 2: Cách pha như thê nào đê nhận được 200ml dung dịch HC1 25% (w/v) từ HC1 có tỳ khối d = 1,19 và nồng (ỉộ 37%. Giải: Nồng độ của HC1 đặc là phần trăm khối lượng - khôi lượng bằng cách chuyển nồng độ % w/w sang % w/v qua giá trị tỷ khôi của axit. Nồng độ axit %(w/v) = 37%(w/w). 1.19(d) = 44 thay vào công thức (1.7) X(ml).44% = 200(ml) . 25% x = 200x25 = 6 44 Cách pha: lấy 113,6ml HC1 đặc dẫn nưóc đến 200ml. - Tính theo quy tắc hình binh hành a ^r___________ (Ị X: nồng độ dung dịch cần pha a: nồng độ dung dịch cao (1.8)c: nồng độ dung dịch thấp c ^ k di số ml (X-c) của dung dịch a b: sô" ml (a-X) của đung dịch c + Pha dung dịch từ một nồng độ Ví dụ 3: c ầ n bao nhiêu ml H2S 04 đặc 96% (d = 1,84) để nhận được dung dịch H2S 0430% ? Giải: Áp dụng công thức (1.8) ta có: 96 ------------ 30g H 2SO., 96% . 3 0: 0 < ---------------------66g H 20 Cách pha: Pha 30g HjjSO,, 96% (30:1,84 = 16,3ml H^so^ 96% ) và 6 6ml H / ) + Pha dung dịch từ hai dung dịch có nồng độ khác nhau: Ví dụ 4: c ầ n có dung dịch 40% từ hai dung dịch 50% và 20%. Giải: theo quy tắc ta có 50 — 7- 20g 50% 2 0 <-------------- lOg 20% Cách pha: Lấy 20g dung dịch 50% và lOg dung dịch 20% được 30g dung dịch 40%. 18 *Chú ý: Nếu chỉ từ một nồng độ dung địch cao xuống nồng độ dung dịch thấp cũng tính theo quy tắc hình bình hành, nhưng dung dịch thấp là nưóc 0%. Ví dụ 5: Pha dung dịch 10% từ dung dịch 50%. Giải: Theo quy tắc hình bình hành ta có: 50 I0 g 50% / \ 0 < ---------------40g H 20 Cách pha: Lấy lOg dung dịch 50% và 40g H20 (=40ml) ta được 50g dung dịch 10% Trường hớp không cần độ chính xác cao và 2 nồng độ gần nhau thì có thể tính theo thê tích. Vi dụ 6: c ầ n bao nhiêu ml dung dịch NaCl 20% và 3% (w/v) đế nhận được 500ml dung dịch NaCl 9%. Giải: Thay vào công thức ( 1.8) ta có: 20 SO,ị = - khôi lượng mol H jjSO, = = 49.04(g) Trong phản ứng GFeSO,, + K2Cr20 7+ 7 H ,S 04= 3Fe2(S04);í + Cr^SOj);, + KvSO, + 7H .fi 6Fe2+ + Cr.,07" + 14 H+ = GFe:u + 2Cr:H + 7HaO 9949 Đương lượng gam K.,Cr , , ( ) 7 = ------ =49,04 g Nồng độ đương lượng thường dược dùng đế biểu thị nồng độ các dung (lịch chuấn vi rất tiện lợi. Nêu dung dịch cùng một nồng độ đương lượng thì phíin ứng đúng theo thè tích bằng nhau. Nêu hai dung dịch có nồng độ đương lượng khác nhau thì phản ứng đúng theo những thế tích tỷ lệ nghịch với nong độ đường lượng cùa í húng. Khi hai dung dịch phản ửng đúng vói nhau thì V ì xNj = V2 xN 2 (1.11) Trong đó: V1 là sô ml dung clịcli thứ nhất có nồng độ đương lượng N 1 V.; là số’ ml dung dịch thứ hai có nồng độ đương lượng Nv Đây là biểu thức cơ ban đế tính toán trong quá trình cliuán độ IV. PHA DUNG DỊCH TIỀU CHUAN đ ẻ CHUAN đ ộ 1* Một s ố d u n g địrh tiêu chuẩn Một sô" dung dịch tiêu chuẩn đê chuẩn độ trong phòng thí nghiệm như H ọ S 0 j 0.1N; KMnO ị 0,1N. Từ các dung dịch có nồng độ 0,lN pha ra các* dung địch 0.05N: 0.02N: 0,0IN. Đẻ pha những dung dịch này trưóc hết pha gần đúng 0,1N (thường lấy cao hôn một ít) rồi sau đó mối xác định lại nồng độ chính xác và điều chình chúng bãng pha loãng. Bảng 1.1- Pha dung dịch tièu chuẩn thường dùng (gần đúng) Dung dịch tiêu chuẩn Lượng hoá chất đê pha thành 1 lít dung clịch h 2s o 4 c u n NaOH 0,1N KMnO.ị 0,1 N Trilon B 0,05N 2,8ml H 2S 04 đặc ((1=1,84) 4,0 g 3,16 g 9,305g (có thê pha chính xác) Phan lốn những chất đà pha trên khống thế căn cứ khối lượng đã lấy pha đê tính ra nồng độ chính xác vì chúng chứa tỉ lệ nưốc ngậm không ôn định hoặc trong thành phần chúng có lẫn thành phần khác như NaOH có chứa Na«,CO K M n01có lẫn MnOjj. Người ta thường dùng những chất có thành phần ồn định, có lượng nước trong tinh thê ôn định hoặc dễ dàng sấy khô, không bị hút ẩm hay bị oxi hoá trong quá trình pha chế, những chất này gọi là hoá chất gôc dùng để kiểm tra các dung dịch tiêu chuẩn đă pha trên. Nồng độ hoá chất gốc được tính từ khôi lượng đỗ lấy pha, sau đó tính nồng độ đương lượng và áp dụng công thức ( 1.11). Cach kiểm tra: Pha 100ml hoá chất gốc có nồng độ chính xác 0,1N. Lấy 3 bình nón cờ 250mỊ cho vào mỗi bình chính xác 20ml dung dịch 0,1N của hoá chất gốc và chất chỉ thị. Dùng dung dịch tiêu chuẩn đă pha rót vào buret. Chuẩn độ cho đến điểm tương đương (đồi màu chất chỉ thị). Bảng 1.2- C ác chả't gốc dùng đế kiểm tra nống độ các dung dịch tiéu chuẩn Dung dịch tiêu chuẩn Chất gốc Sô gam đê pha 100ml chất gốc 0,1N Bỉnh nón có 20ml dung dịch gốc và chất chi thị Màu chuân độ Natri tetrabonat Na^B 40 7.10H2O 1,910 2 giọt chỉ thị metyl da cam Vàng sang đỏ nhạt H2SOf1 TRIS tris [hiđroximetyl] aminoetan C^HpNO^ 1,214 Như trên Như trên NaOH (X4N Axit oxalic H2C20 4.2H20 0,630 3 giọt chỉ thị phenolphtalein Xuất hiện màu hồng n h ạt 23 KMnO.ị (UN Na 2SOfl 0,1N AgNO, 0,05 N Trilon B 0.05N Axit oxalic H2C20 4.2H20 Kali bicromat K.;Ci\)Q7(sấy ò 100°C) Natri clorua khan NaCl (sấy ỏ 120 °C) Magie clorua khan MgCL, (sấy ở 200°C) 0,630 15ml H.,SO,ị đun nóng nhẹ (80 C) 0.490 15ml KI 10%, 3ml HC1 (lặc ((1=1,19), lõOml nuỏc cất, chuẩn độ đên màu vàng nhạt thì thêm 2ml t i n h bột 0,5% 0,580 Cho vào bình nón 5ml NaCl 0,1N thêm lml K2C r0 4 10% 0,476 5ml đệm a mon (pH=ll), 10 giọt chỉ thị cromogen đen 1% (eriochrom black T) Xuất hiện màu hồng n h ạ t Mất màu xanh Xuất hiện màu nâu Đỏ sang x a n h nước biển 2. Pha d u n g dịch tiêu chu ẩn từ fiexanal Ficxanal là lượng cân chính xác của hoá chất chứa trong các ống thuỷ tinh (ampun). Trước khi pha cần bóc nhãn và rửa ampun bằng nưỏc: nóng, sau đó rửa ampun bằng nưổc cât và bỏ vào phễu thuỷ tinh (xem hình vẽ 1.6). Đặt đầu cuổĩ của ampun lên trên đỉnh chữ thập (đính này thường có sẵn trong mồi hộp ficxanal). sau đó đập mạnh xu ông đỉnh chữ thập đê cho thủng đầu dưới, dùng đinh thuỷ tinh đục thủng lỗ bên phía trên của ampun. Khi ampun đã thủng ở hai lồ quy định, dung dịch trong ampun sẽ chảy vào bình định mức, dùng pipet hoặc bình phun rứa sạch ampun, dẫn nước đến ngấn bình định mức 1 lít. Dùng nút nhám đậy kín, trộn đểu và cho vào lọ chứa để dùng dần. Ampun Phễu Lồ trên Ampun Lỗ dưới 24 Vach Bình định mức Hình 1.6 - Cách pha dung dịch chuấn *Chú ý : - Các ficxanal kiểm ăn da có thể bảo quản không quá sáu tháng vì giữ lâu dễ bị vẩn đục do có chất bẩn và tạo thành cacbonat tương ửng. - Các ficxanal của muôi hay axit có thể bảo quản được lâu dài. V. CÁCH TÍNH HỆ SỐ ĐlỂU CHỈNH Trong quá trình pha hoá chất có nhiều yếu tô' làm sai nồng độ như: * Cân đo không chính xác - Các chát chưa tinh khiết hay hút nưổc v.v. - Đê lâu bị thăng hoa hay oxi hoá v.v. Do đó người ta phải kiểm tra nồng độ thực của dung dịch pha dựa vào các chất ôn định hay có nồng độ chính xác như các dung địch tiêu chuẩn ficxanal. Tính sự sai sô cùa dung (lịch để tìm nồng độ thực gọi là hệ sô điêu chỉnh, thường được ký hiệu là T. Hệ sô' điểu chỉnh theo dung dịch tiêu chuẩn ficxanal. Ví dụ 1: - Dung dịch ficxanal của HvSO (1 0,1N (chính xác) và dung dịch NaOH tự pha có nòng (lộ 0,IN. Chuan dỏ: Lấy lOml tiêu chuẩn, chuẩn hết 12ml NaOH tự pha. Hệ sô" điểu chính là: rr ................... Vh2S,1) _10 1 n :io h /h > s o 4 = - 1--------“ T o = VNaOH Như vậy trong trường hợp này nồng độ của NaOH dung dịch tự pha sẽ chí là: 0,1N X 0,83 = 0,083N Vi dụ 2: Nếu dung dịch Ficxanal NaOH là tiêu chuẩn, thì tính ngược lại T H.,S<)4 -V NaOH (0.1N) V lỉ_,SO, - Nêu trường hợp chỉ có một thứ tiêu chuẩn hoặc kiểm hoặc axit, chẳng hạn chí có H.,SO.j 0.IN thì chúng ta phải dùng NaOH tự pha đê làm dung dịch so sánh. Ví dụ 3: 10ml NaOH tự pha chuẩn hết 9ml H 2S 04 tự pha, như vậy nồng độ của H.,SO ị tự pha so vối kiểm tự pha là: r r _ V NhOH _ 1 0 _ 1 11 MIjjSOj /NaOII = 77 — = — = 1,11 vHvS(), 9 25 Sau đó so H.,SO t tự pha voi ll.,vS()| 0, IN tiêu chuấn theo, công thưc sau: T h j S C V I I . s u , <".lN> ” ^11 >SOj/NaOỈI * "NỉiOỊI /II .so. (AlNi Trong đó: T ||.,so /ỈUSO (0 . 1N): 1 lộ số 11,80, tự pha so vối H.,SOj tiêu chuẩn. T|ị so /NaOH : 1 lệ số’ II.,SO 1tự pha so với NaO II tự pha. Tn í iO I I / HoSO. (Í I]N ): H ộ sỏ N a O H t ự p h a s o với I I , s o , t i ê u c h u ẩ n . Thay sô ở 2 ví dụ tròn vào ta có: Tịị so. /II so, {(UN) =0.83* 1,11 =0,9213 Vậy nồng độ thực của axit tụ pha là: 0,1N X 0,9213 = 0,09213N Ngược lại. nếu chỉ có NaOH tiêu chuấn thi ta làm và tính hoàn toàn ngược lại. VI. BÀI TẬP B ài tập 1: Cần bao nhiêu gam NH.ịNOo đê nhận được 60g dung dịch Nll.ịOH 40% ? Đáp sỏ: 24g NH 4NO;i, 36g (ml) nước. B à i tập 2: Cần bao nhiều gam cađimi clorua (CcỉCl.,. 2.5H.,0) và bao nhiêu ml nước để nhận được CclCl, 5% (w/w) ? Đáp số: 6,23g CđCỊ,. 2,51120 , 93.77ml II./). B ài tập : Cần brio nhiêu nil II ,SOj 96% (<1 = 1,84) và bao nhiêu ml nưỏc ctể nhận được dung dịch Hi,SO ị 5% ? Đá p số: 2,72ml H. jSO j 9G%, 91 ml II./). B ài tậ p 4: Cần bao nhiêu nil HNO., 70% (cl = 1,42) và bao nhiêu ml nước đô nhận được dung dịch HNO.J 20% ? Đáp sò: 14,lml IĨNO 70*?« và f)0ml H.,0. B à i tậ p 5: Cần bao nhiêu ml CH >COOH 95,5% (đ = 1,05) và bao nhiêu ml nưốc đê nhận được dung dịch CHọCOOII 15% ? gap.sol; 1.4,28ml CH.COOIl 95,5% và 80,5ml 11,0. B ài tap 6: Cẩn cho nước đến vạch bao nhiêu ml khi pha 40ml dung địch 25% (\v/w) đô nhận được (lung dịch ró nồng- cỉộ 3°ó ? Dá]) sò: 333ml. 26 lià i tập 7: Có bao nhiêu ml dung dịch 20% (w/v) khi pha 50nil HC1 37% (d =1,19)? Đ á p số: 1 1 0 m l . B ài tập 8: Cần bao nhiêu ml H.,S0 4 96% (d = 1,84) bao nhiêu ml nước để nhận dược dung dịch II.,s o 1 30%? Đáp sỏ: 16.3ml H.,SOị 96%, 6 6ml H.,0 B à i tập 9: Cần bao nhiêu ml cồn 96% (d = 0,81) và bao nhiêu ml nước để nhận được dung dịch cồn 10% ? Đáp số: 8 6ml H 20 , 12,34ml cồn 96%. B à i tập 10: c ầ n bao nhiêu ml HNOa 70% (d = 1,42) dể nhận được dung dịch HNO > 0,5M ? Đáp sỏ: 31,7ml B à i tập 11: Cần bao nhiêu ml H.,SOị 96%(d = 1,84) đế nhận được dung dịch H.SO.J 2M ? Đáp so: l l l m l B à i tập 12: Hoà tan 20g chất trong 100ml nưốc. Tìm nồng độ phần trăm của dung dịch. Đáp số: 16,7% B ài tập 13: Cần pha loãng 150g dung dịch NaOH 40% để có dung dịch 15%. Hỏi phải thêm bao nhiêu nước ? Được bao nhiêu gam dung dịch 15% mới pha ? Đáp số: 250ml, 400g B à i tập 14: Pha 90g dung dịch H 2S 04 42% vào 135ml nước. Hỏi nồng độ phần tràm của dung clịch pha được ? Đáp sỏ: 16,8% B à i tập 15: Có thế thu được bao nhiêu dung dịch KOH 22% từ 1 lít dung dịch KOH 47,8% có tỷ khôi 1,485 . cần them bao nhiêu nước vào dung dịch ? Đáp số: 1745ml B à i tập 16: Tìm nồng độ dung dịch KOH khi trộn 80g dung dịch 25% vối 60g dung dịch 42%. Đáp số: 32,3% B à i tập 17: Cần thêm bao nhiêu nước vào 1 lít dung dịch amoniac có tỷ khôi 0.910 đẻ được dung dịch 5% ? Đáp sỏ: 3460ml 27 B à i tập 18: Cần chuẩn bị 80ml dung dịch kiềm 40% từ dung dịch 50% và 20%. Hỏi mỗi dung dịch cần bao nhiêu ? Đáp sỏT: 26,7ml clung dịch 20% và 53,3ml dung dịch 50% B à i tập 19: Cần thêm bao nhiêu nước vào 2 lít dung dịch NaOH 40%, tỷ khôi 1,43 đê có dung dịch kiềm 10% ? Đáp số: 8,58 lít B ài tập 20: Hoà tan l,966g NaCl vào trong bình định mức dưng tích 200ml và dẫn nưốc tỏi vạch. Tìm nồng độ M của clung dịch ? Đáp số:(U682M B à i tập 21: Tìm nồng độ M của dưng dịch Na 2CO:ì 15,20%, d = 1,46 ? (MW = 105,99) Đ áp SCK 1,663M B ài tập 22: Phải chuẩn bị 1 lít dung dịch KOH 0,2N thế nào từ dung dịch 27,3%, d = 1,260? Đáp so>: 32,6ml KOH 27,3% thêm nưóc vào đến 1lít. B à i tập 23: Phải chuẩn bị 4 lít dung dịch HNO.J 0,1N thê nào từ dung dịch HNO'J 42,9%, d = 1,265 ? Đáp số: 46,4ml HNO.