🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Giáo trình sinh học phát triển Ebooks Nhóm Zalo G S .T S . N G U Y Ễ N N H Ư K H A N H (Chủ biên) T TS. N G U Y Ễ N V Ă N Đ ÍN H - T S . V Õ V Ă N T O À N GIÁO TRÌNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN (Tái bản lần thứ nhất) N HÀ X U Ấ T BẢN G IÁ O D ỤC V IỆ T NAM LỜI GIỚI THIỆU Giáo trình Sinh học ph át triển là giáo trình đào tạo đại học và sau dại học ờ các trường Đại học Sư phạm và trường khác. Giáo trình cập nhật những kiến thức mới nhất (đến năm 2011) về các cơ chế phân tử, cơ chế tế bào, vốn là các cơ sờ của các quá trình phát triển của cá thê sinh vật. Sinh học phát triển là môn khoa học tổng hợp kiến thức từ nhiều môn khoa học khác như tế bào, hình thái, giải phẫu, sinh lý học thực vật và động vật, mô phôi, hoá sinh, di truyền, tiến hoá, sinh học phân tử, công nghệ sinh học, môi trường. Giáo trình cũng đã cố gắng tập hợp các lý giải nhiều hiện tượng sinh học, ví dụ, giải thích vì sao ly cà phê giúp người ta hết buồn ngủ dựa trên kiến thức về truyén tín hiệu, hoặc vì sao ăn cá nóc (Figu rubripes) có thể bị ngộ độc chết người nếu không biết chuẩn bị đúng cách; các câu trả lời có trong chương 1. Một câu hỏi đã tồn tại lâu đời rằng, quá trình chuyển đổi từ trứng được thụ tinh (hợp tử) thành cơ thể sinh vật trường thành xảy ra như thế nào? Trước đây để trả lời câu hỏi đó, phải dựa vào lực siêu nhiên huyẻn bí. Ngày nay câu hỏi đó đã có thể trả lời một cách có ca sở. Trong sách cũng có các lý giải được nhiều bệnh lý dựa trên những tri thức của sinh học phân từ như sự biểu hiện gen phân hoá, truyền tín hiệu trong Sinh học phát triển. Giáo trình cũng sưu tập các thành tựu ứng dụng của sinh học phân lử và công nghệ sinh học vốn đang và sẽ được áp dụng rộng rãi vào y học tái sinh và nông nghiệp. Sách hướng tới phục vụ cho sinh viên và học viên cao học các khoa sinh học, sinh học - kỹ thuật nòng nghiệp,, sinh - hoá, sinh học môi trường, công nghệ sinh học cùa các trường Đại học, Cao đẳng Sư phạm và sinh viên các trường đại học và cao đẳng khác, cũng như các trường trung học kỹ thuật có môn học liên quan với sinh học. Sách sẽ là tài liệu tham khảo bổ ích trong quá trình tự bồi dưỡng nâng cao kiến thức cùa giáo viên sinh học trong các trường Trung học phổ thông và Trung học cơ sở. Sách cũng rất bổ ích cho những ai muốn tìm hiểu quá trình phát triển của cá thể sinh vật trong đó có cả bản thân mình. Sách cũng cập nhật các thành tựu của sinh học ứng dụng ở cấp độ phân từ và tế bào vào y học tái sinh nhằm giúp chữa trị, thay thế các cơ quan của cơ thê bị bệnh, lý giải nguyên nhân của một số bệnh tật trên cơ sở kiến thức của khoa học sinh học hiện đại. Giáo trình gồm 3 phần, 13 chương: Phần một: Những ca sở chung cùa sinh học phát triển, gồm 4 chương từ chương 1 đến chương 4 là: 1) Cơ sờ phân tử trong sinh học phát triển, 2) Các cơ chế tế bào của sự phát triển. 3) Kiểm tra hormon quá trình phát triển, 4) Tiến hoá của sự phát triển. Phần hai: Sinh học pliái triển cá thề động vật, gồm 6 chương, từ chương 5 đến chương 10 là: 5) Giảm phân, 6) Phát sinh giao tử, 7) Thụ tinh, 8) Phát triển phôi sớm, 9) Hình thành trục cột sống, 10) Sự phát triển của người. 3 Phần ba: Sinli học pliál triển cá thề thực vật, gồm 3 chương, từ chương 11 đến chương 13 là: 11) Phát triển sinh dưỡng, 12) Phát triển cơ thể (hình thái) thực vật, 13) Phát triển sinh sản ớ thực vật. Cuối mồi chương có phần tóm tắt và câu hỏi. Phàn công bién soạn: GS. TS. Nguyễn Như Khanh, Chủ biên và tham gia biên soạn nhập môn, lời giới thiệu và các chương 1, 2 và 4 phần một. TS. Võ Vãn Toàn biên soạn các chương 3 phần một; toàn bộ phẩn hai, gồm các chương 5, 6, 7, 8, 9 và 10. TS. Nguyễn Văn Đính biên soạn toàn bộ phần ba, gồm các chương 11,12 và 13. Mặc dầu đã rất cố gắng, giáo trình có đặc trưng tổng hợp, chứa đựng kiến thức nhiều môn khoa học sinh học khác nhau nẽn sách không thể tránh khỏi thiếu sót, rất mong sự dóng góp ý kiến cúa các bạn đồng nghiệp, của sinh viên, học viên sau đại học và của bạn đọc dế lẩn tái bản sau sách được tốt hơn. Mọi ý kiến đóng góp xin gửi về Công ty cổ phần Sách Đại học - Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội. XÌII trăn H ọng cám ơn. C Á C T Á C G IẢ 4 MỤC LỤC Lời giới thiệu...................................................................................................................................3 Nhập môn của sinh học phát triển.............................................................................................9 Phần một NHỮNG Cơ SỞ CHUNG CỦA SINH HỌC PHÁT TRIỂN Chương 1. C ơ sở phân tử trong sin h h ọ c phát triể n ....................................................... 11 1.1. Sự biểu hiện gen từ ADN —» Protein.........................................i.u...........................11 1.2. Điểu hoà sự biểu hiện gen..........................................................ij.iij.j.iii..;................36 1.3. Sự biểu hiện gen phân hoá trong phát triển..........................80 1.4. Truyền tín hiệu trong sinh học phát triển................................. ............................... 90 Tóm tắt chương 1: Cơ sờ phân tử trong sinh học phát triển...,.............................. . 110 liiĩ/ Ij.il' i Câu hỏi chương 1..................................................................................... ............................ 115 Chương 2. C á c c ơ c h ế tế bào củ a s ự phát triể n ..........................................................116 Nhập chương....................................................................................................................... 116 2.1. Phân bào................................................................................................................. . 116 _ _ _ . (Triii Ợ nT gnoiHTU 2.2. Phân hoá tế bào...................................................................... f. . . .............130 2.3. Tái lập trình nhân...................................................................................................... 141 2.4. Tạo hình mẫu.................................................................... ............ ................................146 2.5. Phát sinh hình thái...................................................... ................................................. 150 Tóm tắt chương 2: Cơ sở tế bào của sinh học phát .................. 156 Câu hỏi chương 2 ...............................................................................................................157 Chương 3. K iểm tra horm on quá trình phát t r i ể n . ................................... 158 3.1. Hormon Ihực vật (phytohormon)...................... ................. .................................... 158 3.2. Hormon động vật.......................................................................................................... 165 Tóm tắt chương 3: Kiểm ira hormon quá trình phát triển...........................................197 Câu hỏi chương 3 ...................................................................................................................197 Chương 4. Tiến hoá củ a s ự phát triển ............................................................................... 198 4.1. Tống quan về sự tiến hoá của sinh học phát triển................................................. 198 4.2. Độl biến một hoặc hai gen, xuất hiện dạng mới...................................................200 4.3. Cùng gen, chức năng m ới...........................................................................................202 5 4.4. Các gen khác biệt, chức năng đồng quy...................................................................205 4.5. Nhân đổi gen và phân hướng.......................................................................................206 4.6. Phân tích chức nãng của các gen thông qua các loài............................................208 4.7. Sự đa dạng của các con mắt trong thế giới tự nhiên..........................................209 Tóm tắt chương 4: Tiến hoá của phát triển...................................................................212 Câu hỏi chương 4 ................................................................................................................. 213 Phẩn hai SINH HỌC PHÁT TRIỂN CÁ THỂ ĐỘNG VẬT Ch ư ơ n g 5. G iảm p h â n .....................................................................................................................214 5.1. Giảm phân........................................................................................................................214 5.2. So sánh giảm .phân với nguyên phân........................................................................ 226 Tóm tắt chương 5: Giảm phân............................................................................................ 229 Câu hỏi chương 5 .................................................................................................................... 230 Ch ư ơ n g 6. P h át sin h g iao tử (g a m e to g e n e sis)................................................................. 231 6.1. Khái quát chung về phát sinh giao tử ........................................................................231 6.2. Phát sinh tinh trùng (sự sinh tinh, spermatogenesis)........................................... 233 6.3. Phát sinh trứng (Sự sinh trứng, sự tạo noãn bào)...................................................239 Tóm tắt chương 6: Phát sinh giao tử..................................................................................260 Câu hỏi chưcmg 6 ............................................................................................................................................ C h ư ơ n g 7. T h ụ tin h ....’..................................................................................................................... 262 7.1. Sự xâm nhập cùa tinh trùng qua màng sinh chất cùa trứng và sự đung hợp màng..................................................................................................................... 262 7.2. Hoạt hoá trứng................................................................................................................ 263 7.3. Dung hợp nhân ................................................................................................................266 Tóm tắt chương 7: Thụ tinh.................................................................................................266 Cầu Hôi chương 7 ....................................................................................................................267 C h ư ơ n g 8. P hát triển phôi s ớ m ................................................................................................. 268 8.1. Phân cắt và giai đóạn phôi nang (phôi túi)............................................................. 268 8.2. Tạo phôi v ị........................................................................................................................273 8.3. Phát sinh cơ quan........................................................................................................... 280 8.4. Phát sinh cơ quan trong động vật có xương sống................................................. 283 8.5. Các dẫn xuất mào thần kinh trong sự tiến hoá của động vật có xương sống..,..,..)...,,.................................................................................................287 Tóm lắt chương 8: Phát triển phôi sớm ........................................................................... 289 Câu hỏi chương 8....................................................................................................................289 6 Chương 9. Hình thành trụ c cộ t s ố n g .....................................................................................290 9.1. Tổ chức Spemann xác định trục lưng-bụng.......................................................... 290 9.2. Các phân tử truyền tín hiệu từ tổ chức spemann ức chế sự phát triển của bụng..........................................................................................................................292 9.3. Bằng chứng vể tổ chức spemann trong động vật có xương sống..................... 293 9.4. Cảm ứng có thể sơ cấp hoặc thứ cấp........................................................................ 294 9.5. Các chất xác định lưng được mã hoá đằng mẹ hoạt hoá tín hiệu Wnt.... 295 Tóm tắt chương 9: Hình thành trục cột sống................................................................. 295 Câu hỏi chương 9 ...................................................................................................................295 Chương 10. S ự phát triển củ a n g ư ờ i.....................................................................................296 10.1. Sự phát triển trong thời kỳ ba tháng đầu....................................................................... 296 10.2. Phát triển trong kỳ ba tháng thứ h a i......................................................................299 10.3. Phát triển trong kỳ ba tháng thứ b a ....................................................................... 