🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Hoà hợp miễn dịch hồng cầu trong truyền máu hiện đại Ebooks Nhóm Zalo TS. BSCC. TKỊNH X U A IN KIÉM HÒA HỢP MIỄN DỊCH HỒNG CẦU TRONG TRUYỀN MÁU HIỆN ĐẠI 3 NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC TS. BSCC. TRỊNH XUÂN KIẾM HOÀ HỌP MIÊN DỊCH HỔNG CẦU TRONG TRUYỂN MÁU HIỆN ĐẠI NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC HÀ NỘI -2010 LỜI GIỚI THIỆU Từ năm 1900 nhà bác học thiên tài người Đức K. Landsteiner phát hiện ra nhóm máu A, B, 0, việc truyền máu cứu sống ngưòi bệnh đã và đang phát triển rộng khắp toàn cầu. Cho tối nay và cả trong tương lai, máu vẫn là dược phẩm thiên phú quý giá, chưa có chất nhân tạo nào thay thế được. Vì vậy, an toàn truyền máu có tầm quan trọng hàng đầu. Thật vậy, truyền máu càng nhiều thì nguy cơ tai biến càng dễ xảy ra dưới nhiều hình thức phức tạp khác nhau. ở nưóc ta hệ thống truyền máu từ trung ương tới địa phương đã có nhiều tiến bộ. Tuy nhiên, trong thực tế ứng dụng lâm sàng còn có nhiều hạn chế từ kinh nghiệm đến phương tiện và kỹ thuật thực hành, nhất là với sinh viên y khoa. Đáp ứng một phần yêu cầu nói trên, TS.BSCC. Trịnh Xuân Kiếm đã biên soạn cuốn sách “Hòa hợp m iễn dịch hồng cầu trong truyền m áu hiện đ ạ i”. Cuốn sách này đã đề cập đến một số kiến thức cơ bản và kinh nghiệm trong lĩnh vực miễn dịch dòng hồng cầu. Đó là hệ thống nhóm máu A,B,0 và các hệ thống nhóm máu khác ngoài hệ thống A,B,0 vối kháng thể bất thường, gây tai biến tan máu sớm hoặc muộn, ngày càng phổ biến nhưng rất khó phát hiện trong phòng thí nghiệm cũng như trên lâm sàng. Đồng thời cuốn sách cũng giói thiệu một số kỹ thuật nhằm giải quyết những vấn đề thiết thực này. 3 Xin giới thiệu cuốn sách này vói sinh viên y dược khoa, các đồng nghiệp cùng tham khảo trong thực hành và nghiên cứu. Tôi tin ràng tác giả mong được tiếp thu nhiều ý kiến bổ sung của các bạn. Hà Nội, tháng 12 năm 2010 GS.TSKH. ĐỖ TRƯNG PHÂN Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Huyết học - Truyền máu Đại học Y Hà Nội Nguyên Viện trxlởng Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương 4 LÒI NÓI ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển chung của đất nước, hòa nhập cộng đồng Quốc tế, nền Y học Việt Nam cũng như chuyên ngành Truyền máu đã có nhiều tiến bộ. Tuy nhiên, hòa hợp miễn dịch, trước hết là các hệ nhóm máu dòng hồng cầu trong truyền máu hiện đại, ứng dụng lâm sàng vẫn cần được quan tâm nhiều hơn nữa. Để góp phần đáp ứng yêu cầu thực tế phục vụ lâm sàng và đào tạo tại các cơ sở y tế, cuốn sách “Hòa hơp m iễn dịch hồng cầu trong truyền m áu hiện đ ạ i” được ra đòi. Cuốn sách bao gồm 06 chương: Chương 1: Cơ sở di truyền và miễn dịch của các hệ nhóm máu. Chương 2: Các hệ nhóm hồng cầu. Chương 3: Thực hành kỹ thuật an toàn truyền máu. Chương 4: Các kháng thể bất thường và an toàn truyền máu. Chương 5: Những tai biến và sự cố trong truyền máu. Chương 6: Chế tạo và bảo quản sinh phẩm dùng trong truyền máu. Cuốn sách này là kết quả học tập, nghiên cứu trong và ngoài nưốc, ứng dụng thực tế lâm sàng suốt nhiều năm qua của tác giả. 5 Hy vọng cuốn sách sẽ mang lại những thông tin bổ ích và thiết thực với ngưòi đọc, đặc biệt các sinh viên, học viên ngành Y-Dược. Tuy nhiên, trong quá trình biên soạn không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Rất mong sự độ lượng và góp ý của người đọc. Tác giả TSẻBSCCế TRỊNH XUÂN KIẾM MỤC LỤC Lời giới thiệu 3 Lời nói đầu 5 CHƯƠNG 1: Cơ SỞ DI TRUYỂN VÀ MIÊN DỊCH CỦA CÁC HỆ NHÓM MÁU I. Di truyền của các hệ nhóm m áu 11 1 . Cấu trúc cơ bản của DNA và RNA 11 2. Các gen và locus phân chia tế bào 17 3. Di truyền qua hệ tiết các kháng nguyên nhóm máu 25 II. M iễn dịch của các hệ nhóm m áu 27 A. Một sô" vấn đề cơ bản 27 l ế Các kháng nguyên nhóm máu 27 2 . Các kháng thể nhóm máu 29 3. Kết hợp bổ thể 35 B. ứng dụng các hoạt tính kháng thể in - vitro 37 c. Cơ chế của các phản ứng miễn dịch và các yếu tố 38 tác động CHƯƠNG 2: CÁC HỆ NHÓM HỒNG CẦU HỆ NHÓM ABO 40 I. Lịch sử 40 II. Di truyền và tín h k ế thừa 41 III. S inh hoá các kh á n g nguyên nhóm m áu 43 IV. Các kh á n g nguyên hệ ABO 46 7 V. Các kh á n g the thuộc hệ ABO VI. Phương p h á p xác đ ịnh nhóm m áu hệ ABO 57 VII. N hững trường hợp bất thường kh i xác đ ịn h 62 nhóm m áu hệ ABO VIII. Cách p h òng trá n h và xử lý các khó k h ă n k h i 6 6 xác đ in h nhóm m áu ABO HỆ Rh 6 8 I. L ịch sử 6 8 II. D anh p h á p 69 III. Tần số kh á n g nguyên hệ R h ở người da trắ n g 73 IV. Các kh á n g th ể hệ R h 74 HỆ KELL 75 HỆMNSs 78 HỆ LEWIS 81 HỆ p 85 HỆ LUTHERAN 91 HỆ DUFFY 92 HỆ KIDD 93 CHƯƠNG 3: THỰC HÀNH KỶ THUẬT AN TOÀN TRUYỀN MÁU I. Xây dựng và bố trí m ột p h ò n g xét nghiệm m iễn 96 dịch huyết học II. Một số thiết bị nhỏ dùng trong xác định nhóm 99 m áu và kh á n g th ể nhóm m áu 1 . Các pipett Pasteur dùng chung 99 2. Thuốc thử chủ yếu 101 III. Phản ứng kh á n g nguyên, kh á n g th ể và các th ể 102 hiện in vitro A. Kỹ thuật gắn hay hấp thụ 103 B. Kỹ thuật tách 106 c. Kỹ thuật ngưng kết 109 CHƯƠNG 4: CÁC KHÁNG THỂ BẤT THƯỜNG VÀ AN TOÀN TRUYỀN MÁU I. Đại cương 138 II. Thiết lập P anel hồng cầu 140 l ế Định nghĩa 140 2. Nguyên tắc thiết lập các Panel hồng cầu 141 3. Nguyên lý tiến hành kỹ thuật phát hiện và xác 142 định kháng thể bất thường 4. Chế tạo hồng cầu nghiệm cho các Panel, cách 145 bảo quản CHƯƠNG 5: NHỮNG TAI BIẾN VÀ sự c ố TRONG TRUYỀN MÁU / ể N hững p h ả n ứng không huyết tá n 146 1. Phản ứng sốt 146 2. Phản ứng dị ứng 148 3. Phản ứng nhiễm khuẩn 149 4 . Tai biến lây bệnh 150 5. Tai biến gây miễn dịch 151 II. N hững p h ả n ứng huyết tá n 151 A. Nguyên nhân miễn dịch 151 B. Nguyên nhân ngoài miễn dịch 153 III. Thái độ phòng, chống và xử trí 154 1 . Chẩn đoán 154 2. Xử trí 155 CHƯƠNG 6: CHẾ TẠO VÀ BẢO QUẢN SINH PHAM DÙNG TRONG TRUYỀN MÁU I. Giữ m áu và các sin h vật p h ẩ m 157 1 . Các thành phần cấu trúc của tế bào 157 2. Các tế bào đóng băng 158 3. Các kháng huyết thanh 158 7/ệ C h ế tạo các sin h p h ẩ m chủ yếu 159 1. Tiêu chuẩn chế tạo Anti-A, Anti-B, Anti-A + B 160 2 . Tiêu chuẩn chế tạo thuốc thử Antiglobulin người 163 sử dụng trong miễn dịch huyết học Phụ lục: Một sô dung dịch chống dông và dung 173 dịch đệm dùng trong miến dich truyền m áu Tài liệu tham khảo 178 10 Chương 1 c ơ s ở DI TRUYỀN VÀ MIỀN DỊCH CỦA CÁC HỆ NHÓM MÁU Từ năm 1900, Karl Landsteiner phát hiện đầu tiên nhóm máu thuộc hệ ABO, tiếp theo đó hàng loạt các phát hiện khác đều chứng minh rằng tính kế thừa, di truyền về nhóm máu tuân theo đúng các định luật Mendel. Việc nghiên cứu xác định nhóm máu đểu áp dụng các nguyên tắc và phương pháp kỹ thuật miễn dịch. Các nhóm máu khác nhau đều là những kiểu thể hiện của những kháng nguyên nằm trên bề mặt hồng cầu, các kháng nguyên này lại là sản phẩm của các gen nằm ở các locus nhất định, bố trí trong các thể nhiễm sắc (chromosome) của nhân tế bào. Trước khi khảo sát cụ thể từng hệ nhóm máu, cần thiết phải nhắc lại một số điều cơ sở về tổng hợp protein, về DNA và gen, vê thể nhiễm sắc, phân chia tê bào, kháng nguyên, kháng thể, và các phản ứng miễn dịch có liên quan đến việc nghiên cứu các hệ nhóm máu sau này. |ằ DI TRUYỀN CÙA CÁC HỆ NHÓM MÁU Cơ sở vật chất di truyền của gen là các acid nhân: DNA (desoxyribonucleic acid) và RNA (ribonucleic acid). 1. Cấu trúc và chức năng cơ bản của DNA và RNA Cấu trúc cơ bản của DNA gồm 2 chuỗi polynucleotid dài, gấp lại thành một vòng xoắn kép, mỗi chuỗi chạy theo một hướng ngược chiều nhau (hình 1 .1). Thông tin di truyền được mã hoá trên DNA bằng sự sắp xếp trình tự của 4 gốc: Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), và Cytosin (C). Trong sô' đó thì A và G là gốc purin còn T và c là gốc pyrimidin. 11 Hình 1ẵ1. Cấu trúc cơ bản của DNA Một phân tử DNA gồm 3 thành phần: 1 đưòng, 1 gốc, và 1 phosphat, ba thành phần này tạo thành một nucleotid. Số lượng nucleotid chứa adenin bao giò cũng ngang bằng số lượng nucleotid chứa thymin. Số lượng nucleotid chứa guanin bao giò cũng ngang bằng số lượng nucleotid chứa cytosin. Do đó A bao giò cũng cặp đôi vối T, còn G thì cặp đôi vối c. Các đoạn trên phân tử DNA chứa đựng các gen, nên gen là những đơn vị của di truyền. Mã di truyền là do trình tự bộ ba (triplet) của 3 gốc xếp theo thứ tự nhất định. Thứ tự này được mã hoá đối với một acid amin. Bộ ba như thế gọi là một codon, một dãy sắp xếp những “bộ ba” tạo thành một trình tự acid amin trên một chuỗi polypeptidễ Một gen là một trình tự sắp xếp của những “bộ ba” có chứa mã đối với một polypeptid (hình 1.2 và 1.3). - RNA cũng là một phân tử đơn như DNA nhưng khác ở chỗ đưòng của RNA là ribose, không phải desoxyribose như DNA, và “gốc” của RNA là Uracil (U) chứ không phải là thymin như trong DNA (hình 1.4). Có 3 loại RNA với 3 chức năng khác nhau tham gia trong tổng hợp protein: 12 acqtctagct ! ! ! i ! 1 I I p p p p p p p p p M A M A A M s s s s s s s s s s T G C A G A T C G A s s s s s s s s s s W v W W W P P P P F P P P p P: phosphate; S: sugar (desoxyribose) A: Adenine; T: thymine; G: guanine; C: cytosine Hình 1.2. Các thành phần của phân tử DNA A T cTg 6 tItACATTAGCTAGCC 1__ 1 i l l I l I ì 1 1 I 1 Hình 1.3. Trình tự sắp xếp các bộ ba có chứa mã di truyền 13 Hình 1.4. Cấu trúc của phân tử RNA - RNA đưa tin (messenger RNA hay mRNA). - RNA chuyển (tRNA), còn gọi là RNA hoà tan (sRNA). - RNA của ribosom (rRNA). Chức năng của RNA là thông dịch mã từ DNA đến một polypeptid hoặc protein. RNA đưa tin được sinh ra bởi sự sao chép từ DNA, khuôn mẫu sắp xếp các gốc trên mRNA giống hệt như trên DNA, chỉ khác là u thay cho T và cặp đôi với A. Khi mRNA nhận mã di truyền rồi, thì ròi nhân đi ra bào tương kết hợp vối các ribosom. Ribosom là những hạt nhỏ chứa nhiều acid nhân và là nơi tổng hợp protein. Ribosom chỉ hoạt động sau khi tiếp xúc vối một phân tử mRNA (hình 1.5). 14 ÜÖACCUAUO A C TG G A T AC /RNA đưa tin (mRNA) Hình 1.5. Trình tự sắp xếp của phân tử RNA RNA chuyển (tRNA) hoà tan trong bào tương, có chức năng chuyển các acid amin từ bào tương đến từng vị trí thích hợp trên khuôn của mRNA, trình tự diễn biến như sau: - Ribosom gắn vào một điểm dính của mRNA. Mỗi acid amin gắn vào một mặt của tRNA, mặt thứ hai của tRNA trình ra một mã “bộ ba” như đã định. - Ribosom chạy dọc theo mRNA, đọc mã và đặt mỗi acid amin thích hợp vào một vị trí đã định trưốc. - Các acid amin được nối vói nhau bởi những dây peptid, những dây này cũng do ribosom tạo ra dưới tác dụng của 1 men. Sau khi tạo thành các dây này bắt đầu chạy tách ra khỏi ribosom và các tRAN trở nên tự do. Mỗi ribosom cần độ 10 dây để “đọc” suốt chiều dài của 1 RNA. Mỗi khi đọc xong 1 mã và nhiều mRNA cùng đọc 1 lần, thì 1 polypetid vối trình tự sắp xếp các acid amin nhất định được tạo xong, sản phẩm này có thể là 1 men (enzym), 1 hemoglobin v.v (bảng 1 .1 . mã di truyền). Bảng 1.1. Mã di truyền N uctrolid thú- hai A hoỊc u c M e c T hoặc A c hoặc G A h o ịi Ư A hoỊỊc u AAA AAG A A T A A C u u u UỦC ƯUA i n j c Phe Leu AGA AGC AGT AGC UCƯ IJCC UCA UCG Scr ATA ATG A T I A r c UAU UAC ŨÃA TJAG T ,r Stop ACA ACG ACT ACC UGU UGC UGA UGG Cyi T ryp G « c T * A c < c G hoitc c T Vioịc A choặc G AA GAG G A T GAC T A A T A G T A T TAC CAA CAG CAT CƯƯ c u c CUA c u c AƯƯ AUC AUA AUG G UU GUC GUA Leu He Met V»1 GGA GGG GGT GGC TAG TGG T G T TGC CGA CGG CGT c c u c c c CCA c c c ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA V ia T hr Ala GTA GTG GTT o r e TT A T T C T T T TTC CTA C.IG CTT CAU CAC CAA CAG AAU A AC AAA AAG GAU GAC GAA His tiln Asti Lys GCA c c c GCT GCC TCA TCG TCT TCC CCA COG c c r CGU CGC CGA CCG AGU AGO AGA AGG GGU CGC GCA Ar* Ser A rf Gly A < c € r < c « A « o * T t c c A «. G « T t 11c Ac ucAG IJ cA G CAC GUG CGC CCG CTC GAGOlu c o c GGC c « c Chứ ih ic h :A = adcDỈn c = cytoãne I! = «M ilIK AU = alaxúrte Aig = arginine Atn = asparagine Asp = aspartic acid - guanine r = thymine Cva — cyileine Gin = glutamine Glu = gluiimic acid C'ly = Kl>cin« Hit — histidine lie = isolcucinL- ) ,tu — leucine Lyi = lytirj« Met = melliiontne Phe = phenyltmine 1*T«I = proline s»r = iwrine Song song vói chức năng chủ yếu tổng hợp protein nói trên, DNA còn có chức năng nhân đôi, tạo ra nhiều DNA các quá trình phân chia tế bào. 2. Các gen và locus phân chia tế bào Những đặc tính cá thể được mang trong các tế bào ỏ những phân tử nhỏ gọi là gen. Mỗi gen là một đơn vị di truyền, chiếm lĩnh một vị trí đặc hiệu trên chuỗi DNA gọi là locus. Chức năng của mỗi gen cũng đặc hiệu, gen nào tạo ra sản phẩm ấy. Các gen có mặt ở trạng thái nghỉ trong thể nhiễm sắc của nhân tế bào. Ở giai đoạn đầu của phân chia, thể nhiễm sắc tụ lại thành một dải dài (spirene). Ớ đó các gen được phân bô" từng locus theo một thứ tự nhất định. Khi dải dài đó được cắt ra nhiều mảnh thể nhiễm sắc. Ớ ngưòi có 46 thể nhiễm sắc, được xếp thành 23 cặp. Trong đó có 1 cặp giới tính XX hoặc XY. Mỗi cá nhân nhận 2 gen: 1 từ mẹ, 1 từ bô", hợp thành 1 đôi gen allele tương đồng. Nếu 2 gen allele này giống hệt nhau thì gọi là đồng hợp tử (homozygote)ằ Nếu 2 gen đó khác nhau thì gọi là dị hợp tử (heterozygote). Gọi như thế vì tính kế thừa bao giờ cũng từ cả bố và mẹ (hình 1 .6 ). Trong kiểu phân chia các tế bào somatic, các DNA được nhân đôi cho hai tế bào con giống như tế bào cũ (mitosis). Trong kiểu phân chia của tế bào sinh dục thì lại phân 2 nửa, mỗi nửa kết với nửa khác của cá thể khác giới, cấu thành một thể toàn vẹn (meiosis) (hình 1.7). Dù là phân chia kiểu mitosis hay meiosics thì cũng có 4 pha phân chia và 1 pha nghỉ. Bốn pha phân chia là: Kỳ đầu (prophase), kỳ giữa (metaphase), kỳ hậu (anaphase), kỳ cuối (telophase), pha nghỉ gọi là (interphase), ở pha nghỉ, các thể nhiễm sắc nối liền thành một dây dài, cuộn lại trong nhân, không phân tách được. Từ pha giữa mối nhận định được từng cặp thể nhiễm sắc (chromosomes) (hình 1 .8 a, và 1 .8 b). 17 0 , ị Ị , . ; - Hình 1.6ể Các dạng gen tương đồng Metaphase Hinh 1.8b. Sirphân chia te bào Tính kế thừa và di truyền là do các tế bào sinh dục nam và nữ (tinh trùng và trứng). Thông qua kiểu phân chia giảm nhiễm (meiosis). Mỗi tế bào sinh trùng hoặc trứng chỉ có nửa sô' thể nhiễm sắc (cụ thể là 23). Đến khi kết hợp được với một tế bào trứng hoặc tinh trùng khác giới mới tạo thành một tế bào soma đủ 46 nhiễm sắc thể (23 cặp) và cũng bắt đầu từ tế bào đầu tiên này, sự phân chia tế bào tiến hành theo kiểu mitosis, nghĩa là các DNA, các gen cũng như các thể nhiễm sắc đều phân đôi để từ một tế bào mẹ thành hai tế bào con giống hệt tế bào mẹ. Cũng do sự khác nhau cơ bản giữa mitosis (phân chia kiểu soma) với meiosis (phân chia kiểu giảm nhiễm) mà những biến dị (mutation) xảy ra trong di truyền cao hơn nhiều so vói những biến dị xảy ra trong tế bào soma, do những hiện tượng “bắt chéo” (Crossing over) bất ngò của các thể nhiễm sắc từ 2 tế bào hai giới khác nhau kết hợp lại khi thụ thai. Cho tới nay, chưa có kỹ thuật xác định và phân lập từng gen, trực tiếp trong từng locus, mà người ta dùng các phương pháp gián tiếp qua những sản phẩm do gen sinh ra. Chính vì lẽ đó khi sinh ra 1 cặp gen allele (tương đồng) sinh ra 2 sản phẩm tương đồng mà một sản phẩm thể hiện rõ hơn hoặc duy nhất phát hiện được còn sản phẩm kia thể hiện yếu hơn hoặc không phát hiện được, người ta quen gọi là “gen trội” và “gen lặn”. Thực ra thì “trội” và “lặn” chỉ có ý nghĩa khi dùng để giải thích một sô" bệnh lý, thí dụ điển hình như gen bệnh hemophilia gắn vối choromosom X (Xh) được gọi là di truyền “lặn” vì khi di truyền cùng 1 X bình thường thì gen bệnh Xh không thể hiện ra ngoài, đó là trường hợp ngưòi nữ mang 1 gen Xh và 1 gen X bình thường, không phát bệnh nhưng vẫn truyền được bệnh qua gen bệnh lý “lặn” đó. Nói chung trong di truyền và kế thừa, không có tính “trội” và tính “lặn” thực thụ, vì khi một thể hiện nào có vẻ “trội” lấn át, thể hiện kia có vẻ chìm, bị át đi, thì chỉ có nghĩa rằng ngưòi ta chưa có đủ nguyên liệu và biện pháp để phát hiện những thể hiện chìm đó mà thôi. Khi có được nguyên liệu và biện pháp thích hợp thì mọi sản phẩm của gen đều được thể 21 hiện ngang nhau và mọi gen đểu bình đăng, bình quyền như người ta thường gọi những triíòng hợp cùng trội (co-dominant hoặc egalitarian). Tuy nhiên cũng có trường hợp do một tính trội nào khác, thí dụ màu sắc mà ngưòi ta gọi lầm là tính trội của gen. Điển hình là trường hợp lai giữa hai màu da trắng và da đen. Người con được kế thừa từ 2 bố" mẹ, 1 người da trắng, 1 ngưòi da đen chẳng hạn, những gen và sản phẩm gen là màu trắng, đen hoàn toàn bằng nhau và đều thể hiện vối liều lượng ngang nhau, nhưng màu da đen bao giờ cũng nổi bật hơn mặc dù đã pha với một nửa trắng. Do đó có cảm nghĩ rằng gen đen trội hơn gen trắng. Một thí dụ nữa về nhóm máu: Một người nhận từ bô" gen A và từ mẹ gen o, khi định nhóm thì chỉ thấy A thể hiện mà không thấy o, có thể hiểu lầm rằng gen A “trội” và gen o “lặn”. Thực ra nhóm mà người ta gọi o chỉ có nghĩa là không A, không B. Gen H sinh ra chất H rồi từ chất H các gen A và B tác động tiếp để sinh ra chất A hoặc B. Nếu không có cả gen A và B thì chất H còn nguyên vẹn. Nếu dùng Anti H để phát hiện yếu tố H thì thấy yếu tố này thể hiện rất mạnh ở hồng cầu rihóm o, không kém gì các yếu tố A hoặc B ở những hồng cầu nhóm A hoặc B (hình 1.9). AO 0 0 AO oo Hình 1.9. Các kiểu di truyền nhóm máu hệ ABO 22 Từ những khái niệm cơ bản trên, người ta phân làm hai kiểu thể hiện: kiểu hiện (phenotype) và kiểu di truyền hoặc kiểu gen (genotype). Kiểu hiện chỉ là những sản phẩm của gen (kháng nguyên) phát hiện được, còn kiểu di truyền là chỉ tất cả các sản phẩm của tất cả các gen có mặt trong 1 hệ. Thí dụ khi nói nhóm máu A, nhóm máu B là nói kiểu hiện, còn khi muốn nói kiểu di truyền thì phải xác định được là AA hay AO, BB hay BO. Từ đó suy ra khi nói nhóm máu o, hoặc nhóm máu AB là đồng thòi đã xác định được cả kiểu hiện và kiểu di truyền, vì nhóm o chỉ có thể là 0 0 , nhóm AB chỉ có thể là có cả 1 gen A và AO BO MAB AO BO 00 1 gen B kế thừa từ cả hai bố mẹ chứ không thể từ một người bố hoặc một người mẹ (hình 1 .1 0 ). MC Bở' AO 8 8 MAQ AS 6 0 80 Mẹ B ô ' Hình 1.10. Các kiểu hiện và kiểu di truyền 23 Bảng 1.2. Những nhóm kế thừa có hoặc không có khả năng từ cha mẹ (không kể các nhóm phụ) Kiĩu hiện cỉi^ha-M i; Kiều di truyita cóc Chi-M Nhóm k í Ihừa rổ khỉ năng (K itu hiện vi kiỉu di truyfcn) NhD-n* kita hlfn kế i h n kKSnfj c6 khỉ ning 0 X 0 0 0 X 0 0 0 COO) A. B, AB O X A 0 0 X AA < < o 0 0 X A0 illO. B. AB R, AR O X B O O X B B 0 0 X BO B (BO) , B (BO) 0 (OO) f O, A, AB A. AB 0 X AB O O X A B A(AO) A .x B AA X BB B (BO) [ o. AB AO X BB AO X BO AA X BO A X AB AA X AB AO X AB A X A AA X AA AO X A A AO X AO B X B BB X BB AB (AB) AB (AB) Ị B (BO) A ( AO) B (BO) AB CAB) 0 (0 0 ) ' A(AO) I AB (AB) j A (AA) j AB CAB) \ A (AA) ( A B ( A B) B (BO) (1 A(AA) I A(AA) A CAO) A(AA) A CAO) 0 ( 0 0 ) 1 O. A. B 0 . A Khỏng B. 0 B. 0 o O, B. AIỈ 0 . B, AK B, AB BO X BB B (BB) 1ÍO, A, AB BO X BO B X AB BB X AB B (BB) ] B (BO) 1 B ÍBOJ B (BB) ; 0 (0 0 ) i AB (AB) 1 O. A, AB A. AB BO X AB B (B0> (!1O. A Ẹ (BB) AB (AB) A (AO) ! AB X AB AB X AB A (AA> 1 o AB (AB) 10 B (BB) 24 Nhiều trường hợp không phát hiện được kiểu di truyền bằng phương pháp xét nghiệm trực tiếp mà phải bằng điều tra gián tiếp và phả hệ. Thí dụ ngưòi Bố là nhóm A (kiểu hiện), người Mẹ là nhóm B (kiểu hiện), sinh con là nhóm o (vừa kiểu hiện vừa kiểu di truyền) thì chắc chắn ngưòi Bô' có kiểu di truyền là AO và người mẹ có kiểu di truyền là BO. Vói một hệ nhóm máu, thường chưa đủ để xác định, phải điều tra ỏ nhiều hệ khác nhau. Với nguyên liệu, thuốc thử sinh học, phương pháp kỹ thuật đầy đủ, việc xác định các kiểu di truyền qua điều tra phả hệ và gia đình, có thể đạt được ở đa số trường hợp, chỉ trừ những trường hợp quá hãn hữu. Mỗi thành viên gia đình được điều tra, nếu là nam thì ký hiệu là propositus, nếu là nũ thì ký hiệu là proposita (bảng l ế2 ). 3. Di truyền qua hệ tiết các kháng nguyên nhóm máu Từ 1924, Moss và Yamakami đã phát hiện các yếu tố kháng nguyên A, B, H của hệ nhóm máu ABO không chỉ có mặt trong hồng cầu mà còn thấy trong nước bọt nhũng ngưòi có hồng cầu mang kháng nguyên đó. Tuy nhiên, không phải bất kỳ ngưòi nào mà có ngưòi thấy, có ngưòi không. Từ đó đề ra danh từ những người tiết (secreteurs), có tiết các yếu tố A, B, H qua nước bọt và những người không tiết (non secreteurs), không thấy các yếu tố đó trong nựớc bọt. Tính di truyền của hệ tiết ABH do 1 cặp gen alíele sese quyết định, có tính chất trội và độc lập. Sau đó nhiều tác giả xác định có hai dạng kháng nguyên rõ rệt, một dạng hoà tan trong nước, bản chất là polysaccharid thấy ở đa số các dịch trong cơ thể như nước bọt, dịch vị, dịch tuỵ, nước tiểu và một dạng hoà tan trong cồn, bản chất là glycolipid thấy trên màng các hồng cầu. Cepellini, Watkins, Morgan còn thấy có sự liên quan chặt chẽ giữa hệ tiết ABH với hệ tiết nhóm hồng cầu Lewis. 25 Gen Le quyết định sự tạo thành yếu tố Lewis (Leahoặc Leb). Khi không có gen này, yếu tô Lewis không thê hình thành được. Sự có mặt của gen Se có tác dụng chuyển chât cơ bản xrv thành yếu tố H hoặc Lea bằng cách gắn thêm 1 fructose và chỉ sau hoạt động này yếu tô A, B hoặc Lea, Leb mới được tạo thành. Những người này đểu thuộc loại tiết (secreteurs). Hồng cầu của họ ngoài hệ nhóm ABO, còn có nhóm Le (a b ) hoặc Le (a~ b+)ễ Những ngưòi không có gen Se (đồng hợp tử sese), nếu không có cả gen Le (lele) thì yếu tố cơ bản được giữ nguyên vẹn, thuộc loại không tiết (non secreteurs) ABH, và hồng cầu thuộc nhóm Le (a' b ')rất hiếm gặp, chỉ chiếm 0,1%- Những ngưòi không có gen Se, nếu lại có gen Le thì yếu tố cơ bản được chuyển thành Lea, thuộc loại không tiết yếu tô" ABH và hồng cầu thuộc nhóm Le (a+ b~). Tỷ lệ nhóm này chiếm khoảng 20% theo số liệu nưốc ngoài (bảng 1.3). Bảng 1.3. Sơ đồ về hệ tiết các yếu tố A, B, Lewis trong nước bọt 26 Ilẽ MIỄN DỊCH HỌC CỦA CÁC HỆ NHÒM MÁU A. MỘT SỐ VẤN ĐỂ Cơ BẢN 1. Các kháng nguyên nhóm máu Các kháng nguyên nhóm máu đều là sản phẩm của các gen. Gen quyết định nhóm máu có mặt ở thể nhiễm sắc trong nhân hồng cầu non (Erythroblaste) và phát huy chức năng như mọi hệ thống gen khác của cơ thể. Thí dụ locus của hệ ABO (Al, A2, B, H) nằm trên nhánh dài của chromosom số 9. Locus của các gen hệ Rh nằm trên nhánh ngắn của chromosom sô" 1 . Các gen quyết định các sản phẩm tương ứng Al, A, B, H thuộc hệ ABO, hoặc D, c, E, c, e thuộc hệ Rh trên màng hồng cầu (hình 1.11). Khi hồng cầu non mất nhân trở thành hồng cầu trưởng thành làm nhiệm vụ vận chuyển oxy ỏ máu ngoại vi thì các sản phẩm nói trên vẫn tồn tại suốt đời sống của hồng cầu. Đó chính là các kháng nguyên nhóm máu. Đặc tính cơ bản của kháng nguyên là tính miễn dịch và tham gịa tích cực vào phản ứng miễn dịch của cơ thể. Vì vậy người ta dùng các phương pháp kỹ thuật miễn dịch nhằm phát hiện và xác định các kháng nguyên cũng như các kháng thể ứng vối những kháng nguyên đó. Đe phát hiện và xác định các hệ nhóm máu và các kháng thể thuộc các hệ đó, ngưòi ta cũng hưống như vậy. Đây là nội dung chủ yếu của các phương pháp kỹ thuật Miễn dịch-Huyết học dùng trong truyền máu và bệnh lý huyết học miễn dịch từ trưóc tối nay. Thuốc thử cơ bản để xác định nhóm máu là các kháng thể tương ứng với từng kháng nguyên nhóm máu, mà ngưòi ta đã chế tạo đạt đủ tiêu chuẩn để làm xét nghiệm bảo đảm an toàn. Các thuốc thử sinh học này được gọi là huyết thanh nghiệm (Serum-tests). Quy tắc an toàn miễn dịch trong truyền máu là phải truyền máu hoà hợp miễn dịch, nghĩa là không để xảy ra phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể nhóm máu. 27 ngđirv -Nhanh - »I« -— ~7~ \ Q — Enolase-1 — 6 - Phosphogluconate Dehydrogenase — Glucose Dehydrogenase — Elliptocytosis -1 UDP - Galactose - 4 - Epimerase Rh Blood Group a - L - Fucogalactose Scianna Blood Group