Ị 42,9% pha thêm nưốc đến 4 lít. 28 Chương 2 PHƯƠNG PHÁP LẤY MẨU PHÂN TÍCH I. LẤY MẪU 1. Lây m au hạt Khi lấy mẫu hạt chí cần lấy 1/5 hay 1/10 hạt thu hoạch, nhưng không ít hơn 25g. Hạt thu hoạch được trải trên giày thành hình vuông (lấy 1/2 hay 1/3 số’ hạt của một cây), vạch hai đường chữ thập chia hình vuông thành 4 phần đểu nhau, vạch thêm các đường chéo chia thành các phán nhỏ hơn bằng nhau, lấy một sỏ hạt ờ các hình tam giác đối nhau (xem hình 2.1), nhưng lượng hạt lấy phải tuỳ thuộc loại hạt, hạt bé phải lấy hơn 25g, hạt lớn Hình 2.1- C ách chia õ lấy mẫu hạt phâi lâ'y từ 500-1000g. Mẩu được nghiên hoặc xay thành bột, rây qua rây có kích thước lỗ 0,15 - 0,50 mm. Bột giử trong lọ kín, có thê cho thêm chất chông mốc mà không ảnh hưởng đên thành phần hoá học của chất định phân tích. Đôi với hạt có dầu phải giã từng ít một, nên bảo quán nguyên hạt. Nêu là hạt lớn có vỏ cứng ngoài thì phai bóc vỏ trước khi nghiền nhỏ. Nêu muôn tính sò liệu phán tích toàn bộ hạt, phải xác định % vỏ bằng cách cản khôi lượng 50 hay 100 hạt. tách vỏ và tính % khôi lượng vỏ hoặc tính % khôi lượng nhân hạt đả tách vỏ và so sánh vói khôi lương hạt nguvên. Lúc bóc vỏ can chú ý không làm hỏng các phần nhan bên trong như mắt của các loại hạt đậu v.v... Đố dễ dàng tách vỏ, có thê nghiền nhẹ trong cối cho nứt vỏ và sau đó bóc hoặc có thể ngâm cho trương nước rồi mỏi tách vỏ, ví dụ ngâm hạt bông 4 - 6 giờ và dùng dao tách vỏ. Hạt nguyên hoặc hạt đă tách vỏ trước khi nghiển có thê sấy ở 70 - 80°c trong 15 - 18 giò hoặc sấy ỏ 80 ■ 85"c từ 4 - 5 giờ cho đến trạng thái khô không khí. Sau đó, nếu xác định tro hay dầu lại đem sấy tiếp tục ở 10 0-120°c trong một giờ. 2. Lây man rau Tuỳ từng loại rau mà phải chú ý đến đặc điểm của nó lúc lấy mẩu. 29 - Các loai rau ăn quả như cà chua, ốt, dưa chuột, bầu, bí v.v... cần chú ý đến sô lượng quả, vị trí quả trên cây, độ chín của quả V . V . . . .Những cây ra quả nhiều lứa, cần phân tích ít nhất là 10 cây và từ 3 - 5 quả mỗi cây. - Các loại củ như khoai lang, khoai tây v.v..., sau khi lấy 10 cây, phân các cú thành 3 loại to, vừa, nhỏ và lấy 20 - «30 củ ở cả 3 loại. - Những loại rau ăn lá phải chú ý đến giai đoạn sinh trưởng và phân tích ít nhất 2 lứa. Khối lượng của mỗi mẫu lấy để phân tích tùy từng loại. Rau ăn lá là lkg. Cà chua, bắp cải, dưa chuột, v.v... là 2,5kg. Những loại quả lổn như bầu, bí, dưa bở v.v... là 5kg. Quả, củ cần bổ dọc và lấy ở quả, củ một phần, lượng mẫu không ít hơn lkg. Các loại rau nên lấy vào sáng sóm để kịp phân tích trong ngày. Nếu lấy vào buôi chiều (17-18 giờ) phải giữ lạnh để hôm sau phân tích. Nếu phân tích nhiều lần trên một đỗi tượng thì phải thông nhất thời gian lấy. Quả và quả mọng như táo, lê, mận, cam, chanh v.v... phải lày trung bình của 10 cây mọc ỏ các vùng khác nhau trong vườn rộng, trong sô đó có ít n hất là õ cây mọc ở các vùng đại diện cho vườn. Chọn các quả ở các tầng khác nhau trên cây, mỗi cây lấy từ õ - 6 quả, tổng khôi lượng quả ở 10 cây từ 1,5 - 2 kg hoặc lkg đôi vối nho. Quả hỏng không được dùng để phân tích. Mẫu phải ghi đầy đủ: - Tên mẫu - Ngày, tháng thu hoạch - Sô" quả hay khối lượng (sô' dãy, cây), số lặp lại 3. Lây m ẫu h ỗ n hợp dại d iệ n c â y tr ổ n g Việc lấy mẫu hỗn hợp đại diện là công việc đầu tiên của quá trình phân tích cây trồng, nó quyết định kết quả phân tích sau này. Muôn cho mẫu đại diện điển hình cho toàn khối vối mức độ cao có thể thực hiện theo các kiểu sau: - Lấy nhiều điểm Trên một diện tích cây trồng phải lấy nhiều mẫu ở nhiều điểm khác nhau, thường lấy từ 5-9 điểm rồi trộn đều lại và lấy ra một lượng cần thiết, các điểm này phân bô" đều trên toàn diện tích lấy mẫu (hình 2.2). - Loại trừ cá biệt không điên hình. Khi lây mẫu ở các điểm cẩn tránh những mẫu cá biệt không điển hình như các mẫu cây bị bệnh, bị sâu hoặc quá tốt. Tránh lấy mẫu khi vừa mới phun thuốc trừ sâu hay phun hoá chất kích thích. Nếu toàn diện tích kém đổng nhất, thì phải phân chia nhỏ ra. Ví dụ toàn diện tích lấy mảu có chỗ cao, chỗ trùng , cây trổng khác nhau, trong trường hợp này phải phân nhỏ ra nhiều ô, mỗi ô lấy một mẫu đại diện đế về phân tích. Mì 1 2 3 • • • 6 5 4 • • • Hình 2.2 - Các điểm lấy mẫu phân tích - Trộn mẫu Các mẫu lấy phân tích phải được trộn đểu, càng đều sô" lượng càng chính xác. Các mẫu cây thường lấy từ 0,2 -0,5 kg. Cho mầu vào túi nilông và ghi phiếu đầy đủ. Nhãn được ghi bằng bút chì đen loại mềm đê tránh nhoẻ. Mâu mang về cần được xử lý và phân tích ngay. II. CHUẨN b ị m ẩ u p h â n t í c h T ất cả rau quả trước khi phân tích phải rửa sạch đất, gọt sạch vỏ. Cà chua, dưa chuột, ớt, khoai tây, cà rốt, táo, lê, nho, mơ, mận ... nghiền toàn bộ quả. Bắp cải trưốc khi nghiền phải bỏ các lá bẩn, lá xanh ở ngoài. Hành củ loại bỏ lớp vỏ ngoài. Cam, quýt, bưởi bóc lớp vỏ ngoài và cùi trắng bên trong. Hạt quả một số trường hợp lấy phân tích cùng th ị• quả (ót, cà chua, dưa chuột...), một sô" quả cần bỏ hạt (nho, cam, chanh, lê, mận) kể cả phần bao hạt vì phần này giầư hemixenlulozd và pectin. Các quả đã lấy theo cách như trên đem bô dọc, mỗi quả lấy một lát, nghiền nhỏ (quả to có thê dùng dao thái nhỏ trước khi nghiền), quả nhiều nước có thể ép nước để riêng, bã nghiền sau. Có thể dùng cối xay thịt, cối xay hạt, cối sứ, máy xay sinh tô"... để nghiền. Mâu được nghiền thành dịch thể đồng thể. III. CỐ ĐỊNH MẨU Sau khi lấy mẫu, chưa phân tích ngay cần phải cô" định mẫu để giữ nguyên các thành phần của mẫu. 1. S ấ y k h ô đ ến trạ n g th á i k h ô k h ô n g kh í Phương pháp này dùng nhiệt độ cao để diệt enzim và vi khuẩn, sau đó dùng nhiệt để loại phần lốn nưổc đến khi nguyên liệu khô giòn. Đầu tiên cho nguyên liệu vào tủ sấy> sấy ỏ 110 - 120°c, nhiệt độ trong nguyên liệu sẽ đạt 100 - 105° trong khoảng 30 phút, enzim và vi khuẩn bị diệt. Sau đó tiếp tục sấy ỏ 60 - 70°c cho đến khi khô giòn. Thòi gian sấy khác nhau tuỳ từng loại nguyên liệu, nhưng không kéo dài quá 8 - 10 giờ. Đê sấy khô nhanh chóng cần thái nhỏ nguyên liệu, tủ sấy phải thông khí (có quạt gió và lồ thỏng khí). Trong quá trình sây không được đê nhiệt độ cao quá có thể làm cháy, làm hiên đối thành phần hoá học (đặc biệt với nguyên liệu nhiêu đường sè bị caramen hoá có mùi khét). Trong thời gian đầu nếu sấy khô chậm, các enzim sẽ hoạt động mạnh làm biến đôi thành phần trong nguyên liệu. Vì vậy nâng nhiệt độ sấy cao lúc ban đầu rất quan trọng. Nguyên liệu đã được sấy khô, cho vào bình đậy chặt bằng nút cao su hay nút bấc có parafin gắn phía ngoài nắp, giữ ơ nơi khô và lạnh. 2. C ỏ đ ị n h b ằ n g h ơ i n ư ớ c Dùng hới nước đê làm ngừng hoạt động enzim. Có thê dùng nồi xông hơi, nồi cách thuý hoặc xoong binh thường. Đun một ít nước sỏi. lúc đun đậy nắp, sau khi nưốc đã sỏi, trải nguyên liệu thành lốp mỏng gói trong vải màn hoặc đặt trong chén sứ và đặt trên vi trong xoong, không để mẫu tiếp xúc với nưốc, đậy nấp tiếp tục đun 1 5 -2 0 phút hoặc lâu hon tuỳ theo nguyên liệu. Lây mẫu ra và sấy trong tủ sấy thong khí ở 30 - 50“c hoặc tủ sấy bình thường ỏ 60 - 70°c đến khô. Phương pháp này có thể dùng để cô định các nguyên liệu như lá, thân, rễ, hạt... chứa ít axit và hàm lượng (ỉưòng đã được xác định trong nguyên liệu tươi (cà rốt, bắp cải...)- Còn các quả, quả mọng (cà chua) và các loại rau quả có chứa nhiểu nước, đường, axit hữu cơ không thế dùng phương pháp này được vì có thê bị mất dịch, đường bị thuỷ phân cùng như làm biên đối tỷ lệ giữa các dạng hiđratcacbon khi sấy tiêp tục. Vì vậy các loại mẫu này nên dùng phương pháp cố định bằng cồn. Nguyên liệu sau khi sấy khô cho vào lọ sạch, đậy nút chật. Phướng pháp này có thê dùng khi đi khảo sát ngoài thiên nhiên để giữ mẫu về phản tích ở phòng thí nghiệm. 