299 10.4. Những biến đổi quyết định trong hormon dẫn tới sinh đẻ...............................299 10.5. Nuôi trẻ bầng sữa mẹ là đặc trưng khác biệt của động vật có v ú ..................300 10.6. Sự phất triển sau sinh ờ người..................................................................................301 Tóm tắt chương 10: Sự phát triển của người.................................................................. 302 Câu hòi chương 10................................................................................................................302 Phẩn ba SINH HỌC PHÁT TRIỂN CÁ THỂ THỰC VẬT NHẬP MÔN PHẦN SINH HỌC PH ÁT TR IẺN c á t h ể t h ụ c v ậ t ............... 303 Chưong 11. Phát triển sin h d ư d n g ........................................................................................ 303 11.1. Phát triển cùa phôi thực vật.....................................................................................303 11.2. H ạt.................................................................................................................................312 11.3. Q uả.................................................................................................................................313 11.4. Nảy m ầm ......................................................................................................................316 Tóm tắt chương 11: Phát triển sinh dưỡng.................................................................... 319 Câu hói chương 11............................................................................................................... 320 Chương 12. Phát triển cơ th ể (hình thái) thực v ậ t ......................................................... 321 12.1. Tổng quan về tổ chức cùa cơ thể thực vật.............................................................321 12.2. Các mô thực vật..........................................................................................................326 12.3. Rễ: cấu trúc móc neo và hấp thụ........................................................................... 335 12.4. Thân: giá đỡ cho các cơ quan trẽn và dưới mặt đất...........................................341 12.5. Lá: cơ quan quang hợp.............................................................................................347 Tóm lắt chương 12: Phát triển cơ thể (hình thái) thực vật................................................. 354 Câu hỏi chương 12................................................................................................................355 7 C h ư ơ n g 13. P h á t triển sin h s ả n ỏ th ự c v ậ t .......................................................................356 13.1. Sự chuyển đổi pha.........................................................................................................356 13.2. Sự tạo h o a........................................................................................................................361 13.3. Thụ phấn và thụ tinh....................................................................................................372 13.4. Sinh sản vồ tín h ............................................................................................................ 379 13.5. Quãng đời thực v ậ t...................................................................................................... 382 Tóm tắt chương 13: Phát triển sinh sản.......................................................................... 384 Câu hỏi chương 13...................................................................................................................386 T ài liệu tham kháo.....................................................................................................................387 8 NHẬP MÔN CỦA SINH HỌC PHÁT TRIEN Phát triển có thể được xác định như là quá trình của những biến đổi có hệ thống, được di truyền điều phối, qua đó cơ thê chịu hàng loạt các biến đổi tiến triển, hình thành nên các giai đoạn kế tiếp (hình 1.1) vốn đạc trưng chu trình sống cùa cá thể (W. K . Purves et al., 2003, Peter H. Raven et al., 2010). Các giai đoạn phát triển sớm của cơ thể thực vật hoặc động vật được gọi là phôi. Đôi khi phôi nằm bên trong một cấu trúc bảo vệ như vỏ hạt, hoặc vỏ trứng, hoặc tử cung. Phôi không quang hợp hoặc không được cung cấp dinh dưỡng chủ động; thay vào đó, nó tiếp nhận thức ăn trực tiếp từ cơ thê mẹ hoặc gián tiếp (bàng dinh dưỡng dự trữ trong hạt hoặc trong trứng). Nhiều giai đoạn phôi có thể xảy ra trước khi sinh ra ccr thể mới, độc lập. Hầu hết các cơ thể tiếp tục phát triển suốt cả cuộc đời; phát triển chỉ dừng lại khi cơ thể chết. 2 tê bào Phôi giai đoạn Phôi giai đoạn Phôi bên 8 tế bào quả tim trong hạt (Giai đoạn ngư lôi) Cây trưởng thành Các giai đoạn phát triển từ phôi đến trưởng thành của cơ thè thực vật và động vật. Sinh trưởng, phán hoá và phát sinh hinh thái là toàn bộ các phẩn của quá trinh phức tạp của sự phát triển. (Theo w. K. Purves et ai, 2003). Phát triển bao gồm sinh trướng, phân hoá và phát sinh hình thái. Ba quá trình đó chịu Irách nhiệm đối với các biến đổi phát triển mà mỗi cơ thể trải qua trong chu trình sống cùa nó. Sinh trưởng (gia tăng kích thước) diên ra thông qua quá trình phân bào và giãn bào. Trong mọi sinh vật đa bào, sự phân bào lặp lại lạo nên cơ thể đa bào. Ớ thực vật, sinh trướng giãn dài bắt đầu vào một thời gian ngắn sau các làn phán bào đầu tiên của trứng đã 9 được thụ tinh. Ớ động vật, ngược lại, sự giãn bào thường bắt đầu chậm hơn. Phôi động vật có thể gồm hàng nghìn tế bào trước khi nó trở nên lớn hơn so với trứng nguyên khởi đã được thụ tinh. Sinh trường tiếp tục trong suốt đời sống cá thể trong một số loài, nhưng trong một số loài khác, sinh trưởng đạt đến một điểm cuối tương đối ổn định. Phán hoá là tạo ra các tế bào chuyên hoá; điều đó có nghĩa là phân hoá xác định cấu trúc và chức năng chuyên biệt của tế bào, phân hoá thuộc phạm trù phát triển. Nguyên phân sàn sinh ra nhân mới vốn y hột về mặt di truyền và nhiễm sắc thổ đối với nhân từ đó nó được hình thành. Tuy nhiên có thể thấy rõ rằng, các tế bào của cơ thể đa bào không hoàn toàn giống nhau về cấu trúc và chức năng. Sự thiếu nhất quán rõ rệt như vậy là kết quả từ quá trình điều hoà biểu hiện các phần khác nhau của bộ gen (genome). Khi phôi bao gồm chỉ sô ít các tế bào, mỗi tế bào có tiềm năng phát triển theo nhiều con đường khác nhau. Tuy nhiên, vì phát triển diễn tiến, những khả năng sẵn có đối với các tế bào riêng biệt bị thu hẹp dần đến khi số phận của tế bào được xác định hoàn toàn và tế bào đã được phân hoá. Phát sinh hình thái (Morphogenesis) có nghĩa là sự "tạo hình dạng". Đó là hình dạng cúa cơ thê đa bào và các cơ quan với các đặc điểm giải phẫu của chúng. Phát sinh hình thái là kết quá từ sự tạo hình mẩu (pattern formation), là sự tổ chức của các mô khác biệt đã phân hoá thành các cấu trúc chuyên biệt; trong sự tạo hình mẫu, các tế bào trong phôi đang phát triển phải định hướng đối với sơ đồ thiết kế thân của cơ thể mà phôi sẽ trở thành. Sự tạo hình mẫu liên quan với khả nãng của các tế bào phôi khám phá ra thông tin vị trí. Thông tin đó chỉ dẫn các tế bào đạt đến số phận cuối cùng. Trong sự phát triển của thực vật, tế bào bị giối hạn bời vách tế bào và khỏng di chuyển quanh thân thể, do vậy, sự phân chia tế bào và sự giãn tế bào được thực hiện một cách có tổ chức là những quá trình chủ yếu tạo nên cơ thể cùa cây. Trong động vật, sự vận dộng của tế bào là rất quan Irọng trong phát sinh hình thái. Ở cả thực vật và động vật, sự chết được chương trình hoá cùa tế bào là thiết yếu đối với sự phát triển có trật tự. Tương tự như sạ phân hoá, phất sinh hình thái có kết quả cuối cùng là từ sự hoạt động được điều hoà cùa các gen và các sản phẩm cùa chúng, cũng như từ sự tương tấc của các tín hiệu ngoại bào và sự truyền tín hiệu của chúng vào các tế bào đích. 10 P h ầ n m ột NHỮNG Cơ SỞ CHUNG CỦA SINH HỌC PHÁT TRIỂN C hư ơng 1 C ơ SỞ PHÂN TỬ TRONG SINH HỌC PHÁT TRIEN Thay cho phần nhập chương, chúng ta xem bằng cách nào chất độc, trong trường hợp cụ thê’ là rixin, giết chết tế bào. Điều đó liên quan đến nội dung biểu hiện gen cùa chương. Rixin, một chất độc từ hạt cây thầu dẩu (Ricimts communis). Độc tố là một protein không có trong tinh dầu thầu dẩu vốn đã được sử dụng hàng thế kỷ như là nguồn dược liệu để tẩy rửa đường tiêu hoá và hiện nay tinh dầu này được sử dụng trong công nghiệp chất dẻo. Rixin giết chết tế bào bằng cách phong toả quá trình tổng hợp protein. Một cách đặc hiệu hơn, nó xúc tác sự biến đổi và sự phân cắt của một trong các phân tử ARN lớn vốn cấu thành ribosom (bào quan tổng hợp protein) trong cơ thể có nhân (eukaryote). Các protein là biểu hiện kiểu hình của kiểu gen - thông tin di truyền được mã hoá trong ADN của tế bào. Rixin ức chế khả năng của tế bào Hình 1.1. Cây thầu dẩu (Ricinus communis). Hạt cùa nó chứa phân tử rixin, một chất độc gây chết tế bảo bằng cách ức chế sự tổng hợp protein tại ribosom. biểu hiện kiểu gen thành kiểu hình thông qua sự tổng hợp protein, do vậy tế bào bị nhiễm độc rixin không thể sống được (Perves w . K. et al„ 2008). Trong mục tiếp theo sau đây, chúng ta sẽ xem xét cơ chế mà theo đó các gen (từ ADN) được biểu hiện thành các protein vốn làm xuất hiện các chu trình trao đổi chất dẫn đến phát sinh hình thái (phát sinh cá thể, phát triển cá thể). 1.1. S ự B IỂU HIỆN G EN TỪ ADN — PRO TEIN Kiêu gen —* kiêu hình (Genotype —> phenotype) Bây giờ chúng ta sẽ bắt đầu với chứng minh cho quan hệ giữa gen và protein và sau đó sẽ cung cấp một số các chi tiết về quá trình phiên mã - sao chép trình iự gen của ADN thành trình tự cùa A R N - và dịch mã - sử dụng trình tự của A R N để tạo polypeptit với trình tự xác định của các axil amin. Cuối cùng, chúng ta sẽ xác định các đột biến và các kiểu hình nong những giới hạn phân tử đặc trưng. 11 1.1.1. Một gen, một polypeptit Có nhiều bước giữa kiểu gen và kiểu hình. Các gen không thể tự mình trực tiếp sản sinh ra kết quả kiểu hình, ví như màu mắt riêng, hình dạng hạt riêng biệt hoặc rănh cằm,... Bước có tính lịch sử đầu tiên trong các gen liên quan đến các kiểu hình đã xác định kiểu hình trong các giới hạn phân tử. Cơ sờ phân tử của các kiểu hình thực tế đã được phát hiện ra trước khi phát hiện ra AD N là nguyên liệu di truyền. Các nhà khoa học đã nghiên cứu sự khác biệt hoá học giữa cá thê hoang dã và các alen đột biến trong các cơ thế như là con người và mốc bánh mỳ. Họ phát hiện ra rằng, sự khác biệt kiểu hình là kết quả của sự khác biệt trong các protein chuyên biệt. Trong năm I940, George w . Beadle và Edward L . Tatum ở Trường Đại học Stanford dã thấy ràng khi một gen đã biến đổi dẫn đến kết quả được thê hiện trong một kiểu hình biến đổi và kiểu hình biến đổi luôn luôn liên kết với enzym biến dổi. Sự phát hiện ấy là cực kỳ quan trọng trong việc xác định các ranh giới hoá học. Vai trò của enzym trong hoá sinh đã dược mô tả vào thời gian này. Điều đó làm cho Beadle và Tatum nảy ra ý tưởng rằng, sự biểu hiện của gen thành kiểu hình có thể xảy ra thông qua enzym. Họ đã thực nghiệm với mốc bánh mỳ N eurospora crassa. Nhân trong thân nấm đó là đơn bội («) vì đó là các bào tử sinh sản của nó. (Sự kiện ấy là quan trọng vì điểu dó có nghĩa rằng, thậm chí alen đột biến lặn là dễ thăm dò trong thực nghiệm). Beadle và Tatum đã nuôi cấy Neurospora trẻn mỏi trường dinh dưỡng tối thiểu chứa saccarose, muối khoáng và vitamin, sử dụng môi trường ấy, các enzym của Neurospora kiểu hoang dã có thê xúc tác các phản ứng trao đổi chất cần để tạo nên tất cả các cấu tử hoá học cùa tế bào của chúng, gồm cả các protein. Các chủng kiểu hoang dã ấy được gọi là các protolropli (vật ăn khới nguyên). Beadle và Tatum đã xử lý Neurospora kiểu hoang dã bằng tia X có tác động như là chất gây đột biến (mutagen). Khi họ khảo sát nấm mốc được chiếu xạ, họ thấy rằng một số các chúng đột biến có thể sinh trưởng không được lâu trên môi trường tối thiểu, cẩn phải cung cấp dinh dưỡng bổ sung. Các nhà khoa học đã giả thuyết rằng, các chủng khuyết dưỡng (auxotrophs - "increased eaters") ấy đã phải trải qua các đột biến ở trong gen vốn đã mã hoá đối với các enzym được sử dụng để tổng hợp các chất dinh dưỡng, bây giờ chúng cần được thu nhặn từ mói trường. Đối với mỗi chủng khuyết dưỡng (auxotrophic train), Beadle và Tatum đã phát hiện một hợp chất đơn mà khi được cho thêm vào môi trưcmg tối thiểu, chủng nấm đó đã duy trì được sinh trưởng. Kết quả ấy giả thiết rằng, các đột biến đã có được các hiệu ứng đơn và mỗi đột biến đã gây được khuyết tật chỉ trong một enzym trong một con đường trao đổi chất được mô tả như là giả thuyết mộI gen, một enzym (hình 1.2). V í dụ, một nhóm các chủng khuyết dưỡng (auxotrophs) chỉ có thể sinh trưởng nếu môi trường tối thiểu dược phụ thêm axit amin arginin. (Kiểu hoang dã Nenrospora tự nó tạo được arginin). Các chúng đột biến ấy được ký hiệu là các thể đột biến arg. Beadle và Tatum đã phát hiện dược một vài chủng đột biến arg khác biệt. Họ đã giả định hai giả thuyết chọn thay thế để giải thích vì sao các chủng di truyền khác biệt như thế lại có cùng kiểu hình: 1) Các thế đột biến arg khác biệt có thể đã có những đột biến trong cliinh gen đó, như trong trường hợp các alen màu mắt của ruổi giấm (Drosophila). Trong trường hợp đó, gen có the mã hoá dối với một enzym liên quan trong lổng hợp arginin. 