I— Adenylate kinase - 2 L_ Uridine monophosphate kinase Phosphoglucomutase -1 Amylase Pancreatic Amylase salivary Duffy Blood Group Cataract, Zonular Pulverulent NbôÁh dđf—— L#UDP - Glucose Pyrophosphorylase -1 Guanylate kinase -1 & 2 Peptidase C Fumarate Hydratase 5S Ribosomal RNA gene Guanylate Kinase -1 & 2 Hình 1.11. Sắp xếp gen của Chromosom 1 của người 28 Cũng như các đáp ứng miễn dịch khác, khi đưa một kháng nguyên hồng cầu vào cơ thể không có kháng nguyên ấy, thì cơ thể sẽ nhận biết kháng nguyên đưa vào như một “tính lạ”. Nhò hệ miễn dịch của bản thân sẽ huy động hệ miễn dịch sản sinh ra kháng thể đặc hiệu vối kháng nguyên “lạ” ấy. Cụ thể, nếu truyền hồng cầu A cho ngưòi nhóm o hoặc truyền hồng cầu Rh dương (+) có kháng nguyên D cho ngưòi Rh âm (-) không có D (dd),thì sau một thòi gian nhất định trong huyết thanh ngưòi nhóm o sẽ sản sinh ra kháng thể Anti-A miễn dịch, trong huyết thanh Rh (-) sẽ có mặt kháng thể Anti-D miễn dịch, gây nên các tai biến truyền máu. Gọi là kháng thể miễn dịch vì phải qua một quá trình gây miễn dịch khi đưa kháng nguyên “lạ” vào cơ thể, khác với kháng thể tự nhiên. Với hệ ABO, có một số điều đặc biệt là từ khi sinh ra, đã thấy những kháng thể sẵn có trong huyết thanh không ứng vối kháng nguyên trên hồng cầu như một tất yếu và tuyệt đối. Cụ thể là ỏ huyết thanh người hồng cầu nhóm A tất yếu phải có kháng thể Anti-B, không có kháng thể Anti-A; ỏ huyết thanh ngưòi hồng cầu nhóm B thì tất yếu có kháng thể Anti-A, không bao giò có kháng thể Anti-B. Huyết thanh ngưòi hồng cầu nhóm o thì có mặt cả kháng thể Anti-A và Anti-B; ở huyết thanh người hồng cầu nhóm AB, tất yếu không có kháng thể nào thuộc hệ ABO, nghĩa là không có cả Anti-A và Anti-B. Những kháng nguyên và kháng thể nói trên là tự nhiên và thường xuyên. 2. Các kháng thể nhóm máu Cũng như mọi kháng thể khác, các kháng thể nhóm máu đều có bản chất lý hoá là các globulin miễn dịch Ig. Có 5 loại chính: IgA, IgG, IgM, IgE, IgD. Các kháng thể nhóm máu chủ yếu thuộc 2 loại IgG và IgM (hình l ẽ12). 29 Cấu trúc hoá học của IgG được dùng để mô tả cơ bản, chung cho các loại Ig, vì IgG ỏ dạng đơn phân (monomer). IgG gồm 4 chuỗi polypeptid, cấu trúc 4 bậc: 2 chuỗi nặng (Heavy Chain) ký hiệu là H giống hệt nhau, môi chuôi có khối lượng phân tủ khoảng 55.000; 2 chuỗi nhẹ (Light Chain) ký hiệu là L giống hệt nhau, mỗi chuỗi có khối lượng phân tử khoảng 22.500. Có 2 loại chuỗi nhẹ Kappa hoặc hai chuỗi nhẹ Lamda, mỗi chuỗi nhẹ nối với 1 chuỗi nặng bằng 1 cầu nối disulfua (disulfide bond S-S), 2 chuỗi nặng nối vối nhau bằng 1 đến 2 hoặc hơn nữa các cầu nối S-S như trên (hình 1.13). Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc của 5 lớp globulin miễn dịch và phân tử IgG 30 Hình 1.13b. Sơ đồ cấu tạo của phân tử IgG Các liên kết disulfua trong chuỗi đã tạo ra tại mỗi vùng (VH, Vì c, CH1, CH2 Ch3) một sô' cấu hình gồm 60 acid amin: đó ià các lĩnh vực của Ig (immunoglobulin domains) 31 IgA cũng có cấu trúc tương tự như vậy, chỉ khác nhau ỏ chỗ IgA hay ở dạng lưỡng phân (dimer), 2 đơn vị nhỏ (subunis) nối nhau bằng một chuỗi phụ, gọi là J.Chain, (hình 1.14). Hình 1.14ẽ Cấu trúc phân tử IgA IgM gồm 5 đơn vị nhỏ, cấu trúc tương tự như đơn vị IgG, 5 đơn vị nhỏ này gắn với nhau bằng chuỗi phụ J. Chain, một pentamer như 5 cánh sao (hình 1.15) (hình 1.16). Hình 1.15. Phân tử IgM liên kết disulíit; ------ chuỗi polypeptid 32 Hình 1.16. Phân tử IgG và IgM gắn trên bề mặt hồng cầu Trở lại đặc điểm của IgG, loại Ig này chiếm tỷ lệ 70 đến 75% tổng số Ig trong huyết thanh ngưòi bình thường, cụ thể là nồng độ từ 1 0 - 14g/lít. Khối lượng phân tử khoảng 150.000 ứng với hệ sô' lắng là 7S (siêu ly tâm). Vì thế trước đây quen gọi là gamma globulin 7S. Các IgG không đồng nhất mà bao gồm nhiều loại nhỏ. Vì vậy trên diện di miễn dịch thể hiện một cung tủa chạy dài từ vùng dịch chuyển của các globulin alpha 2 đến điểm cuối của vùng cực âm (hình 1.17). c Hình 1ẵ17ẳ Hình ảnh điện di miễn dịch với các cung của các globulin miễn dịch IgG, IgA, IgM: 2 thành phần bổ thể C3 và C4, 1 sô' các protein khác: p lip (Beta lipoprotein), a 2M (alpha 2-macro-globulin và Tf (transferrin) 33 Vì tính lý hoá tương tự nhau giữa phần tủ IgG và các đơn vị nhỏ của phân tử IgM nên Porter và Edelman cùng các cộng sự đã phân tích phân tử IgG để từ đó làm sáng tỏ cấu trúc và tính năng của các Ig khác như IgA và IgM như sau: - Sử dụng các men tiêu protein khác nhau (Papain, cystein, pepsin...), có thể cắt ròi từng phần của phân tử IgG, nghiên cứu những chức năng và đặc tính khác nhau của từng phần đó. - Đoạn Fab (Fragment Antigen-binding) là đoạn mang tính chất kháng thể sẽ gắn vào kháng nguyên tương ứng. - Đoạn Fc (Fragment Cristallisable) là đoạn không có biến đổi, mang tính kháng nguyên. Nếu dùng IgG làm kháng nguyên gây miễn dịch ỏ động vật như thỏ hoặc ngựa để tạo ra kháng thể anti-globulin người, thì tác động sinh miễn dịch chính là do các vị trí của các yếu tố quyết định kháng nguyên (Antigenic Determinants) trên đoạn Fc. - Trên đoạn Fc có một vị trí để có thể gắn với bổ thể. - Giữa đoạn Fab và Fc có một vùng bản lể (Hinge region) cho phép 2 nhánh Fab mở ra một góc alpha, thuận lợi cho việc gắn vối kháng nguyên. IgM là một pentamer gồm 5 đơn vị nhỏ, mỗi đơn vị nhỏ cấu trúc tương tự như một phân tử monomer IgG. Khối lượng phân tử IgM khoảng 900.000, hệ số lắng (siêu ly tâm) là 19 s, tỷ lệ trong huyết thanh là lg/lít. Các kháng thể nhóm máu chủ yếu thuộc loại IgG và IgM: - Các kháng thể thường xuyên và tự nhiên đều là IgM, như anti-A, anti-B tự nhiên của hệ ABO, phân tử lượng lón, không qua nhau thai được. - Các kháng thể miễn dịch thường là IgG, như anti-A miễn dịch thuộc hệ ABO, anti-D thuộc hệ Rh, Anti-K thuộc hệ Kell phân tử lượng tương đối nhỏ nên qua nhau thai được, vì thê mà có khả năng gây nên bệnh huyết tán sơ sinh (xem Chương 2 ). 34 3ề Kết hợp bổ thể Nhiều kháng thể loại IgG và IgM có tính năng kết hợp bổ thể. Nếu không có vai trò của bổ thể kết hợp vào, các kháng thể dù là IgG, IgM, IgA chỉ có khả năng gắn lên hồng cầu mang kháng nguyên tương ứng, mạnh nữa thì gây ngưng kết các hồng cầu vối nhau và những cục ngưng kết này bị các đại thực bào (Macrophage) và các tế bào của hệ võng mô trong gan và lách tiêu huỷ, loại khỏi vòng tuần hoàn, tạo nên hiện tượng huỷ hồng cầu ở trong mô, ngoài huyết quản, vẫn quen gọi là huyết tán ngoài huyết quản extra vascular hemolysis. Bổ thể là một nhóm thành phần gồm từ Cl đến C9, có mặt trong các huyết thanh tươi bình thường, đa số' là các bêta globulin. Khi kháng thể gắn vào kháng nguyên thì phân tử kháng thể có sự biến đổi, mở ra và bộc lộ vị trí kích hoạt bổ thể nằm ở đoạn Fc của nó. Nếu kháng thể thuộc loại IgG thì ít nhất cần hai phân tử kế cận nhau mới đủ vị trí để kích hoạt việc gắn vối bổ thể, vì các phân tử IgG đều là monomer. Nếu là IgM thì chỉ một phân tử cũng đủ, vì phân tử IgM là pentamer, tức là có 5 đơn vị nhỏ giông như IgG. Điều này là một trong những lý giải về hoạt tính mạnh của những kháng thể IgM. Sau bưốc kích hoạt khởi đầu, sẽ diễn biến hoạt hoá một loạt các thành phần bổ thể từ Cl đến C9 theo kiểu dây chuyền khá phức tạp nhưng rất tuần tự và nhanh, có sự tham gia của các ion Ca++ và Mg++, dẫn tối cuối cùng là C8 và C9 được hoạt hoá, hỗ trợ nhau, tăng cưòng cho nhau cùng gắn lên hồng cầu, gây nên tổn thương ở màng hồng cầu. Từ những chỗ tổn thương ấy huyết sắc tô' thoát ra ngoài, tạo nên hiện tượng huỷ hồng cầu trong lòng mạch (Intra Vascular Hemolysis). Kiểu huyết tán này không cần sự tham gia của các đại thực bào và tổ chức võng mô (RES), xảy ra trong cơ thể. Kỹ thuật invitro cũng thấy tiến hành được như vậy, vối sự tham gia của bổ thể lấy từ huyết thanh tươi của người, của chuột lang hoặc thỏ (hình 1.18). 35 Hình 1.18Ẻ Kháng thể kết hợp bổ thể gắn trên hồng cầu Trong bệnh lý miễn dịch huyết học, những kháng thể nào có tính năng ket hợp bổ thể để gây ra huyết tán ngay trong lòng mạch được gọi tên là hemolysin, tức là kháng thể gây huyết tán. Cung như những kháng thể chỉ gây ngưng kết hồng cầu quen được gọi là agglutinin, nghĩa là các kháng thể gây ngưng kết. Nhiều tác nhân có thể dùng để ức chế hoạt tính của bổ thể, từ đó ngăn hiện tượng huỷ hồng cầu trong lòng mạch, như các chất chống đông có Sodium hay Kalium, Ethylene-Diamino Tetra-Acetic Acid (EDTA Na hay EDTA K). Các ion Ca++ rất cần cho sự hoạt hoá Cl. Vì vậy các chất chống đông ức chế Ca** đều có tác dụng ngăn cản hoạt động của bổ thể. Heparin cũng chống bổ thể. Nhiệt độ 56°c trong 30 phút làm mất hoạt tính hoàn toàn Cl và C2, một phần của C4. Đa số các tác nhân trên thường được sử dụng chủ yếu “invitro”, tuỳ cơ chế, tuỳ theo yêu cầu. Khi sử dụng tác nhân nào cũng phải chú ý tính năng tác dụng của nó, thí dụ heparin tuy cũng có tác dụng chống bổ thể nhưng phải dùng liều lượng cao. Thông thường trong kỹ thuật, dùng phổ biến nhiệt độ 56°c để làm mất hoạt tính bổ thể, ngăn ngừa hiện tượng huyết tán miễn dịch trong ống nghiệm, vì hiện tượng huyết tán thường che lấp mất hiện tượng ngưng kết một khi cả hai hiện tượng huyết tán và ngưng kết cùng xảy ra, và đêu cân phát hiện, chẩn đoán, khảo sát. 36 B. ỨNG DỤNG CÁC HOẠT TÍNH KHÁNG THE IN-VITRO Nhiều hoạt tính kháng thể được sử dụng để phát hiện, xác định sự có mặt của kháng nguyên hồng cầu(trong định nhóm), và đánh giá các phản ứng miễn dịch kiểu kháng nguyên, kháng thể, nhằm nhiều mục đích kỹ thuật. Thường sử dụng những nguyên lý chính sau đây: 1ế Gâ y n g ư n g k ết h ồ n g c ẩ u : K hi m ột kháng th ể đặc h iệ u tiếp xúc với những hồng cầu ở vị trí của kháng nguyên ấy và kéo 2 hoặc nhiều hồng cầu khác tụm lại với nhau thành một cụm ngưng kết (agglutinats). Hiện tương này gọi là hiện tượng ngưng kết hồng cầu. 2. Gây huỷ hồng cầu (huyết tán): Khi kháng thể có tính năng kết hợp bổ thể và nếu có mặt của bổ thể thì sau khi gặp kháng nguyên tương ứng trên màng hồng cầu, kháng thể không chỉ gắn vào, không chỉ gây ngưng kết mà cao hơn nữa, gây huỷ hồng cầu ngay trong ống nghiệm. Nhiều khi cần sử dụng hiện tượng này để làm kỹ thuật chẩn đoán, nhưng cũng nhiều khi cần biết để tránh, khi người ta cần ngăn hiện tượng huyết tán để bộc lộ ra hiện tượng ngưng kết mà ngưòi ta cần chẩn đoán hoặc khảo sát. 3. Gây cảm thụ hồng cẩu: Khi một kháng thể đặc hiệu đã gắn lên kháng nguyên tương ứng trên màng hồng cầu, nhưng không đủ vị trí kháng thể, nói cách khác, không đủ cưòng độ hoạt tính để kéo hai hoặc nhiều hồng cầu tụm thành một cụm ngưng kết thì hiện tượng đó gọi là kháng thể mới gây cảm thụ hồng cầu, hoặc hồng cầu đã được cảm thụ với kháng thể. Sự cảm thụ này không nhìn thấy bằng mắt thường cũng như qua kính hiển vi quang học nếu không sử dụng một số biện pháp kỹ thuật phụ thêm như kỹ thuật Antiglobulin, kỹ thuật men (xem Chương 3). 4. Gây tủa: Khi kháng nguyên không nằm trên các tế bào lưu động như các tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) mà cũng hoà tan như kháng thể thì không dùng hiện tượng ngưng kết để 37 quan sát và đánh giá được, thường phải dùng các kỹ thuật gây tủa. Thường ngưòi ta cho kháng nguyên và kháng thể khuếch tán trong môi trường gel thạch Agarose, hoặc vừa cho khuếch tán vừa tạo một dịch chuyên điện di điêu khiên theo một hướng nhất định. Cao hơn nữa, người ta dùng phương pháp hai thì. Thì thứ nhất là điện di, thì thứ hai là khuếch tán miên dịch, đó là nguyên lý của phương pháp điện di miễn dịch. Tất cả các phương pháp đều nhằm mục đích tạo ra được sự tiếp xúc đặc hiệu vối hiệu suất cao nhất giữa kháng nguyên và kháng thể cùng là yếu tô' hoà tan. Sự tiếp xúc đặc hiệu ấy, nếu có sẽ được thể hiện thành những cung tủa cố định trong gel thạch. Thực chất những cung tủa đó là những phức hợp kháng nguyên kháng thể thường rất khó tái hoà tan, có thể được nhuộm màu khác nhau để phân tích chi tiết. Kỹ thuật gây tủa ít dùng trong xác định nhóm máu, nhưng đối vối việc chẩn đoán các kháng nguyên hoà tan liên quan đến an toàn truyền máu thì có ý nghĩa phổ cập rộng rãi, cụ thể là dùng trong chẩn đoán kháng nguyên HBsAg mà trước đây vẫn quen gọi là kháng nguyên “Au”, trong chẩn đoán các chứng bệnh rối loạn protein huyết thanh (Đa u tuỷ, bệnh Waldenstrom, các bệnh chuỗi nặng). 