3. Cố d ịn h b ằn g cồn Thường khi phân tích đường, axit a mill, lấy 1 lượng mẫu thái nhỏ cho vào bình có lắp ông làm lạnh, cho cồn 96° đã đun sôi vào bình làm ngập toàn bộ mẫu, phải tính toán trước đê nồng độ cồn còn từ 78 - 82°, tiếp tục đun sôi 30 phút trên nồi cách thuỷ. Sau đó để nguội (vẫn giữ nguyên ỏng làm lạnh), thay ông làm lạnh bằng nút đậy kín. Cô định mẫu bằng phương pháp này có thế giữ được thành phần hoá học trong mẫu không bị biến đổi trong thời gian đến 1 năm. Phương pháp này thường dùng đê cô" định các mẫu lá, quả, rễ, cú. hạt ... Một sô đối tượng khác như mẫu có chất chát cần sấy khô trong bóng tối và ỏ nhiệt độ không cao lam, vì ánh sáng mặt trời làm giảm hàm lượng chất chát, nhiệt độ cao làm tăng quá trình oxi hoá và tạo thành các chất không tan. Ngoài ra, tất cả các chất chát đểu tan trong nước lạnh và bị thuỷ phân dưối tác dụng của các enzim có trong nấm mốc. Vì vậy các mau phân tích chất chát phải giữ khô, tránh ẩm, mốc như: • Đật mảu (lá, rễ) vào chỗ tối. 32 sấy khô khống quá 60°c. Sấy khỏ mẫu đến trạng thái khô giòn. Tránh mưa, sương, đất ẩm. Phòng tránh mốc. Chương 3 PHƯƠNG PHÁP SO MÀU (C o lo rim etry ) I . PHƯƠNG PHÁP SO MÀU Một trong những kỹ thuật phân tích hữu hiệu nhất trong sinh học là phương pháp phân tích so màu (colorimetry). Trong phương pháp này, nồng độ của hợp chất màu được xác định bằng cách đo cường độ màu của dưng clịch chứa hợp chất màu đó. Phương pháp so màu chỉ là một phần của phương pháp quang phỏ hấp thụ. Phương pháp quang phô hấp thụ củng chỉ là một phần của phương pháp quang học. Trong hoá sinh, các phương pháp đo quang phô thường được cìo trong dải bước sóng từ 2 2 0 đến 800nm. Dải quang phố này lại được chia thành vùng tứ ngoại (dưối 380nm), vùng khá kiên (trên 380nm) và vùng hồng ngoại (trên 800nm). Vùng hồng ngoại có rất ít ứng dụng trong thí nghiệm hoá sinh. Còn vùng kha kiên (ánh sáng thây) lại dùng trong phương pháp phân tích so màu. Đề biết màu được đo như th ế nào, trước hết phải hiểu được màu ]à gì? Khi dòng ánh sáng trắng xuyên qua một dưng dịch màu, các bước sóng nhất định (tuỳ thuộc vào bản chất của dung dịch) sẽ bị hấp thụ, trong khi những bước sóng khác thì gần như không bị ánh hương. Màu của dung dịch sẽ là màu của những bưóc sóng không hấp thụ. Những điểu đó được tống kêt một cách đơn giản trong bíing 3.1. Báng 3.1 - Tính chất màu dung dịch trong vùng ánh sáng trắng Ánh sáng trắng tỏi Ánh sáng hấp thụ Ánh sáng không hấp thụ Màu của dung dịch Vàng và xanh da trời Đỏ Đỏ Đỏ, Xanh da trời Đỏ và vàng Da cam vàng Xanh da trời và đỏ Vàng Vàng và xanh da trời Đỏ Vàng và xanh da trời Xanh lá cây Đỏ và vàng Xanh da trời Xanh da tròi Vàng Xanh da trời và đỏ Tím Cường độ màu của dung dịch có thê được xác định bẳng cách đo cường độ ánh sáng hấp thụ bởi hợp chạt màu có trong dung dịch. Vì dùng ánh sáng trang đo cưòng độ màu. nên ánh sáng hấp thụ cách càng xa càng tốt những bưóc sóng mà không bị 34 hấp thụ bới dung dịch màu. Ví dụ: đế đo độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch màu đỏ thì dùng ánh sáng vàng - xanh da trời (chính là ánh sáng xanh lá cây) là thích hợp nhất. Tốt nhất là dùng ánh sáng của một bước sóng riêng (ánh sáng (lờn sảc). Anh sáng đơn sắc này có thê được tạo ra từ giấy lọc, lăng kính hoặc là cách tử nhiều xạ trong máy so màu và máy quang phô. II. ĐỊNH LUẬT LAMBERT- BEER Nêu ánh sáng đơn sắc xuyên qua một dung dịch màu thì cường cỉộ ánh sáng hấp thụ sẽ phụ thuộc vào: - Độ dài đường ánh s á n g qua dung địch - Nồng độ của chất tan hấp thụ ánh sáng. Môi liên hệ nàv được biểu hiện bằng định luật Lambert- Beer trong phương trình s a u : lg ụ = Kci (3.1) Trong đó: I0- cường độ của tia tới Ie - cường độ của tia đi ra K- hệ sô" tắt hoặc chỉ sô hấp thụ phán tử (cũng có thể được dùng 6 thay K) c - nông độ dung dịch 1 - chiểu dài của ánh sáng qua dung dịch (thường là lcm) độ hấp thụ (A- absorbancy). Trong thực hành, giá trị này không phải tính mà thu được trực tiếp từ mấy đo. OD 3* éCL c Hình 3.1 -Đ ô thị mẫu 35 Từ phương trình (3.1) dễ dàng thấy rằng khi 1 (độ dài) được giữ không đổi thì mật độ quang sẽ tỷ lệ thuận trực tiêp với nồng độ của chất màu. Vì vây, đường chuẩn (sè là một đưòng thẳng) có thể được vẽ từ một dãy các (lung clịch chuẩn vối những nồng độ khác nhau (hình 3.1). Nồng độ của một dung dịch nghiên cứu sẽ được xác định dựa trẽn đường chuấn này. Tuy nhiên, không phai lúc nào củng cần phải vẽ một đường chuẩn. Vì có thế tính được nhò sự liên quan giữa dung dịch nghiên cứu (u) và dung dịch chuẩn (S): An - Kcl Au _ cu A s c s và As = Kcsl Bởi vì Aj,, cs là đã biết hoặc có thê đo được nên cu có thê được tính từ phương trình trên. Khi tăng chiều dài (1) cũng như tăng nồng độ thì mật độ quang (OD) sẽ tăng tỷ lệ thuận vối chúng chứ không phải độ hấp thụ ánh sáng. Ví dụ: nêu dung dịch có nồng độ Cì hấp thụ 50% ánh sáng thì dung dịch có nồng độ c 2= 2Cj phải chăng sẽ hấp thụ 100% ánh sáng? Mật độ quang của dung dịch thứ nhất là: OD, = lg — = lg = 0,3 ' I, 100 Mật độ quang của dung dịch thử hai là: OD^ = lg — = 2 0 D ị = 0 ,6 1*2 Từ đó ta có thê tính: lg U = lg I0 - OD^ = 2,0 - 0,6 = 1,4 I2 =25 Nghĩa là độ hấp thụ ánh sáng của clung dịch thứ 2 là 75%. Trong Iihiểu trường hợp độ hấp thụ và nồng độ không tỷ lệ thuận. Do đó, cần phải xác định giới hạn nồng độ, chỉ áp dụng định luật Lambert-Beer ó’ phần nồng độ táng tuyên tính. Khi quan hệ giữa hai yếu tố này không phải là cỉưòng thang tuyên tính thì không dùng được công thức (3.1). Trong trường họp này. phải xây dựng một đường chuẩn và giá trị dung dịch nghiên cửu dược xác định trực tiếp từ 36 (lường chuẩn. Đê so màu, người ta chọn điếu kiện sao cho mật độ quang (OD) nằm trong khoảng 0,1-1: tốt nhất là 0.2-0,5. III. MÀU D U N G DỊCH VÀ CHỌN BƯỚC SÓ NG ÁNH SÁ N G (HAY CHỌN KÍNH LỌC M ÀU) Màu của dung dịch là do sự hấp thụ không đồng đểu các vùng khả kiên. Khi cho ánh sáng trắng đi qua dung dịch màu. không phải tất cả các tia cua phố đều bị hâp thụ vối mức độ giông nhau, có phần tia bị hấp thụ mạnh, có phan tia hình như không bị hấp thụ. Mỗi (lung dịch màu của các hợp chất khác nhau có đường cong hấp thụ khấc nhau hay có phổ hấp thụ khác nhau. Đê có đường cong hấp thụ, người ta tiên hành đo mật độ quang của dung dịch màu đó ở các bưỏc sóng khác nhau. Trên trục hoành của đồ thị là độ dài của bưỏc sóng ánh sáng từ 400nm (tím) đẻn 700nm (đỏ). Trên trục tung ctồ thị ghi giá trị mật độ quang (OD). Điếm cực đại của cìường cong là dạc tính quan trọng của hợp chat màu. Khi nói hệ sô" hấp thụ phân tử của một chất màu nào đó có nghĩa là trị sô" đó đủ được đo ổ vùng phổ mà ánh sáng bị hấp thụ cực đại (hình 3.2). Tím Xanh Lục Vàng Cam Da cam Đỏ Hinh 3.2 - Đường cong hấp thụ của dung dịch axeton coban sunfoxianua(1) và của sắt sunfoxianua (2) Nhửng dung dịch có mầu trong các thí nghiệm sinh học ít khi chứa những màu đơn giản và cơ bản. Do đó, việc lựa chọn bước sóng đúng đê dùng sẽ không phải là một vấn clề dễ dàng mà phải được xác định bằng thực nghiệm. Những ký hiệu của màu như đỏ, xanh, vàng... thiếu chính xác so vổi bước sóng của ánh sáng (X) thường được dùng. Mối liên quan giữa bưỏc sóng và màu được giới thiệu ỏ hình 3.3. 37 1. Thí n g h iêm 1 - Liên hệ giữa các màu và các bướic sóng. Đặt một mẩu giấy trắng nhỏ trên đường tia sánjg truyền qua trong một máy quang phể (theo hướng dẫn) và ghi lại màu của tia sáng tại những bước sóng khác nhau. 350 430 470 500 650 850 *Chú ý: Đơn vị của bước sóng (X) lànm . Hãy cho biết lnm = .........m lnm = ........ (đòn vị này không được dùng cho X). 2- Thí ngh iêm 2 - Đồ thị độ hấp thụ của chất màu thực phẩm. 1. Quan sát màu sắc của 3 chất màu thực phẩm được đưa ra và dự đoán các đỉnh hấp thụ sẽ là bao nhiêu dựa trên bảng màu - bưóc sóng ỏ* trên. Chất màu thực phẩm A B Màu của chất màu thực phẩm Dự đoán đỉnh trong phạm vi màu Dự đoán đỉnh tại vị trí bước sóng (nm) c ' 2. Đồ thị hấp thụ của 3 chất màu này sẽ được ghi lại bằng máy quang phổ tự kí. 3. Đỉnh hấp thụ của mỗi chất màu là bao nhiêu ? 38 Sử dụng máy so màu hoặc máy quang phố để phân tích những dung dịch này theo phướng pháp so màu thì đọc ỏ bưóc sóng nào là tốt nhất ? Chất màu thực phẩm A B c Màu của chất màu thực phẩm Đỉnh (nm) quan sát được Vùng màu của đỉnh quan sát được Bưốc sóng tốt nhất cho phân tích (nm) 4. Đỉnh hấp thụ của dung dịch xanh lá cây là bao nhiêunm ? 5. Cho một dung dịch xanh lá cây đã pha loăng 50%, độ hấp thụ dự tính là bao nhiêu? 6. Trộn 5ml chất màu xanh lá cây vối 5ml nước không ion hoá (nước cất). Sau đó xác định độ hấp thụ của cả chất màu ban đầu và chất màu đă bị pha loãng bằng máy quang phố ở đỉnh bước sóng. 7. Có dung dịch xanh lá cây vối nồng độ lổn gấp 5 lần. Hăy dự đoán độ hấp thụ của dung dịch này là bao nhiêu ? 8. Đọc độ hấp thụ bằng máy quang phổ. 9. Độ hấp thụ của dung dịch này có lơn gấp 5 lần độ hấp thụ của dung dịch ban đầu không ? Giải thích tại sao ? 3. T hí n g h iệ m 3 - Minh hoạ định luật Lambert - Beer 1. Sắp xếp các ông nghiệm theo bảng sau. Thành phần của các ổng nghiệm được trộn cẩn thận. ô n g nghiệm số 1 2 3 4 5 6 10|ig/mỉ chất màu xanh lá cây (ml) 0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 H 20 (ml) 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0 2. Trên máy quang phổ, đặt bưốe sóng tại đỉnh hấp thụ của dung dịch màu xanh lá cây mà đã xác định ở thí nghiệm 2. Dùng ống sô" 1 để điều chinh thiết bị về vị trí sô' 0. Sau đó ghi lại độ hấp thụ của mỗi dung dịch. 3. Sinh viên được cung cấp một chất màu không biết nồng độ. Ghi lại độ hấp thụ của dung dịch nghiên cứu này. 4. Báo cáo th í nghiệm: - Vẽ đồ thị độ hấp thụ A* và nồng độ của chất màu (^Ag/ml trong mỗi ống nghiệm). - Đồ thị có tuân theo định luật Lambert- Beer không ? 39 - Nồng độ cùa chát màu nghiên cứu là bao nhiêu ? í Đưa vể đoìi vi ng/ml. 4. Thí n g h iệm 4 — Định lượng hiđratcacbon bằng ị phương pháp so màu a) Định lương glucozơ hằng phương pháp so rmàu Somogyi - Nelson - Nguyên tắc Vì phần lốn các hợp chất sinh học là khóng màu inẻn phương pháp phản tích so màu thường đòi hỏi phải có một phản ứng đầu dế tạo rra một sán phẩm có màu. Phán ứng này được tiên hành dưỏi những điêu kiện sao cho !lượng màu tạo thành phải tỉ lộ thuận vối nồng độ của hợp chất được phân tích. Ví dụ: phân tích glucozd bằng phương pháp Somoggyi • Nelson. Trong thí nghiệm này, muôi đồng bị khử trong dung dịch kiêm. Khi thêmi dung dịch arseno-molypđat, đồng oxit hình thành ỏ giai đoạn đẩu cua quá trinh khư sẽ phan ứng vối arseno moiypđat, tạo thành một dung dịch màu xanh (két hỢ]p giữa xanh da tròi và xanh lá cây). Màu của (lung dịch tỷ lệ thuận vối nồng độ của chường khứ (dường khứ là bất cử phân tử đường nào có chứa một nhóm anđehit hay xetoỉtt). Thí nghiệm này cho các loại (tường khác nhau. - Thí nghiệm 1. Chuẩn bị 8 ỏng nghiệm cỡ 25ml có chia vạch, sắp' xêp các ông nghiệm theo bảng sau: Các ống nghiệm 1 9 3 4 5 6 7 8 Glucozd 10 0Jig/ml - 0,25 0,50 0,75» 1 .0 • - - Fructozd 10 0Ịig/ml • * - - - 1.0 * * Xylozơ 100 |.ig/ml - - * - - • 1 ,0 - Hồn hợp glucozơ - fruct.ozơ - - - - - - - 1 ,0 H ,0 1 ,0 0,75 0,50 0,25 - - - • 2. Cho 1ml thuốc thử Somogvi vào tấ t cả các ông nghiệm và đun nóng trong nồi cách thuy đang sôi khoảng 2 0phút.. 3. Làm nguội bằng nước lạnh và thêm lm l thuốc thử arseno - molvpđat rồi trộn đều. Hoà loăng đến 25mỉ. Trộn đều bằng cách lộn ngược ông nghiệm (dùng parafin bọc miệng Ông nghiệm lại). 