2) Các thê dột biến arg có thể có các dột biến Irong các gen khác biệt, mỗi một mã hoá 12 đối với các chức năng tách biệt vốn dẫn đến sự hình thành arginin. Các chức năng không phụ thuộc ấy có thể phải là các enzym khác nhau theo cùng con đường hoấ sinh. Một số các chúng thể đột biến rơi vào một trong hai loại. Sự bắt chéo di truyền chỉ ra ràng, một số các đột biến là ở cùng locus (ổ gen) và do vậy là các alen khác nhau của cùng gen. Các dột biến khác là ở các quần cư (loci) tương ứng khác nhau, hoặc trẽn các nhiêm sắc thể khác nhau, do vậy đã không phải alen của cùng gen. Beadle và Tatum kết luận rằng, những gen khác biệt ấy tham gia vào sự điểu phối con đường tổng hợp đơn, trong trường hợp này là con đường dẫn đến tổng hợp arginin (xem kết luận trong hình 1.2). Thực nghiệm Cảu hỏi: Quan hệ giữa các gen và các enzym trong con dưòrtg hoá sinh là g ì? Phương pháp Cho các bào tử cùa mỗi chủng đột biên lèn mõi trường tối thiểu (mm) không có chất bổ sung; mm + arginin; mm + xitrulin và mm+ ornithin. Kết quả Kiểu hoang dã sinh trường trẻn r Ị g t n d l l i » 1 ^ ẲTất cả các chủng đột biến Các chất bổ sung vào môi trường tối thiểu sinh trường nếu bổ sung axit amin arginin (các chủng dã chọn vi chúng cẩn arginin). mọi môi trường: vi nó có the tổng ỉ hợp được arginin của nó. Chùng dột biến 1 chi sinh trưởng trên arginin, nó không có thể biến đổi hoặc xitrulin hoăc ornitin thành arginin. Chủng đột biến 2 sinh trường hoặc arginin hoặc xitrulin, nó có thể biến đổi xitrulin ttìành arginin, nhưng không thể chuyển đổi ornitin. Chủng dột biến 3 sinh trưòng khi môt trong ba thành phần phụ đuạc bổ sung. Nó có thể biến ornitin thành xitrulin và xitrulin thành arginin. Giải thích Nếu cơ thể không chuyển hoá một hợp chất rièng thành một chất khác, nó có lẽ thiếu enzym cán cho sự chuyển hoả và sự đột biến trong gen vỏn ghi mã đỏi với enzym dó. — — — i!i* i I 1 — — —h— I ĩ*'7 I 8 v I ! v_y XS' 1 Chủng 3 bị Chủng 2 bị Chủng 1 bị chặn tại chặn tại chặn tại bước này bước này bước này Tiền chất Omllhli.* @ EEE>niiuUin. 1 1 t Gen A Gen B Gen c Kết luận: Sự tổng hợp arginin xảy ra như thế. Mồi gen chuyên biệt một enzym riêng. Hinh 1.2. Một gen, một enzym Beadle và Tatum đã nghiên cứu một số các đột biến arg của Neurospora. Các chủng đột biến arg khác nhau đòi hỏi phải bổ sung các hợp chất khác nhau để tổng hợp arginin cẩn cho sinh trưởng của chúng. Đảy là hình minh hoạ giả thuyết "một gen, một enzym" (Theo W.K. Purves et al., 2008). 13 Do các thể đột biến sinh trưởng trong sự hiện hữu của các hợp chất khác nhau, đã có sự nghi ngờ rầng, chúng là các hợp chất trung gian trong con đường trao đổi chất tổng hợp đối với arginin. Beadle và Tatum đã phân loại mỗi đột biến như là ảnh hưởng một enzym, hoặc enzym khác và điều phối các hợp chất dọc theo con đường. Sau đó họ kiểm tra hoạt tính enzym của các tế bào chủng đột biến và kiểu hoang dã. Kết quả đã khẳng định giả thuyết của họ: mỗi một chủng đột biến thật sự mất enzym hoạt tính đơn trong con đường (trao đổi chất). Theo Purves et al., 2008, sự liên kết gen - enzym đã được đề xuất từ lâu, trong năm 1908, bác sĩ nội khoa Scotlen Archibald Garrod, người đã nghiên cứu bệnh di truyền cùa người alcapton - niệu (alkaptonuria). Ông gắn kiểu hình hoá sinh của bệnh vào một gen dị thường và enzym mất. Ngày nay, chúng ta đã biết được hàng trăm ví dụ về bệnh di truyền như vậy. Khái niệm về quan hệ gen - enzym đã trải qua một số các biến đổi dưới ánh sáng của kiến thức về sinh học phân tử. Nhiều enzym được cấu thành từ nhiều hơn một chuỗi polypeptit hoậc đơn phân (tức là chúng có cấu trúê bậc bốn). Trong trường hợp này, mỗi chuỗi polypeptit là được chuyên biệt bởi gen tách biệt chính nó. Như vậy, một cách chính xấc hơn cần nói: quan hệ một gen, một polypeptit; chức năng của gen là điều phối sự sản xuất ra polypeptit đơn, chuyên biệt. Vẻ sau, đã phát hiện được rằng, một sô' gen mã hoá các dạng A R N vốn không thể được dịch thành polypeptit và rằng còn những gen khác đã liên quan trong việc điều phối các trình tự ADN nào khác được biểu hiện. Trong khi dó, các phát minh mới đã thay thế ý tưởng rằng, tất cả các gen mã hoá protein, chúng không làm mất quan hệ giữa gen và polypeptit. Nhưng quan hệ ấy hoạt động bằng cách nào - có nghĩa là bằng cách nào thông tin được mã hoá trong AD N được sử dụng để chuyên hoá polypeptit riẽng biệt? 1.1.2. ADN, ARN và dòng thõng tin Sự biểu hiện của gen để hình thành polypeptit diễn ra trong hai bước lớn: 1) Phiên mã: sao chép (copy) thông tin của trình tự AD N (gen) thành thông tin tương ứng trong trình tự ARN . 2) Dịch mã: chuyển trình tự AR N đó thành trình tự các axit amin của polypeptit. a) A R N k h á c với A D N ARN là chìa khoá trung gian giữa ADN và polypeptit. A R N (axit nucleic) là polynucleotit tương tự đối với AD N (hình 1.3), nhưng khác với AD N trong ba cách: - Nhìn chung A R N gồm chỉ có một sợi polynucleotit. - Phân tử đường được phát hiẽn trong ARN là ribose, thay cho deoxyribose được tìm thấy trong ADN. - Ba trong số các bazơ nitơ (adenin, guanin và xytoxin) trong ARN là tương tự với các bazơ trong ADN, bazơ thứ tư trong ARN là uraxin (U), vốn là giống với thymin nhưng thiếu nhóm metyl (-C H 3). 14 H H Thymin Uraxịn ARN có thể cặp đòi bazơ với sợi đơn ADN. Sự cặp đôi ấy tuân theo đúng các quy tắc cặp đôi như trong ADN, ngoại trừ adenin cặp đôi với uraxin thay thế cho thymin. Sợi đơn ARN có thể gấp cuộn thành các hình dạng phức tạp bằng cách cặp đôi bazơ bên trong. b) Thòng tin truyền theo một hướng khi các gen được biểu hiện Chẳng bao lâu sau, Watson đã đề nghị cấu trúc ba chiều đối với ADN, Francis Crick đã cân nhắc vấn đề bằng cách nào ADN quan hệ chức năng đối với protein. Điều đó dẫn ông đến giả định điều mà được óng gọi là giáo lý trung tâm của sinh học phân tử. Giáo lý trung tâm được phát biểu một cách đơn giản rằng, ADN ghi mã để sinh ra ARN , A R N ghi mã để sinh ra protein và protein không ghi mã cho sự sản sinh protein, ARN hoặc ADN (hình 1.4). Trong các phát biểu của Crick "một khi 'thông tin' đã chuyển thành protein, nó không thể lộ ra một lẩn nữa". Thứ tự cacbonARN ( sợi dơn) ADN (sợi kép) Trong ARN, các base được gắn vào ribose. Các bazơ là các purin adenin (A), guanin (G) và các pyrimidin xytosin (X), uraxin (U). Trong ADN, các bazơ được gắn vào deoxyribose. Bazơ thymin (T) được phát hiện thay cho uraxin. Các liên kết hydro giữa các purin và cảc pyrimidin nối hai sợi ADN lại với nhau. Hình 1.3. Những dặc trưng khác biệt giữa ADN và ARN ARN thường là một sợi đơn. ADN thường gổm hai sợi chạy theo các hướng ngược nhau. Giáo lý trung tâm nêu ra hai câu hỏi: * Bằng cách nào Ihông tin di truyền được chuyển từ nhân vào tế bào chất? (như đã biết hầu hết AD N của tế bào có nhân (eukaryote) được giữ ở trong nhân, nhưng các protein được tổng hợp trong tế bào chất). * Quan hệ giữa các nucleotit đặc hiệu trong ADN và trình tự axit amin đặc hiệu trong protein là gì? 15 Thông tin được mă hoá trong trình tự của Thông tin trong ARN đã được truyền đến các căp bazơ trong ADN đã được truyền các protein. Thông tin đó chảng bao giờ đến các phân tử ARN truyển từ protein đến axit nucleic. Hình 1.4. Giáo lý trung tàm. Dòng thông tin từ ADN đến ARN đến protein như được chỉ ra trên hỉnh Để trả lời các câu hỏi đó, Crick để nghị hai giả thuyết: G iá thuyết truyền tin và phicn mã: Để trả lời câu hỏi thứ nhất, Crick và các cộng sự của ông đã đề nghị giá tlniyết truyền tin. Các ông đã giá định rầng, phán tứ ARN tạo bán sao bổ sung của một sợi ADN của gen riêng biệt. Quá trình mà theo đó hình thành nên A R N như thế dược gọi là phiên m ã (hình 1.5). ARN truyền tin hoặc m A RN , sau đó di chuyển từ nhân vào tế bào chất, nơi nó phục vụ như là khuôn cho sự tổng hợp protein. Giả thuyết Crick đã được thử lặp lại đối với các gen vốn mã hoá protein và câu trả lời luôn luôn là như vậy: Mỗi trình tự gen trong AD N mã hoá ctio một protein được biểu hiện như là một trình tự trong mARN. G iá thuyết tiếp hợp và dịch mả: Để trả lòi cho câu hỏi thứ IDịch mã (Tổng hợp protein) (xem hình 1.10, 1.11, 1.12, 1.13, 1.14). Hình 1.5. Từ gen đến protein hai C ric k đề nghi g iá tliuyết tiếp Hinh này tóm lược các quá trình của sự biểu hiện gen trong tế * _ * , . báo íiển nhàn (prokaryote). Trong tế bao có nhan (eukaryote), hợp: ơ đo cân co phãn tư tiêp hợp quà (rinh có phẩn phức tạp hơn (hình 1.29). vốn có Ihể gấn axit amin đặc hiệu tại một vùng và nhận biết trình tự của các nucleotit tại vùng khác. Sau này, các chất tiếp hợp ấy đã được định rõ và được gọi là A R N vận chuyển hoặc tARN. V ì chúng nhân ra thông tin di truyền của mARN và đổng thời mang axit amin đạc hiệu, tARN có thê dịch ngôn ngữ cùa ADN thành ngôn ngữ cùa các protein. Chất tiếp hợp tARN xếp hàng nôi đuôi nhau trên mARN, do vậy các axit amin là ờ vào trình tự đúng đối với chuỗi polypeptit đang lớn một quá trình gọi là dịch mã (hình 1.5). Một khi lặp lại, cấc quan sát thực tế về sự biểu hiện của hàng nghìn gen đã khẳng định già thuyết rằng, tARN hoạt động như là chất trung gian giữa thông tin của trình tự nucleotit trong mARN và trình (ự axit amin trong protein. Tóm lược những đặc điểm chủ yếu cùa giáo lý trung tâm, già thuyết truyền till và giả 16 thuyết tiếp hợp, chúng ta có thê nói rằng, gen đã cho đã được phiên mã để sinh ra ARN truyền tin (mARN) bổ sung cho một trong các sợi ADN và rằng, các phân tử ARN vận chuyển (tARN) dịch trình tự của các bazơ trong mARN thành trình tự chính xác của các axil amin dược liên kết trong quá trình tổng hợp protein. ARN virut bién dổi Ị>iáo lý trung tâm: Một số virut xác định là các ngoại lệ hiếm hoi đối với lý thuyết trung tâm. Virul là các tiểu phẩn lây nhiễm vốn sinh sản bên trong các tế bào. Nhiều virut như virut khảm thuốc lá, virut bệnh cúm (influenza) và virut gây bệnh bại liệt (poliovirus) có ARN thay cho ADN như là vật chất di truyền. Với trình tự nucleotit của nó, có thể có tiềm năng hoạt động như là một chất mang thông tin và có thể được biểu hiện thành protein. Nhưng vì ARN thưòng là sợi đơn, sự lái bán cùa nó là một vấn đề. Nói chung, các virut giải quyết vấn đề đó bới sự phiên mã từ ARN đến A RN , tạo nên một sợi ARN, điều đó có nghĩa là bổ sung cho bộ gen (genome) của chúng. Sau đó, sợi đối nghịch như thế được dùng để tạo các đa bản sao của bộ gen (genome) virut bòi sự phiên mã: Virut gây thiếu hụt miễn dịch ờ người (H IV) và một số virut u bướu hiếm nhất định cũng có ARN là bộ gen (genome) của chúng, nhưng không tái bản nó như ARN thành ARN. Sau khi gây nhiễm tế bào chủ, chúng thực hiện bản sao AD N bộ gen của chúng và dùng nó tạo nhiểu hơn ARN. Sau đó ARN ấy được dùng như là các bộ gen để sao chép nhiều hơn của virut và nhu là mARN để sản ra các protein virut. ADN ARN Protein Sự tổng hợp AD N từ A R N được gọi là phiên m ã ngược và không ngạc nhiên, những virut như thế được gọi là retrovirus (virut retro). 1.1.3. Phiên mã: ADN điểu khiển sự tổng hợp ARN Mặc dầu các virut ARN đặt ra sự biến đổi của lý thuyết trung tâm, sự Ihực vẫn là như vậy trong các tế bào tiền nhân (prokaryote) và có nhân (eukaryote), sự tổng hợp A R N được điều khiển bởi ADN. Sự phiên mã - hình thành A R N đặc hiệu từ ADN đặc hiệu - đòi hỏi một số thành phẩn: 1) Khung ADN đối với cập đôi bazơ bổ sung. 2) Các triphosphat ribonucleotit thích hợp (ATP, GTP, XTP và UTP) để hoạt động như là các cơ chất. 3) Enzym, A R N polymerase. Bẽn trong mỗi gen, chỉ có một trong hai sợi ADN là sợi khuôn được phiên mã. Sợi khác, sợi ADN bổ sung, được ám chỉ như là sợi khõng làm khuôn, không được phiên mã. Đối với các gen khác nhau trong cùng phân tử ADN, các sợi khác biệt có thể được phiên mã. Có nghĩa là sợi vốn là không làm khuôn trong mội gen có thể trớ thành sợi khuôn trong gen khác. Không chỉ mARN được sinh ra bởi phiên mã. Quá trình như thế chịu trách nhiệm đối với sự tống hợp lARN (ARN vận chuyên) và rARN (ARN ribosom), vai trò quan trọng của các ARN này sẽ được mô là bèn dưới. Tương tư với các Dolypeptit, các ARN ấy được mã hoá bới các gen đặc hiệu. 2-GTSNHHOCPT 17 Trong sự tái bản A D N , như đã biết, hai sợi của phân từ mẹ tháo xoắn và mỗi sợi phục vụ như là khuôn đúc sợi mới. Trong phiên mã, A D N tháo xoắn từng phần, do vậy nó cộ thể phục vụ như là khuôn cho sự tổng hợp A R N . V ì A R N phiên mã (tiền A R N , A R N sơ khai) đã được hình thành và tách ra, cho phép A D N được tái xoắn thành xoắn kép (double helix) như trên hình 1.6. Trên hình 1.6, phiên mã có thể phân biệt thành ba quá trình: khởi đẩu, kéo dài và kết thúc. Bây giờ chúng ta nghiên cứu lẩn lượt mỗi quá trình trong chúng. ARN polym erase gắn vào gen Khởi đẩu và bắt đẩu tháo xoắn các sợi ADN. ARN polỵmera^e Sợi bổ sung. ✓ Nơi khởi dầu Tái xoắn Sại khuôn / Tháo xoắn ADN Gen khỏi dấuARN polymerase đọc sợi khuôn ADN từ 3’ dến 5' và sinh ra ARN sơ khai bởi thèm các nucleotit vào đáu 3' Khi ARN polymerase đạt đến nơi kết thúc, sợi ARN phién mã Kết thúc Hỉnh 1.6. ADN được phiên thành ARN ADN thảo xoắn từng phần để làm khuôn cho tổng hợp ARN. ARN phiên mã (tiền ARN, ARN sơ khai) được hinh thành và sau đó tách ra khỏi khuôn, cho phép ADN đã được phiên mã tái xoắn thành xoắn kép. Ba quá trinh khác biệt: khởi đấu, kéo dài và kết thúc - lạo nên sự phiên mã ADN. ARN polymerase thực ra phải lớn hơn so với ỏ trèn hinh, che phủ khoảng 50 cặp bazơ (Theo w. K. Purves et al., 2008). 