5. Các kỹ thuật khác Kỹ thuật ức chế. ngưng kết hồng cầu, kỹ thuật kết hợp bổ thê, kỹ thuật huyết tán, kỹ thuật gắn (absorption) và tách (elution), kỹ thuật ngưng kết thụ động sẽ đề cập đến trong các chương sau. c. Cơ CHẾ CỦA CÁC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH VÀ CÁC YẾU Tố TÁC ĐỘNG Phản ứng miễn dịch là phản ứng sinh học. Nhưng các phản ứng sinh học đều do các đặc tính lý hoá của các phân tử kháng nguyên, kháng thể chi phối: nhiệt độ, độ pH, nồng độ ion, lượng 38 kháng nguyên, lượng kháng thể, khoảng cách và mức tiếp xúc giữa kháng nguyên và kháng thể, cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc của kháng thể, số lượng các vị trí kháng thể, lực đẩy, lực hút giữa các phân tử, điện tích của các phân tử, tính chất lý hoá của môi trường tiến hành phản ứng, vị trí kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu... Nhò hiểu biết và vận dụng điều khiển các yếu tô' tác động trên mà người ta có thể tạo những điều kiện tối ưu (optima) cho các phản ứng kháng nguyên kháng thể trong kỹ thuật để tăng cưòng và biến đổi các phản ứng yếu thành mạnh, không nhạy thành nhạy khiến cho dễ khảo sát, đánh giá. Thí dụ: dùng các men tiêu protein làm giảm bớt lực đẩy giữa các hồng cầu với nhau (enzyme techniques) hoặc dùng các Antiglobulin làm trung gian để gây ngưng kết hồng cầu khi các kháng thể chỉ mối gắn được trên hồng cầu chứ không đủ mạnh, không đủ vị trí kháng thể để tự nó gây được ngưng kết hồng cầu; hoặc dùng môi trường albumin cũng làm giảm đi lực đẩy của các hồng cầu. Mặt khác, có thể sử dụng các nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp, nồng độ, thòi gian tiếp xúc thích hợp với từng loại kháng thể, từng loại kháng nguyên, từng loại phản ứng nhằm đạt hiệu quả tối đa. Thí dụ nhiệt độ thuận lợi cho các kháng thể ngưng kết lạnh là 4°c đến 10°c, nhiệt độ tốt nhất cho các kháng thể nóng là từ 37°c đến 40°c. Tuy nhiên có loại kháng thể có biên độ hoạt động nhiệt khá rộng, có thể từ 4°c đến 37°c, tuy vậy vẫn có phạm vi tối ưu của nó. Với pH thường là từ 5,5 đến 8,5. Ngoài phạm vi nói trên của nhiệt độ và pH, phản ứng miễn dịch bị giảm rõ rệt, thậm chí mất hoàn toàn, thí dụ như đưa nhiệt độ tới 56°c thì mọi kháng thể đều tách ròi khỏi hồng cầu, dù là loại kháng thể nóng hay lạnh. Vì vậy thường dùng phương pháp tách ở 56°c để thu lại kháng thể từ cụm ngưng kết hoặc từ phản ứng gắn trưốc đó. 39 Chương 2 CÁC HỆ NHÓM HỒNG CẨU HÊ NHÓM ABO |ệ LỊCH SỬ Năm 1900. Karl Landsteiner phát hiện hệ nhóm máu ABO, mờ đầu cho kỷ nguyên truyền máu. Thoạt tiên, K. Landsteiner xác định 2 kháng nguyên A và B. cùng vối hai kháng thể tương ứng là Anti-A và Anti-B. từ đó có 3 nhóm hồng cầu A. B và O: - Nhóm A: Trên hồng cẩu có kháng nguyên A, được ngưng kết bời các kháng thể Anti-A. - Nhóm B: Trên hồng cầu có kháng nguyên B. được ngưng kết bời Antì-B - Xhóm O: Trên hồng cầu không có cà khảng nguyên A và kháng nguyên B. không ngừng kết vối Anti-A và Anti-B. vì vậy được gọi là o. với nghĩa không A. không B. Đến năm 1902, Von DecasteUa và Sturli học trò của K. Landsteiner. phát hiện thêm nhóm thứ tư: Nhóm AB. Hồng cầu thuộc nhóm này có cả hai kháng nguyên A và B và ngưng kết vối cả Anti-A và Anti-B. Các tác giả đã hoàn chỉnh bước đầu hệ nhóm này gồm 4 nhóm hồng cầu nhu' sau: - Xhóm A: Trên hồng cầu có kháng nguyên A. ngúng kết tảt yếu với kháng thể Anti-A đồng thời trong huyết thanh có kháng thể Anti-B. không có kháng thể Anti-A. 40 - Nhóm B: Trên hồng cầu có kháng nguyên B, ngưng kết tất yếu vối kháng thể Anti-B, đồng thời trong huyết thanh có kháng thể Anti-A, không có kháng thể Anti-B. - Nhóm AB: Trên hồng cầu có hai kháng nguyên Ạ và B, ngưng kết tất yếu với cả hai kháng thể Anti-A và Anti-B, đồng thòi trong huyết thanh không thể có một kháng thể nào dù là Anti-A hay Anti-B. - Nhóm O: Trên hồng cầu không có cả hai kháng nguyên A và B, đồng thòi trong huyết thanh có mặt cả hai kháng thể Anti A và Anti-B. (Xem bảng 2.1). Bảng 2.1 ề Định nhóm máu hệ ABO Nghiệm pháp hồng cầu (Beth Vincent) dùng các huyết thanh nghiệm Nghiệm pháp huyết thanh (Simoni) dùng các hồng cầu nghiệm Nhóm máu Anti-A Anti-B Anti A+BHồng cầu Hồng cầu B Chứng (HCO) + + + - A - + + + B + + - o + + + AB II. DI TRUYỀN VÀ TÍNH K Ế THỪA Tính di truyền và kế thừa nhóm máu thuộc hệ ABO đã được Epstein và ottenberg nêu ra từ năm 1908, tiếp đến Von Dungern và Hirchfeld chứng minh năm 1910, nhưng đến năm 1924 Bernstein mối xác định rõ 3 gen allele là A, B, o, di truyền và kế thừa theo luật Mendel. Đến nay các tác giả phương Tây iều công nhận có ít nhất 4 gen allele là Al, A2, B và o (bảng 2.2 a và 2 .2 b). 41 Bảng 2.2a. Tần sô' nhóm máu ABO ở một số dân tộc (MOURANT và cs 1976) Dân tộc (số người được định nhóm máu) Người da Đỏ Nam My (539) % kiểu hiện khác nhau Đặc điểm riêng 0 A1 A2 B A1B A2B 100 0 0 0 0 0 Tất cả là 0 Việt Nam (220) 45 21,4 0 29,1 4,5 0 Không có Người Aborigines Úc (126) 44,4 55,6 0 0 0 0 A2. B và A gần ngang nhau Đức (100.000) 42,8 32,5 9,4 11,0 3,1 1,1 Không có A2 và B Bengal (240) 22,0 22,2 1.8 38,2 14,8 0,9 B cao nhất Lapps (324) 18,2 36,1 18,5 4,8 6,2 6,2 A2 rất cao Bảng 2.2b. Tần số nhóm máu ABO (Tỷ lệ %) Nhóm máu Người da trắng Người da đen Người da đỏ (Mỹ) Người Phương Đông Người Việt Nam* 0 45 49 79 40 48 A 40 27 16 28 20 B 11 20 4 27 28 AB 4 4 <1 5 4 * Hằng số sinh học người Việt Nam (Bộ Y tế, 1975). Bernstein chứng minh rằng mỗi ngưòi đều kê thừa hai gen ABO, mỗi gen từ một cha hoặc mẹ, những gen này quyết định các kháng nguyên ABO có mặt trên hồng cầu. 42 Gen A và gen B cùng có tính di truyền trội (co-dominant) còn Gen o không tạo nên sản phẩm kháng nguyên nên gọi là gen amorphic (vô định hình). Vì vậy tạo ra những kiểu hiện và kiểu di truyền (Genotype, Phenotype) vói điều kiện như sau: Bảng trên nói lên rằng khi định nhóm hồng cầu của một người là A hoặc B, ngưòi ta mối chỉ xác định kiểu hiện (Phenotype) mà chưa xác định được kiểu di truyền (Genotype) vì kiểu di truyền của ngưòi nhóm A có thể là AA (đồng hợp tử) hoặc AO (dị hợp tử). Còn khi định nhóm hồng cầu của một người là AB hoặc o, người ta đã đồng thòi xác định cả kiểu hiện và kiểu di truyền: Nhóm AB bắt buộc phải là dị hợp tử, nhóm o bắt buộc phải là di truyền đồng hợp tử 00. (xem bảng 2.3) Bảng 2.3. Kiểu hiện và kiểu di truyền nhóm máu ABO Kiểu hiện (Phenotype) Kiểu di truyền (Genotype) AAA AO BBB BO AB AB o o o III. SINH HOÁ CÁC KHÁNG NGUYÊN NHÓM MÁU Các kháng nguyên nhóm hồng cầu hệ ABO là các chất đa đưòng (mucopolysaccharides). Những kháng nguyên A và B trên bề mặt hồng cầu, chỉ có thể xuất hiện nếu có tác động của gen H. Trong cơ thể có sẵn một tiền chất mucopolysaccharide (precursor mucopolysaccharide substance). Gen H chuyển chất này thành chất H nhò một men đặc hiệu. Chỉ có trên nền chất H đó, các gen A và B mới tác động bằng những men đặc hiệu của 43 mình để biến đổi chất H thành các chất A và B. Mức độ biến đổi này có thể rất nhiều, có thể rất ít tạo ra các kháng nguyên A mạnh, A yếu, B mạnh, B yếu khác nhau. Nếu không có tác động của các gen A và B thì chất H còn nguyên không bị biến đổi, đó là trường hợp nhóm o, vì vậy người ta gọi gen o là gen vô định hình (amorphic), thực chất những người nhóm o là có gen H, gen H tạo ra chất H trên hồng cầu. Nếu định nhóm hồng cầu vói Anti-H, sẽ tạo được kết quả trình tự như sau: Độ ngưng kết của Anti-H với o là cao nhất rồi đến với A2, A2B, B, AI thấp nhất là với A1B. (O > A2 > A2B > B > AI > A1B) Điều trên có nghĩa chất H ỏ hồng cầu o còn lại nguyên vẹn, giảm dần theo thứ tự A2, A2B, B, Al, A1B. Tiền chất gồm 4 phân tử đường: 1 phân tử N-acetyl galactosamine, 1 phân tử N-acetyl-glucosamine và phân tử D galactose (xem hình 2 .1 ) Bằng vận hành một men chuyển đường đặc hiệu (glucosyl transferase), gen H gắn thêm một phân tử đưòng L-fucose vào phân tử D-galactose tận cùng, tạo nên chất H.. Xem bảng 1.3 thấy rõ từ tiền chất (precursor substance), các gen Sese, Lele, H, A, B lần lượt tác dụng, phối hợp xen kẽ, liên quan mật thiết vối nhau để tạo ra hoặc không tạo ra các yếu tố Lea Le\ H, A, B hoà tan trong các dịch sinh lý của cơ thể. Người ta mới biết được sự tổng hợp này trong các tế bào niêm mạc của tuyến nước bọt, các yếu tô" tổng hợp đều ở dạng hoà tan và có mặt trong các dịch tiết. Còn sự tổng hợp trong các hồng cầu non thì chưa được biết hết vì tách được các yếu tô đó từ hồng cầu ra khó và công phu hơn nhiều. Tuy nhiên về tính đặc hiệu thì chắc chắn là giống nhau. Có khác chăng là ỏ chỗ các gen chi phôi đối vối các yếu tố hoà tan thì đã biết là do sự chi phối của 44 các gen Se, Le, H, A, B. Người ta đã biết rằng một sản phẩm cuối cùng có thể do hai hoặc nhiều loại tê bào, hai hoặc nhiêu loại gen đặc hiệu cùng tổng hợp ra. (onti — H ) (ontí _ A| ) Hình 2.1. Sơ đồ minh hoạ KN: H, A1, A, B 45 IV. CÁC KHÁNG NGUYÊN THUỘC HỆ ABO Các kháng nguyên A, B, H có thể phát hiện được từ lúc còn là bào thai 5 đến 6 tuần, trong suốt thòi kỳ bào thai không tăng là mấy, chỉ từ khi sau sinh mói tăng dần, nhưng phải từ 2 đến 4 năm sau mối phát triển tối mức ổn định và tồn tại hằng định suốt cuộc đời. Vị trí của các kháng nguyên A,B,H trên hồng cầu đã được nhiều tác giả nghiên cứu: Greenbury năm 1963, Economi-dou năm 1967, Carton năm 1974, Schenkel-Brunner năm 1980. Số lượng vị trí kháng nguyên A (trên hồng cầu Al), của người trưởng thành ước tính vào khoảng 850.000. Sô' lượng vị trí kháng nguyên B (trên hồng cầu nhóm B) cũng tương tự. Số lượng vị trí kháng nguyên H (trên hồng cầu O) khoảng gấp đôi. Việc tính này dựa trên số lượng phân tử kháng thể dùng để kết hợp với kháng nguyên hồng cầu, vói giả định rằng một phần tử kháng thể gắn vối một vị trí kháng nguyên. Cách này không phản ánh thực tế lắm vì có nhiều bằng chứng rằng Anti-A và Anti-B gắn với hai vị trí kháng nguyên của hồng cầu. Schenkenl-Brunner dùng men đặc hiệu A-glucosyltransferase đánh dấu bằng c 14 để tính sô" lượng vị trí kháng nguyên A .v.v. Từ đó có sô liệu đáng tin cậy để so sánh số vị trí kháng nguyên. A,B của hồng cầu người lớn vối hồng cầu của trẻ sơ sinh, chỉ xấp sỉ 1/3. Năm 1976, Carton cho số liệu về vị trí kháng nguyên A của các hồng cầu thuộc các dưới nhóm của A như sau: A, : 850.000 a 2 240.000 A3 : 35.000 Ax : 4.800 Aend : 3.500 700 Dựa vào kết quả trên, có thể tóm lại rằng Aj là mạnh nhất vì số lượng vị trí kháng nguyên cao nhất, A2 đứng thứ hai, nhưng từ A3 trở đi có thể gọi chung là các A yếu. So với A, thì A2 cũng đã là A yếu hơn hẳn. Cũng bằng một men chuyển đưòng đặc hiệu của mình, gen A hoặc gen B gắn một phân tử đưòng đặc hiệu vào chất H ở vị trí D-galactose tận cùng. Nếu là gen A thì gắn đường N-acetyl galactosamin, nếu là gen B thì gắn đường D-galactose (xem hình 2.2 và 2.3). Nói các khác, khi có mặt của gen A thì chất H sẽ được chuyển thành chất A bằng cách gắn thêm vào chất H một đưòng N-acetyl-galactose; khi có mặt của gen B thì chất H sẽ được chuyển thành chất B bằng cách gắn thêm vào chất H một đường D-galactose. Khi không có mặt cả gen A và gen B thì chất H không chuyển thành A hoặc B được, còn nguyên vẹn chất H, đó là hồng cầu nhóm o thông thường. Hồng cầu nhóm o thông thưòng không có nghĩa là không có gì, mà chỉ có nghĩa là không có chất A hoặc chất B nhưng lại có chất H vì chất H là nền của các chất A và B. Có những trường hợp hãn hữu, đó là nhóm Oh (kiểu hiện Bom bay), hồng cầu không có chất H, khi đó dù có mặt gen A hoặc gen B nhưng hồng cầu vẫn xác định nhóm là o vì đã không có chất H làm nền thì gen A hoặc B đều không thể tác động để tạo ra hoạt tính A hoặc B được. Nhóm Oh rất hiếm, lần đầu tìm thấy ở Bombay nẳm 1952, tuy ỏ nhiều nước không có ý nghĩa thực tiễn, nhưng lại mang một giá trị lý thuyết rất quan trọng sáng tỏ về hệ ABO. 47 __ ẹu ___ 8U __BI3 Ị Ị— I ỵ - ị I— Q Tiền chất XIV __ *»!»