4. Đo cường độ tạo thành bang máy quang phô ỏ 500nm . dùng ống nghiệm sô 1 làm đôi chứng. Ông nghiệm này là ông thuốc thứ trắng và dùng cỉể hiệu chỉnh màu của thuốc thử. - Báo cáo thí nghiệm: 1. Vẽ một cìồ thị chuẩn cho glucozơ từ giá trị thu đưọc của các ông nghiệm sô 1 đến sô 5. Đổ thị này có tuân theo định luật Lambert - Beer không ? 2. So sánh giá trị thu được của ống sô 5, 6, 7. Chúng có giông nhau không ? Giai thích. 3. Tinh lượng đường khứ trong dung dịch, chuyến thành đơn vị mg/ml. b) Định lương glucozơ bằng phương pháp dùng enzim glucooxidaza Nguyên tắc Các kỳ th u ật hoá học dùng trong quá trình phân tích gluxit. thiêu tính đặc trưng. Khi tiên hành thi nghiệm bằng phương pháp dùng enzim glucooxidaza sè cho kêt quả tốt hơn nhiều. Enzim này oxi hoá glucozơ tạo thành axit gluconic và H 20 2- Thuốc thử có peroxidaza. sẽ khử peroxit (H./).,) thànli nước với sự có mặt của chất cho hiđro thích hựp. Chất cho hiđro (o-toluiđin) sẽ bị oxi hoá đê tạo ra màu, -Thi nghiệm: 1. Chuẩn bị những ông nghiệm như sau Các ông nghiệm 1 2 3 4 5 6........... 7 8 Glucozd 100 [Ấg/ml - 0,25 0,50 0,75 1,0 - _ - Fructozd 100 (.Ig/ml - - - - - 1,0 - - Xylozo* 10 0ịig/ml - - - - - 1,0 - Hỗn hợp glucozờ * fructozo’ - - - - - - - 1 ,0 11,0 1.0 0,75 0,50 0,25 - - - ■ 2. Trộn đểu. cho thêm õml thuốc thử glucozơ vào mồi ỏng ỏ những khoảng thời gian nhất định. Trộn đểu và để ỏ nhiệt độ phòng trong 20 phút. 3. Tiếp tục cho thêm 0,5ml HC1 IM vàó, trộn đểu và đọc ở bước sóng 680nm . Báo cáo thí nghiệm: 1. Vê đồ thị chuẩn từ giá trị đo được của ống sô 1 đến ông số 5. Kết quả có tuân theo định luật Lam bert - Beer không ? Nếu tính nồng độ bằng công thức này thì đến nồng độ g]ucozơ nào mà định luật L am bert« Beer văn được dùng. 2. Nồng độ của glucozd trong hỗn hợp là bao nhiêu ? 3. Kẻ bảng ghi nồng độ của glucozơ và fructozơ trong dung dịch. Thể hiện bằng đơn vị Ịig/ml và mM. 4. Xylozơ được đưa vào phần a và b để làm gì và nó đã chứng minh được điêu gì ? Trá lời một cách định lượng. c) H oá c h ấ t - Dung dịch glucozơ 100|Ag/ml 41 - Dung dịch fructozd 100fig/m] • Dung dịch xylozơ 100|ig/ml - Dung dịch HC1 1M - Thuôc thử arseno-molypđat: Cân 25g amoni molypdat [(NH t):,MoO j] hoà tan trong 450ml nước cất, cho thêm 31ml H2S 04 đặc, trộn đểu, cho thêm 3g natri arsenat (Na 2H A s0ít.7H.,0). Trộn lẫn hai dung dịch, ủ ở nhiệt độ 37°c từ 24 - 48 giờ hoặc đun nóng đến 55°c và giữ ở nhiệt độ này 25 phút. Cất dung dịch trong lọ màu. Dung dịch có màu vàng và bển. - Thuốc thử Somogyi: + Thuôc thứ đồng I: Cân 200g Na 2S 04 khan hoặc 356g Na2SO J.10H.,0 hoà vào 600ml nước cất nóng. Cho thêm 25g muôi Seignette (kali - natri - tactrat) (KNaC Cuỉ+ ), kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ gạch, qua đó tính được lượng đường khứ. Định lượng đường khử thường dùng thuốc thử fehling. Thuốc khử fehling là hỗn hợp ( 1:1) của hai dung dịch: dung dịch đồng sunfat gọi là fehling (I) và dung dịch kiểm của muôi Seignett (muôi kali natri tactrat) gọi là fehling (II) hay là fehling B. Khi trộn hai dung dịch fehling (I) và fehling (II) vối nhau thì xẩy ra phản ứng giữa chúng theo hai giai đoạn. Đầu tiên tạo thành kết tủa đồng hictroxit [Cu(OH).,] màu xanh da trời. C uS 04+ 2NaOH = Cu(OH ) 2+ Na.,SO, Sau đó Cu(OH ) 2 tác dụng vối muối Seignett tạo thành muôi phức hoà tan, dung dịch có màu xanh thâm. HO-CH COONa /O - C I I - C O O N a / I C u (O H)2 + + 21I<) Muôi phức trên là một hợp chất không bển. Các đường có chứa nhóm anđehit hoặc xeton dễ dàng khử Cu^+ thành C u1+, tạo ra kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch và đường bị 0X1hoả khi tác dụng với clung dịch fehling. 46 CIIO I /O -Cll-COO N a (C’IK )IÍ) 4 + 2Cu ị + 2II2O ị ()-CH-CX)()K ( 11.0 11 COOII HO-CII-COONa i (CHOH)jj + 2HO-CH-COOK + Cu . p i I CII2OÍI Để định lượng đồng (I) oxit (Cu 20 ) tạo thành, trưốc hêt oxi hoá nó bằng sắt (111) sunfat hoặc bằng amoni sắt kép sunfat trong môi trường axit sunfuric, đồng (I) (Cu1+ ) bị oxi hoá trở lại đồng (II) (Cu‘i+), còn sắt (III) (Fe'ì+) bị khử thành sắt (II) (Fe2+). Cu20 + Fe 2(SO.,);j + H2S 04 = 2CuSO., + 2FeSO,j + H.,0 Lượng sắt (II) (Fe2+) tạo thành được xác định bằng cách oxi hoá nhờ dung dịch KMnO.ị trong môi trường axit. lOFeSO,, + 2KM nơ 4+ 8H 2S 04 = 5Fe 2(S 04 ) 3+ 2MnSOí( + K 2S 0 4+ 8H20 Từ lượng KMnO. ị tiêu tôn trong chuẩn độ, có thể tính lượng đồng (I) oxit và từ đó tính hàm lượng đường trong dung dịch bằng cách tra bảng tỷ lệ giữa lượng đồng và (Uí. I2+ Culỵ +2K 2S 04 Chuẩn độ lượng iôt tạo thành bằng natri thiosunfat (Na 2S20^) chuẩn, qua đó tính được lượng đường khử có trong dung dịch. I2+ 2Na 2S.20 3= Na 2S4Of, + 2NaI 2. Hoá chất - Dung dịch fehling (I): 34.64gCuS0.1. 5H20 trong 500ml H20 - Dung dịch fehling (II) : 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H20 - Dung dịch KI 30% - Dung dịch lỉ.^so,! 25% - Dung dịch N: S2O ỉ O,1N. 3. T iến h à n h a) Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm Cách xử lí mẫu để có dung dịch đường đem phân tích giống như mục (a) trang 48. b) Tiến hành thí nghiêm 1. Cho vào bình nón dung tích 50ml: lm l dung dịch đường, 2ml nưốc cất, lm l dung dịch fehling (I) và lm l dung clịch fehling (II). 2. Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sôi, dung dịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưối có một lớp kết tủa đồng (I) oxit màu đỏ gạch là được. Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch fehling cho vào không đủ để oxi hoá hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm. Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm vổi dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dung dịch đường. Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng (I) oxit thì phải táng lượng dung dịch cỉường, giảm nước cất (luôn bảo đảm thể tích là 5ml). 51 3. Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp lm l H 2SO4 25% vàlm l KI 30%, lắc đểu và giữ trong 2 0phút. 4. Chuẩn độ I 2tạo thành bằng Na 2S2Oa 0,1N. Song song làm thí nghiệm đỏi chửng bằng cách thay dịch đường bằng míỏc cất. 4. T ính k ế t q u ả Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau: X = ( a - b ) x f x 3 ,3 « yx l0 0 w X V 1 Trong đó: X - % đường khử, a - sô' ml Na 2S20«t 0,1N dùng chuẩn độ mẩu đôi chứng, b - sô' ml NagS^O-i 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm, f - hệ sô" hiệu chỉnh nồng độ của Na 2S20^ 0,1N, 3,3 - hệ sô chuyên thành đường, V - tống thể tích dịch chiết (ml), Vj - thể tích lấy thí nghiệm (ml), w - khối lượng nguyên liệu (g), 100 - hệ số* chuyển thành % . III. ĐỊNH LƯỢNG GLUCOZƠ TRONG MÁU BANG PHƯƠNG PHÁP NELSON l.H oá chất - Dung dịch Z1 1SO4 0,45% (pha loảng từ dung dịch gôc 45%). - Dung dịch NaOH 0,1N (0,4%). • Hoá chất đồng (I): Hoà tan 200g Na 2SO,1 hoặc 356g Na 2S 04.10H20 vào 600ml nước cất nóng. Cho 25g muôi Seignette vào 100ml nưốc, hoà tan. Cho cả hai dung dịch vào bình định mức 1 lít. Cho thêm 20g NaHCO<Ị và 25g Na 2CO^ khan, sau khi hoà tan dẫn nưỏc đến 1 lít. Lọc nêu dung dịch vẩn đục. Tốt nhất bảo quản ơ 37°c. Trong trường hợp xuất hiện tinh thê thì hoà tan lại bằng cách đun nóng lại trên nồi cách thuỷ. - Hoá chất đồng (II): Dung dịch C uS0 4.5H20 15%, cho thêm 1-2 giot H^so.-I đặc. * Thuốc thử Somagyi là dung dịch hỗn hợp thuốc thứ đồng (I) và đồng (II) với tỷ lệ 25: 1. Chuẩn bị trưỏc khi cỉủng. 52 - Hoá chất arseno molypđat: Cân 20g amoni molypđat [(NH4)2MoOf1] hoà vào 450ml II./). Trộn hai dung dịch vói nhau, ủ ỏ nhiệt độ 37°c từ 25-48 giò hoặc nung nóng đến 55°C/ và giữ ỏ nhiệt độ này 25 phút. Cất giữ dung dịch trong bình màu tối. Dung dịch bển, có màu vàng. 2. T h an g ch u ẩn Pha dung dịch gốíc glucozd 500mg%: 500mg/100ml nưốc. Thay 0,1 ml máu bởi 0 . 1ml (lung dịch glucozd chuẩn có nồng độ từ 10-2 0 0mg% từ dung dịch gôc. 3. Tiền h à n h 1. Cho vào ông nghiệm 2,9ml dung dịch hỗn hợp ZnSO.ị 0,45% và NaOH 0,1N (tỷ lệ 5:1). 2. Cho thêm 0,lm l máu (lấy ở ngón tay bằng ông pipet lấy máu, thối hết máu có trong pipet). Rửa sạch máu trong pipet bằng một ít hỗn hợp trên. 3. Đặt ỏng nghiệm lên nồi cách thuỷ đun sôi 3-5 phút. Làm nguội, lọc lấy dịch trong (hoặc li tâm). Lấy lm l dịch lọc cho vào ông nghiệm. Cho thêm lm l thuốc thứ Somagyi và đun sôi trên nổi cách thuỷ 20 phút. 4. Làm nguội, cho thêm lm l thuốc thử arseno molypcìat, lắc mạnh hoà tan toàn bộ (tồng oxit, đê yên thấy có bong bóng khí C 0 2tách ra. Tiếp tục cho thêm 70ml H 20, lắc đểu. õ. Đo trên máy so màu với phin lọc màu đỏ (GOOnm), song song làm thí nghiệm kiêm tra. thay máu bằng nước cất. Kết quả phán tích được xác định theo dung dịch ehuấn. 4. T ính k ế t quả Có thê tính nồng độ glucozơ theo phương trình (3.1) của định luật Lambert- Beer hoặc theo đồ thị chuẩn. IV. ĐỊNH LƯỢNG FRƯCTOZƠ TRONG DUNG DỊCH CÓ LAN ĐƯỜNG KHỬ KHÁC MuòVi biết riêng hàm lượng của glucozơ và fructozd, người ta phải định lượng fructozơ. Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucozơ bằng hiệu của hàm lương đường khử và hàm lượng fructozd. Trưổc hết phai xác định lượng đường khử tống số, sau đó xác định hàm lượng fructozd. 1. N guyên tắ c Đầu tiên oxi hoá glucozơ và các đường khử khác bằng dung clịch kiểm của iôt. CH2OH(CHOH)4CHO + I 2+ 3NaOH = CH.pHCCHOH^COONa + 2NaI + 2H20 Trong điều kiện này, fructozơ không bị oxi hoá. Sau đó, xác định fructozd bằng phương pháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng. 2. Hoá chât - Dưng dịch iôt 0,2N trong KI - Dung dịch NaOH 0,2N - Dung cìịch NaOH 5% - Dung dịch H.,SOt15% - Dung dịch Na 2S0^5% - Dung dịch metyl 0,02% (0,02g metyl đỏ (Cj.-Hj 5N.jO9) 60ml cồn, 40ml nưốc) - Các thuốc thử dùng để xác dịnh đường khử. 3. T iến h àn h 1. Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20mg glucozơ). Trung hoà đến pH 6,5- 7,0. 2. Cho thêm 5ml dung dịch iôt 0.2N và 2,5ml đung dịch NaOII 0,2N (thêm từng giọt). Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng. 3. Axit hoá dung dịch bằng 2ml HọSOị 5% và loại iôt dư bằng dung dịch Na.jSO.* 5% (nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch mất màu vàng rơm). Thêm vài giọt metyl đố và trung hoà hỗn hợp bằng NaOH 5%. 4. Thê tích dung dịch thu được là V(Jo. Dịch thu được chỉ chứa fructozd. Phân tích fructozơ theo phương pháp Bertrand hoặc theo phương pháp vi lượng. 4. T ính kết q u ả Nếu fructozd được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường được xác định theo công thức sau: X = ( ĩ - b ) » f » 3 , 3 « v « v , i , , K 20x W xV 1 Trong đó: a * sô ml Na.jS.jO.) 0,1N cỉùng chuẩn độ mẫu đôi chứng, b - sô" ml Na^s<;0., (XlN chuẩn độ mẫu thí nghiệm, f - hệ sô" chỉnh nồng độ của Na^S^Oit 0,1N, 3,3 - hệ sô" chuyển thành đường, V - tỏng thể tích dịch chiết từ m gam nguyên liệu (ml), 2 0- lượng dung clịch thí nghiệm loại cấc đường khừ khác (trừ fructozd), Vị - thể tích lấy thí nghiệm (ml), w - khôi lượng nguyên liệu (g), 10 0- hệ sô" chuyển thành %. 54 V. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẢNG PHƯƠNG PHÁP AXIT DINITRO - SALICYLIC (DNS) 1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sỏ phản ứng tạo màu giữa đường khử vối thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vối nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucozở tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. 2. Hoá chất - Thuốc thử DNS: Hỗn họp: Nưốc c â t : 1416ml Axit - 3,5 - dinitrosalicylic ( C 7H.ịN.>07) : 10,6g NaOH : 19,8g Sau khi hoà tan, cho them vào dung dịch : Muối Seignett (KNaC j M jo j;.4H 70 ) : 306g Phenol (CrHr>OH) nóng chảy ở 50UC: 7,6ml N atri metabisunfit (Na 2S^05) : 8,3g Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HC1 0,1N với 5-6ml chỉ thị phenolphtalein. Nêu cần thêm NaOH. 3. Tiên hành a) D ựng dồ th ị ch u ẩ n glucozơ Pha dãy glucozơ chuẩn từ 0,2-5,Omg trong lml. Cho l-2ml dung dịch glucozơ chuẩn vào một ông nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Pha loăng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng G.2-0,8. Đo mật clộ quang ỏ bước sóng 540nm vối đối chứng là nước. Võ đường chuẩn glucozd vối trục tung là mật (ìộ quang, trục hoành là nồng độ glucozơ. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04mg glucozơ do glucozơ bị oxi hoá. b) C huẩn bị d u n g dịch th í nghiêm Dung dịch đường cần phân tích cũng được chuẩn bị như mục (a) (trang 48). Hỗn hợp phản ứng giữa glucozơ vối thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. Đốì với những mẫu có lượng đường khử thấp, thêm 0,1 mg glucozơ vào mỗi mẫu. Cứ 3ml thuốc thừ DNS này sẻ phản ứng hêt với khoảng lOmg glucozơ. Những dung clịch đường đậm đặc phái đu ọc pha loãng sao cho mẫu đem phân tích chi chứa 4mg (tường khử hoặc ít hdn. *Cku v: - Màu của hỗn hợp chỉ được tạo thành trong môi trường kiêm. Vi vậv những mầu fix it. phải được trung hoà trùỏc khi đem phân tích. - Phương pháp này không đặc hiệu cho tất cá các đường khử. Nêu glucozơ được dùng làm đường chuẩn thì xelobiozd cho giá trị thấp hơn 15% còn xylozd lại cho cao hớn 15%. - Các mẫu cìả đun có thê đế được một thời gian (20 phi it) trước* khi đo. Cá< mảu không (tun sẽ bị phàn huỷ dần dần. VI. ĐỊNH LƯỢNG SACCAROZƠ THEO PHƯƠNG PHÁP THƯÝ PHẨN BANG AXIT Trong nhiểu loại rau, củ, quả... các vật phẩm thực phẩm có chửa một lượng khá lún saccarozd cùng với đường khử. SaccarozcJ không có tính khứ nên không thê trực tiếp xác định được bàng các phương pháp Bertrand. Đế có thế xác (tịnh saccarozci bang phương pháp nhy phải thuỷ phân saccarozo thành các đường khử (glucozcj và fruetozd). 1. Nguyên tắc Khi thuỷ phân dung dịch sacc:arozo' bằng axit ta (luộc: hỗn hợp của hai đường khử lả glucozo* và fructozd. Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính được lượng saccarozơ có trong mẫu thí nghiệm. ^ 1 2^ 2 2® 1 1 +■ Cị.HịọOị; (saccarozcf) (glueozri) (fructnzd) 2. Hoá ch ất - Dung dịch HC1 5% - Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na.,C().> bão hoà. - Metyl (tỏ 0,02% (0,02g rnotyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất) Các thuốc thử dùng đe xác định đường khử theo Bertrand. 3. Tiến hành 1. Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bổ protein và í/huan bị cho xát định đường khử như phần (a) (trang 48) cho vào bình nón 250ml. 2. Cho thêm 5ml clung dịch HC1 5%. 3. Đun cách thuỷ hỗn họp có ống làm lạnh bang khỏng kill trong M0-40 phut, làm nguội nhanh. 4. Trung hoà hổn hợp bằng dung dịch Na.,CO:ibào hoà đèn pH 6,5-7,0 vối chi thi metyl đỏ (3 giọt). 5. Thêm từng giọt kiểm vào cho đến khi dưng dịch chuyên từ đỏ sang vàng. 6. Xác định lượng đường bằng phướng pháp Bertrand. *Clỉũ ý: Khi xác định saccarozơ là các dịch chiết bằng nước có thẻ kêt quả sẽ bị sai khác, bới vi cổ một số polisacarit cao phân tử khốc cũng chuyến vào dịch chiêt một phan hay hoàn loàn. Trong quá trình thuỷ phản những chất này cũng tạo thảnh các nionosacarit. Do đó, có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung dịch đạt 75 • 80%. 4. Tính kốt quả Ham lượn£saccarozơcaủa mầu thí nghiệm tính theo công thức: X = (a b)*0.95 Tron tỉ dó: X • hàm lượng sacarozd tính bằng %, a - hàm lượng đường khử t.heo glucozd của dịch đường sau khi thuỷ phản hang axit (%), b - ham lượng đường khử của dung dịch đường (trước khi t-huỷ phân) (%), 0,95 * hệ sô chuyển từ glucozd sang saccarozd VII. ĐỊNH LƯỢNG TINH BỘT THEO PHƯƠNG PHÁP THUỶ PHÂN BANG AX1T Hiện nav, có ríu. nliiểu phương pháp xác định tinh bột: các phương pháp hoá học, phương pháp cực phổ, phương pháp khúc xạ kế, phương pháp hoá sinh... Các phương pháp hoa học xác định bằng cách đo cường độ màu của tinh bột vối iôt hoặc bằng cách định lượng glucozơ tạo thành sau khi thuỷ phân tinh bột bằng axit hoặc- bang enzim amylaza. Phương pháp này không chính xác vì amylozd và amylopectin tạo màu vối iôt rất khác nhau mà hàm lượng của chúng trong từng loại tinh bột iại khác nhau. Phương pháp dựa trên cơ sỏ thuỷ phân tinh bột bằng axit cũng không cho kết quả thát đáng tin cậy vì khi thuỷ phân tinh bột bằng axit, không những chỉ có tinh bột mà cả hemixenlulozt) và các polisaccarit phân tử thấp cùng bị phân giải. Do đó khi dùng phương pháp thuỷ phân bằng axit, trước tiên phải tách tinh bột ra khỏi nguyên liệu thực vật, sau đó mới thuỷ phân và xác định hàm lượng glucozơ. Phương pháp thuỷ phân bằng enzim cho kết quả chính xác hơn cả, vi khi dùng chê phẩm enzim đặc hiệu thì chỉ có tinh bột bị phân giải. Dưởi đay là phương pháp thuỷ phản bằng axit. 57 1. Nguyên tắc Dưổi tác dụng của axit, tinh bột bị thuỷ phân tạo thành đường glucozơ. Xác định lượng glucozơ tạo thành rồi nhân vối hệ sô 0,9 ta được hàm lượng tinh bột. (C(*>Hl 0O-)n + nH 20 -> nCGH1 20 6 162,1 18,02 180,12 F = - 1 ^ i2- = 0,90 180.12 2. Hoá chất - Dung dịch HC1 5% - Dung dịch NaOH 5% - Dung dịch Pb(CH 3COO) 210% hoặc Pb(NCKị) 2 10% - Dung dịch Na 2SOt1hoặc N aH P0 4bão hoà - Các thuốc thử dùng đê xác định đường khử. 3. Tiến hành 1. Cân 200-250mg mẫu tinh bột đã nghiền nhỏ (đã biết rõ độ ẩm), cho vào bình cầu dung tích 10 0ml. 2. Cho thêm vào bình 50ml nưốc cất, lắc đều, giữ yên 30-45 phút, lọc, bỏ nưâc lọc đê loại bỏ đưòng tan. 3. Rửa tinh bột bằng nước cất 2-3 lần. Chọc thủng giấy lọc và chuyển tinh bột vảo bình cầu chứa 25ml dung dịch HCI 5%. Đậy kín bình bằng nút cao su có lắp ông lảm lạnh hồi lưu. 4. Đun cách thuỷ hỗn hợp 3-5 giờ. Thử sự thuỷ phân hoàn toàn của tinh bột bằng dung dịch iôt. 5. Làm nguội. Trung hoà hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH=5,6-6,0 (bỏ trực tiếp mẩu giấy quý vào bình) . 6. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức lOOmL Kết tủa protein bằng (lung dịch chì axetat 10%. Loại bỏ chì axetat bằng dung dịch NagHPOị hoặc Na^so,} bão hoà. Thêm nưổc cất tói vạch mức, lắc đểu và lọc. 7. Định lượng đương glucozo’ trong dung dịch (lấy 5ml hoặc 10ml) bằng phướng pháp Bertrand, qua đó tính được hàm lượng tinh bột. 4. Tính kết quả H àm lượng tin h bột tính theo công thức sau: 58 a X V X 100 X 0,9 ~ V1 X w Trong đó: X - hàm lượng tinh bột tính bằng %, a - sô' mg glucozơ tra bảng tính được (ứng vỏi sô' ml K M n0 4 dùng chuẩn độ mẩu thí nghiệm trừ đi số* ml KMnOị dùng chuẩn độ mẫu đối chứng), V, - thể tích dung dịch đường (sau thuỷ phân) lấy để xác định đường glucozd (ml), V - dung tích bình định mức, w - khỏi lượng mẫu thí nghiệm (mg), 10 0- hệ sô" tính chuyển thành %, 0,9 - hệ sô" quy chuyển glucozơ thành tinh bột. VIII. ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZƠ Trong các sản phàm thực vật (hạt, rau, quả...) xenlulozd thường gặp cùng vối nhiều chất khác như: hemixenlulozơ, lignin, pectin... 1. N guyên tắc Phương pháp định lượng xenlulozơ dựa vào tính chất của nó trong một hợp chất bền đôi vói tác dụng của axit mạnh và kiềm mạ nil, không bị phân huỷ dưới tác dụng của axit yếu, còn c~c chất khác thường đi kèm theo vối xenlulozơ như hemiluloza, iignin... ít bển hơn đối vỏi tác dụng của axit và kiềm nên bị oxi hoá, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp axit nitric vối axit axetic. 2. Hoá chất - Dung dịch axit nitric (HNOfi) đặc ( đ=l,4), - Dung dịch axit axetic (CH. ịCOOH) đặc, - Rượu etylic 96%. 3. T iến h à n h 1. Cân 0,5-1 gam mẵu đă nghiền nhỏ (sấy khô đến khôi lượng không đổi ở nhiệt độ 100-105°C), cho vào bình nón dung tích 250ml. Nêu hàm lượng xenlulozơ trong mẫu khoảng 10-20% thì cân l,5-2g, hàm lượng khoảng 40-50% thì cân 1-1,5g, nhỏ hớn 10% cân 2,5-5mg. 59 2. Thêm vào bình 1(5,õml hỗn hợp gồm 15ml axit nitric dạc và ],õml axit axetic đặc. Láp ông làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn họp 30 phút. Đê nguội, pha loăng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biêt trước khôi lượng. 3. Rửa kết tủa xenlulozd nhiều lần bằng nước cất nóng (mồi lẩn 10*15ml). 4. Rửa bằng rượu etylic (96%) 1-2 lẩn. 5. Rửa bằng ete etylic. 0. Sấy giấy lọc có chứa xenlulozơ ở nhiệt độ 100-105'’c đôn khối lượng không đổi (khoảng 2-3 giờ). Tuỳ theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng vói xenlulozd thường còn lại một lượng nhỏ hemixenlulozd, chú yếu là các pcntozd và 1‘ignin v.v... Do đó xenlulozơ xác định được gọi là xenlulozo* ’’thô". 