18 a) S ự k h ở i đ ầ u p h iê n m ã đ ò i h ỏ i g e n k h ỏ i đ ầ u và e n zy m A R N p o ly m e r a s e Khơi đầu bắt dáu phiên mã và đòi hỏi gen khởi đầu (gen khới động, một trình tự đặc hiệu của ADN, nơi A R N polymerase gắn vào rất chặt. Ở đấy có ít nhất là một gen khới đẩu đôi với mồi gen, hoậc như trong các cơ thể tiền nhân (prokaryotes, mỗi tập hợp các gen). Các gen khới đẩu là các trình tự điẻu phối quan trọng vốn "tiết lộ" ba điểm: - Nơi bắt đẩu phiên mã. - Sợi nào của AD N đê dọc mã. - Hướng tiến triển từ điểm bắt đầu. Gen khỏi đẩu là trình tự đặc hiệu trong AD N vốn đọc các hướng riêng biệt, định hướng ARN polymerase và như vậy hướng nó vào sợi chính xác để dùng làm khuôn. Các gen khởi đấu hoạt động có phẩn giống với các dấu chấm chấm vốn xác định trình tự của các từ được đọc như thế nào để thành câu. Phẩn của gen khởi đầu là vị trí khỏi đáu, nơi bất đầu phiên mã. Xa hơn hướng đến đầu 3' của gen khởi đầu định vị các nhóm của các nucleotit vốn giúp ARN polymerase gắn kết. A R N polymerase chuyển dịch theo hướng 3’ đến 5' dọc theo sợi khuôn (hình 1.6). Măc dầu mỗi gen có vùng khởi động; không phải tất cả các vùng này là y hệt nhau. Một số các vùng khởi đầu là hiệu quả hơn khi khởi đẩu phiên mã so với các vùng khác. Hơn nữa có những khác biệt giữa sự khởi đầu phiên mã trong prokaryote và trong eukaryote (tìm hiểu về các khác biệt này trong các mục sau của sách và trong các sách về di truyền, hoá sinh hoặc sinh học phân tử). b) m A R N p o ly m e r a s e k éo d à i sợ i p h iê n m ã ( tr a n s c r ip t) Một khi ARN polymerase đã liên kết vào gen khởi đầu, nó bắt đầu quá trình kéo dài. Nó tháo xoắn AD N khoảng 20 cặp bazơ trong mỗi lần và đọc sợi khuôn theo hướng từ 3' đến 5' (hình 1.6). Tưcmg tự AD N polymerase, A R N polymerase thêm những nucleotit mới vào đẩu 3' cùa sợi đang lởn, nhưng không đòi hỏi mỗi (primer) để bắt đẩu. A R N mới kéo dài từ bazơ thứ nhất vốn tạo nẽn đẩu 5' của nó đến đầu 3' cùa nó. Như vậy, sợi phiên mã ARN là đối song song (antiparallel) vởi sợi ADN khuôn. Không giống với các AD N polymerase, các A R N polymerase không kiểm tra và điểu chình công việc của chúng. Các lỗi phiẽn mã xảy ra với tỷ lệ sai suất là một sai lầm đối với mỗi 10“ đến 10' bazơ, vì có nhiều các bản sao của A R N được thực hiện và vì chúng thường chỉ tổn tại tương đối ngắn, những sai lầm ấy không có tiềm năng gây hại như các đột biến trong ADN. c) P h iên m ã k ế t th ú c tạ i c á c tr ìn h tự b a zơ d ặ c b iệ t ARN polymerase “nói gì” để dừng cho thêm các nucleotit vào sợi phiên mã ARN đang lớn? Ngay khi các nơi khởi đẩu định rõ sự bắt đẩu phiên mã, các trình tự bazơ đặc biệt trong ADN định rõ sự kết thúc của nó. Các cơ chế kết thúc là phức tạp và có nhiều kiểu. Đối với một sô gen, sợi phiên mã mỏi được hình thành dễ dàng rời khỏi khuôn AD N và ARN polymerase. Đối với các gen khác, protein hỗ trợ đẩy sợi phiên mã tách rời ra. Trong prokaryote, nơi không có vỏ nhân (nuclear envelope) và các ribosom có thể ở bên cạnh nhiễm sắc thể, sự dịch mã m ARN thường bắt đẩu ở đẩu 5’ cùa m ARN trước khi phiên mã của phân tử m ARN được hoàn thành. 19 Trong eukaryote, tình hình phức tạp hơn: Thứ nhất, tồn tại sự phân cácli không gian của sự phiên mã (trong nhân) và sự dịch mã (trong tế bào chất). Thứ hai, sản phẩm đầu tiên cùa phiên mã là tiền m A RN (m ARN sơ khai) vốn dài hơn m A RN cuối cùng và cần phải chịu sự xứ lý (cắt nối) nhiều trước khi nó có thể được dịch mã. Những lợi thế của sự xử lý như vậy là: 1) Sự gắn mũ 5' bào vệ chuỗi A R N đang lớn khỏi bị RNase (ribonuclease) phân giải; 2) Nối đuôi poly - A có tác dụng bảo vệ chống lại Rnase, do vậy gia tăng độ ổn định cúa các phân tử m A RN Irong tế bào chất; 3) Cả poly - A và mũ 5' càn cho sự vận chuyển m ARN qua lỗ nhân; 4) Đuôi poly - A tăng hiệu quả dịch mã trên ribosom, nhu cấu của các m ARN eukaryote có cả mũ 5’ và poly - A đảm bảo chắc chắn rằng, chỉ có các chuỗi phiên mã đã dược xừ lý đúng thì mới đến ribosom và được phiên mã; 5) Qua sự cắt bò các iritron và nổi các exon lại với nhau tạo được nhiều m A RN từ 1 A R N phiên mã (tiền A R N , ARN sơ khai) và như vậy từ 1 gen, bằng cách cắt nối khác nhau đối với A R N phiên mã, hình thành nhiều polypeptit khác nhau, điều này góp phần vào sự đa dạng của các sinh vật có nhân (eukaryote). 1.1.4. Mã di truyền Bằng cách nào quá trình phiên mã và dịch mã sản sinh ra các protein chức năng và chuyên biệt? Các quá trình ấy đòi hỏi phải có m ã di truyền (genetic code) vốn liên kết các gen (ADN) đến m A RN và m A RN đến các axit amin của các protein. Mã di truyền chuyên hoá các axit am in nào sẽ được dùng dể kiến tạo protein. Chúng ta có thể so sánh thông tin di truyền trong phân tứ m A RN như là trình tự của loạt ba ”chữ cái" không trùng lặp. Mỗi trình tự cùa ba các bazơ nucleotit (bộ ba "chữ cái") dọc theo chuỗi chuyên hoá axit amin riêng biệt. Mỗi một bộ ba "chữ cái" được gọi là mã (di truyền). Mỗi mã là bổ trợ đối với bộ ba (triplet) tương ứng trong phân tử AD N từ đó nó được phiên mã. Như vậy, mã di truyền là các phương tiện của các mã liên quan đối với các axit amin chuyên biệt (đặc hiệu) của chúng. Mã di truyền hoàn chỉnh được dẫn ra trong hình 1.7. Nhận thấy rằng có nhiều mã hơn so với các axil amin trong các protein. Phối hợp bốn "chữ cái" (các bazơ) sẵn cho 64 (4‘) các mã bộ ba chữ cái khác biệt, vậy mà các mã bộ ba ấy chỉ xác định 20 axit amin. A U G , bộ ba ghi mã cho metionin, cũng là mả khởi đầu, tín hiệu bắt đầu dịch mã. Ba mã (U A A , U A G , UG A) là các mà dừng (mã kết thúc), hoặc các tín hiệu kết thúc sự dịch mã; khi bộ máy dịch mã đạt đến một trong các mã ấy, sự dịch mã dừng lại và chuỗi polypeptit rời khỏi phức hệ dịch mã. Sau khi mô tả các tính chất của mã di truyền, chúng ta sẽ kiểm tra một số ý tưởng khoa học và thực nghiệm vốn dẫn đến sự giải mã nó. a) M ã di truyền dư thừa nhưng không nhiều nghĩa (không m ơ hổ) Sau các mã khới đầu và mã dùng, 60 mã (bộ ba) còn lại là vượt xa so với số lượng dủ dế ghi mã cho 19 axit amin khác và quả thật ở đó có sự lặp lại. Như vậy chúng ta nói rằng, mã di truyén là dư thừa; và rằng một axit amin có thể tương ứng với nhiểu hơn một mã. Sự dư thừa (sự lặp lại) không được phân chia đểu đặn giữa các axit min. V í dụ, metionin và tryptophan là tương ứng chỉ vớimỗi một mã, trong khi đó leuxin lại là tương ứng với sáu mã khác nhau (hình 1.7). 20 Chư cái thứ hai u Ị I A 1 G 1 u u uuu uuxPhenyl alanin uxu uxx Serin U A U U A XTyrosin U G U U G XXyslein X X UUA UUG xuu xux XUA X U G Leucin Leucin U X A U X G xxu xxc XXA X X G A X U Prolin UAA U A C X A U X A X A A U A A X G A U Mä dừng Mã dừng Histidin Glutamin U C A HMH X G U X G X X G A X G G Mã dừng Tryptophan Arginin A G T T X A G u A G U U A U X A U A Isoleucin Metionin Mã khỏi đẩu A X X A X A A X G Threonin G A XAsparagin A G U A G X A A A AAG Lysin A G A AGG Serin Arginin X A G G G U U G U X GUA G U G Valin GXU G XX G XA G X G Alanin GAU GAX c a a I GAG Aspartic acid Glutamic acid GGU GGX GGA GGG Glycin u X A G Hình 1.7. Mã di truyền Thõng tin di truyền được mã hoá trong mARN trong các đơn vị ba chữ cái - mã bộ ba (codons), gồm các bazơ uraxil (U), xytoxin (xytosin, X), adenin (A) và guanin (G). Để đọc mã (dịch mâ, giải mã), tim chữ cái thứ nhất của nó trong cột bên trải, sau đó đọc ngang qua đỉnh đến chữ cái thứ hai của nó, rổi đọc xuống cột bên phài đến chữ cái thứ ba của nó. Định rõ mã axit amin được cho trong hàng tương quan. Ví dụ, các mã AUG đối với metionin và các mã GUA đối với valin. Không được nhầm lẫn thuật ngữ "dư thừa" với nghĩa mơ hồ hoặc tối nghía. Mã di truyền khỏng mơ hồ. Sự thừa trong mã có nghĩa là, ở đó có nhiều hơn một con đường đã rõ. Chắng hạn, "ở đó là leuxin". Nói một cách khác, axit amin leuxin đã cho có thể được ghi mã bởi nhiều hơn một mã, nhimg mã cần được ghi cho chỉ một axit amin. Điều đó cũng tương tự như trường hợp, khi con người ở tại các địa phương khác nhau chọn các cách khác nhau để nói về cùng sự việc - "tạm biệt!", "hẹn gặp lại!" và tương tự! - có cùng một nghĩa - các cơ thể khác nhau chọn mã này hoặc mã khác trong các mã dư thừa. b) M ã d i tru y ề n là (h ầ u n h ư ) v ạ ủ n ă n g Hơn 40 năm Ihực nghiệm trẽn hàng nghìn các cơ thể từ tất cả các miền và các giới sinh vật đã phái hiện ra rằng, mã di truyền xuất hiện gần như vạn năng, áp dụng đối với tất cả các loài irên hành tinh chúng ta. Như vậy mã phải là một mã cổ xưa vốn đã được duy trì nguyên vẹn trải qua sự tiến hoá của các cơ thể sống. Các ngoại lệ đã biết là: bên trong ty the và các lục lạp, mã có sự khác biệt nhỏ giữa mã trong prokaryote và trong nhân cùa các tế bào eukaryote: Irong một nhóm sinh vật nguyên sinh (sinh vật đơn bào), mã U A A và UAG dùng cho glutamin hơn là cho chức năng như các mã dừng (stop codons). Ý nghĩa của các khác biệt ấy hiện còn chưa lõ. Cái đã sáng tỏ là các ngoại lệ ít ỏi và bé nhỏ. Mã di truyền chung, có nghĩa là cũng có ngôn ngữ chung đối với sự tiến hoá. V ì rằng sự chọn lọc tự nhiên thế hiện kết quá trong một loài thay thế cho loài khác. Mã chung cũng đã có ánh hướng sâu xa đối với công nghệ đi truyền, như sẽ thấy ờ phần sau, từ đó có nghĩa làng, gcn người ớ trong cùng ngôn ngữ như gen vi khuẩn. Sự khác biệt là giống với trường 21 hợp có thổ ngữ cùa thứ ngôn ngữ đơn giản hơn là các ngôn ngữ toàn vẹn. Như vây, bộ máy phiên mã và dịch mã của vi khuẩn về mặt lý thuyết có thể sử dụng các gen từ người cũng như gen của chính nó. Các mã trong hình 1.7 là các m ã mARN. Trình tự bazơ trên sợi AD N vốn đã được phiên để sản ra m ARN là bổ trợ và đối song song đối với các mã đó. Thật vậy, ví dụ, 3' - A A A - 5’ trong sợi khuôn AD N tưcmg ứng với phenylalanin (vốn được ghi mã bởi mã mARN 5' - u u u - 3') và 3' - A X X - 5' trong AD N khuôn tương ứng với tryptophan (vốn được ghi mã bởi mã m ARN 5' - U G G - 3'). Bằng cách nào các nhà sinh học phân chia những mã ấy cho các axit amin chuyên biệt? c) G iả i m ã d i tru y ê n b ằ n g c á ch sủ d ụ n g c h ấ t tru y ề n tin n h ă n ta o Sự xác định được mã nào trong 64 mã bộ ba có khả năng ghi mã (mã hoá) mỗi axit amin riêng biệt là một trong những thắng lợi vĩ đại nhất của Hoá sinh học thế kỷ X X (Raven et al., 2010). Các nhà sinh học phân tử đã bé gãy mật mã di truyền trong thời gian những năm 1961 - 1966. Vấn đề gây bối rối là làm thế nào viết được hơn 20 từ mật mã ("code words") với "báng chữ cái" (Alphabet) gồm chỉ bốn "chữ cái"? Nói cách khác, làm sao bốn bazơ (A, u , G và X ) có thê ghi mã được hết 20 axit amin khác nhau? Rằng mã đã là mã bộ ba, dựa trên các mã ba chữ cái (A, G, X , U), mã một - rõ là không thể mã hoá 20 axit amin; nó có thể ghi mã (mã hoá) chỉ bốn trong chúng. Còn mã hai - chì chứa 4 x 4 = 1 6 mã - vẫn chưa đủ. Nhưng mã bộ ba có thể chứa đến 4 X 4 X 4 = 64 mã. Chừng đó đã là quá đủ để ghi mã 20 axit amin. Marshall w . Nirenberg và J. Malhaei, ờ Viện Y học Quốc gia Mỹ, dã mở ra con đường giải mã đầu tiên trong năm 1961 khi họ nhân thức được rằng, có thể sử dụng polynucleotit nhân tạo đơn giản thay cho mARN tự nhiên phức tạp làm chất truyền tin. Công việc thực nghiệm được hoàn thành lần đầu tại phòng thí nghiệm của Marshall Nirenberg dản đến sự sáng tỏ mã di truyền. Nhóm Nirenberg lần đầu tiên đã chỉ ra rằng, bổ sung phân tử mARN nhân tạữ poly - u (m ARN nhân tạo mà trong đó tất cả bazơ đểu là uraxil) vào các hệ thống tế bào tự do đã sản sinh ra polypeptit polyphenylalanin. V ì thế, u u u ghi mã phenylalanin. Tiếp theo, các nhà khoa học đó đã sử dụng các enzym để sản xuất ra các polyme A R N với nhiều hơn một nucleotit. Các polyme như vây đã cho phép họ suy luận ra thành phẩn cấu tạo của nhiều mã bộ ba có thể, nhưng không suy ra được trinh tự cùa các bazơ trong mỗi mã bộ ba. Sau đó, các nhà nghiên cứu đã sử dụng các enzym để tổng hợp các trình tự bộ ba bazơ xác định vốn đã có thể thử được đối với sự liên kết vào bộ máy tổng hợp protein. Cái gọi là sự kháo nghiệm liên kết bộ ba đã cho phép họ nhận biết 54 trong số 64 bộ ba có thể. Các nhà khoa học đã chuẩn bị m ARN nhân tạo được cấu tạo bời các bazơ uraxil (poly U). Khi poly Ư đã dược bổ sung vào ống nghiệm chứa tất cả các hợp chất cần cho sự tổng hợp protein (ribosom và tất cả các axit amin, các enzym đang hoạt hoá, các tARN, và các tác nhân khác). Polypeptit đã được tạo thành. Polypeptit ấy chỉ chứa một kiểu axit amin: phenylalanin (phe). Nirenberg và Mathael sử dụng hệ thống protein ống nghiệm đê xác định các axit amin được chuyên biệl bời các mARN tổng hợp của thành phẩn mã bộ ba đã biết. 22 Thực nghiệm Câu hỏi: Các axlt amln nào dược chuyên biệt bới các mã bộ ba uuu, AAA và XXX Phương pháp Kết quả (1) Chuẩn bị dịch chiết vi khuẩn chứa tất cả các thành phẩn cẩn để tao protein trừ mARN (2) Cho thôm mARN nhản tạo chứa chỉ một bazơ lăp lại (3) Polypeptit được sản ra chứa một axit amin đơn +f f g w w i + Kết luận: uuu là một mã mARN đối với phenylalanin (Phe). AAA là một mã mARN đối vói lysin (Lys). XXX là một mã mARN đối với prolin (Pro). Hinh 1.8. Giàr mã di truyền Poly u đã mã hoá cho polyphenylalanin. Một cách tưcmg ứng, u u u xuất hiện phải là chữ ghi mã mARN - mã đối với phenylalanin. Tiếp tục phát triển như vậy, Ninrenberg và Mathaei chẳng bao lâu sau đó chỉ ra rằng các mã X X X đối với prolin và A A A đối với lysin (hình 1.8). (Poly G đặt ra một số khó khăn hoá học và đã không được thử nghiệm từ đầu), u u u , X X X và A A A đã là ba của các mã dễ nhất; đã đòi hòi các cách tiếp cận khác nhau để thử nghiệm. vể sau, các nhà khoa học khác đã phát hiện rằng, các mARN nhân tạo chỉ dài ba nucleotit - rốt cuộc mỗi một ba nucleotit (bộ ba) cho một mã - có thể gắn vào một ribosom và ràng sau đó phức hệ kết quả có thể gây nên sự liên kết tARN tương ứng vối axit amin chuyên biệt. Như vậy, ví dụ, mã u u u dem làm cho tARN mang phenylalanin đến liên kết vào ribosom. Sau phát minh đó, hoàn thành sự giải mã cùa mã di truyển đã là tương đối đơn giản. Để phát hiện "sự dịch" mã, Ninrenberg đã có thể sử dụng mẫu của mã đó như là một mARN nhân tạo và biết được axit amin nào thích hợp liên kết vào nó (mARN). 1.1.5. Chuẩn bị cho sự dịch mã: C ác ARN liên kết, các axit amin và các ribosom Theo giả thuyết tiếp hợp của Crick đã được đề xuất, sự phiên mã m ARN thành các protein đòi hói một phân tử vốn liên kết ihông tin chứa trong các mã m ARN với các axit amin chuyên biệt trong các protein. Phân tử thực hiện chức năng ấy là tARN. Có hai sự kiện chìa khoá cần phải xảy ra để đảm bảo được rằng, protein được tạo nên là phân tử protein chuyên biệt bởi mARN: * tARN cần phải đọc chính xác mARN. * tARN cần phải mang đúng axit amin để đọc chính xác mARN. a) C ác A Ẹ N v ậ n ch u yển (tA R N ) m a n g cá c a x it a m in ch u yên b iẻ t (đ ặ c h iệu ) và liê n kết vào cá c d ơ n vị m ã ch u yên b iệ t (sp e cific codon) Đơn vị mã trong m ARN và axit amin trong protein là tương quan theo cách cùa chất tiếp hợp -tA RN chuyên biệt với một axit amin được gắn vào. Đối với mỗi một trong 20 axit amin, có lì nhất là một kiểu (loại) chuyên biệt của phân từ IARN. 23 Phân tử tARN có ba chức nãng: (1) mang (là "được nạp tải" với) một axit amin, (2) liên kết với các phân tử m A RN và (3) tương tác với các ribosom. Cấu trúc phân tử của nó liên quan rõ rệt với tất cả các chức năng ấy. Phân tử tA RN có khoảng 75 đến 80 nucleotit. Nó có cấu lùnli (dạng ba chiều) vốn được duy trì bởi các cặp bazơ bổ sung (các liên kết hydro) bên Irong trình tự cùa chính nó (hình 1.9). Giới thiệu sự sắp xếp không cấu trúc ba chiểu này Mô hinh "cỏ ba lá" bị ép gian đừợc máy tính tái tạo chĩ chĩ rõ các miền bên dẹt chì rõ căp bazơ giữa rỏ cấu trúc ba chiểu của tARN trong của căp bazơ. các nucleotit bổ sung Hình 1.9. ARN vặn chuyển Phản tử tARN gắn các axit amin, liên kết với các phân tử mARN và tương tác với các ribosom. Có ít nhất một phân tử tARN chuyên biệt đối với mỗi axit amin. Khi tARN được gắn vào một axit amin, nó được xác định như ià một tARN đã được nạp tải. Cấu hình riêng cùa phân tử tA RN cho phép phối hợp một cách đặc hiệu với vị tri gắn kết trên các ribosom. Từ đầu 3' của mỗi phân tử tA RN là nơi để axit amin liên kết cộng hoá trị vào. Tại khoảng điểm giữa của tA RN có một nhóm bộ bả bazơ, gọi là nhóm đối mà (anticodon), vốn là vị trí của cặp bazơ bổ trợ (liên kết hydro) với m ARN . Mỗi một loại tARN có một đối mã duy nhất vốn là bổ trợ cho mã m A RN đối với phức hợp axit amin - tARN ấy. Tại nơi tiếp xúc, mã và đối mã là đối song song với nhau. Như là một ví dụ cho quá trình đó, chúng ta xem xét axit amin arginin: - AD N ghi mã miền đối vối arginin là 3’ — G X X - 5’, vốn đã được phiên, bởi cặp bazơ bổ trợ (bổ sung), cho mã m A RN 5' - )£GG - 3'. - Mã m ARN ấy được liên kết bởi cặp bazơ bổ trợ cho tA RN với đối mã 3' — G X X - 5' vốn đã được nạp tải với arginin. Nhớ lại rằng, 61 mã khác nhau ghi mã (mã hoá) 19 axit amin trong các protein (xem hình 1.7). Phải chăng điểu ấy có nghĩa rằng, tế bảo phải sinh ra 61 các loại tARN khác nhau, mỗi một với đối mã khác biột? Không. T ế bào xoay xở với khoảng 2 - 3 số lượng của các loại tARN , vì tính đặc hiệu đối với bazơ tại đầu 3' của mã (và đầu 5' của đối mã) không phải luôn luôn nghiêm ngặt. Hiện tượng đó được gọi là linli hoại, cho phép, ví dụ, các mã alanin G X A , G X X và G X U , tất cả đều được cùng một tA RN nhận biết. Hiện tượng linh hoạt được phép trong một số cặp đôi, nhưng lại không Irong cặp đôi khác; điều quan trọng nhất là không cho phép mã di truyền trờ nên mơ hồ, tối nghĩa! b) H o a t h o á c á c e n zy m liê n k ế t d ũ n g c á c tA R N v à c á c a x it a m in (a a ) Sự nạp tải của mỗi tA RN với axit ainin đúng cùa nó đạt được nhờ họ các enzym hoạt 24 hoá, đã biết chính thức nhiều enzym như aminoaxyl - tA RN syntetase (hình 1.10). Mỗi enzym hoạt hoá là đặc hiệu đối với axit amin và đối với tA RN tương ứng của nó. Enzym có ba nơi hoạt tính bộ phận vốn nhận biết ba phân tử nhỏ hơn: axit amin chuyên biệt, ATP và tARN chuyên biệt. Enzym hoạt hoá axit amin, xúc tác phản ứng với A TP để tạo phức axit amin - AMP năng lượng cao Axit amin chuyên biệt nạp tải tARN đã được nạp tải sẽ giao axit amin thích hợp dể nổi vào sàn phẩm polypeptit đang lân của sự dịch mã. tARN chuyên biệt (chưa nạp tài aa) Sau đó enzym xúc tác phản ứng của axit amin đả được hoạt hoá với tARN đúng. Tính chuyên hoá của ehzym đảm bảo rằng axit amin đúng và tARN đã được mang đi cùng nhau. Hình 1.10. Nạp tải phân tửtARN Mỗi enzym hoạt hoá nạp tải tARN chuyẻn biệt với axit amin đúng. Như vậy, enzym là mối liên kết chủ yếu giữa axit nucleic và protein (Theo Purvez et al., 2008). Enzym hoạt hoá phản ứng với tARN và axit amin trong hai bước: Enzym + A TP + aa —► Enzym -A M P - aa + pp,. Enzym AM P - aa + tA RN —* Enzym + A M P + tA RN — aa Các axit amin gắn vào đầu 3' của tARN (vào nhóm O H tự do trên ribose) với liên kết Cao nãng, tạo nên tA RN đã nạp tải. Liên kết đó sẽ cung cấp năng lượng cho sự tổng hợp liên kết peptit vốn sẽ nối với các axit amin kế cận. Thực nghiệm thông minh của Saymour Benzer và các cộng sự của ông tại Viện Công nghệ California đã chứng minh tầm quan trọng của tính chuyên biệt (đặc hiệu) của mối liên kết giữa tARN với axit amin của nó. Trong phòng thí nghiệm của họ, axit amin xystein đã liên kết đúng vào tARN của nó, đã bị biến đổi về mặt hoá học để trở thành axit amin khác, alanin. Thành phần nào - axit amin hoặc tARN - sẽ được nhận biết khi tA RN nạp tải lai như vậy đã dược đưa vào trong hệ thống tổng hợp protein? Câu trả lời: tARN . Khắp mọi nơi trong protein được tổng hợp, nơi được cho rằng phải là xystein, thay vào đó alanin đã xuất hiện. Phức lA R N chuyên biệt - xystein đã giao phát tải (alanin) của nó cho mỗi "địa chỉ" mARN nơi đòi hỏi xystein. Thực nghiệm ấy đã chỉ rõ rằng, bộ máy tổng hợp protein nhận biết dối mã của tARN đã nạp tải (axit amin), chứ không phải axit amin gắn vào nó. 25 Nếu các enzym hoạt hoá trong tự nhiên đã làm cái mà Benzer đã làm trong phòng thí nghiệm và các tARN đã nạp tài với các axit amin sai, các axit amin ấy sẽ được cài vào bên trong các protein tại các điểm không thích đáng, dẫn đến sự thay thế trong chức năng và hình dạng của protein. Sự thật rằng, các enzym hoạt hoá là chuyên biệt cao dẫn đến quá trình nạp tài tARN được gọi là "ghi mã di truyền thứ cấp" (W .K. Purvez et al. 2008). c) R ib o so m là n a i d ịc h m ã Ribosom là cần cho sự dịch mã cùa thông tin di truyền trong m ARN thành chuỗi polypeptit. Mặc dầu ribosom là nhỏ bé so với các bào quan khác, khối lượng của nó là vài triệu dalton làm cho nó lớn so với các tARN. Mỗi ribosom gồm hai đcm phân, đơn phân lớn và đơn phân bé (hình 1.11). Trong cơ [hể eukaryote, đơn phân lớn gồm ba phân tử khác biệt của rA R N và 45 phân tử protein khác nhau được sắp xếp trong một hình mẫu chính xác. Đơn phân bé gồm một phân tử rARN và 33 phân tử protein khác nhau. Khi không hoạt tính trong dịch mã m ARN , các ribosom tồn tại như là các đơn phân tách biệt (Purvez et al., 2008). Nơi liệi| kết mARN Đơn phàn bé mARN Đdn phân lón đối Các ribosom có hinh dạng không Có bốn vị trí cho liên kết tARN. Các tương tác mă - đểu đăn và gổm hai đơn phân mã giữa tẢRN và mARN chì xảy ra tại các vị trí p và T. Hình 1.11. Cấu trúc của ribosom Mỗi ribosom gồm một đơn phân lớn và một đan phản bé. Các đan phân còn tách biệt khi chúng chưa được sử dụng cho sự tổng hợp protein (theo Purvez et al., 2008). Các ribosom trong cơ thể tiền nhân (prokaryote) có phần bé hơn so với ribosom trong eukaryote, đồng thời các protein ribosom và ARN là khác biệt. Ty thể và các lục lạp cũng chứa các ribosom, một số trong chúng tương tự với các ribosom của prokaryote. Các protein khác nhau và các rARN trong đơn phân ribosom được duy trì thành một tống thề nguyên vẹn nhờ lựe ion và ghét nước, không phải bằng các liên kết cộng hoá trị. V í dụ, nếu các lực ấy bị bè gãy bời các chất tẩy rửa, các protein và tA RN tách rời khỏi nhau. Khi các chất tẩy rửa bị loại bỏ, cấu trúc phức hợp nguyên vẹn tự tập hợp lại. Điẻu đó giống như sự tách các mẩu vật cùa trò chơi lắp hình và làm cho chúng phù hợp lại với nhau mà không có bàn tay con người dẫn dắt chúng! Một ribosom không thể sản ra ngay một protein chuyên biệt. Ribosom có thể sử dụng bất kỳ m ARN và tất cả các loại tARN đã nạp tải, và như vậy có thể sử dụng để tạo nhiều các sản phẩm polypeptit khác nhau. m ARN, như là trình tự đường thẳng của các mã bộ ba, cẩn phải Ihực hiện sự chuyên biệt các trình tự polypeptit; ribosom đơn giản như là cái bàn hoạt động phân tử, nơi nhiệm vụ được hoàn thành. Cấu trúc của nó làm cho nó giữ được m ARN và các tARN đã nạp tải (axit amin) ở các nơi đúng, điểu đó cho phép polypeptit đang lớn phải được tập hợp lại một cách có hiệu quả. ‘26 Trên đơn phân lớn cùa ribosom có bốn nơi cho tARN liên kết vào (hình 1.11). tARN đã nạp tải trượt ngang trong trật tự qua bốn nơi ấy: * T (vận chuyển, tiếng Anh: transfer) là nơi tARN lẩn đáu chạm vào ribosom, được hộ tống bới protein đặc biệt "escort" được gọi là T hoặc transfer (vận chuyển). * A (axit amin) là nơi đối mã cùa tARN liên kết vào mã cùa m ARN, theo cách đó xếp hàng các axit amin đúng để được bổ sung vào chuỗi polypeptit đang lớn. * p (polypeptit) là nơi tARN bổ sung axit amin của nó vào chuỗi polypeptit đang lớn. * E (exit, lối thoát) là nơi tARN, đang giao nộp axit amin của nó, cư trú trước khi rời bỏ ribosom và trở lại xytosol (tế bào chất) để nạp tải axit amin khác và bắt đầu lại quá trình. Các mối tương tác giữa mã và đối mã cũng như sự hình thành liên kết peptit xảy ra tại các nơi A và p, do vậy sẽ cần phải mô tà chức năng cùa các nơi đó trong phần tiếp theo. Vai trò quan trọng của ribosom là phải làm rõ rằng, các tương tác m ARN - tARN là chính xác: rằng tARN đã nạp tải với đối mã đúng (có nghĩa là 3' - U A X - 5') liên kết vào mã phù hợp trong m ARN (có nghĩa là 5' - A U G - 3'). Khi điều đó xảy ra, các liên kết hydro được tạo thành giữa các cặp bazơ. Nhưng các liên kết hydro ấy khống đủ đề giữ tARN tại chỗ. rA R N của đơn phân bé ribosom có vai trò trong việc chấp nhận sự chọn cặp đối bộ ba bazơ. Nếu các liên kết hydro không được hình thành giữa tất cả ba cập bazơ, tARN chắc là một bộ ba sai (không tương ứng) đối với bộ ba của m ARN và tARN bị đẩy ra khói ribosom. I Khài dẩu I Đơn phân bé (1) Đơn phân ribosom bé gán vào trinh 5 tự nhận biết của nó trôn mARN. Trình tự nhận biết ribosom (2) tARN đã nạp metionin gắn vào mả khỏi đẩu" AUG, hoàn thành phức hệ khỏi đẩu. 3 ’ (3) Đơn phân ribosom lón nối vào phức hệ khỏi dầu, với tARN đã nạp metionin bây giò chiếm vị trí p. 5' Hình 1.12. Khỏi đẩu dịch mã Dịch mã bắt đầu với sự hình thành phức hệ khởi đẩu (theo Purvez et al., 2008). 