___ ?•<» e'<» m M l — O ' " H (gen H 9ắn thêm j F ' 2 L-Fucose vào tiền chất) ____ e«.3______ ẹ*,3_____ Hỉ ẹi,3 — L e a (gen Le gắn thêm L-Fucose vào tiền chất) gắn thêm ;0 0 - 0 - A H » Agắi N-galactosamine vào N-galact0Saiiiiiic va chuỗi H hoạt động) Q t f t W b - B ? e"B D-aalac gắn thêm D-galactose vào chuỗi H hoạt động) D D. galactose N . glucosamine o N. galoctosamine 0 L . fucose o Hình 2.2. Cấu trúc của các kháng nguyên nhóm máu (Watkins, Ceppellini) 48 1. C h u o ĩ locsiẽ I Loại X D. Galactose N. Ace&jlglucosamine o.galactose 2 . C h u o i lo ạ i u D-Golocfbse N-Acetylqlucosamine O-Gotoctose Hình 2.3Ẽ Sơ đồ minh hoạ chuỗi loại I và II - Chuỗi loại I: Liên kết 1-3 giữa D galactose tận cùng và N-acetyl glucosamine - Chuỗi loại II: Liên kết 1-4 giữa 2 phân tử đường tương tự 49 Hồng cầu Oh không bị ngưng kết bởi Anti - A, Anti - B, Anti - H, nhưng trong huyết thanh lại có mặt cả Anti - A, Anti - B và Anti - H, vì vậy gây ngưng kết tất cả mọi hồng cầu dù là A, B, 0 hay AB. Sau nhiều năm nghiên cứu, Cepellini đã nêu giả thiết về sự có mặt 1 gen vô định hình (amorphic) không sinh ra yếu tố H, hoặc ức chế gen H không hoạt động. Giả thiết này được, Levine và cộng sự chứng minh thực tế qua nhiều công trình thực nghiệm. Tới nay đã đi đến xác nhận những điều sau đây: - Có một số quan hệ mật thiết giữa 3 hệ: hệ ABO (hay ABH), hệ lewis và hệ Sese ( hệ tiết yếu tô' ABH). Những yếu tốA, B, H loại hoà tan trong nước (hydrosolible) đều có thể có mặt trong các dịch sinh lý của cơ thể như nước bọt, huyết thanh, sữa, dịch u nang buồng trứng v.v hoặc không có mặt tuỳ theo người đó có mang gen Se hoặc Sese. Hệ Sese được gọi là hệ tiết ABH. Mối liên quan được thiết lập như sau: Khi một người thuộc loại không tiết yếu tố ABH, nghĩa là mang gen đồng hợp tử sese thì không có mặt các yếu tố A,B, H trong các dịch tiết mặc dù có đủ các gen H, A hoặc B. Khi một người thuộc loại tiết, nghĩa là gen Se, dù SeSe hay Sese, gen H hoạt động và chỉ khi đã có yếu tô H thì gen A, B mối phát huy tác dụng của mình. Khi ấy, nếu không có gen A và B thì chất H không bị biến đổi, gọi là ngưòi nhóm o. Nhưng nếu không có cả gen H ( những ngưòi đồng hợp tử hh) thì được ký hiệu là Oh. Tuỳ theo những người Oh này có gen A, gen B hay không mà có những nhóm Oh, OhA, OhB, OhAB. ở những người sese, nếu có mặt gen Le thì yếu tô Lea sẽ có mặt trong các dịch tiết (thí dụ nưốc bọt) và hồng cầu sẽ là Lea+, nhưng nếu không có mặt gen Le, nghĩa là thuộc loại đồng hợp tử lele thì yếu tô Lea cũng không có mặt trong các dịch tiết, do đó hồng cầu phải là Lea. (Xem hệ Lewis) 50 1. A1 và A2 Được Düngern và Hirschfeld phát hiện từ năm 1911, cho tới nay vẫn là hai dưới nhóm chủ yếu, nhiều ứng dụng thực tế nhất. Sự khác biệt giữa Aj và A2 chủ yếu là do lượng chuyển yếu tố H khác nhau, với Aj thì lượng yếu tố H chuyển mạnh hơn, vối A2 thì ít hơn (hình 2.4). Nếu dùng Anti - H cho “chạy” với hồng cầu Aj sẽ cho kết quả âm tính hoặc dương tính rất yếu, nhưng cho chạy với hồng cầu A2 thì kết quả dương tính khá rõ. Hình 2.4. Sơ đồ minh họa điều kiện A, và A2 - HC A1: Men N- ạcetyl galactosaminal transferase chuyển kháng nguyên H thành kháng nguyên A nhiều hơn. - HC A2: Men N - acetyl galactosaminal transferase kém hiệu lực nên ít kháng nguyên A, còn lại nhiều kháng nguyên H hơn. Mặt khác lại thấy sự khác biệt không thuần tuý số lượng vì trong huyết thanh những người nhóm A2 đôi khi có mặt anti-Ai tự nhiên. Theo Race và Sanger cho rằng: Anti-A Nhóm Kháng nguyên Anti-A Anti-A, A, A A, + + A2 A + - 51 Theo bâng trên, phái hiểu ràng trong huyết thanh Anũ-A cua ngưòi nhóm B hoặc nhóm o gồm 2 kháng thể là Anti-A vã Anti-Aj. Trên hồng cẩu nhóm Aj có hai kháng nguyén là A và Aj. Nếu đem huyết thanh Anti-A của ngũời nhóm B hoặc nhóm o ơan với hồng eau A Ị thi các kháng thể sẽ riêu thụ hết. khỏng còn lại gì. những nếu đem huyết thanh Antí-A đó gàn với hồng cầu A, thi chì gắn được phần kháng thể Anti-A thỏL còn lại Anti-Aa (xem trên mục hệ P). Ở các nước phương Táy (Âu. Mỹ) trong ứng dụng phổ thõng. người ta xác định 6 loại nhóm thuộc hệ ABO là Aj. ẵ\j, AjB. AjB, o và B vi tắn suất nhóm Aỹ và AvB khá cao (20%). Hơn nữa trong huyết thanh nhung người Av và A',B lại rất hay có mặt Anti-A- tự nhiên rất dẻ gảy tai biến khóng hoà hợp nhóm thuộc hệ ABO trong huyết máu (từ 20 đến 30°o). Ờ Việt Xam. có khác. Theo tài liệu của Bạch Quốc Tuyên và Nguyễn Đinh Lượng tỉu ò người Việt Nam khỏng thấy có Ai hoặc AvB. Một 5ố tác giã khác cho kết quả điều tra từng địa phương cũng thống nhất nhu vậy. Trong khi chò đợi một kết quá nghién cứu trén quy mó rộng lớn khẩp mọi miền đất nước và dán 5Ó. chúng ta đã có cơ 50 bước đáu đé xác định 4 loại nhóm A.B. AB và o. 2. Các A yếu: A3, A,, An, v.v - A.: Friedenreich phát hiện đầu tién nhóm A3 nãm 1936. từ đó phát hiện nhóm A:B. Các hồng cẩu A. ngxtng kết rất vếu. rất ít với kháng thể có trong huyết thanh Anti-A. rất khó nhận thấy \i đa số hồng cáu tự do khống ngưng kết. Hồnơ cầu Aj không ngưng két vối Anti-A;. Ngược lại. với Anti-H thi hồng cẩu A. ngưng két mạnh hon cả hống cầu ằ\-ỹ. Trong huvết thanh ngüoi A-. đối khi cũng có Anti-A- tự nhiên 52 - Ax: Gồm 1 loạt A4, A5, Az, A0, gọi chung một tên Ax: Fischer và Haln mô tả năm 1930. Phản ứng rất yếu hoặc không phản ứng với huyết thanh Anti-A, thường định nhóm lầm là o vì 2 lẽ: Khi làm nghiệm pháp hồng cầu thì không ngưng kết với Anti-A, khi làm nghiệm pháp huyết thanh thì huyết thanh có thể gây ngưng kết vối hồng cầu Aj. - Aint, Aend, Abantn, tất cả đều là các dưới nhóm rất yếu, ít có ý nghĩa thực tế trong truyền máu, chỉ có giá trị trong di truyền học, nhân chủng học và các nghiên cứu khoa học (xem các tài liệu chuyên sâu của Race Sanger, Mollison, Salmon). 3. Các nhóm B yếu (dưói nhóm của B) Với kháng nguyên B, ngưòi ta không thấy các dưới nhóm giống như đối với A, vì thế trong truyền máu thường không được nhắc tói. Tuy nhiên từ năm 1976 Salmon.c cũng đề nghị sử dụng các thuật ngữ dưối nhóm của B. Thí dụ B3, Bx, Bel. Tuy các dưới nhóm này không hoặc rất ít gây ngưng kết vối Anti-B, các kháng nguyên B yếu cũng không phát hiện được trong nước bọt của những ngưòi “tiết”, vẫn có ý nghĩa trong học thuật. Người ta vẫn có thể dùng kỹ thuật gắn và tách để nghiên cứu phát hiện những kháng nguyên yếu này. V. CÁC KHÁNG THỂ THUỘC HỆ ABO Theo quy luật tự nhiên, những ngưòi có hồng cầu mang những kháng nguyên A, B hoặc H thì trong huyết thanh nhất thiết có mặt những kháng thể ứng với những kháng nguyên không có trên hồng cầu của bản thân, ngược lại nhất thiết không có mặt những kháng thể ứng vối những kháng nguyên có trên hồng cầu của bản thân. Cụ thể là người có hồng cầu mang kháng nguyên A, nhất thiết có kháng thể Anti-B trong huyết thanh, không thể có Anti-A; ngưòi có hồng cầu mang kháng nguyên B, nhất thiết có kháng thê Anti-A trong huyết thanh, 53 không thể có Anti-B; ngưòi có hồng cầu mang kháng nguyên H (tức là nhóm O) nhất thiết trong huyết thanh có mặt cả Anti-A và Anti-B; người có hồng cầu mang kháng nguyên A và B, nhất thiết không có Anti-A hoặc Anti-B trong huyết thanh. Dựa trên quy luật tự nhiên tuyệt đối này mà người ta có hai nghiệm pháp để xác định nhóm thuộc hệ ABO: nghiệm pháp hồng cầu (Beth Vincent) và nghiệm pháp huyết thanh (Simonin) (Xem phần định nhóm). 1. Quá trình phát triển của Anti-A và Anti-B Người ta cho rằng những chất có “tính đặc hiệu” A, B, H có nhiều và phổ biến trong thiên nhiên (màng hồng cầu, thành các tế bào vi khuẩn, thức ăn, lông thú, bụi trong môi trường quanh con người). Các kháng nguyên này đã xâm nhập cơ thể từ những ngày đầu của đồi sống bào thai, khiến cơ thể con người tạo ra những kháng thể tương ứng. Các kháng thể này được hình thành và phát triển dần lên, khi sinh ra đòi đã có sẵn nên được coi là các kháng thể tự nhiên. Kháng thể đó chỉ có thể không tương ứng vối những kháng nguyên mà cơ thể sẵn có, thí dụ một người Oh (không có kháng nguyên H) mới có thể có Anti H trong huyết thanh. Ngưòi Aj hoặc AjB vì có quá ít kháng nguyên H nên đôi khi cũng thấy có Anti-H trong huyết thanh, tuy nhiên Anti-H này rất yếu so với Anti-H của ngưòi Oh. 2. Anti-A! Kháng thể Anti-Ai có thể tách được từ huyết thanh Anti-A của người nhóm máu o hoặc B (như phần kháng nguyên Aj đã nói) bằng cách hấp thụ huyết thanh Anti-A với hồng cầu A2 nhưng thưòng thì Anti-Ai thu đước theo cách này rất yếu, chỉ có thể đủ cho việc chẩn đoán, không đủ để dùng làm nguồn thuốc thử định nhóm Aj. Người ta đã thử gắn nhiều lần Anti-A! tự nhiên với hồng cầu A2 thì đến một lúc nào đó kháng thể đó cũng 54 bị giảm dần rồi mất hẳn hoạt tínhỗ Vì lẽ đó Anti-AỊ dùng để làm huyết thanh nghiệm thường được chế tạo từ hạt Dolichos Biílorus (Lectin). 3. Thời điểm xuất hiện và tiến triển của Anti-A và Anti-B Thông thường, các kháng thể nhóm máu bắt đầu được tạo ra sau khi sinh, tăng dần cường độ đến tuổi thứ 5, thứ 6 rồi từ đó giữ mức hằng định suốt đòi, khi tuổi già lại giảm dần. Vậy đáng lưu ý khi định mức ở những trẻ mối sinh trong vòng 4 đến 6 tháng nếu thấy hoạt tính Anti-A, Anti-B thấp là bình thường, ngược lại nếu thấy cao thì phải cảnh giác với loại Anti-A hoặc Anti-B miễn dịch (chủ yếu hay gặp là Anti-A miễn dịch), từ huyết thanh mẹ qua màng nhau sang tuần hoàn thai nhi. 4. Anti-A, Anti-B tự nhiên và miễn dịch Các kháng thể Anti-A và Anti-B tự nhiên, bản chất hoá học là IgM, hình thành tự nhiên, từ khi là thai nhi, không qua màng nhau thai được, nên không có khả năng từ tuần hoàn mẹ sang tuần hoàn thai nhi, hằng định suốt đòi (xem mục I và V). Các kháng thể Anti-A, Anti-B (chủ yếu là Anti-A) loại miễn dịch, bản chất hoá học là IgG không hình thành tự nhiên mà phải sau một quá trình đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên lạ xâm nhập vào, cụ thể trong hai trường hợp sau đây: - Không cùng nhóm máu giữa mẹ và thai nhi, thí dụ mẹ nhóm o, thai nhi nhóm A. Trong quá trình sinh, hồng cầu thai nhi có thể qua tuần hoàn của mẹ ít hay nhiều, gây miễn dịch cho mẹ, từ đó cơ thể mẹ thông qua đáp ứng của hệ miễn dịch mà tạo ra kháng thể Anti-A miễn dịch. - Những ngưòi không có kháng nguyên A, bị những chất mang kháng nguyên A trong thiên nhiên xâm nhập cơ thể. Những sản phẩm sinh học của vi khuẩn, của virus, những 55 thành phần trong protein của các vaccin, các huyết thanh phòng và chữa bệnh chế từ các động vật tiêm chủng cho người, những thành phẩm huyết tương tươi và khô, những trường hợp không hoà hợp ABO đểu có thể là những nguồn đưa kháng nguyên A vào cơ thể và tạo ra những kháng thể Anti-A, Anti-A. Đó là kháng thể miễn dịch. Anti-B miễn dịch cũng được tạo ra theo cách trên, nhưng hiếm xảy ra so với Anti-A. Các kháng thể miễn dịch khác vối kháng thể tự nhiên ở chỗ qua màng nhau thai để từ tuần hoàn mẹ sang tuần hoàn thai nhi, hoạt tính mạnh ổ 37°c và trong môi trường albumin, cường độ, hiệu giá và độ nhậy cao hơn nhiều, hoạt tính huyết tán mạnh hơn, nếu cứ bị kích thích nhắc nhở thì hoạt tính cao lên, nhưng nếu không bị nhắc nhở sẽ giảm dần đến mất hẳn. Bảng 2.4. So sánh các đặc tính của Anti-A1, Anti-B tự nhiên và miễn dịch Đặc tính của Anti-A, Anti-B tự nhiên Bản chất hoá học là IgM Không qua màng nhau thai Làm phản ứng 4°C: + Làm phản ứng 37°C: + Phản ứng trong albumin: + Có bị ức chế bởi kháng nguyên A hoặc B hoà tan Không kèm hemolysin Phản ứng với môi trường muối 22°c ngưng kết: + + Có bị bất hoạt bởi 2ME (2Mercapto ethanol) Đặc tính của Anti-A, Anti-B miễn dịch Bản chất hoá học laf IgG Qua màng nhau thai Làm phản ứng ở 4°C: - Làm phản ứng ở 37°C: +++ Trong albumin: +++ Không bị ức chế bởi kháng nguyên A hoặc B hoà tan Thường kèm theo hemolysin Phản ứng ở môi trường muối 22°c ngưng kết: ++ Không bị thất hoạt bởi 2ME Qua bảng