4. T ính kốt quỉi Hàm lượng xenlulozơ tính bàng công thức sau: v _ a x io o ./V — ....w Trong đó: X - hàm lượng xenlulozơ tính bằng %, a - khốỉ lượng xenlulozơ (gam), w - khôi lượng mẫu thí nghiệm (gam), 10 0- hệ sô" chuyển thành %. IX. ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BANG PHƯƠNG PHÁP CANXI PECTAT 1. N guyên tắe Phương pháp dựa trên cơ sỏ thu nhận muối canxi pectat ờ dạng kết tủa. 2. Hoá c h â t - Dung dịch canxi clorua 2N: hoà tan 230-250 gam canxi clorua íCaCl.^) trong bình dung tích 1000ml, thêm nước cat tới vạch ngấn. Dung tích phai có tý khôi l,09g/cm:\ không cần xác định nồng độ chuẩn. - Dung dịch NaOH 0,1N: hoà tan 4g NaOH trong bình định mức có dung tích 10 0 0ml, thêm nước cất tới vạch ngấn. - Dung dịch axit axetic (CH^COOH) IN: pha loãng 60,03ml axit axetic đặc bằng nước cất cho tối 10 0 0ml. 3. T iến h à n h 1. Cho 0,] 5 gam pectin mẫu nghiên cứu vào bình. 60 2. Cho thêm 100ml NaOH IN. 3. Đe hồn hợp trong 7 ịỉiơ hoặc qua đêm để xà phòng hoá hoàn toàn pectin ĩhnnh nxit pectic. 4. Thêm 50ml dung dịch axit axetic 0?1N. 5. Sau 5 phút thêm õOml CaCl, 2N . giữ 1 giờ. 6. Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan dã được sấy khỏ tới khói lượng không đối. 7. Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tối khi không còn ion clo nửa (thứ nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1% không có kết tủa trang). 8. Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kêt tủa vào chén cân và sấy ỏ 105’c cho tới khôi lượng không đôi. 4. T ĩn h kết q u a Lượng pectin lấy đê xà phòng hoá (B) tính theo công thức sau: V, Trong đó: W- khỏi lương của pectin lấy đẻ pha thành dung dịch (gam), Vị -thể tích dung dịch pectin ban đẩu (ml), V., - thể tích dung dịch pectin lấy đê xà phòng hoá (ml). Hàm lượng của canxi pectat hằng hiệu của khỏi lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không có kết tủa. Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau: p Wx 0,92x100 B Trong đó: w - khôi lượng của kết tủa canxi pectat (g), B - lượng pectin lấy đem xà phòng hoá (g), 0,92 - hệ sô" tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghía là pectin chiêm 92% khôi lượng caiixi pectat), 10 0- hệ sô'chuyển để biểu thị kết quả theo phần %. X. ĐỊNH LƯỢNG DEXTRIN BANG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA VỚI C ổN 1. N guyên tắ c Phương: pháp dựa vào tính chất đextrin kết tủa hoàn toàn trong cồn nồng độ cao, còn đường glucozơ, mantozơ tan trong cồn. 61 2. Hoá chat Cồn tuyệt đốì. 3. Tiến hành 1. Cân 5g mẫu cho vào cốc. Cho thêm 50ml nưỏc cất. Khuấy kỹ cho tan. 2. Lọc qua giấy lọc và cho vào bình định mức. Rứa vài lần bằng nưóc cất định mức đến vạch lắc đểu. 3. Dùng pipet lấy 100ml dung dịch trong bình định mức cho vào cốc. Thêm từ từ vào côc 30ml cồn tuyệt đôi, lắc đều. Để yên cỏc khoáng 30 phút cho kẻt tủa đextrin màu trắng lắng xuống. 4. Lọc lấy kết tủa qua hai lớp giấy lọc (đã biêt khôi lượng). Rửa kết tủa vài lần bằng cồn tuyệt đôi. Sấy giấy lọc có chứa kết tủa ỏ 105°c đến khi có khôi lượng không đổi. 5. Hàm lượng % đextrin trong mẩu là hiệu sô' giữa giấy lọc có chứa đextrin và giây lọc không chứa đextrin. 4. T ính k ết q u ả Hàm lương đextrin được xác định theo công thức sau: ^ _ ( a - b ) x V x 100 “ v J T w Trong đó: X - % đextrin trong mẫu, a - khỏi lượng của giấy lọc và kết tủa sau khi sấy (gam), b - khôi lượng giây lọc (gam), V - thế tích định mức (ml), VI - thể tích lấy xác định (ml), w - khôi lượng mẩu phân tích (gam). 6 2 C h ư ơ n g 6 ĐỊNH LƯỢNG LIPIT I. ĐỊNH LƯỢNG L IP IT BANG MÁY SOXHLET 1. Nguyên tắc Tron^ tê bào, lipit ở dạng tự do và liên kết. Lipit tự do tập trung chủ yếu ỏ các cơ quan dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật). Trong thực tế, sự xác định lipit dựa vào hàm lượng lipit được rút ra khỏi nguyên liệu bằng các dung môi hữu cơ. Có hai phương pháp đê xác định: - Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp. - Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipit ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu. Các dung mỏi chiết xuất lipit thường dùng là ete etylic (ete dầu hoả, et.e petrol, benzen, xang, cloroform, tetraclorua cacbon...)- Trong phòng thí nghiệm thường dùng ete etylic, vì nó có độ bay hơi cao, nhiệt độ sôi thấp. Tốc độ của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ nguyên liệu. Ngoài lipit ra còn có một sô hợp chất khác như: vitam in hoà tan trong lipit photphatit, steroit, các sắc tô... cũng được chiết ra. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp hàm lượng các chất này rất ít, nên các phương pháp này vẫn được chấp nhận trong các thí nghiệm thông thường. Vì vậy các lipit xác định được bằng một trong hai phương pháp trên được gọi là lipit “thô”. Quá trình chiết xuất lipit được thực hiện trên máv Soxhlet, gồm có: bình cầu (a) (lung tích 100 - 300ml. trụ chiết (b) và ông làm lạnh (sinh hàn - c). Tất cả các phàn được lắp nôi vói nhau nhờ cố nhám (hình 6.1). 2. Hoá chất Ete etylic hoặc ete petrol. 3. Tiến hành - Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu hoặc dùng ống hình trụ đựng mẫu có sẵn (hình 6.1), túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiểu rộng, gấp thành túi trụ (kiểu gói thuốc) có đường kính bé hơn trụ chiết. Túi được sấy khò đến khôi lượng không đổi và được cân trên cân phân tích (nêu xác định theo phương pháp gián tiếp). 63 C á c bép của bộ chièt S o xh le í C ác ống chiẻt Hinh 6.1 - Bộ chiết S o xh let a - binh cầu ; b - trụ ch iế t; c - ống làm lạnh 64 - Nguyên liệu được nghiên nhỏ, sấy khô đến khôi lượng không đổi (hoặc làm thí nghiệm kiểm tra nguyên liệu đến khôi lượng không đổi và tính tỷ lệ vối lượng mẩu nghiên cứu). Cân chính xác 2 - 5g rồi cho mẫu vào túi giấy. Gấp kín mép túi, đặt túi có mấu phân tích vào trụ chiết. a) P hư ơ ng p h á p xác đ ịn h trực tiếp 1. Trước khi chiết, bình cầu (a) được sấy khô đên khôi lượng khỏng đối. 2. Đặt bình cầu trên nồi cách thuỷ và cho ete vào 1/2 thể tích bình. 3. Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết (b). 4. Lắp trụ chiết vào bình cầu (a). 5. Cho dung mỏi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu. Mức dung môi đến phần trên ông xifon trụ chiết. 6. Lắp õng làm lạnh (c), ngâm nguyên liệu trong dung môi vài giờ. 7. Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thuỷ (đôì vổi ete không quá 50 ’-C) sao cho số’ lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10-15 lần trong 1 giò (4-6 phút/lần). 8. Thử lipit đã chiết hêt chưa bằng cách lấy một vài giọt ete từ đầu cuối trụ chiêt cho lên đĩa kính đồng hồ sạch. Cho bay hơi hết ete. Nêu không có lipit trên đĩa kính, xem như lipit đã được chiết hoàn toàn. 9. Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào và cất lấy ete. 10. Sấy bình cầu có chứa lipit đến khôi lượng không đổi rồi đem cân. Nêu chiêt bằng ete etylic thì sấy ở nhiệt độ 60-70°c trong 30 phút. Nêu chiết bằng ete petrol thì sấy d nhiệt độ 80-90°C trong 45-50 phút. Để tránh cho chất béo khỏi oxi hoá, tôt nhất là sấy trong chân không ỏ nhiệt độ 70-80°C (trong 4 giờ). Tính kết quả: Hàm lượng lipit có trong lOOg mẫu nguyên liệu tính theo công thức sau: ỵ _ (a -b )x 10 0 c Trong đó: X - hàm lượng lipit tính theo %, a - khối lượng bình và lipit (g), b - khốỉ lượng bình (g), c - khổi lương mẫu đã tách lipit (g). b) P hư ơ ng p h á p xá c đ ịn h g iá n tiếp Sau khi kẻt thúc thí nghiệm như trên, lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khỏ đến khôi lượng không đổi. 65 Tính kết quả: Hàm lượng lipit có trong lOOg mẫu nguyên liệu như sau: v _ (a - b) X 100 Ả —--------------- c Trong đó: X - hàm lượng chất béo lipit tính bằng%, a - khôi lượng túi mẫu nguyên liệu trưổc khi chiêt (gam), b - khôi lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (gam), c - lượng nguyên liệu lấy đê xác định các chỉ sô" của chất béo (lipit). II. XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ s ố CỦA LIPIT 1. Xác định chỉ số axit a) N guyên tắc Chỉ sô axit của lipit là sô mg KOH cần đế trang hoà axit béo tự do trong 1 gam chất béo. Phản ứng xảy ra như sau: RCOOH + KOH -> RCOOK + H20 Dựa vào lượng KOH dùng đê trung hoà các axit béo đê tính chỉ sô axit.. b) Nguyên liệu Bơ tươi và bơ ôi hoặc dầu thực vật. c) Hóa chất - Dung dịch cồn - ete (3:1) - Dung dịch KOH 0,IN trong cồn 96". - Dung dịch phenolphtalein (C 2qH1 40 4) 1% trong cồn 96°. cỉ) D ụng cụ và m áy móc Buret 10ml, 2 bình cầu 200ml, ông đong 50m], nồi cách thuỷ. e) Tiên h à n h 1. Cho vào bình cầu 200ml khoảng 5g chất béo (hoặc dầu lạc). 2. Thêm vào 50ml hỗn hợp cồn - ete (tỷ lệ 3:1) đê hoà tan chất béo, lắc cẩn thận. Nếu chất béo chua tan hết có thê đun nhẹ hỗn họp trên nồi cách thuý. lắc đều. Làm nguội. 6 6 3. Cho hai giọt chỉ thị phenolphtalein và chuẩn độ hổn hợp bằng dung dịch KOH 0,1N trong cồn (dùng dung dịch KOH trong cồn để tránh xẩy ra sự xà phòng hoá trong trường hộp hỗn hợp chứa từ 2 0% trở lên) cho đến khi xuất hiện màu hồng tươi (trường hộp chất béo có màu thảm thì dùng chỉ thị tymolphtalein 1% trong cồn. chuẩn độ cho (tên màu xanh). /) Tính kết quả Chỉ sô axit (Ax) tính theo công thức: (a -b )x 5,611 Ax —------------------ c Trong đó: a • sô ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ỏ bình thí nghịêm (bơ ôi), b - sô ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ỏ bình kiểm tra (bơ tươi), c - sô gam bơ, 5,611 - sô mg KOH có trong lm l KOH 0,1N hoặc tíiili theo công thức: A a X f X 5,611 Ax = -------------- c Trong đó: a - sô" ml KOH dùng để chuẩn độ, f - hệ sô" điếu chỉnh của KOH 0,1N (dung dịch tự pha), c - sô gam mẫu. 2• Xác định chỉ số xà phòng hóa a) N guyên tắc Chỉ sô xà phòng hóa là lượng mg KOH cần đê trung hoà axit béo tự do cũng như liên kết có trong lg chất béo. Phán ứng xảy ra như sau: CHịOCOR I CII2OII KịCOOK Ị I CHOCOR 2 + 3KOH — ►CHOH + IW )()K Ổ lbO C O R , CH2OH R O ) ()K Lượng kiểm dư được xác định bằng HC1. Dựa vào lượng kiểm phản ứng, tính được chỉ sỏ xà phòng hoá. b) N guy én liêu Bơ, hoặc mỡ, hoặc dầu thực vật. 67 c) Hoá chất • Dung dịch KOH 0,5N - Cồn 96% - Dung dịch HC1 0,5N - Dung dịch phenolphtalein (C. 2()H1.1 0.1) 1% trong cồn 96“. d) D ụng cu và m áy móc Hai bìnli cầu 200ml với ông làm lạnh, ông đong 50ml, pipet 10ml, buret 25ml, nồi cách thuỷ. e) Tiên h à n h 1. Lấy 1g chất béo cho vào bình cầu. 2. Thêm vào 10ml KOH 0,5N và 50ml cồn. 3. Lắp ổng làm lạnh không khí (ồng thuỷ tinh dài khoảng Im, đường kính 3-õmm). 