27 1.1.6. Dịch mã: ARN điều khiển sự tổng hợp polypeptit Quá trình biểu hiện gen trải qua các bưóc, theo đó trình tự của các bazơ trong sợi khuôn của phân tử AD N chuyên biệt trình tự cùa các axit amin trong protein (hình 1.5). Bây giờ chúng ta đang ở bưởc cuối: dịch mã, đó là quá trình lắp ráp protein. Tương tự phiên mã, dịch mã xảy ra trong ba bước: khởi đẩu, kéo dài và kết thúc. a) D ịch m ã b ắ t d ầ u với p h ứ c h ệ k h ở i d ầ u I Kéo dải I Sự dịch m ARN bắt đầu với sự hình thành phức hệ khởi dầu, vốn bao gồm tARN mang axit amin nào sẽ là dầu tiên cùa chuỗi polypeptit và dơn phân ribosom bé, cả hai được liên Nhận biết mã: Đôi mă của tARN đi vào liên kết với mả Đối mã kết vào mARN (hình 1.12). rARN của đơn phán ribosom bé liên kết vào tành lự nhận biết ribosom bổ trợ trên mARN. Trình tự ấy là "ngược dòng" dược lộ ra tại vị trí A N đáu cuối I tARN____ I đi vào A (hướng tới đầu 5’) cùa mã khởi đáu thực sự vốn bắt đầu dịch mã. Nhớ rằng, mã khới, đầu trong mã di Iruyền là A U G (hình 1.7). Đối mã tARN đã nạp tải metionin gắn vào mã khởi đầu ấy bới cặp bazơ bổ trợ để hình thành phức hộ khới đáu. Như vậy axit amin đầu tiên trong chuồi luôn là meúonin. Tuy nhiên không phải tát cả các piolein thành thục có metionin như là axit amin N - đầu cuối. Trong nhiều trường hợp, metionin khởi đầu bị cắt bỏ bới enzym sau khi dịch mã. Sau khi tARN nạp metionin đã gắn vào mARN, đơn phân lớn của ribosom nối phức hệ. Bây giờ tARN nạp tải metionin nằm ở vị trí p của ribosom và vị trí A được xếp thẳng hàng với mã m ARN thứ hai. m ARN với các thành tố ấy, hai đon phân ribosom và lARN nạp metionin đã được lấp ráp dúng bới nhóm các protein được gọi là các lác lĩlìân khởi dân (initiation factor). b) P o ly p e p tit kéo d à i từ d ầ u cu ố i N Hỉnh ỉhành liên kết peptit: Pro được gắn vào Met bời peptidyl transferase Kéo dài: tARN tự do được giải phóng ra khỏi vị trí p và ribosom chuyển dịch một mã (bộ ba), do vậy peptit dang lớn chuyển đến vị trí p. tARN tự do được giải phóng đi qua vị trí E Quá trinh lặp lại: biết mả. hinh thành peptit và kéo dài Hình 1.13. Dịch mã: Giai đoạn kéo dài: Chuỗi peptit kéo dải ra vì đang dịch mã mARN tARN dã nạp tài, mà dối mã (anticodon) của nó là bổ trợ cho mã thứ hai trẽn mARN. bây giờ tiến vào vị trí A mớ của dơn phân ribosom lớn (hình 1.13). Sau đó đơn phân lớn xúc tác hai phản ứng: 28 * Nó bè gãy liên kết giữa tARN trong vị trí p và axit amin của nó. * Nó xúc tác sự tạo thành liên kết peptit giữa axit amin vừa được tách ra đó và axit amin đã được tiên kết vào tARN trong vị trí A. V ì lằng đơn phân lớn đã hoàn thành hai hoạt động như thế, rõ là phái có lioạt línli peplidyl transferase. Theo cách đó, metionin (axit amin ở vị trí P) trớ thành đầu cuối N của protein mới. Bây giờ axit amin thứ hai gán vào metionin, nhưng vẫn nối với tARN của nó bới nhóm cacboxyl (- COOH) của nó ớ vị trí A. c đầu cuối Sản phẩm polypeptit dược giải phóng: Tác nhân giải phóng tách tARN khỏi nơi p và ngắt polypeptit. N đ ầ u CUỐI Iỉằng cách nào đơn phân ribosom lớn xúc tác mối liên kết đó? Harry Noller và các cộng sự của Trường Đại học California tại Santa Cruz (1992) đã phát hiện ràng, nếu họ loại bỏ hầu hết tất cả các protein trong đơn phân lớn, vân còn có xúc tác sự hình thành liên kết peptit. Nhưng nếu rARN đă bị hư hại, hoạt tính peptidyl transferase cũng đã bị hư hại. Phần của rARN trong đơn phân lớn tương tác với đầu của tARN đã nạp tải, nơi axit amin đã gắn vào. Như vậy rARN xuất hiện phái là chất xúc tác. Tinh huống như vây là rất không bình thường, vì rằng thông thường các protein là các chất xúc tác trong các hệ thống sinh học. Sự linh chế mới đây và sự tinh thể hoá các ri bosom đã cho phép các nhà khoa học kiểm tra tỉ mỉ cấu trúc của chúng và vai trò xúc tác cùa rARN trong hoạt tính peptidyl transferase đã được xác nhận (Purvez et al., 2008). ■occ -© © © © C H 3 2 S Mã dừng Tác nhân giải phóng gần phứd hệ khi mă dừng dến nơi A Đơn phàn lớn Các thành phẩn còn lại (mARN và đơn phân ribsom) tách rời nhau Hình 1.14. Kết thúc dịch mả Dịch mã kết thúc khi nơi A của ribosom bắt găp mả dừng (mả kết thúc) trên mARN. (Theo Pervez et al., 2008). c) T iếp tụ c sự kéo d à i và p o ly p e p tit lớn d ầ n Sau khi tARN thứ nhất giải phóng metionin của nó, nó lách khỏi ribosom, quay về lại xytosol (tế bào chất) để lại được nạp tải với metionin khấc. Bây giò tARN thứ hai mang dipeptit và chuyển dịch đến vị trí p vì ribosom đã dịch chuyển một mã bộ ba (one codon) dọc iheo mARN theo hướng từ 5' đến 3'. Quá trình kéo dài tiếp tục và chuỗi polypeptit lớn dẩn lên, vì các bước được lặp lại: * tARN ciã nạp tải liếp theo chuyển vào vị trí A mở. * Axil amin của nó tạo liên kết peptil với chuỗi axit amin ớ vị trí p, do vậy nó đón được chuỗi polypeplil dang kéo dài ra từ lARN ớ vị lrí p. 29 * tARN ở vị trí p được giải phóng. Ribosom dịch chuyển một mã (bộ ba), do vậy toàn bộ phức hệ polypeptit - tA RN , cùng với mã của nó, di chuyển đến vị trí p mới bỏ không. Tâì cả các bước như thế được các protein, gọi là các tác nhân kéo dài (elongation factors) trợ giúp. d) T á c n h â n g i ả i p h ó n g k ế t th ú c d ic h m ă Chu trình kéo dài kết thúc và kết thúc sự dịch mã khi mã dừng (stop codon) - U A A , U A G hoặc U G A - tiến vào vị trí A (hình 1.14). Các mã này không ghi mã các axit amin và cũng không liên kết các tA RN . Chúng gắn protein túc nhân giải phóng, vốn thuỷ phân liên kết giữa polypeptit và tA R N ở vị trí p. Protein mới được tổng hợp ngay sau đó tách ra khỏi ribosom. Đẩu cuối c của nó là axit amin cuối cùng nối vào chuỗi. Đầu cuối N cùa nó, trước tiẻn, là metionin, là trình tự của mã khởi đẩu A U G . Trong trình tự axit amin của nó có chứa thông tin chuyên hoá cấu hình cùa nó, cũng như đích tế bào cuối cùng của nó. Bảiig 1.1 tóm tắt các tín hiệu axit nucleic đối với sự khởi đẩu và kết thúc phiên mã và dịch mã' Bàng 1.1. Các tín hiệu khỏi đẩu và kết thúc sự phiên mã và dịch mã Phiên mã Dich mã Khởi đầu Trinh tự khởi động trong ADN Mã khởi đầu AUG trong mARN Kết thúc Trinh tự kết thúc trong ADN Mã dừng UGA hoặc UAG, UAA trong mARN e) Đ iê u h o à s ự d ịc h m ã Tương tự nhà máy, bộ máy dịch mã có thể hoạt động với tốc độ khác nhau. Sự biến động trong tốc độ dịch mã là có lợi cho sự kiểm tra số lượng protein hoạt tính trong tế bào. Một số các hoá chất bên ngoài được đưa vào, như một số chất kháng sinh, có thể làm ngừng dịch mã. Ngược lại, sự hiện diện của nhiẻu ribosom trẽn một m A R N có thể tăng tốc độ tổng hợp protein. - Một số chất kháng sinh và chất độc (các toxin) vi khuẩn hoạt dộng bảng cách ức chế dịch mả: Các chất kliáng sinh là các phân tử bảo vệ được các sinh vật như một số vi khuẩn và nấm sản sinh ra. Các chất ấy thường phá huỳ các vi khuẩn khác vốn có thể cạnh tranh vể dinh dưỡng. Từ những năm 1940, các nhà khoa học đã tách chiết được số lượng ngày càng tăng các chất kháng sinh và các bác sĩ nội khoa dùng chúng để điều trị các bệnh nhiễm trùng từ bệnh viêm màng não vi khuẩn đến viêm phổi, bệnh lậu. Chìa khoá mỡ đường cho việc áp dụng các chất kháng sinh vào y học là tính đặc hiệu: Chất kháng sinh có thể tác động phân huỷ vi khuẩn gây bệnh, nhưng không gây tổn hại cho người bệnh. Con đường mà theo đó các chất kháng sinh chống được vi khuẩn là phong toả sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn vốn thuộc cấu trúc chù yếu của vi khuẩn, nhưng không phải là phần hoá sinh của con người. Penixilin (penicillin) tác động theo con đường đó. Một con đường khác mà trong đó các chất kháng sinh hoạt động là ức chế loàn bộ sinh tổng hợp protein vi khuẩn. Nhớ rằng ribosom vi khuẩn là bé nhỏ và có các lập hợp khác nhau của các protein so với ribosom eukaryole. Một số chất kháng sinh chỉ gắn vào các protein ribosom vi khuẩn vốn là quan trọng trong tổng hợp protein. Mất khả nãng tạo protein, vi khuẩn nhiễm bệnh sẽ chết và sự nhiễm bệnh bị ngăn chặn. 30 Bàng 1.2. Các chất kháng sinh ức chẽ' tổng hợp protein (Theo Purvez et al., 2008) Chất kháng sinh Bước bi ức chế Chloromyxetin Hình thành các liên kết peptit Erythromyxin Chuyển chỗ của mARN dọc theo ribosom Neomyxin Tương tác giữa tARN và mARN streptomyxin Khởi đầu dich mã Tetraxyclin Liên kết tARN vào ribosom Paromomyxin Hiệu lực của cäp đôi mARN - tARN Một số vi khuẩn tác động lên người thông qua các cơ chế tương tự với cách chúng ta sử dụng chống lại chúng. Bệnh bạch hầu (diphtheria) là bệnh gây nhiễm của trẻ thơ và trước khi xuất hiện vacxin có hiệu nghiệm, nó đã là nguyên nhân lớn gây ra sự chết của tuổi Ihơ. Tác nhân nhiễm bệnh, vi khuẩn Cornybaclerium diphtheriae sản ra toxin gây chết cao, toxin này làm biến đổi và làm bất hoạt protein vốn là thiết yếu cho sự vận động của mARN và các ribosom trong tổng hợp protein eukaryote. - Sự hình thành polysom gia tăng tốc độ tổng hợp protein: Một số ribosom có thể hoạt động đổng thời dịch mã trên phân tử m A RN đơn, tạo ra các da phân tử protein tại cùng thời điểm. Ngay sau khi ribosom thứ nhất chuyển dịch đủ xa khói điểm khới đầu, phức hệ khởi đẩu thứ hai có thể hình thành, sau đó là thứ ba và tiếp theo như thế. Tập hợp gồm sợi m ARN với các ribosom giông chuỗi hạt của nó và các chuỗi polypeptit đang lớn được gọi là polyribosom hoặc polysom (hình 1.15). Các tế bào, vốn tích cực tổng hợp protein, chứa số lượng lớn các polysom và một ít ribosom tự do hoặc các đơn phân ribosom. (a) (b) Hình 1.15. Polysom a) Polysom gổm nhiều ribosom và các chuỗi polypeptit đang lân cùa chúng di chuyển trong sợi đơn dọc theo phân tử mARN; b) Nhìn polysom dưới kinh hiển vi điện tử. (Theo Purvez et al., 2008). Sự tổng hợp protein có thể bị ức chế bởi các chất kháng sinh và tãng tốc độ bằng con đường polysom, đó không chỉ là các cách mà có thể điều phối được số lượng protein hoạt 31 tính trong tê bào. Sau khi protein được tổng hợp, nó có thể chịu sự biến đổi vốn có thể thay dối chức năng của nó. f) S ư d iê u h o à s a u d ic h m ã Trong các tế bào eukaryote, các polypeptit sau khi rời khỏi ribosom có thể phải di chuyển xa khỏi nơi tổng hợp trong tế bào chất, chuyển dịch vào các bào quan, hoặc thậm chí bị bài tiết ra khói tế bào. Thêm vào đó, các chuỗi polypeptit thường bị biến đổi bằng cách gắn thêm các gốc hoặc chất khác nhau vốn có vai trò chức năng. Trong phẩn này chúng la sẽ xem xét hai mặt sau dịch mã của sự tổng hợp protein. - C ác tín hiệu hoá học trong các protein điểu khiển chúng (các protein) tới các đích đốn trong tố bào: Hình 1.16. Các đích đèn của các polypeptit mái được dịch trong tê' bào eukaryote Các trình tự tín hiệu về các polypeptit mới được tổng hợp gắn vào các protein chất nhận đặc hiệu trên các màng ngoài của bào quan mả chúng được “chì định đến". Một khi protein đã liên kết vào nó (bào quan), chất nhặn tạo nên kênh trong màng và protein xâm nhập vào bào quan. Khi chuỗi polypeptit ra khỏi ribosom, nó cuộn xếp thành dạng (hình 1.18) kích thước ba chiểu. Cấu dạng như vậy được xác định bởi trình tự của các axit amin tạo nên protein, cũng như bới các tác nhân như là tính phân cực và điện tích của các gốc R của chúng. Cuối cùng, cấu dạng của polypeptit cho phép nó tương tác với các phân tử khác trong tế bào, như cơ chất hoặc chuỗi polypeptit khác. Thêm vào thông tin cấu hình như vậy, trình tự axit amin chứa "đánh dấu địa chỉ" chỉ rõ nơi trong tế bào, polypeptit phái đến. Mọi sự tổng hợp protein bắt đầu trên các ribosom tự do trong tế bào chất. Khi chuồi polypeptit được tạo thành, thông tin chứa trong trình tự axit amin cho nó một trong hai tập hướng dẫn (hình 1.16): * "Kết thúc sự dịch mã và phải rời tế bào chất". Những protein ấy được gửi đến nhẫn, ty thế, lạp thế hoặc là peroxisom, phụ thuộc vào địa chỉ trong tập hướng dẫn, hoặc không có hướng dẩn chuyên biệt như thế, chúng lưu lại trong xytosol (phần bào tan trong tế bào chất). * "Ngừng dịch mã, di chuyển đến lưới nội sinh chất (LN SC - E R ) và kết thúc sự tổng hợp tại dó. Sau dó sự tổng hợp protein được hoàn thành, các protein như thế có thể ở lại trong E R , hoặc dược gửi đến các lysosom bằng con đường thổ Golgi. Khi bị thay đổi. 32 chúng có thế được gửi đến màng sinh chất, hoặc khi không có các hướng dẫn chuyên biệt như vậy, chúng được bài tiết ra khỏi tế bào bằng các túi vốn bắt nguồn lừ màng sinh chất. - Noi đến: tê bào chất: Sau dịch mã, một số polypeptit đã được cuộn xếp có trình tự ngắn được biểu hiện của các axit amin vốn tác động như "mã thư tín" (postal "Zip code"), điều khiển chúng đến một bào quan. Các trình lự tín hiệu ấy hoặc là tại đầu cuối N, hoặc là bẽn trong chuỗi axit amin. V í dụ, trình tự sau đây diều khiển protein đến nhân: -Pro - Pro - Lys - Lys - Lys - Arg - Lys - Val - Chắng hạn, trình tự axit amin như thế có trong các protein histon liên kết với ADN nhân, nhưng không có trong các enzym chu trình axit xitric (chu trình Krebs) vốn được định cư trong ty thể. Các trình tự tín hiệu có cấu hình vốn cho phép chúng liên kết vào protein chất nhận đặc hiệu một cách thích đáng được gọi là các protein lắp ghép (docking proteins), trên màng ngoài cúa bào quan thích hợp. Một khi protein đã gắn được với chất nhận, chất nhận đó tạo nên kênh trong màng, cho phép protein ấy đi qua màng vào nơi đến bào quan cùa nó. Trong quá trình ấy, protein (hường không cuộn gấp bởi chaperonin, do vậy nó có thể lọt qua kênh, sau đó tái cuộn gấp thành cấu hình bình thường của nó (Purvez et al., 2008). 