trên, cần rút ra kết luận thực tê là nếu làm xét nghiệm bằng phản ứng ngưng kết thông thường trong môi trường muôi ỏ 22°c thì không phát hiện được các kháng thể 56 miễn dịch. Muốn phát hiện, thường dùng xét nghiệm hemolysin đầu tiên đơn giản và dễ làm nhất vì thường các kháng thể miễn dịch kèm theo hemolysin. Sau, tới kỹ thuật ức chế và so sánh độ ngưng kết ở môi trường albumin, nhiệt độ 37°c. Các kháng thể miễn dịch Anti-A, Anti-B (nhất là Anti-A) thường gặp ở người nhóm máu o, vì vậy những người này được gọi là người có nhóm máu o nguy hiểm, không dùng để truyền phổ thông như nhóm o thông thường. Các kháng thể miễn dịch cũng có thể gặp cả trong những người nhóm A hoặc B nhưng hiếm hơn. Do đó trong định nhóm, chủ yếu nhằm phát hiện Anti-A ở nhóm o để xác định những ngưòi mang nhóm o nguy hiểm. 5. Anti-H Như ở mục 1 đã nói, Anti-H là kháng thể ứng với kháng nguyên H trên hồng cầu và cũng có mặt theo quy luật chung của hệ ABO là nếu trên hồng cầu vắng mặt kháng nguyên nào thì trong huyết thanh sẽ có mặt kháng thể ứng vối kháng nguyên đó. Vậy trong huyết thanh của những ngưòi có nhóm hồng cầu Aj, AjB có thể có Anti-H. Nhưng loại Anti-H này rất hiếm gặp và hoạt tính rất yếu. Vì thế Anti-H chỉ đáng kể trong huyết thanh của người nhóm Oh (Bombay), có hoạt tính mạnh và phạm vi nhiệt độ hoạt động rất rộng (từ 4°c đến 37°C), ngưng kết với mọi loại hồng cầu, ngưng kết mạnh nhất vói tất cả các hồng cầu o, chỉ trừ hồng cầu Oh mà thôi. Tất nhiên người Oh có cả Anti-H, Anti-A, Anti-B trong huyết thanh, chỉ nhận được máu truyền của người Oh. Ở nưốc ta chưa phát hiện trường hợp nào Oh cả. Vlẵ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO Xác định nhóm máu hệ ABO là thường quy ở mọi cơ sở có làm công việc truyền máu. Cần định nhóm cả ngưòi cho máu và người nhận máu bằng hai nghiệm pháp sau đây: (bảng 2.5). 57 Bảng 2.5. Kết quả định nhóm máu ABO (theo AABB technical manual) Nghiệm pháp hổng cầu (dùng huyet thanh nghiệm) Nghiệm pháp huyết thanh (dùng hồng cầu nghiệm) Nhóm máu Anti-A Anti-B Anti-AB HC A H CB H C O ABO + + 0 + + + - A + + + B + + + AB Ghi chú: + Có ngưng kết (dương tính) - Không ngưng kết (âm tính) Nghiệm pháp huyết thanh vói HC o Bao giờ cũng phải âm tính (-) 1. Nghiệm pháp hồng cầu Đây là nghiệm pháp sử dụng kỹ thuật trực tiếp (direct grouping), còn gọi là định nhóm xuôi (forward grouping), nhằm xác định kháng nguyên hệ ABO trên hồng cầu, quen gọi là nghiệm pháp Beth-Vincent. Nguyên lý kỹ thuật này là sử dụng những kháng huyết thanh đã chuẩn hoá chứa các kháng thể Anti-A, Anti-B, Anti-A+B đủ tiêu chuẩn mọi mặt để làm xét nghiệm, đem làm phản ứng ngưng kết với hồng cầu cần định nhóm. Những kháng huyết thanh đủ tiêu chuẩn như thế được gọi chung là huyết thanh nghiệm (serum-test) có nghĩa là đủ điều kiện để được sử dụng làm thuốc thử nghiệm pháp Beth Vincent, là nghiệm pháp sử dụng huyết thanh nhằm xác định kháng nguyên trên hồng cầu. Căn cứ vào kháng thể đã biết chứa trong huyết thanh nghiệm, nếu sau tiếp xúc mà ngưng kết dương tính là hồng cầu mang kháng nguyên ứng vối kháng thể đã biết, nếu ngưng kết âm tính là hồng cầu không mang kháng nguyên đó. 58 2ế Nghiệm pháp huyết thanh Nghiệm pháp này sử dụng kỹ thuật định nhóm huyết thanh (serum grouping), còn gọi là định nhóm ngược (revese grouping), quen gọi là nghiệm pháp Simonin. Nguyên lý kỹ thuật này là sử dụng những hồng cầu mang kháng nguyên đã biết, làm phản ứng ngưng kết với huyết thanh của người cần định nhóm nhằm xác định sự có mặt hoặc không của kháng thể Anti-A, Anti-B trong huyết thanh, từ đó biết được kháng nguyên trên hồng cầu, theo cách ngược lại nghĩa là nếu không có mặt Anti-A trong huyết thanh thì hồng cầu không thể là A, nếu có mặt Anti-B trong huyết thanh thì hồng cầu không thể là B, nếu có mặt cả Anti-A, Anti-B trong huyết thanh thì hồng cầu phải là o, nếu không có mặt cả Anti-A, Anti-B trong huyết thanh thì hồng cầu phải là AB. Các hồng cầu dùng làm chuẩn để thử cũng phải là những hồng cầu đã xác định kháng nguyên chính xác để tiến hành nghiệm pháp, vì thế cũng được gọi là hồng cầu nghiệm (Globule-test). Đối với hệ ABO, ngưòi ta thường dùng các Hồng cầu nghiệm A, B, o hoặc Aj, B và o. Đe đảm bảo chính xác và an toàn cao, vối hệ ABO, yêu cầu những điều sau đây: - Tiến hành đồng thòi, song song cả hai nghiệm pháp nói trên, chỉ khi kết quả của cả hai nghiệm pháp hoàn toàn khốp mới kết luận, nếu không phải dùng các kỹ thuật cao hơn để xác định. - Huyết thanh nghiệm phải đủ Anti-Aj, (hoặc Anti-A), Anti-B, Anti-AjB (hoặc Anti-AB). Hồng cầu nghiệm phải có đủ hồng cầu Aj (hoặc A), B và o. - Vối một số trường hợp đặc biệt, cần sử dụng thêm huyết thanh người nhóm AB. Nói chung hồng cầu o và huyết thanh AB đều là những nguyên liệu dùng làm chứng (Control) vì trong huyết thanh ngưòi AB không có kháng thể nào thuộc hệ ABO, 59 trên hồng cầu o không có một kháng nguyên nào thuộc hệ ABO. Nếu vối huyết thanh người nhóm AB và hồng cầu nhóm o mà thấy phản ứng dương tính khi làm các nghiệm pháp định nhóm, dù nhiều, dù ít đều phải nghi ngờ, điều tra sâu them xác định cho rõ, không thể kết luận ngay được. (Xem phần các kháng thể bất thường). - Huyết thanh nghiệm cần đạt đủ 4 điều kiện tiêu chuẩn của quốc gia và quốc tế là độ nhậy (Avidity), độ mạnh (Potency), hiệu giá (Titre). Có nhiều cách tính, cách đánh giá. Nhiều tác giả sử dụng cách cho điểm (score) để dễ thống nhất. - Hồng cầu nghiệm hoặc hồng cầu cần định nhóm (chủ yếu là hồng cầu nghiệm) khi dùng phải sử dụng hồng cầu mới, đã rửa sạch 3 lần bằng nước muối (9/1.000) rồi pha thành huyền dịch 5/100 đến 10/100. Tuy nhiên tuỳ theo từng chỉ định đối vói từng trường hợp ứng dụng kỹ thuật mà có thể dùng các nồng độ huyền dịch khác nhau: 10/100, 20/100, 30/100, 50/100 hoặc 2/100 v.v - Có thể tiến hành kỹ thuật định nhóm trên tấm hoặc trong ống. Trên tấm nghĩa là dùng một tấm men trắng (opalin) do các hãng chế tạo sẵn, to nhỏ tuỳ theo yêu cầu. Thường dùng cõ vừa phải mỗi lần định nhóm được 5 mẫu nhóm. Nếu không sẵn tấm men opalin như thế, có thể dùng một viên gạch trắng hình vuông mỗi cạnh 15cm hoặc 2 viên như thế ghép lại thành một tấm hình chữ nhật. Phản ứng ngưng kết định nhóm được tiến hành bàng cách cho trộn huyết thanh với hồng cầu trên mặt tấm men, hiện tượng ngưng kết dương hay âm được quan sát trên nền men trắng. Thông thường, việc xác định nhóm có thể tin cậy vối kỹ thuật trên tấm nếu làm đúng quy cách, không linh động, cụ thể là: làm đồng thòi song song 2 nghiệm pháp định nhóm, dùng huyền dịch hồng cầu theo đúng quy định, sát cạnh nhau rồi dùng một đầu tròn của đũa thuỷ tinh, hoặc một vật gì tròn nhẵn như đầu đũa nhựa, đáy một ống nghiệm trộn đều hồng cầu với huyết thanh trên một diện tròn từ 2 cm đến 60 3cm đường kính, sau cùng cầm tấm men đảo nhẹ nhàng tạo một sự tiếp xúc kháng nguyên/ kháng thể tối ưu và quan sát, đánh giá ghi kết quả. Tất cả những thao tác kỹ thuật đó phải thành thạo, khéo, nhanh, đúng vì đều có ảnh hưởng đến kết quả: Thí dụ nếu lượng huyết thanh hoặc hồng cầu không thích hợp thì sẽ thừa hoặc thiếu kháng nguyên, kháng thể, hiện tượng ngưng kết sẽ không thoả đáng, nếu hồng cầu không được rửa kỹ thì fibrinogen còn dính trên bề mặt hồng cầu sẽ có thể gây hiện tượng lầm vối ngưng kết, tấm men rửa không sạch, còn mỡ thì rất khó tạo diện tròn cho phản ứng hoặc các dịch lỏng sẽ chảy dài lẫn mẫu nọ với mẫu kia làm hỏng tất cả. Nhiệt độ phải từ 20°c đến 24°c để thuận lợi cho phản ứng vì ở nhiệt độ cao từ 35°c trở lên phản ứng ngưng kết sẽ yếu đi (kháng thể hệ ABO thông thường là loại hoạt động tối ưu ở nhiệt độ từ 4°c đến 25°C). Nếu ỏ xứ nóng, nhiệt độ phòng lên tới 35°c thì cần có điểu hoà nhiệt độ, ít nhất cũng có một khoảng nhỏ trong phòng, dùng nước đá hạ nhiệt xuống dưối 30°c. Nếu thao tác chậm, mà nhiệt độ cao sẽ gây bay hơi nhanh, đọc kết quả dễ lầm. Nền trắng của tấm men có ý nghĩa lốn, nếu bất đắc dĩ phải dùng một lam kính trong suốt thì phải, đưa lên một nền giấy trắng, bìa trắng và chỉ trên một nền trắng mới nhận định được ngưng kết mạnh, yếu, vừa ngưng kết vừa không, ngưng kết giả và các hiện tượng bất thường khác. - Có thể tiến hành kỹ thuật định nhóm trong ống nghiệm, thường gọi là trong typ, có độ tin cậy cao hơn kỹ thuật trên tấm vừa nói. Tuy nhiên đòi hỏi phương tiện, dụng cụ cao hơn, cụ thể là các typ có thể ly tâm được, máy ly tâm. Vối kỹ thuật nàý, các nguyên liệu cũng giống như kỹ thuật trên tấm (huyết thanh, hồng cầu), hồng cầu cũng rửa và pha thành huyền dịch thích hợp, nhưng khác ở chỗ phản ứng ngưng kết tiến hành trong typ. Thường dùng loại typ Kahn, mỗi mẫu máu cần 5 đến 6 tub. Nhỏ vào mỗi ống từ 1 đến 2 giọt huyết thanh hoặc huyền dịch hồng cầu, ly tâm nhẹ khoảng từ 1.500 đến 2.000vòng/phút trong 3 phút. Đọc kết quả có thể bằng mắt thưòng (đại thể) hoặc qua 61 kính hiển vi (vi thể). Nếu đại thể thấy có bất thường, nghi vấn hoặc là đối vối những kháng thể bất thường ngoài hệ ABO (xem Chương 4: Phát hiện và xác định các kháng thể bất thường). Vllẵ NHỮNG TRƯỜNG HỢP BẤT THƯỜNG KHI XÁC ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO Một khi kết quả của 2 nghiệm pháp định nhóm ABO (nghiệm pháp hồng cầu và nghiệm pháp huyết thanh) có một chút gì không phù hợp hoặc đáng nghi vấn, không được kết luận mà nhất thiết cần điều tra nghiên cứu tiếp bằng những kỹ thuật sâu hơn. Nếu mẫu máu đó là của người cho máu thì phải loại khỏi diện sử dụng cho tới khi xác định rõ những bất thường ấy. Nếu mẫu máu đó là của ngưòi cần được truyền máu gấp thì có thể chỉ định dùng hồng cầu o hoặc tốt nhất hồng cầu o đã loại huyết tương. Song song tiến hành xác định rõ những bất thường như trên, điều quan trọng là khi lấy những mẫu máu để định nhóm trước khi truyền máu, phải lấy đủ hồng cầu và huyết thanh để có nguyên liệu cho các điều tra nghiên cứu tiếp theo. Thường nên lấy từ 5 đến 10 ml máu, vừa chống đông, vừa để đông, khoảng một nửa chống đông, một nửa để đông, như vậy có đủ nguyên liệu hồng và huyết thanh cho những xét nghiệm tiếp khi cần đến. Sai lệch kết quả trong định nhóm máu thường do 3 khâu: kỹ thuật, hồng cầu, huyết thanhễ 1ẻ Do khâu kỹ thuật Khâu này bao gồm các sai sót chủ quan trong việc tiến hành kỹ thuật như: Lầm lẫn máu, lầm thuốc thử, ghi chép sai, không tuân theo những quy tắc kỹ thuật nghiêm ngặt, nhận định sai dương tính và âm tính, không xác định được những hiện tượng dương tính giả và âm tính giả, sử dụng những vật phẩm và dụng cụ bị ô nhiêm, sử dụng trong phản ứng những tỷ lệ lượng 62 kháng nguyên và lượng kháng thể không tương xứng, ly tâm quá mức hoặc chưa đủ mức, trình độ non yếu khi nhận định kết quả không phát hiện những hiện tượng huyết tán ức chế và che lấp ngưng kết, những trưòng hợp dân sô" kép (double population) v.v những hình ảnh chuỗi tiền (rouleaux formation). 