4. Đun sôi cách thuỷ 1 giờ. Sự xà phòng hoá kết thúc khi dung dịch ỏ trong bình trở nên trong suốt. Làm nguội hồn hợp. 5. Thêm vài giọt phenolphtalein vào bình. 6. Chuẩn độ bằng dung dịch HC1 0,5N. Song song làm thí nghiệm kiếm tra bang cách thay chất béo bằng nước cất. f) Tính kết qua - Chỉ sỏ xà phòng (Xp) tính theo công thức: (a - b) X 28,055 xp = - Trong đó: a - sô ml dung dịch HC1 0,5N dùng đê chuẩn độ ở bình kiểm tra, b - sô ml dung dịch HC1 0,5N dùng đế chuẩn độ ở binh thí nghiệm, c - sô gam chất béo, 28,055 - sô mg KOH trong lm l KOH 0,õM hoặc tinh theo công thức: v _ (a - b) X X 28, Oõõ X 2 Ỉ p “ r c Trong đó: a - sỏ^ ml HC1 0,õN dùng đề chuẩn độ bình kiểm tra, b - sô ml HC1 0,5N dùng đê chuẩn độ bình thí nghiệm. 6 8 f1 - hệ sô hiệu chỉnh nồng độ HC1, ĩ2 - hệ số’ hiệu chỉnh nồng độ KOH, c - sô gam chất béo. 3, Xác đ ịn h chỉ sô oste Chỉ số este là sô' mg KOH cần để xà phòng hoá các glixerit (este) có trong lg chất béo. Chỉ sô este (Es) bằng hiệu sô" của chỉ sô" xà phòng và chỉ sô" axit. Es= Xpx A, Trong thực tẽ sản xuất, chỉ sô este cho phép tính được lượng glixerin có thể thu được khi xà phòng hoá chất béo. Hàm lượng glixerin của chất béo tính theo công thức: G% = 0,0547 X Es 4. Xác định chỉ số iôt a) N guyên tắc Chỉ sô iôt là sô" gam iôt kết hợp vối lOOg chất béo. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc iôt kết hợp vỏi axit béo ớ các vị trí nôi đỏi. Ớ nhiệt độ thưòng, iỏt phản ứng với axit béo có trong thành phần cúa chất béo chậm, khi đun nóng thì iôt kết hợp vào các nối đôi không đồng đểu, không làm no được hoàn toàn các nôì đôi. Các halogen khác (clo, brom) phản ứng vổi axit béo rất mạnh, nên thay iôt bằng các hợp chất của nó vói các halogen khấc. b) N guyên liêu Bớ, mỡ hoặc dầu thực vật. c) Hoá chất - Dung dịch Hanus (lOg IBr hoà tan trong 500ml axit axetic [CH.jCOOH] đặc). - Dung dịch KI 10%. - Dung dịch Na 2S20 3 0,1N. - Dung dịch tinh bột 1%. • Clorofom. d) D ung cu và m áy móc Pipet lOmỊ hai bình cầu dung tích 200 - 300ml có nút nhám, 2 cốc nhỏ (đường kính 1 - 2 cm). 69 e) Tiên h à n h 1. Cân vào lọ nhỏ 0,2g dầu hoặc 4g bơ hoặc mỡ. Chuyên sang bình cầu dung tích 200 - 300ml có nút nhám. Bình kiểm tra thay chất béo bằng 0,2ml nước cất. 2. Cho thêm 10ml clorofom vào mỗi binh, lắc nhẹ đê hoà tan hết chất béo. 3. Cho thêm lõm l dung dịch Hanus, đậy kín bình ngay bằng nú t nhám . Lắc cẩn thận bình. Để yên chỗ tốĩ 15 phút (dầu có nhiều axit béo không no thì để lâu hơn). 4. Thêm 15ml dung dịch KI 10%, 50ml nước cất. Chuẩn độ iôt giải phóng ra bằng dung dịch Na.,S.,O.Ị 0,1N cho đên màu vàng rơm. 5. Thêm lm l dung dịch hồ tinh bột 1%, 3ml clorofom. Chuẩn độ tiếp cho đên khi dung địch bị m ất màu hoàn toàn. 6. Cho thêm clorofom vào để giải phóng iôt bị hấp thụ trên chất béo (khi chuẩn độ phải lắc mạnh), đồng thời làm thí nghiệm kiểm tra. f) Tính kết quả Chỉ số' iôt được tính theo công thức sau: J ( b - a ) x f x O ,0126 9 x 1 0 0 c Trong đó: a - sô ml dung dịch Na.^S.^Oo 0,1N dùng chuẩn độ bình kiểm tra, b - số ml dung dịch Na^SgCX* 0,lN dùng chuẩn độ bình thí nghiệm, c - lượng chất béo (g), f - hệ sô điểu chỉnh nồng độ N a 2S2 0^) 100 - hệ sô" quy chuẩn cho lOOg chất béo, 0,01269 - số gam iôt tương ứng vói lm l dung dịch Na.;SyO.< 0,1N. 5. Xác định chỉ sô peroxit chất béo a) Nguyên tắc Chỉ sô peroxit là sô gam iôt được giải phóng ra bởi peroxit có trong lOOg mầu. Trong không khí, các axit béo có trong chất béo, đặc biệt là các axit béo không no dễ dàng bị oxi hoá một phần và tạo thành peroxit, gầy nên hiện tượng mơ bị ôi. Việc xác định chỉ sô peroxit dựa vào phản ứng sau: Rì - CH - CI Ỉ - R2 Rì - CH - CH - R2 + KI + 2CH:1COOH -> \ / + 2CH:tCOOK + H20 + L, o Lượng iôt giải phóng ra được chuẩn độ bằng clung dịch Na 2S20 . ? 2N a2S ./), + I, -----------> 2NaI + Na 2S4Ofì b) N guyên liệu Bơ, mõ hoặc dầu thực vật. c) Hoá ch ấ t - Axit axetic (CH^COOH) đặc - Clorofom ■ Dung dịch KI bão hoà (pha dùng ngay) • Dung dịch Na.>s.,0.t 0,0IN (pha trước khi dùng từ dung dịch Na^SyO^ 0,1N bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa C 02. - Dung dịch hồ tinh bột 1%. d) Tiến h à n h 1. Lấy hai bình nón dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2g dầu lạc, bình 2 (kiếm tra) 2ml nước cất. 2. Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axit axetic - clorjofom (tỷ lệ 2 : 1), lm l dung dịch KI mói pha (hoặc một ít tinh thê KI), đậy nút. Lắc hổn hợp cẩn thận và đật vào chỗ tôi 10 phút. 3. Cho thêm 25ml nước cất. 4. Cho thêm 0,5ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iôt tạo thành bằng clung dịch Na^S^O.j 0,01N cho đến khi m ất màu xanh. e) Tính kết qua Chỉ sô' peroxit (p) tính theo công thức sau: p ( a - b ) x f x 0,01269 X 100 c Trong đó: a - sô" ml đung dịch Na 2S20^ 0,01N dùng chuẩn độ bình thí nghiệm, b - sô ml dung dịch N a 2S2 0 ' 4 0,0IN dùng chuẩn độ bình kiêm tra, c - khôi lượng chất béo, f - hệ sô" hiệu chỉnh nồng độ N a 2S20 3, 100 - hệ sô quy chuẩn cho lOOg chất béo, 0,01269 - sô gam iôt tương ứng vối lm l dung dịch Na.^SyO.^ 0,0IN. 7 1 C h ư ơ n g 7 Đ Ị N H L U Ơ N G A X IT A M IN v à p r o t e i n I. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BANG PHƯƠNG PHÁP CHUAN đ ộ FORM OL (PHƯƠNG PHÁP SỒRENSEN) 1. N guyên tắ c Axit amin hoà tan trong nước có tính chất muôi nội phân tử, các nhóm amin và cacboxyl trung hoà lan nhau. Nhóm -COO của axit amin bị cản trở bởi các nhóm amin nên không thê chuẩn độ trực tiếp được. Trong fomanciehit. nhóm amin của axit amin phản ứng với nhóm anđehit cho metylen. kẻt quả cũa phản ứng là nhóm amin mất tính chất cơ bán của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng metylen không bị cản t.rớ và có thê chuẩn độ. R N H ,+ i I c o o HC \ o R II N = CH. I CH I COOH H .p N=CH., N = CH., I 2 I R — CH + NaOH --------♦ R — CH + H O I I COOH COONa Số nhóm cacboxyl tự do bằng sô' nhóm amin liên kết với fomandehit, khi chuẩn độ nhóm cacboxyl thì xác định được nlìóm amin. Vì vậy cho phép định lượng được axit amin có trong dung dịch nghiên cứu. 2. N guyên liệu Dung dịch axit amin khoảng 0,1% hoăc cốc nguyên liệu có axit amin cần địníì lượng. 3. Hoá c h ấ t - Dung dịch NaOH 0,IN 72 - Dung dịch HC1 0,1N - Dung dịch fomandehit trung hoà 30%: Lấy 50ml fomandehit 30% cho thêm 0.1ml phenolphtalein trong etanol 1% và chỉnh bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt. - Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%. - Dung dịch KOH 0,01 N trong etanol 90%. - Cồn tuyệt đối - Dung dịch CuCl 2amoniac 0,0025M - Dung dịch phenolphtalein 1% trong etanol 60%. 4. D ụng cụ Bình nón, buret, 2 pipet 10ml. 5. Tiến hành 1. Cho vảo bình nón 20ml dung dịch chứa axit amin và 0,5ml dung dịch phenolphtalein 1%. 2. Để trung hoà dung dịch axit amin, cho từng giọt NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt. 3. Cho thêm 20ml dung dịch fomandehit 30% đã trung hoà và lắc đều bình nón. Sau 5 phút dung dịch m ất màu. 4. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt trở lại (pH = 9,0). Thí nghiệm kiểm tra cũng được tiến hành tương tự vối các hoá chất trên nhưng thay dung dịch chứa axit amin bằng nước cất cùng thể tích. 6. Tính k ế t quả lm l dung dịch NaOH 0,1N tương đương l,4mg nitơ. Sô” mg nitơ amin của dung dịch nghiên cứu được tính theo công thức: mgN = (A - B) X 1,4 Trong đó: A - Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm, B - Sô ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. Phương pháp chuẩn độ formol các axit amin trực tiếp và thuận lợi. Nó được sử dụng để định lượng axit am in trong dung dịch nghiên cứu. Đồng thời cũng cần nhố rằng phương pháp này không cho kết quả hoàn toàn chính xác giá trị nitơ amin, vì nếu trong dung dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fomandehit nên làm giảm kết quả định lượng. Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có từozin, nó lại làm tăng kết quả định lượng vì nó có nhóm phenol. Phương pháp định lượng bằng chuẩn độ formol 73 không thể sử dụng vái mẫu có muôi amoni, vì formalin sẽ cho hexamin, đồng thời giải phóng ra axit. 4NH4CỈ + 6HCHO -------> N4(CH2)r. + 6H20 + 4HC1 Nhóm cacboxyl của các axit amin lưỡng tính, các peptit lốn và protein có thể được xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ trong dung dịch nước - etanol không có formalin. Môi trường nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm amin, kết quả là nó trơ trong môi trường nưóc, axit ami . 1 1trỏ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amin có thể được chuẩn độ lại bằng kiềm. VỚI đặc tính cơ bản này. có thể định lượng axit amin bằng phương pháp micro: Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90% và chuẩn độ bâng KOH 0,0IN trong etanol 90% đến khi xuất hiện màu xanh. Sau đó cho thêm 10 thỏ tích cồn tuyệt đối vào 1thể tích (lung dịch cần định lượng axit amin. Màu dung dịch biên mất, chuẩn độ lại dung dịch cho đến màu xanh. Mầu để so sánh vối màu chuẩn độ có thê sử dụng dung dịch amoniac CuCl 20,0025M . Phương phốp này đăc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzim, biểu diễn dưối ảnh hưởng tác động lên các enzim proteolitic protein và peptit. II. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BANG NINHIĐRIN 1. N guyên tốc Dưới tác dụng của ninhiđrin, axit amin bị oxi hoá chuyên thành axit am in rồi đến amoniac và cacbonic. Axit amin bị giảm bớt 1 nguyên tử cacbon, nó trở thành dọng anđehit. Như vậy axiit amin có khôi lượng phân tử nhỏ hơn và amoniac tạo thành sẽ oxi hoá ninhiđrin tạo nên phức hợp có màu xanh tím. cường độ màu tương ứng với giá trị nitơ amin của axitt am in. Phản ứng của axit amin vói ninhiđrin là cơ sở để định lượng các hợp chát theo phương pháp khí kê bằng cách tính số lượng CO <2 hoặc NHU, bay ra, còn phương pháp so màu lại đo cường độ màu, nó phụ thuộc nồng độ phức hợp của ninhiđrin vói NH :V Phản ứng m àu niiihiđrin cũng xảy ra với axit amin mạch bên của pept.it vi protein cũng như với muôi amoni, glucozamin và amoniac. Để định lượng chính xác axit amin, dung dịch nghiên cứu phải không có hợp chất trên. 0 o HIII R - C - C O O H + I n h 2 c OM c —> R - CH + CO., + / \ II c OH NH 0 CS V H / \ c OH II o + H ,0 axit amin ninhiđrin ninhicừin khử 74 R - CH + H, 0 —> R - c f + NH J 1 1 H NH n oIIoII c OH \ / / \ c OH II II o o c* . c — N = c / oIIc /+ 3H20 + NH 4 \ cIIocIIo Phức chất mầu 2. Nguyên liệu Dung dịch chứa axit amin có 3 - 5|0.g nitơ trong lm l. 3. Hoá chất - Dung dịch ninhiđrin: hoà tan 2g ninhiđrin trong 50ml dung dịch etanol 50%. - Dung dịch đệr* xitrat 0,4M; pH = 5 - Dung dịch etanol 50% 4. Máy móc và d ụ n g cụ Bình định mức 10ml, 1 pipet lm l, 2 pipet 5ml, ông nghiệm 10ml, nồi ủ, máy so màu. 5. T iến h àn h 1. Lấy 0,5ml clung dịch axit amin, cho thêm l,5m l dung dịch đệm xitrat 0,4M; pH = 5 và 2ml dung dịch ninhiđrin. 2. Lắc đều Ống nghiệm và đặt vào nồi ủ nhiệt đun sôi 30 phút. 3. Cho thêm etanol 50% vào đến 10ml. Đo giá trị hấp thụ ở 570nm. Chĩnh máy về không vối ông kiểm tra có đủ các hoá chất nhưng thay dung dịch axit amin bằng nưỏc cất cùng thể tích. Giá trị hấp thụ nhận được tương ứng vói độ hấp thụ của dung dịch chuẩn leuxin đã biết nồng độ (cường độ màu trong phản ứng ninhiđrin tương ứng với cường độ màu của dung dịch chuẩn leuxin). 75 4. Đường chuẩn leuxin: lấy lm l của các dung dịch chuẩn leuxin có từ 1 - 5|ig cho vào các ống nghiệm. Làm phản ứng vối các hoá chất trên và đo hấp thụ. Phương pháp ninhiđrin rất. nhạy và chính xác, nó được sử dụng nhiều để định lượng axit amin tách ra bằng phương pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột. Nó cũng được dùng để định lượng axit amin của các peptit và protein thuỷ phân bằng hoá học hoặc enzim. *Chú ý: Định lượng chính xác axit amm bằng phương pháp dùng ninhiđrin phụ thuộc vào sự loại bỏ chất chứa NH 3và các hoá chất sứ dụng cũng phải không có NH‘V III. ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN NHỜ TẠO THÀNH PHỨC CHAT VỚI ĐỎNG (Phương p h áp Pope và Stevens) 1. Nguyên tắc Để định lượng axit amin của dung dịch nghiên cứu cán cho thêm vào môi trường bazơ yếu dung dịch đồng photphat dư trong dung dịch đệm borat. Muối đồng của axit amin hoà tan tốt trong dung dịch. Đồng photphat dư được loại bỏ bằng cách lọc, sau đó cho thêm CH 3COOH và KI. Xác định lượng đồng bằng cách chuẩn đô vối dung dịch Na 2S2 03, iỏt được tách ra, phản ứng xảy ra như sau: 2Cu2+ + 41 ->2CuI + I 2 Xon I trong môi trường axit khử ion đồng của phức chất liên kết vối axit amin và bị oxi hoá thành I2. Từ kêt quả của phương trình trên ta thấy 1 ion iôt khử 1 ion đồng tạo nên sự liên kết của phức chất với 2 gôc axit amin. 1 ion iôt "nối" nhóm amin của axit amin. lm l dung dịch Na 2S.j0.ị 0,0lN tương ứng vói 0,28mg nitơ amin. 2. Nguyên liệu Dung dịch chứa axit amin hoặc dung dịch protein thuỷ phân đã trung hoà chứa 0,5 T l,0mg nitơ amin trong lml. 3. Hoá chất - Dung dịch đồng photphat mối pha. Một thể tích dung dịch A vổi 2 thể tích dung dịch B, cho thêm 2 thể tích dung dịch c. Dung dịch A: hoà tan 35,4g CuC 1 . 22H20 hoặc 27,3g CuCly vào nước và dẫn đến lOOOml. Dung dịch B: Hoà tan 64,õg Na 2HPO,t.12HvO cùng 7,2g NaOH vào 500ml nước và dẫn đến 10 0 0ml. Dung dịch C: Dung dịch đệm borat: 57,21g borat (Na.,B 4P7.10H.,0) hoà tan trong 1500ml nước, cho thêm 100ml HC1 IN và dẫn nưổc đến 2000ml. 7 6 - Dung dịch tymolphtalein: 0,25g tymolphtalein hoà tan trong 100ml dung dịch etanol 50%. - Dung dịch N a 2S2 03 0,0IN (được pha loãng từ dung dịch gốc 0,1N đã được chỉnh bởi KIO 3). - Dung dịch NaOH 0,lN. - Dung dịch tinh bột 1% hoà tan trong NaCl bão hoà. - CH; (NH4)2S 04 Các nguyên to" p, K, Ca, Mg... chuyển thành dạng oxit: K20, CaO, MgO... Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH: (NH4)2S 04+ 2NaOH = Na 2S 04+ H20 + 2NHa NH3bay ra cùng với nước sang bình hứng, bình hứng chứa H 3BO3 2NH ịOH + 4H;ìBOa = (NH4)2B40 7 + 7H,;0 hoặc H 2S 0 4, phản ứng xảy ra như sau: 2NH4OH + H 2S0 4 -> (NH4)2S 04+ 2H2 0 2. Tiến h àn h a) Vô cơ hoá nguyên liệu 1. Cân lg mẫu tươi hoặc 0,1 - 0,3g mẫu khô đã được nghiền nho (dùng met ông giấy cân cuộn tròn). Cho cẩn thận vào đáy bình Kjeldahl dung tích 50ml. 2. Cho thêm 5 - 10ml H 2S 04 đặc (d=l,84). Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt nưóc cất không có nitơ đê thấm ưỏt bột. Nếu mẫu lỏng nhi) rntóc mắm, xì dầu,... dùng pipet lấy 2 ■ õml, còn nưốc quả hộp lấy 10 - 20ml. Khi ch( mẫu vào bình, không được để mẩu dính bám cổ bình. 7 8 3. Đậy bằng nút lổng thuỷ tinh quả hồng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhỏ giọt. Lắc nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đun nhẹ khoảng 30 - 40 phút, sau đó nhấc bình ra, đê nguội. 4. Cho vài giọt xur tác axit percloric (hoặc HC10., hoặc H:,c > 2 30%, chỉ cho ở giai đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K^SO.J và C uS0 4 vối tỉ lệ 3:1, cho một lần ngay từ đầu (lượng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẩu tưdi dùng để vô cơ hoá), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa. Dung dịch sẽ chuyên từ màu đen sang màu cánh dán. Nhắc bình ra khỏi bếp, để nguội. 5. Cho them chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric), tiêp tục đôt cho đên khi dung dịch trong bình không màu. Đê nguội. 6. Chuyến dung dịch sang bình định mức 50 hoặc 100ml, tráng bình Kjeldahl vài lần bằng nưổc cất không có nitơ và dẫn đên thê tích định mức bằng nưốc cất không có nitơ. b ) S ử d ụ n g H ' ịB O .ị ở b ì n h h ử n g • Hoá chất: - H2SO,| đặc - Dung dịch H2S 040,1N - Dung dịch NaOH đặc - Dung clỊch NaOH 40% - Dung dịch HClO't hoặc H 20 2 30% hoặc K 2S 0 4, CuSO.ị (100:10:1), có thể dùng selen kim loại 0,05g) hoặc hỗn hợp K 2S 04: CuS0 4 (3:1). - Dung dịch H.jBO.j 3%. - Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0,1% trong rượu etylic và metylen xanh 0,1% trong etylic, tỉ lệ 2:1. - Chi thị Tashiro: Hỗn hợp metyl đỏ và metylen xanh có giối hạn biến đối màu ở pH 5,2-5, 6. Môi trường axit có màu tím đỏ, môi trường kiểm có màu xanh lục. Hoà 0,05g metvlen xanh vào õml nưỏc, cho vào đấy 100ml etanol và hoà thêm 0,15g metyl đỏ. Hoà tan và cho vào lọ màu đậy kín. • Tiến hành: 1. Rửa bộ chưng cất Kjeldahl kỹ bằng nưốc cất không có nitơ. Lấy 10 • 20ml (tuỳ theo hàm lượng nitơ có trong mẫu) đã vô cơ hoá cho vào bình phản ứng (c) qua phều (e). 2. Cho một vài giọt thuốc thử hỗn hợp vào bình phản ứng nếu dùng xúc tác bằng axit HCIO.^ hoặc H 9O2. 79 3. Cho vào bình hứng 20ml clung dịch H^BO-Ị 3%, thêm vài giọt chỉ thị Tashiro. 4. Đun sôi nước trong bình đốt (a) đồng thời cho nước từ vòi qua ông làm lạnh (d). 5. Cho qua phễu (e) vào bình phản ứng (c) 30ml NaOH 40%. 6. Mở khoá cho kiềm chảy vào bình đến khi dung dịch trong bình phản ứng đối màu thì đóng khoá lại. 7. Đun bình đốt, NH.J được bay lên cùng vối nước qua ống làm lạnh sang bình hứng và tác dụng với H^BO.Ị tạo thành muôi amon tetraborat [(NH/))2B40 7]. Quá trình cất được tiến hành 30 - 40 phút. Kiểm tra NHg đã hết chưa bằng cách hạ thấp bình hứng và thử bằng mẩu giấy đo pH vào đầu ống làm lạnh. Khi NH.( đã được cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nước cất nhỏ tráng sạch axit dính đầu ông làm lạnh. 8. Định lượng amon tetraborat[(NH 4)2B40 7] tạo thành bằng dung dịch H 2S 04 0, IN cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, phản ứng xảy ra như sau: (NH4)2B,í0 7 + H2S 0 4 + 5H20 -» (NH4)2S 0 4 + 4H3BO3 • Tính kết quả: Hàm lượng nitơ tổng số có trong mẫu: Nmg% = —“. M 21 10 0 w Trong đó: V- số ml H 2S 04 0,1N chuẩn độ, 1,42 - số’ mg nitơ ứng vói lm l H.,S0 40,lN, 10 0- hê số chuyển thành %, w - khôi lượng mẫu tính bằng mg. c) Sử dụng H2S 0 4 ở bình hứng • Hoá chất - H2S 04 đặc - Dung dịch H.,S0,J (hoặc HC1) 0,1N (chính xác) - Dung dịch NaOH 30% - 40% - Dung dịch NaOH 0, IN. - Thuốc thử hỗn hợp: metyl đỏ 0.1% trong rượu etylic và metyl xanh 0,1% trong rượu etylic, tỉ lệ 2:1. - Chất xúc tác ( như trên) 80 Bép đốt Kjeldahl lớn Bộ cất Kjeldahl lớn Hình 7.1 - Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng nitơ a - bình đốt e - phễu b - bình rửa f - bình hứng c - bình phản ứng g - đèn đốt d - ông làm lạnh 81 -Thuôc thử Nessler: phát hiện sự có mặt nitd trong dung dịch. Cách pha chê: + Cách 1: 15g Hgl.,; lOg KI hoà vào lõml nước cất, thêm 80ml dung dịch NaOH 50%, dan thể tích đến 500ml bằng nước cất (không có nitơ và cacbonic). + Cách 2: - 35g KI hoà tan trong 100ml nưỏc cất nóng - 17g HgCl2hoà tan trong 300ml nước cất - NaOH hoặc KOH 20% Đồ dung dịch HgClr, vào dung dịch KI đến khi kết tủa đỏ của HgỈ 2 tạo thành không thấy tan nữa thì dừng lại. Sau đó dùng (lung dịch kiềm 20% dẩn đến 1 lít. Lại thêm õml dung dịch HgCL, đến khi có kết tủa đỏ xuất hiện. Đẽ dung dịch lang đến khi hoàn toàn trong. Bảo quản trong lọ màu, đậy bang nút cao su. • Tiên hành: Quá trình định lượng được tiến hành như trên nhưng ở bình hứng cho một lượng H.;S0 4 0,IN (sao cho ngập đầu ỏng làm lạnh) và vài giọt thuốc thử hỗn hợp. Theo dõi bình hứng, nêu thấy dung dịch biên đôi từ màu vàng sang màu lá mạ thi cho thêm 5m] HrjSO I 0,1N nữa vào bình hứng, cần làm nhanh đê tránh mất nitơ. Đun sôi khoảng 30 phút, quan sát cột nước ỏ đầu ông làm lạnh không chuyển từ mầu hồng sang xanh là được. Mucin chắc chắn, lây nước đầu ông làm lạnh thử vổi thuốc thử Nessler, lấy bình hứng ra và chuẩn cỉộ axit dư bằng kiềm 0J N. • Tính kết quả: Hàm lượng nitơ có trong mẫu được tính theo công thức: (Vì - v2) X 1,42 X f V 10 0 Nmg%w Trong đó: Vị - sô ml H.^SOị 0,1N cho vào bình hứng, v «2- sô ml NaOH dùng đê chuẩn độ axit (lư trong bình hứng, f ■ hệ sô điểu chỉnh nồng độ H.,SO ị ờ bình hứng. f = 1 khi nồng độ H.>SO,ị chính xác 0,1N, w - khôi lượng mấu dùng đê vô cơ hoá mẫu ửng với thể tích cỉung dịch mẫu lấv đê định lượng ni tớ tương ứng voi ì ml HySO ị, I,42 - sô mg nitơ. * Chú ỷ: - Quá trình vô cớ hoá mẫu trong bình Kjeldahl giai phóng khi so., nen phíii tiên hành trong tủ hôt. S2