1) Tổng hởp protein bắt đầu trên các ribosom tự do (ribosom vốn không gắn vào ER), trình tự tin hiệu có trên chuỗi polypeptit. 2) Polypeptit gẳn vào tiểu phấn nhận biết tin hiệu và cả hai gắn vào protein chất nhận trong màng của ER. Tiểu phần nhặn biết tin hiệu Bên trong LNSC hạt Màng sinh chất mARN Bén trong tẻ' bào Protein chất nhận 4) Trinh tự tín hiệu được chuyển vào trong LNSC (ER). 5) Polypeptit tiếp tục dài ra. 3) Tiổu phần nhận biết tín hiệu được giải phóng. Trinh tự tín hiệu đi qua kênh ở trong màng. Enzym chuyển tín hiệu 6) Dịch mã kết thúc. 7) Giải phóng ribosom. Protein được hình thành bên trong LNSC hạt Hinh 1.17. Trinh tự tín hiệu chuyển dịch polypeptit vào LNSC (ER) Khi trinh tự tín hiệu của các axit amin hiện diện tại khởi đầu của chuỗi polypeptit, polypeptit sẽ được nhận vào trong ER. Nhưvậy protein dã kết thúc được tổng hợp bị tách khỏi xytosol (phấn bào tan) trong tế bào chất. 3-GTSNHH0CPT 33 - Nơi den: lưới nội sinh chát (LN SC, Anh ngữ: endoplasmic retyculum - E R ). Nếu trình tự đặc hiệu ghét nước chứa khoảng 25 axit amin tại nơi khởi đầu của chuỗi polypeptit, trước tiên sản phẩm đã kết thúc được gửi đến E R và sau đó đến các lysosom, màng sinh chất hoặc ra khỏi tế bào. Trong tế bào chất, trước khi dịch mã kết thúc, trình tự tín hiệu gắn vào tiểu phần nhận biết tín hiệu (signal recognition particle) gồm protein và A R N (hình 1.17). Mối liên kết như thế phong toả sự tiếp tục tổng hợp protein cho đến khi ribosom có thể gắn được vào protein chất nhận đặc hiệu trong màng của LN S C hạt (rough ER ). Một khi lặp lại, protein chất nhận được chuyển đổi thành kênh, thông qua đó pcptil dang lớn di chuyển qua màng. Peptit đang lớn có thể tự nó được chứa trong màng E R , hoặc nó có thể xâm nhập vào không gian bẽn trong - xoang của E R . Hoặc trong một sô trường hợp, enzym trong xoang của E R chuyển trình tự tín hiệu ra khỏi chuỗi polypeptit. Tại điểm đó, sự tổng hợp protein lại tiếp tục và chuỗi dài ra hơn cho đến khi trình tự cùa nó được hoàn thành. Nếu protein đã được tổng hợp xâm nhập vào xoang của E R , nó có thể được vận chuyển đến các ngăn khác cùa tế bào hoặc ra khỏi tế bào, không trộn lần với các phân tử khác trong tế bào chất. Các lín hiệu bổ sung là cần thiết để chọn lọc protein tiếp theo (nhớ rằng trình tự tín hiệu vốn được gửi nó đến E R đã bị chuyển dời). Các tín hiệu ấy gồm hai kiêu: * Một số là các trình tự của các axit amin vốn cho phép giữ được protein bên trong ER . * Một số là các loại đường được bổ sung ờ trong các thể Golgi, mà các protein được vận chuyển trong các túi từ E R đến các thể Golgi đó. Kết quả là hình thành các glucoprotein kết thúc, hoặc tại màng sinh chất, hoặc trong lysosom (hoặc khỏng bào thực vật), phụ thuộc vào loại đường nào được bổ sung. Các protein với các tín hiệu bổ sung di chuyển từ E R qua thé Golgi và được bài tiết ra khói tế bào (William K . Purvez et al., 2008). Điểu đó là quan trọng để nhấn mạnh rằng, địa chì cùa protein tới nơi đến cùa nó là thuộc tính của trình tự axit amin của nó, vậy là được xác định vể mật di truyền. V í dụ về cái gì có thể sai lệch nếu gen mã hoá protein đích bị đột biến là m ucoplidosis II, hoặc bệnh tê' bào - 1 . Người mắc bệnh này thiếu enzym thiết yếu cho sự hình thành tín hiệu đích lysosom. Hậu quả là các protein được chỉ định đến các lysosom của chúng không bao giờ đến được đó, nhưng thay vì hoặc ở lại trong Golgi (nơi chúng tạo nên I, hoặc bao gộp, các hạt), hoặc được bài tiết ra khỏi tế bào. Thiếu các chức năng lysosom bình thường trong các tế bào của con người dẫn đến các bệnh tiến triển và chết ở thòi thơ ấu (Purvez, 2008). - Nhiều protein bị biến đổi sau dịch mã: Hầu hết các protein đã kết thúc hoàn Ihiện không giống với các chuỗi polypeptit đã được dịch từ m A RN trên ribosom. Thay vào đó, hầu hết các polypeptit được biến đổi sau dịch mã và các sự biến đổi ấy là thiết yếu đối với chức năng cuối cùng của protein (hình 1.18). xử lý sau dịch mã Sự phản giải protein [ì o Phân cắt polypeptit thành các ------- ( O ) l \ đo^n cu^n x®p thánh cá c hinh khẩc nhau Glycosyl hoá Gắn thêm đường là quan trọng đối với sự hướng đích và nhận biết - Phosphorin hoá Gắn thêm các nhỏm phosphat biến đổi hinh dạng của protein Hinh 1.18. Các biến dổi sau dịch mã dối với protein Hẩu hết các polypeptit bị biến đổi sau khi dịch mã và những biến đổi như thế là thiết yếu cho protein đã kết thúc tổng hợp đối với chức nãng thích hợp. Sự phân giải protein là sự cát chuỗi polypeptit. Cát các trình tự tín hiệu từ chuỗi polypeptit đang lớn trong LN SC (ER ) là ví dụ vể sự phân giải protein: protein có thể di chuyển ngược trở lại ra khỏi ER qua kênh trong màng nếu trình tự tín hiệu không bị cắt bỏ. Cũng vậy, một số protein thực sự đã đuợc tạo nẽn từ các polyprotein (các polypeptit dài) vốn đã được cắt vào trong các sản phẩm cuối cùng bởi các enzym gọi là protease. Các protease là thiết yếu đối với một số virut, bao gổm H IV , vì rằng polyprotein virut lớn không thế cuộn gấp một cách thích hợp nếu không bị cắt xén. Một số thuốc dùng để trị bệnh A ID S tác động bằng cách ức chế H IV protease, nhờ vậy ngăn chặn sự hình thành các protein cần cho sinh sản virut (hình 1.19). Hlnh 1.19. Chất ức chế protease HIV Sau khi xác định dược cấu trúc của protease HIV (trong hình: chuỗi polypeptit dạng lưới), protein thiết yếu đối với chu trinh sống của HIV, các nhà hoá sinh đâ thiết kẽ loại thuốc (mô hinh trám tồ trong râng) cho đúng vừâ vảo protease và phong toà hoạt động của nó. Nhiểu người chung sống với HIV và AIDS bây giờ dùng thuốc đó (Wiliams et al., 2008). Sự đường hoá liên quan với việc gắn phân tử glucose vào các protein. Trong cả E R và thể Golgi, các enzym định cư tại đó xúc tác gắn thêm các gốc đường khác nhau hoặc các chuỗi đường ngắn vào các nhóm R axit amin trên các protein khi chúng đi ngang qua. Một kiểu như "áo khoác đường" là thiết yếu đối với các protein đã có địa chỉ đến lysosom như đã được xem xét ở trên. Các kiểu khác là quan trọng trong cấu dạng và chức năng nhận biết đối với các prolein tại bể mặt của tế bào. Còn các gốc đường đã được gắn kết khác giúp ổn định các protein dự trữ trong các không bào dự trữ của các hạt thực vật. Phosphorin hoá, bổ sung các nhóm phosphat vào protein, được kích thích bới các enzym protein kinase. Các gốc phosphat tích điện gây biến đổi các tế bào đã có đích đến, thường phơi lộ vị trí hoạt tính của enzym, hoặc vị trí liên kết cho các enzym khác. 35 Tất cả các quá trình chúng ta vừa mô tả thể hiện kết quả chỉ trong protein chức năng nếu trình tự axit amin của protein ấy là chính xác. Nếu trình tự không chính xác sẽ dẫn đến loạn chức năng tê bào và bệnh tật. Các biến đổi trong AD N đột biến là nguồn lớn của các sai lệch trong các trình tự axit amin. Các đột biến là các biến đổi trong gen dẫn đến những kiêu hình dị thường trong phát sinh hình thái (phát triển). Các sách về Di truyền học đã đề cập về đột biến gen. Ớ đây chỉ dẫn ra ví dụ về những biến đổi rất nhỏ trong vật liệu di truyền đã ảnh hướng lớn đến kiểu hình. Một vài đột biến trong con người dẻ phát hiện - hiện tượng lùn. hoặc xuất hiện nhiều hơn năm ngón trên một bàn tay. Những đột biến khác cũng dẻ quan sát. V í dụ trong con người, đột biến đặc biệt làm giảm sút một cách ấn tượng mức cùa enzym glucose - 6 - phosphat dehydrogenase vốn hiện diện trong nhiều mổ, bao gồm các tế bào hồng cẩu. Các tế bào hồng cầu của người mang alen đột biến có nhạy cảm không bình thường đối với thuốc chống muỗi gây sốt rét, gọi là primaquyn. Khi những ngưòi như thế được xử lý với thuốc đó, các tế bào hổng cầu của họ bị vỡ. Những người với alen bình thường không có vấn đề như vậy (Purvez et al., 2008). Một kiểu gen đột biến trong vi sinh vật có thể hiển nhiên, nếu trong kết quả về sự biến đổi nhu cẩu dinh dưỡng, như được mô tả Irong hình 1.2. Sau khi đã điểm lại quá trình biểu hiộn gen, bây giờ chúng ta xem xét quá trình biéu hiện gen được diều hoà như thế nào? 1.2. ĐIỂU HOÀ Sự BIỂU HIỆN GEN Điều hoà sự biểu hiện gen là thiết yếu đối với tất cả mọi sinh vật. Trong các cơ thể tiền nhân (prokaryote), nó cho phép tế bào có được lợi thế trong các điều kiện môi trường biến đổi. Trong các sinh vật có nhân (eukaryote) đa bào, nó có tính quyết định đối với sự điều khiển quá trình phát triền và duy trì sự cân bằng nội môi (nội cân bằng). 1.2.1. Sự điều hoà thường xảy ra tại mức khởi đầu phiên mã Như đã trình bày trong mục 1.1, biểu hiện gen là sự chuyển đổi kiểu gen thành kiểu hình - đó là dòng thông tin từ AD N để sản sinh ra các protein với chức nãng điều phối các hoạt động cùa tế bào. Chúng ta có thể hình dung sự điều hoà quá trình ấy tại bất kỳ điểm nào dọc theo quá trình đó và sự thật là các ví dụ về sự điều hoà xảy ra tại hầu hết các bước. Tuy nhiên, lôgic nhất đối với sự điều hoà quá trình đó là tại nơi khởi đầu: sản sinh mARN từ AD N bời quá trình phiên mã. Bản thãn sự phiên mã có thể được điều hoà tại mọi bước, nhưng vùng khởi đẩu của phiên mã là phổ biến. ARN polymerase là chìa khoá để phiên mã, enzym này phải có lôi vào đến xoắn ADN và cẩn phái có khả năng liên kết vào miền khởi động để phiên mã bắt đầu. Các protein điểu hoà hoại động bàng cách biến đổi hoạt tính của ARN polymerase để liên kết vào miền khới động. Ý tướng ấy về sự điều khiển lối vào của A R N polymerase đến miền khởi động (gen khới động) là chung đối với cả prokaryote và eukaryote, nhung có khác biệt lớn về chi tiết. Các protein điều hoà ấy gắn vào các trình tự nucleotit chuyên biệt trên AD N vốn thường chỉ dài 1 0 - 1 5 nucleotit. (Thậm chí protein điểu hoà lớn có "dấu ấn", hoặc có vùng liên kết, cũng chỉ có 20 nucleotit). Đã đặc trimg được hàng trăm các trình tự điểu hoà như :ìb thế và mỗi một cung cấp nơi liên kết cho protein chuyên biệt vốn có khả năng nhận biết trình tự. Mòi liên kết cùa protein hoặc là pliong lod sự phiên mã nhờ vào con đường của ARN polymerase, hoặc kích tliícli sự phiên mã bằng cách tạo thuận lợi cho mối liên kết của ARN polymerase vào miền (gen) khởi động. 1.2.2. C ác chiến lược điều hoà trong prokarryote là tạo thích ứng đối với các biến đổi của môi trường Điều hoà sự biểu hiện gen được thực hiện theo cách rất khác biệt trong prokaryote so với trong eukarryote. Các tê bào prokarryote đã thích nghi qua tiến hoá đê sinh trướng và phàn chia nhanh chóng theo khá năng có thể, buộc chúng sử dụng các nguồn trung gian. Các protein trong piokaryote quay vòng nhanh, cho phép các cơ thể ấy phản ứng nhanh đối với sự biến dối của môi trường bên ngoài bằng cách biến đổi hình mẫu của biểu hiện gen. Trong prokaryote, chức năng đầu tiên của sự điều hoà gen là làm cho các hoạt động cùa tế bào thích ứng được với môi trường trực tiếp của nó. Nhũng biến đổi trong biểu hiên gen làm thay đổi các enzym nào vốn là đang hiện hữu trong phản ứng đối với kiểu và sô lượng của các chất dinh dưỡng sẵn có và hàm lượng ôxy. Hầu như tất cả các biến đổi ấy là hoàn toàn thuận nghịch, cho phép tế bào tạo sự thích nghi trong các mức độ enzym của nó tăng lén hoặc giảm xuống trong phản ứng đối với môi trường biến đổi. 1.2.3. C ác chiến lược điểu hoà trong eukarryote là duy trì sự cân bằng nội môi Ngược lại, cấc tế bào cùa các cơ thể đa bào qua quá trình tiến hoá đã thích nghi phải dược bào vệ khỏi các biến đổi trung gian trong môi trường sống trực tiếp của chúng. Hầu hết kinh nghiệm cúa chúng là ở trong các điều kiện khá ổn định. Đúng, cân bằng nội môi - duy trì môi trường bên trong ổn định - đã dược nhận xét bằng nhiều kiểm tra các cơ thể đa bào. Các tế bào trong nhũng cơ thể như vậy phản ứng đối với các tín hiệu trong mỏi trường trực tiếp cúa chúng (chẳng hạn, các tác nhân sinh trưởng, hormon) bời sự biến đổi biểu hiện gcn và bằng cách đó chúng tham gia vào việc điều hoà toàn bộ cơ thể nguyên vẹn. Một số những biến đổi như thế trong sự biểu hiện gen bù đắp cho các biến đổi trong điều kiện sinh lý của ihân thể. Các biến đổi khác làm trung gian những quyết định vốri sản sinh ra thân thể, đảm bảo rằng các gen đúng đã được biểu hiện trong các tế bào đúng và thời gian đúng trong phát triển. Chi tiết về vấn để này sẽ được trình bày trong các phần tiếp sau, nhưng bây giờ chúng ta có thê nói đơn giản rằng, sự sinh trưởng và phát triển cùa các cơ thê đa bào đòi hỏi một loạt dài các phản ứng, mỗi một được enzym đặc hiệu xúc tác. Một khi những biến đổi phát triển riêng biệl đã xảy ra, các enzym ấy ngừng hoạt động, vì sợ ràng chúng sẽ gây rối các sự kiện tiếp theo. Đế sản ra các trình tự enzym như vậy, gen được phiên mã theo trình tự phiên mã cẩn thận, mỗi trình lự được phiên cho một thời kỳ chuyên biệt, theo chương trình di truyền đã dược cô định, thậm chí, có thế dẫn lới sự chết tế bào đă được lập trình (apoptosis). Sự biểu hiện một lẩn cùa các gen vốn chi dần chương trình phát triển là sự khác biệt cơ bản với hoạt dộng điều chỉnh trao dối chát thuận nghịch mà các tế bào tiền nhân (prokaryote) thực hiện irong phản ứng đối với môi trường. Trong tất cả các cơ thể đa bào, các biến đổi trong biểu hiện gen bẽn trong các tế bào riêng biệt đáp ứng các nhu cẩu cùa cơ thể nguyên vẹn hơn là sự sõng sót của các tê bào cá thể. 37 Các cơ thế có nhân (eukaryote) đơn bào cũng sử dụng các cơ chế điểu hoà khác nhau từ các cơ chế như vậy của các cơ thể tiền nhân (prokaryote). Tất cà các cơ thể có nhân được màng bao bọc, sử dụng các cơ chế tương tự để sắp xếp AD N vào trong các nhiễm sắc thể và có cùng bộ mấy biểu hiện gen, tất cả đó khác biệt với các cơ chế ấy cùa prokaryote. 