2. Do hồng cầu - Khi có chỉ định kỹ thuật pha mẫu hồng cầu trong huyết thanh của chính mình, hoặc trong môi trường protein phân tử lớn, cũng như các mẫu máu lấy từ dây rốn của trẻ sơ sinh có chất nhầy Wharton (Whartons Jelly), có thể gặp những hình ảnh chuỗi tiền (rouleaux formation), dễ lầm với ngưng kết. - Định nhóm bằng những mẫu máu lấy từ người vừa nhận máu truyền (nhất là ở những ngưòi không phải nhóm o mà nhận máu o, hoặc những ngưòi nhóm AB mà nhận máu A hoặc B trong những trường hợp cấp cứu), sẽ có thể thấy hình ảnh vừa ngưng kết, vừa không (2 dân số = Double population) dễ dẫn tối nhận định sai nếu không nghiên cứu điều tra cẩn thận. Đặc biệt là khi xảy ra tai biến hoặc biến cô" trong truyền máu thầy thuốc chuyên khoa được mòi đến xác định vấn đề. - Những mẫu hồng cầu thuộc nhóm A yếu, B yếu. - Những mẫu hồng cầu có bề mặt bất thường do di truyền bẩm sinh, hoặc do mắc phải. - Những mẫu hồng cầu mang kháng nguyên giống B (B like Antigen). Năm 1975 A-Gerbal và công sự đã nghiên cứu một sô" trường hợp, thấy rằng trên một sô" mẫu hồng cầu mang kháng nguyên A nhưng kháng nguyên A này được chuyển một phần qua hoạt tính của kháng nguyên B. Năm 1976, các tác giả thực nghiệm xử lý hồng cầu Aj bằng men Deacetylase thì làm mất đi hoạt tính A, chuyển sang hoạt tính B. Tiếp đó các tác giả gắn lại acetyl thì chuyển qua hoạt tính Aj (phản ứng ngưng kết 63 vối lectin Anti-Ax chiết từ đậu Dolichos Biflorus), cuối cùng đi đến nhận xét rằng loại kháng nguyên giống B đó thuộc loại Đeacetyl type tức là do bị khử acetyl, chỉ thấy xuất hiện trên những hồng cầu A, có thể thực nghiệm trong ống nghiệm, có thể gặp trên lâm sàng ở những ngưòi bệnh nhóm máu A mắc các bệnh tắc ruột do viêm, do ung thư đại trực tràng, do tính thấm thành ruột tăng lên, các men của vi khuẩn dễ xâm nhập tuần hoàn, trong số này có các men khử acetyl của phân tử N. acetyl galactosamin tận cùng, chuyển thành D. galactosamin, có nghĩa là chuyển hoạt tính kháng nguyên A qua hoạt tính kháng nguyên B mà các tác giả gọi bằng một tên riêng kháng nguyên giống B (B like Antigen). Tuy nhiên, loại B like này rất yếu, không bền vững, khi bệnh lý viêm tắc, nhiễm khuẩn nói trên giảm bớt thì hoạt tính của nó cũng giảm theo và mất đi. Nhưng dù sao cũng vẫn phải đề phòng lầm lẫn trong định nhóm. Sự lầm này rất dễ tránh nếu bao giò cũng sử dụng cả hai nghiệm pháp ký thuật (hồng cầu và huyết thanh) vì mặc dù kháng nguyên giống B có xuất hiện trên hồng cầu nhưng ngược lại người ta không bao giò thấy có mặt Anti-A trong huyết thanh những ngưòi ấy. - Hiện tượng đa ngưng kết hồng cầu (Pan agglutina-tion). Hiện tượng này thực ra không thuộc hệ ABO, sẽ được để cập ở chương bốn (xác định các kháng thể bất thường). Tuy nhiên khi tiến hành định nhóm hệ ABO thường quy, ta vẫn phải đối phó và xử trí thích hợp khi bắt gặp tình cò hiện tượng nàyễ Thuật ngữ ”Đa ngưng kết” chỉ nói về hiện tượng bề ngoài. Thực chất, có hai lý do chính như sau: Một là do sự có mặt của một hoặc nhiều các kháng thể bất thưòng thuộc loại nóng hay lạnh, IgG hay IgM (chủ yếu thường là lạnh, IgM) có thể kết hợp bổ thể hoặc không, đã gắn trên hồng cầu hay tự do trong huyết thanh. Đây là phần miễn dịch bệnh lý đối với hồng cầu, nghiên cứu trong phần chuyên khảo riêng. Hai là do một số kháng nguyên cá biệt T, Tn, Tk, Cad, mỗi kháng nguyên là một cảm thụ quan 64 (Receptor) trên bề mặt hồng cầu, chỉ bộc lộ khi có tác dụng ở một hoàn cảnh đặc biệt, thí dụ một loại men vi khuẩn (trong cơ thể hoặc Ống nghiệm). Hầu hết người trưởng thành đều có Anti T và Anti-Tk trong huyết thanh, khi chế tạo huyết thanh nghiệm Anti-A, Anti-B nhiều khi cũng không loại bỏ hết được những Anti-T và Anti-Tk đó, tuy nhiên vẫn chấp nhận được vì thường chúng rất yếu. Đại đa số tường hợp, nếu tuân thủ nghiêm khắc các quy tắc an toàn kỹ thuật, ngưòi ta có thể loại bỏ riêng những trường hợp nói trên để điều tra nghiên cứu tiếp theo, lý giải thoả đáng, không để sai lầm trong xác định nhóm hệ ABO. Sự suy giảm tính kháng nguyên A, B, H trên hồng cầu. Tình trạng này có thể gặp ở những người bệnh bị những bệnh ác tính cấp về máu như bạch cầu cấp (Leukemias), các bệnh u ác khác. Nhưng quá trình u ác tính có thể gây tác động biến đổi đến các kháng nguyên hồng cầu qua bộ máy gen, không những chỉ làm suy giảm mà còn có thể gây nên những biến đổi, khiến cho việc xác định nhóm máu ỏ những ngưòi bệnh như thế càng phải hết sức lưu ý, tránh nhầm lẫn. - Khi có chỉ định pha huyền dịch hồng cầu trong chính huyết thanh của mình, ta có thể gặp trường hợp người đồ tiết yếu tô' A, B, H trong huyết thanh với nồng độ cao, yếu tố hoà tan này có thể đủ sức kết hợp với huyết thanh nghiệm Anti-A hoặc Anti-B, ức chế kháng thể trong huyết thanh đó, gây nên phản ứng yếu ót hoặc âm tính khi đính nhóm. Để tránh tình trạng này, người ta khuyên chỉ nên sử dụng môi trưòng albumin hoặc huyết thanh AB đã biết trước, thuộc loại không tiết yếu tố A,B, H (sese). 3. Do huyết thanh - Khi trong huyết thanh người cần định nhóm, xuất hiện protein bất thường, do bệnh lý (multiple myeloma, macro-globulinemia), 65 hoặc do quá trình điều trị bằng những dịch cao phân tử, cũng có thể gây nên hiện tượng chuỗi tiền (Rouleaux formation), có thể lầm với ngưng kết. Nếu huyết thanh ấy có nồng độ fibrinogen cao cũng có thể gây nhầm. - Khi trong huyết thanh người bệnh có chứa các kháng thể bất thưòng ngoài hệ ABO (xem kỹ ở Chương 4) thí dụ các tự kháng thể lạnh, tự kháng thể nóng, các kháng thể đồng loại do quá trình gây miễn dịch nhiều lần (allo-antibodies), hoặc các kháng thể tự nhiên nhưng không thường xuyên (Anti-A!, Anti H, Anti-LeJ. - Trường hợp định nhóm cho trẻ sơ sinh, huyết thanh của trẻ chưa đủ nồng độ kháng thể tự sản xuất ra, thường chưa hoàn chỉnh hoặc tiếp nhận từ mẹ qua nhau thai (IgG), vì vậy nghiệm pháp định nhóm bằng huyết thanh chưa có giá trị. Trường hợp tuổi quá già, lượng kháng thể trong huyết thanh cũng giảm đáng kể, khi định nhóm máu phải lưu ý. - Khi định nhóm ỏ người bệnh, có thể gặp trường hợp bệnh suy giảm miễn dịch thí dụ bệnh Hodgkin, có thể gặp trạng thái suy giảm miễn dịch do điều trị hoá chất hay phóng xạ, cũng là một khó khăn có thể xảy ra khi xác định nhóm bằng nghiệm pháp huyết thanh. - ở những người mối được truyền tuỷ của người cho khác nhóm ABO, hoặc mối được điều trị bằng thay huyết tương (Plasmapheresis), lượng kháng thể trong huyết thanh có thể bị pha loãng hoặc hỗn tạp, không thể dùng trong xác định nhóm được. VIII. CÁCH PHÒNG TRÁNH VÀ xử LÝ CÁC KHÓ KHĂN KHI XÁC ĐỊNH NHÓM ABO 1. Trước nhất là phải tuân thủ các quy tắc kỹ thuật, định nhóm bằng cả hai nghiệm pháp (hồng cầu và huyết thanh), phải rửa kỹ hồng cầu, pha huyền dịch thích đáng, thao tác kỹ thuật 66 thành thạo, nghiêm túc. Như thế đã có thể phòng và tránh được hầu hết các khó khăn dẫn tối khả năng sai lầm trong định nhóm hệ ABO. 2 . Sử dụng các thuốíc thử có chất lượng tốt, đáng tin cậy từ niên hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, nơi chế tạo, quy cách dùng đến quan sát màu sắc, nhãn hiệu, không để xảy ra những lầm lẫn về ghi chép. 3. Nếu vẫn còn nghi vấn, phải tiến hành thêm những bưốc sau đây: - Làm lại kỹ thuật định nhóm bằng 2 lô thuốc thử khác nhau, do 2 KTV cùng làm trong cùng một điều kiện và sử dụng 2 loại kỹ thuật. Sô' 2 là ít nhất, nếu được có thể dùng 3 hoặc 4. Cụ thể là dùng 2 mẫu thuyết thanh nghiệm do 2 nơi chế tạo khác nhau, bô" trí 2 KTV thành thạo cùng định nhóm, bằng hai kỹ thuật trên tấm và trong typ. Tất nhiên là theo 2 nghiệm pháp và thống nhất kỹ thuật. - Lấy mẫu máu mối của ngưòi cho hoặc của ngưòi bệnh làm lại từ đầu, đề phòng mẫu trước đã bị ô nhiễm. - Sử dụng các mẫu chứng như hồng cầu o, huyết thanh nhóm AB, các mẫu hồng cầu A1; A2B. - Thử phản ứng tự thân (hồng cầu bản thân vối huyết thanh chính mình) ở các nhiệt độ 4°c, 22°c, 37°c trong môi trường nưốc muối, môi trường albumin, làm nghiệm pháp Anti globulin, cao hơn nữa có thể làm kỹ thuật vối hồng cầu xử lý men, nhằm phát hiện vai trò các tự kháng thể. Nếu qua những phản ứng tự thân còn nghi vấn, làm tiếp phản ứng ngưng kết như trên vối những mẫu hồng cầu o của người khoẻ. 67 HỆ Rh I. LỊCH SỬ Năm 1939, Levine và Stetson phát hiện một kháng thể bất thường trong huyết thanh một phụ nữ vừa sinh thai tử sản (stillborn) ngưòi này đã bị một tai biến huyết tán khi nhận máu của chồng. Lấy huyết thanh chứa kháng thể đó thử với các mẫu máu cùng nhóm hệ ABO thì 80% mẫu máu bị ngưng kết. Các tác giả ghi nhận sự có mặt loại kháng thể bất thường đó. Năm 1940 Landsteiner và Wiener lấy máu của khỉ Macacusrhesus tiêm chích cho thỏ và chuột lang, tạo được trong huyết thanh các động vật này một loại kháng thể gây ngưng kết cả với các hồng cầu của khỉ, cả với 85% ngưòi cho máu bấy giò, từ đó người ta gọi số 85% này là nhóm Rh dương tính (Rh+), 15% còn lại thì gọi là Rh âm tính (Rh~). Kháng thể gây ngưng kết được gọi là Anti-Rh. Cũng năm ấy, Wiener và Peters chứng minh rằng kháng thể phát hiện được ở huyết thanh ngưòi phụ nữ nói trên và một số người khác đã qua nhiều lần nhận máu truyền cùng nhóm ABO với kháng thể Anti-Rh tạo ra được trên thỏ chống lại hồng cầu của khỉ Rhesus, là rất giống nhau về hoạt tính, không phân biệt được. Năm 1941, Levine và cộng sự mô tả một trường hợp bệnh huyết tán sơ sinh vối tên gọi bấy giò erythroblastosis fetalis do có mâu thuẫn nhóm máu Rh giữa mẹ và thai nhi. Thực ra, kháng thể Anti-rhesus tạo ra được ỏ thỏ vối kháng thê phát hiện ở người sau một quá trình truyền máu hoặc thai nghén không phải là một loại mà chỉ là một sự trùng hợp ngẫu nhiên về hoạt tính. Điều này vài năm sau đó đã xác định rõ. Để giữ tính lịch sử của nguồn gốc phát hiện, người ta vẫn cứ dùng 68 danh từ Anti-Rh để chỉ các kháng thể của người ứng với một hệ kháng nguyên hồng cầu của người cũng mang tên hệ Rh. Còn kháng thể của thỏ chông lại hồng cầu khỉ Rhesus thực thụ thì Levine đề xuất đặt tên kháng thể Anti-LW, kỷ niệm sự phát hiện của Landsteiner và Wiener. Cho đến nay chính thức dùng như vậy. Các gen hệ LW cũng được thừa kế ở ngưòi độc lập với các gen hệ Rh. Đại đa sô' có sự trùng hợp hoạt tính giữa 2 hệ đó, nhưng cũng có những người Rh âm nhưng lại LW dương. Ke từ năm 1940, từ những phát hiện phong phú về hệ Rh đưa đến nhiều luận thuyết khác nhau, vì vậy có nhiều cách gọi tên khác nhau, mà 3 loại danh pháp của Fisher-Race, của Wiener, của Roseníìeld là chủ yếu. Ị|ể DANH PHÁP 1Ế Theo Fisher-Race Kể từ năm 1943, lần lượt phát hiện các kháng thể Anti-D, Anti-C, Anti-C, Anti-E, Anti-e, các tác giả xác định được các kháng nguyên D, c, c, E, e thuộc hệ Rh. Fisher giả thiết rằng các kháng nguyên xếp từng cặp allele với nhau trên một locus, giả thiết này đã được chứng minh và đi đến lý thuyết sắp xếp thứ tự như sau: c và c là 1 cặp, E và e là 1 cặp, D và d là 1 cặp. Trên chromosom xuất hiện cặp Dd rồi đến Cc và Ee, do đó phức hợp gen hệ Rh phải tập hợp thành 8 cụm: Dee, DcE, DCE, dce, dcE, dCe và dEC. Vậy có 3 locus cho 3 cặp allele. Các loại này kết chặt nhau vì vậy những biến dị do Crossing over (bắt chéo) rất hiếm gặp. Khi di truyền cũng cả cụm, coi một phức hợp cụm 3 gen. Thí dụ 1 ngưòi DCe/DcE chỉ có thể di truyền cho con hoặc bộ ba DCe,hoặc bộ ba DcE mà thôi, không thể có một phức hợp nào khác. ở đây, 5 kháng nguyên là có thật D, c, c, E,e đó là sản phẩm của các gen D,c, c, E, e. Chỉ có kháng nguyên d là không có thật 69 vì người ta đã phát hiện, phân định hoặc chế tạo được các kháng thể đặc hiệu tương ứng Anti-D, Anti-C, Anti-C, Anti-E, Anti-e mà không có Anti-d, do đó d chỉ là allele giả thiết của d, khi viết Dd có nghĩa là D dị hợp tử vì d chỉ có nghĩa là D. Nếu viết DD thì có nghĩa là D đồng hợp tử, còn dd thì có nghĩa là D'D~. Tất cả ngưòi nào dd tức là D'D“ (không có kháng nguyên D) được gọi là Rh~ bất kể kháng nguyên khác c và Eề Nhưng ai đó có 1D+ được gọi là Rh+ bất kể các kháng nguyên khác c hay e. Kháng nguyên D là kháng nguyên mạnh nhất và Anti-D cũng là kháng thể chủ yếu gây nên các tai biến thuộc hệ Rh. Đối vối các kháng nguyên khác như Dw G, V, Cw củng xếp theo nguvên tắc trên. 2. Theo Wiener Để dễ hiểu, xem bảng so sánh cách gọi của Wiener và Fisher Race dưối đây: Bảng 2.6ẽ So sánh cách gọi kháng nguyên hệ Rh của Fisher và Wiener Fisher Race Wiener DCe Rh, (Rho rh’ hr”) DcE Rh2 (Rho hr’ rh”) Dce rh (hr’ hr”) dCe rh’ (rh‘ rh") dcE rh” (hr' rh”) dCE rhy (rh’ rh') DCE Rhz (Rho rh' hr”) Dce Rho (Rho hr’ hr”) 70 Theo bảng so sánh trên, Wiener gọi D của Fisher là Rh0, c của Fisher là rh’, E của Fisher là rh”, d của Fisher là rh, c của Fisher là hr’, e của Fisher là hr”. 3. Theo Rosenfield Năm 1962 Rosenfield và những ngưòi cùng trường phái đề xuất cách gọi tên bằng số, thí dụ D của Fisher gọi là Rh: 1 c của Fisher gọi bằng Rh: 2, E của Fisher gọi bằng Rh: 3, c của Fisher gọi bằng Rh: 4, v.v. (xem bảng 2.7) Bảng 2.7Ẽ So sánh cách gọi kháng nguyên hệ Rh của Wiener, Fisher-Race; Rosenfiele Theo Wiener Theo Fisher-Race Theo Rosenfield Rho D Rh 1 rh’ c Rh 2 rh” E Rh 3 hr’ c Rh 4 hr” e Rh 5 hr f, ce Rh 6 rhi c e Rh 7 rhwl C w Rh 8 rhx c x Rh 9 cE Rh 34 Mỗi cách gọi tên trên đều có ưu và nhược điểm,thí dụ cách của Fisher-Race rất dễ hiểu và thông dụng nhưng khi đọc lên không gọn, cách của Wiener tuy gọn hơn nhưng nhiều khi tối nghĩa, cách của Rosenfield thì không nói lên gì về tính di truyền, về gen, về kháng nguyên nhưng lại tiện cho máy tính, cho thống kê và cho áp dụng tự động hoá, vì vậy trên thực tế 71 người ta ứng dụng cả ba cách, tuỳ từng yêu cầu. Trên thị trường quốc tế, một số thuốc thử như Anti-D đều in trên bảng nhãn chai cả 2 cách gọi theo Fisher-Race và theo Wiener thí dụ: Anti D (Anti-Rh0) v.v Không thể kể cách gọi của Rosenfield (là cách gọi đánh sô) 2 cách gọi của Fisher và Wiener tuy có khác nhau về quan niệm nhưng không có mâu thuẫn gì thực tế, vì vậy vẫn dùng chung cả 2 cách. Cụ thể là Fisher và Race giả thiết có 3 gen vối 3 cặp allele mà Fishe gọi là pseudo allel nhưng Wiener chỉ có quan niệm có 1 gen sinh ra 1 kháng nguyên vối 3 yếu tố (xem bảng 2.8). Kết quả cuối cùng áp dụng thực tế thì giống nhau nhưng nguồn gốc thì khác nhau. Bảng 2.8. Kháng nguyên và kháng thể hệ Rh Gen Kháng nguyên 3 yếu tố 3 kháng thể Wiener: R, Rh, Rh0 Anti-Rh0 rh’ Anti-rh’ hr” Ahti-hr” Anti-D Fisher: Dce D, c, e Anti-C 3 gen 3 kháng nguyên Anti-e Quan niệm về nguồn gốc khác nhau Kết quả thực tế cuối cùng giống nhau Trong mấy chục năm, kể từ khi phát hiện hệ Rh tới nay, quan niệm của Fisher-Race cùng vối danh pháp của các tác giả được thịnh hành, thông dụng, nhưng quan niệm này có những điẻm yếu cơ bản. Cùng với sự phát hiện ngày càng nhiều các kháng nguyên bộ phận, kháng nguyên kép, kháng nguyên G v.v thì điểm yếu càng lộ rõ, cụ thể là giả thiết về kháng nguyên d, allele của D không được chứng minh. Về tính phức tạp ngày càng tăng của hệ này, xin tham khảo về luận thuyêt ở các tài liệu chuyên sâu hơn, chi tiết hơn, 72 thí dụ tài liệu Blood Groups in Man của Race và Sanger từ lần tái bản thứ sáu trở lại đây. Có thể tổng quát những phức tạp này dưối những dạng sau: - Những kháng nguyên yếu như Du, Cw’ Cx, Ew v.v - Những hoạt tính kháng nguyên kép, có thể là sản phẩm chung của các loại liên kết quá chặt, thí dụ Ce (Rh:7), CE (Rh:2 2 ), cE (Rh:27)ằ - Những gen thiếu hụt một phần hoặc thiếu hụt toàn bộ (short deletion, small piece of chromosome missing or complété deletion) thí dụ: D (C) (e) D (C) (E) D - - thiếu hụt một phần kháng nguyên c và e thiếu hụt một phần kháng nguyên c và E. thiếu hẳn các sản phẩm của locus CcEe (gen câm) thiếu hẳn toàn bộ (gen câm toàn bộ còn gọi là Rh Dc - DCW - null) : thiếu hẳn các sản phẩm locus Ee III. TẦN SỐ KHÁNG NGUYÊN HỆ Rh ở NGƯỜI DA TRẮNG K háng nguyên D (Rh„) Khoảng 85% G RhG) 85% e (hr”) 98% c (hr’) 80% c (rh’) 70°/o f (ce) (hr) 64% E (hr”) 30% (Rh dương) 73 Kiểu di truyền phổ biến Tần số DCe/dce (R,r) DCe/DCe ( R ^ ) dce/dce (rr) DCe/DcE (R,R2) DcE/dce (R2r) Khoảng 30% 16% (Rh ầm: RÍT) 15% 13% 12% Như vậy, nếu chỉ tính tỷ lệ Rh+ (có kháng nguyên D) và Rh(D~ hoặc dd) thì ở người châu Âu sô người Rh+ chiếm 85% so người Rh" chiếm 15%. Riêng ở Việt Nam, các tác giả cho sô' liệu về tỷ lệ Rh' (Rh âm) từ 0,01% đến 0,07%, hàng ngàn lần thấp hơn tỷ lệ ỏ người châu Âu. Tuy nhiên các điểu tra chi tiết chưa đủ số liệu nghiên cứu. Có tác giả điểu tra nhỏ trong một thôn xóm ở một gia tộc số lượng chưa đến 2 0 người nội ngoại đã có 3 người Rh âm (dd). Vậy nếu có điều kiện điều tra chi tiết ở thôn xóm ấy, có khả năng thu được những tài liệu đáng lưu ý về việc này. IV. CÁC KHÁNG THÊ HỆ Rh Tuyệt đại đa số kháng thể thuộc hệ Rh đều là IgG, kháng thể miễn dịch, sản sinh ra sau những quá trình đáp ứng miễn dịch truyền máu hoặc thai nghén. Cụ thể là nếu người D’ nhận máu truyền D+ hoặc ngưòi cc nhận máu truyền c, người ee nhận máu truyền E v.v hay trong thai nghén nếu người mẹ mang thai là D" (tức dd) mà thai nhi là D+ thì có khả năng những hồng cầu mang kháng nguyên D+, c hoặc E đó khi xâm nhập tuần hoàn của ngưòi me D” sẽ gây đáp ứng miễn dịch tạo ra các kháng thể Anti-D, Anti-C, Anti-E v.v Trong các kháng thể thuộc hệ Rh, đáng kể nhất là Anti-D còn các kháng thể khác yếu hơn nhiều và mức độ gây phản ứng cũng rất ít so với Anti-D. 74 Anti-D là kháng thể loại liên kết, nhưng đòi hỏi những kỹ thuật nhân tạo như kỹ thuật Antiglobulin, kỹ thuật men hoặc kỹ thuật sử dụng môi trường huyền dịch hồng cầu là albumin các thuốc thử Anti-D (Anti-Rh0) phổ cập trên thị trường, dùng để định nhóm D+, D", thường đã được chế tạo nâng cao cường độ và hoạt tính, pha trong môi trường albumin, để khi định nhóm, không đòi hỏi phải dùng kỹ thuật Antiglobulin hoặc kỹ thuật men. Các thuốc thử như vậy gây phản ứng ngưng kết trực tiếp vối hồng cầu Rh dương trên tấm (tile technique), trong ống như các thuốc thử hệ ABO chỉ khác là phải tiến hành ở nhiệt độ 37°c đến 40°c. Do những tính chất cơ bản trên, trong phát hiện và xác định kháng thể bất thường, các kháng thể Rh, nhất là Anti-D đều là IgG, miễn dịch, nóng (hoạt động ở 37°c - 40°c, đòi hỏi kỹ thuật Antiglobulin,hoặc kỹ thuật men, hoặc sử dụng môi trường albumin, qua nhau thai, không kết hợp bổ thể, thường phát hiện được bắt đầu từ tuần thứ tám, thứ chín, sau lần gây miễn dịch đầu tiên và xuất hiện vối nồng độ cao nhất vào tuần thứ 2 0 . (Xem thêm ở mục kháng thể bất thường). HỆ KELL Kể từ 1946, Coombs, Mourant và Race phát hiện đầu tiên hệ này, đến nay đã trở thành ngày càng phức tạp. Năm 1949 Levine và cộng sự phát hiện kháng thê Anti-k và Allel “k”. Tối đây coi như hệ kell có hai Allel K và k. Năm 1957 Alle và Lewis phát hiện kháng nguyên Kpa và Kpb. Năm 1956 , sau Giblett đến Stroup và cộng sự phát hiện hệ Sutter gồm 2 allele Jsa và Jsb gắn với hệ Kell về di truyền. 75 Gần đáy còn thấy những yếu tố phụ: Mac leod và Claas. Tóm lại hệ Kell đến bây giò gồm những kháng nguyên sau đáy với các tén gọi cũng đã thay đổi cho thống nhất: T ên củ Tên m ới Tần su ất (da trắng) K (Kell) ...... Kj khoảng 0,05 K (Cellano) ...... K2 khoảng 0.9Õ Kp* (Penney) ...... K3 khoảng 0,02 Kpfc (Rautenberg) ...... K4 rất phô biến K- (Peltz) ...... K, -Jsa (Sutter) ...... IC5 Js= (Matthews) ...... K7 Sự phát triển của hệ Kell những năm gắn đây lên tới 18 kháng nguyên thêm nữa: K (K“) Phát hiện nám 1956 Kx. (Claas) Phát hiện nãm 1968 K- (Ulẻ) Phát hiện nám 1968 K (K like. Còté) Phát hiện nám 1971 K-ọ ế.. Phát hiện nám 1973 K-; (Sgro) Phát hiện năm 1974 K:4 (San) Phát hiện nãm 1974 K 5 (Kx) Phát hiện nám 1974 K>; (Côtélike) Phát hiện nãm 1974 K - (Weeks. \W ) Phát hiện nám 1974 K; Phát hiện năm 1974 Ngoài ra còn khoảng 5 kháng nguyên tần số rất thấp (private), không nêu lẻn đây. Đáng lưu ý rang kiểu hình McLeod cũng như K là loại kiểu hình rất hiếm, mà trong chửng 76 bệnh u grannulom mạn tính (chronic granulomatous disease) hồng cầu đều thuộc kiểu hình K° hoặc Mc Leod. Các kh á n g th ể thuộc hệ Kell: 1. Anti-Kì (tức Anti-K cũ) Rất ít khi thuộc loại IgM và xuất hiện tự nhiên, thường là loại IgG và kháng thể miễn dịch, gặp khá phổ biến, chỉ đứng sau hệ ABO và Rh, thường phát hiện nhậy bằng kỹ thuật antiglobulin ở 37°c. Một số mẫu kháng thể nhậy với kỹ thuật men, thậm chí hoạt động cả trong môi trường nước muối, môi trường albumin hoặc vối huyền dịch hồng cầu pha trong chính huyết thanh bản thân, nhiều khi kết hợp bổ thể. Loại kháng thể này thường là thủ phạm gây huyết tán trong truyền máu và ở trẻ sơ sinh, và cũng thường được kích thích sản xuất ra do các quá trình truyền máu hoặc thai nghén. 2. Anti-K2 (tức Anti-k cũ) Hiếm hơn Anti-K!, tính chất cũng hoàn toàn giống như thế, thường là kháng thể miễn dịch, loại IgG, phát hiện chủ yếu bằng kỹ thuật Antiglobulin, luôn được kích thích sản xuất bởi những quá trình truyền máu và thai nghén, đồng thòi là thủ phạm phổ biến gây ra những tai biến huyết tán trong truyền máu và với sơ sinh. Cả hai loại kháng thể trên khiến cho hệ Kell trở thành hệ quan trọng thứ ba sau hệ ABO và Rh của hồng cầu, có ý nghĩa lâm sàng cả vói truyền máu và miễn dịch thai nghén. Các tai biến thường ở mức độ đáng lưu ý, có khả năng thậm chí rất nặng, có thể dẫn tới chết ngưòi vì các kháng thể thường kết hợp bổ thể. Vì thế, việc kiểm tra về hệ nhóm này là việc tất nhiên phải làm ở mọi cơ sỏ truyền máu, băng máu, huyết sinh học lâm sàng. 77 Mặc dù tính phức tạp của hệ Kell nhưng trong thực tế thường chỉ cần hai loại kháng nguyên và 3 kiểu hình hồng cầu sau đây: Kháng nguyên Chứng dương Chứng âm K, (tức K cũ) K,K2 (Kk) K2K2 (kk) «2 (tức k cũ) k ,k 2 K,K,(KK) HỆ MNSs Năm 1927, Landseiner và Levine phát hiện 2 kháng nguyên M và N nhò 2 kháng thể Anti-M và Anti-N. Lúc đó cho rằng hệ này gồm 2 allele M và N. Đến năm 1947, Walsh và Mongomery tiếp đến Sanger và Race phát hiện kháng thể Anti-S và kháng nguyên s. Năm 1951, Levine và cộng sự lại tìm thấy Anti-S và 1 kháng nguyên tương ứng s. Vấn đề không đơn giản mà ngày càng phức tạp. Năm 1960, tác giả Cleghorn đã điều tra trên 1.000 người Anh, kết quả như sau: Anti-M Anti-N Anti-S Anti-S Tần số Kiểu Kiểu di % hình truyền + + 5,7 MS MS/MS + + + 14,0 MSs MS/Ms + + 10 1 Ms Ms/Ms + + + 3,9 MNS MS/NS 22,4 MNSs MS/Ns hay Ms/NS + + + 22,6 MNs MS/Ns + + 0,3 NS NS/NS + + + 5,4 NSs NS/Ns + + 15,6 Ns Ns/Ns 78 ở ngưòi da trắng, thấy sự phân bổ trên các Chromosom theo tỷ lệ như sau: NS : 0,39 Ms : 0,30 MS : 0,24 NS : 0,07 Sự phân bố kết hợp gen như trên cho phép sử dụng hệ này có hiệu lực cao trong các nghiên cứu di truyền, kế thừa. Cho đến nay, mỗi ngày càng phát hiện tính phức tạp, người ta tìm thấy kháng thể Anti-U và kháng nguyên u (Weiner). Ở ngưòi da đen lại có kháng nguyên s u nhưng không có kháng thể Anti-SƯ mà những người u+ hoặc s u đểu là S-s.Dù sao người ta cũng phải công nhận có những kiểu hình MSU, NSU, MU, NU chủ yếu là ở ngưòi da đen. Ngoài ra còn Mg, Mj, Mv và một loạt các kháng nguyên chưa hoàn toàn sáng tỏ như Me, Mz, Mr, N2, Ma, Me, S2, Mk. Không những thế, còn thấy có các kháng nguyên vệ tinh (satellite) của hệ này, thí dụ Mia, Vw, Mủ, Hill Những vệ tinh này lên tối số hàng chục và chứng tỏ một điều rằng có nhiều locus sinh ra kháng nguyên ấy đã gắn chặt chẽ với các allele thuộc hệ MNSs. Mặc dù tính phức tạp như vậy, cũng có thể kết luận rõ ràng được đổi với hệ này gồm mấy điểm chính như sau: - M, N, s, s là các allele, có các kháng thể tương ứng Anti M, Anti-N, Anti-S, Anti-S. - Nhiều tác giả cho rằng M và N không thực chất là allele của nhau mà N là tiền chất (precursor) của M giống như H là precursor của A và B. Tuy nhiên có tác giả thấy điều đó chưa đủ chứng cứ. 79 - Kháng nguyên u gặp phổ biến ở người da đen, có liên quan mật thiết với hệ MNSs. Những người u+ đểu là S-S-. Tuy nhiên kháng nguyên u có cả trên hồng cầu và bạch cầu hạt neutrophil. - Hệ MNSs có giá trị lốn trong nghiên cứu, điểu tra về di truyền, kế thừa. Các kh á n g thê thuộc hệ MN: 1. Anti-M Thường là loại IgM, kháng thể ngưng kết mạnh, hoạt động tốt nhất ỏ 4°c, nhưng cũng có thể là IgG, vậy có thể vừa là tự nhiên vừa là miễn dịch, đôi khi gặp ỏ trẻ nhỏ dưới 1 tuổi, ỏ môi trường albumin, hoạt tính tốt hơn ở môi trường muối, và ở cả 37°c cũng hoạt động, gây được cả tai biến truyền máu và huyết tán sơ sinh. Khi Anti-M yếu, chỉ dương tính với hồng cầu đồng hợp tử MM. Là loại kháng thể không kết hợp bổ thể. 2. Anti-N Còn hiếm hơn Anti-M, tuyệt đại đa số là tự nhiên, hoạt động ổ 4°c, cũng có thể gây phản ứng chéo vối hồng cầu MM, không kết hợp bổ thể, rất ít gây tai biến truyền máu hoặc huyết tán sơ sinh. 3. Anti-S Đa số thuộc loại kháng thể miễn dịch IgG. Một số ít có thê là IgG, có thể kết hợp bổ thể nhưng không thấy huyết tán invitro. Có khả năng gây tai biến truyền máu và huyết tán sơ sinh. Kháng thể này thường gặp ỏ ngưòi nhận truyền máu nhiều lần. 4ế Anti-S Rất hiếm gặp, thường là IgG, kháng thể miễn dịch, đa số không kết hợp bổ thể, một số ít có kết hợp, có khả năng gây tai biến huyết tán trong truyền máu và sơ sinh. 80