1.2.4. C ác protein điều hoà Khả năng cùa một sô' các protein gắn kết vào các trình tự AD N điều hoà chuyên biệt cung cấp công cụ cơ sở cùa sự điểu hoà gen. Để hiéu được bằng cách nào các tế bào kiểm tra sự biểu hiện gen, trước hết cẩn coi cơ sở cùa sự biểu hiện gen là chìa khoá mở khả năng có thể kiểm tra sự biểu hiện gen. Để hiểu được bằng cách nào các tế bào kiểm tra sự biểu hiện gen, trước hết cẩn có được bức tranh sáng tỏ cùa quá trình nhận biết. 1.2.4.1. Các protein có thế tương tác với ADN qua rãnh lớn (major groove) Trong quá khứ, các nhà sinh học phân tử đã có thể phân biệt một trình tự AD N với trình tự ADN khác, chỉ bằng cách suy luận, có thê các protein điều hoà có được lối vào đến các liên kết hydro của các nucleotit và các chất nhận có khả năng đi vào. Hình mẫu được tạo nên bới các nhóm hoá chất ấy là duy nhất cho mỗi một cùa bốn cách sắp xếp cặp bazơ có thê, điều hoà có được lối vào đến các liên kết hydro của các nucleotit và các chất nhận có khả nãng đi vào và cung cấp một con đường sẩn sàng cho protein náu mình trong rãnh để đọc trình tự của các bazơ (hình 1.20). Vị trí quan sát phản tử ADN ! phân tử ADN 2 Hỉnh 1.20. Đọc rãnh lón của ADN Nhìn vào rãnh lớn của xoắn ADN, chúng ta có thể thấy các mép của các bazơ nhô ra rãnh. Mỗi trong bốn sắp xêp câp bazơ có thể (hai được chỉ ra trong hinh) kéo dài tập hợp đơn các nhóm hoá chất vào trong rãnh, được chi rạ trong hinh bằng các vòng màu khác biệt. Protein điểu hoà có thể nhận biết sự sắp xếp các cãp bazơ nhờ tín hiệu đậc trưng ấy (Theo Raven et al., 2010). 1.2.4.2. Các miến liên kết - ADN tương tác với các trinh tựADN chuyên biệt (đặc hiệu) Sự nhận biết protein - AD N là lĩnh vực tích cực nghiên cứu; trong chừng mức như vậy, đã phân tích được cấu trúc cùa hơn 30 protein điều hoà. Mặc dầu mỗi protein có các chi tiết tinh tế riêng của nó, phẩn protein gắn kết hoạt tính vào AD N là ít biến đổi. Hầu như tất cả các protein sử dụng một trong các tập hợp bé nhỏ cùa các hoạ tiết liên kết - ADN. Hoạ tiết 38 (sự không tương tự, không đồng dạng giữa các protein khác nhau) là dạng của các đơn phân cấu trúc 3D (ba chiều) đã được phát hiện trong nhiểu protein. Những hoạ tiết liên kết - ADN như thế chia sẻ các đặc tính của mối tương tác với các trình tự chuyên biệt của các bazơ, thường qua rãnh lớn của xoắn ADN. Các hoạ tiết liên kết' - ADN là cấu trúc chìa khoá bên trong miền liên kết - ADN của các protein ấy. Miền đó là phần khác biệt chức năng cùa protein cần thiết để liên kết vào ADN trong kiểu đặc hiệu trình tự. Các protein điều hoà cũng cần để có khả năng tương tác với bộ máy phiên mã, vốn được đổng hành bới miền điểu hoà khác biệt. Nhận thấy rằng hai protein, vốn chia sẻ cùng miền liên kết - ADN không cần phải gắn vào cùng trình tự ADN. Các đặc điểm tương đồng trong các hoạ tiết liên kết - ADN xuất hiện trong cấu trúc ba chiều và trong các tiếp xúc đặc hiệu vốn chúng thực hiện với ADN. 1.2.4.3. Một sô'các hoạ tiết liên k ế t- ADN p h ố biến dược nhiều protein chia sẻ Sô lượng hạn chế của các hoạ tiết phổ biến đã được phát hiện trong hàng loạt các protein. Đã biết được chi tiết của bốn hoạ tiết liên kết - AD N sẽ được trình bày dưới đây tạo ra nhận thức: bằng cách nào các protein liên kết - ADN tương tác với ADN. a) H oạ tiế t x o ắ n - v ò n g - x o ắ n (helix - tum - helix motif) Hầu hết các hoạ tiết liên kết - ADN là xoán - vòng - xoán, được cấu tạo từ hai đoạn xoắn a của protein liên kết bởi đoạn không xoắn, ngắn, "vòng" (hình 1.21 ứ). Xem xét cẩn thận cấu trúc cùa hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn phát hiện ra: bằng cách nào các protein chứa các hoạ tiết như vậy tương tác được với rãnh lớn của ADN. Các đoạn xoắn của hoạ tiết tương tác với đoạn khác, do vậy chúng được giừ gần các góc phía phải. Khi hoạ tiết ấy bị ép vào ADN, một trong các đoạn xoắn (được gọi là xoắn nhận biết, ricognition helix) điều chỉnh sít sao trong rãnh lớn của phân tử ADN và đoạn xoắn khác áp sát phía ngoài của phân tử ADN, giúp đảm bảo được vị trí đúng của xoắn nhân biết. Háu hết các trình tự AD N được nhận biết bởi các hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn trong các cạp đối xứng. Những trình tự như vậy được liên kết bởi cấc protein chứa hai hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn tách biệt nhau bởi khoảng 3 - 4 nanomet (nm), khoảng cách đòi hỏi đối với một vòng của xoắn AD N như được ghi trên hình 1.21 a. Có hai vị trí liên kết AD N - protein gấp hai vùng tiếp xúc giữa protein và ADN và củng cố vững chắc mối liên kết giữa chúng. b) H oa tiế t d ồ n g m iề n (homeodomain motif) Một lớp chuyên biệt của các hoạ tiết xoắn - vòng — xoắn, hoạ tiết đồng miền, có vai trò quyết định đối với sự phát triển trong tính đa dạng rộng của cơ thể có nhân (eukaryote), kể cả loài người. Đã phát hiện ra các hoạ tiết như thế khi các nhà nghiên cứu bắl đầu đặc trưng một tập hợp các đột biến đồng nguồn (homeotic mutations) trong Drosophila (các đột biến gãy nên sự thay thế một phán cơ thể bởi phần khác). Các nhà nghiên cứu đã phái hiện dược ràng, các gen đột biến đã mã hoá các protein điều hoà. Bình thường các protein ấy sẽ khới đầu các giai đoạn chìa khoá (mở đường) của sự phát triển bời mối ltén kết vào các gen điếm chuyên đổi (công tắc). Đã phân tích được hơn 50 protein điểu hoà như thế, tất cả chúng đều chứa hầu như trình tự y hệt cùa 60 axit amin vốn được gọi là dồng miền. Phần 39 được báo toàn nhất của đổng miền chứa xoắn nhận biết của hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn. Phán còn lại của đổng miền tạo nên hai xoắn khác của hoạ tiết ấy. c) H oa tiế t n g ó n ta y k ẽ m (The zinc finger motif) Một kiểu khác biệt của hoạ tiết liên kết AD N sử dụng một hoặc nhiều hơn các nguyên từ kẽm đế phối hợp mối liên kết của nó vào ADN. Các hoạ tiết, được gọi các ngón tay kẽm, tồn tại trong một số dạng. Trong một dạng, nguyên tử kẽm liên kết một đoạn xoắn a vào một cấu trúc p (một cấu trúc mặt phẳng), do vậy đoạn xoắn phù hợp khít vào rãnh lớn của ADN. Loại hoạ tiết ấy thường tụ tập lại, các cấu trúc p cách quãng các đoạn xoắn do vậy mỗi xoắn tiếp xúc được rãnh lớn. Hiệu quả giống như bàn tay nắm quanh A D N với các ngón nằm trong rãnh lớn. Trong tụ tập có nhiều các ngón tay kẽm hơn, gia tăng các liên kết protein đến ADN. d) H oạ tiế t z i p p e r le u x in (The leucine zipper motif) Trong các hoạ tiết liên kết - AD N khác, hai đơn phân protein khác nhau phối hợp tạo nên vị trí liên kết - AD N đơn. Hoạ tiết như Ihế được tạo nên tại vị trí, nơi một vùng trên một đơn phân chứa một số axit amin ghét nước (thường là leuxin) tương tác với vùng tương tự trên một đơn phân khác. Mối tương tác như thế ghép hai đơn phân lại với nhau tại các vùng ấy, trong khi đó phần còn lại của các đơn phân vẫn còn tách biệt. Cấu trúc có hình dạng cúa chữ Y , với hai cánh tay của Y tồn tại các miền xoắn vốn vừa vặn vào rãnh lớn của ADN (hình 1.21 b) được gọi là zipper lcuxin. V ì rằng hai dơn phân có thể đóng góp các miền xoắn khác biệt hoàn toàn vào hoạ tiết, zipper leuxin tạo ra tính linh hoạt lớn trong sự điều hoà biểu hiện gen. a) Hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn (the Helix - Turn - Helix Motif) b) Hoạ tiết zipper leuxin (Leucine Zipper Motif) Hình 1.21. Các hoạ tiết liên kết - ADN lỏn Hai hoạ tiết liên kết - ADN khác biệt là bức hoạ mối tương tác với ADN. a) Hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn gắn vào ADN dùng một xoắn a, xoắn nhận biết, để tương tác với rãnh lớn. Xoắn khác bố trí xoắn nhận biết. Các protein với hoạ tiết như vậy thường là nhị phân, với hai đơn phản y hệt nhau, mỗi một chứa hoạ tiết - liên kết ADN Hai bản sao hoạ tiết là cách biệt nhau một khoảng 3,4nm, một cách chính xác khoảng cách của một vòng của xoắn ADN; b) Zipper leuxin hoạt động để sắp xếp hai đơn phàn cùng nhau vào trong protein đa đơn phản, bằng cách đó cho phép các vùng xoắn u tương tác với ADN (Theo Raven et al., 2010). 1.2.5. Sự điểu hoà biểu hiện gen ở cơ thể tiền nhản (prokaryote) Có thô làm lộ ra sự diều hoà bằng cách kiểm tra các cơ chế, vốn dược các cơ thể tiền nhân (prokaryote) sứ dụng dê điều phối sự khởi dầu phicn mà. Prokaryote và eukaryote 10 chia sé cùng các chủ đé chung, nhưng chúng cũng có một số sự khác biệt sâu sắc. Trong mục sau, chúng ta sẽ thảo luận về hệ thống điều hoà biểu hiện gen ờ các cơ thể có nhân (eukaryote) và sẽ làm sáng lỏ về sự khác biệt với các hệ thống prokaryote đơn giản hơn. 1.2.5.1. Điéu hoà s ự phiên má có thê hoặc là âm hoặc là duơng Sự điều hoà ớ mức khởi đẩu phiên mã có thể hoặc dương, hoặc âm. Điều hoà dương gia tăng tần số của sự khởi đầu và điểu hoà âm giảm thiểu tần số của sự khởi đầu. Mỗi một trong các dạng như thế của sự điều hoà là được trung gian bới các protein điều hoà, nhưng các protein có các hiệu ứng ngược nhau. a) Đ iêu h o à á m bởi c á c c h ấ t ức ch ê Điều hoà âm bới các protein được gọi là các chất ức c7/é'(repressors). Các chất ức chê là các protein vốn gắn vào vị trí điều hoà trẽn ADN được gọi là miền vận hành (gen vận hành, gen chỉ huy, trình tự vận hành) để ngăn chặn hoặc giảm thiếu sự khới đầu phiên mã (hình 1.22). Chúng hoạt động như một kiểu vật cán xe cộ trên dường nhằm ngăn chặn có hiệu quà polymerase thực hiện sự khới đầu. Các chất ức chế không lác động đơn lẻ; mỗi một phản ứng đối với các phân tử chất tác động (effector). Chất tác động liên kết làm biến đổi cấu dạng cùa chất ức chế để Miền vận hành Chất ức chẻ' gắn chặt vào ADN vân hành, tạo nẻn vật càn đối với sự phiên mã Hỉnh 1.22. Chất ức chế phong toả sự phiên mã. Một trinh tự ADN không được phiên mả gọi là miển vận hành có thể điểu hoà sự phiên mã của gen cấu trúc. Khi protein ức chế gắn vào miền vận hành, sự phiên mã cùa các gen cấu trúc bị phong toả (Theo Purvez et al. 2008). hoặc tăng cường, hoặc huỷ bỏ mối liên kết của nó với ADN. Các protein chất ức chế như thế là những protein hoạt tính với vị trí hoạt tính vốn liên kết A D N và vị trí điều hoà, đó là nơi liên kết các chất tác động. Chất lác động liên kết tại vị trí điều hoà làm biến đổi khả năng cùa chất ức chế liên kết ADN. b) Đ iều h o à d ư ơ n g b ởi c á c c h ấ t h o a t h o á Sự điều hoà dương được trung gian qua một lớp các protein hoạt tính, điều hoà được gọi là các cliất hoại hoá vốn có thê gắn vào ADN và kích thích sự khởi đầu phiên mã. Các chất hoạt hoá như vậy gia tăng mối liên kết ARN polymerase vào gen (miền) khới động để tăng mức khới đầu phiên mã. Các chất hoạt hoá là các đối diện vật lý cùa các chất ức chế. Các phân tử tác dộng có the hoặc gia tăng, hoặc giảm thiổu các liên kết hoạt hoá. 1.2.5.2. Các c ơ thể tiên nhân (prokaryote) có thể tự diều hoà s ự biếu hiện gen trong phán úng dõi vói các diều kiện môi trường Những biến đổi trong môi trường mà vi khuẩn và động vật nguyên bào phải dương đẩu thường dẫn đến các biến đổi trong biểu hiện gen. Nhìn chung, gen mã hoá các protein liên quan trong con đường dị hoá (phàn giải các phân tử) phản ứng ngược lại các gen mã hoá các protein liên quan trong các COI1 đường dồng hoá (tổng hợp các phân tử). Trong phần 41 thảo luận tiếp theo, chúng ta mô tả các enzym trong con đường dị hoá, trong đó có sự vận chuyển và sử dụng đường lactose. Sau đó, chúng ta sẽ mỏ tả con đường đổng hoá vốn tổng hợp axit amin tryptophan. Như đã biết, các gen trong cơ thể tiền nhân (prokaryote) thường được tổ chức thành các operon (operon là đơn vị phiên mã trong prokaryote), các đa gen vốn là một phần của đơn vị phiên mã đơn có miền khởi động (promoter) đcm. Các gen vốn liên quan trong cùng con đường trao đổi chất thưòng được tổ chức theo cách đó. Các protein cần để sử dụng lactose dược mã hoá bởi lac operon và các protein cẩn cho sự tổng hợp tryptophan được mã hoá bới trp opcron. a) C ảm ứ n g và ức c h ế Nếu vi khuẩn gặp phải lactose, nó bắt đầu tạo ra các enzym cần để sử dụng lactose. Tuy nhiên khi không có lactose, không có nhu cầu tạo nên các protein ấy. Như vậy, chúng ta nói ràng, sự tổng hợp các protein là được càm ứng bởi sự hiện diện của lactose. Bởi vậy, sự cảm ứng xảy ra khi các enzym của một con đường xác định đã được sản sinh ra trong phán ứng đối với cơ chất. Khi tryptophan có sẵn trong môi trường, vi khuẩn sẽ không tổng hợp các enzym cẩn cho sự tổng hợp tryptophan. Nếu tryptophan trở nên cạn kiệt, vi khuẩn bắt đầu tổng hợp các enzym ấy. Sự ức chế xảy ra khi vi khuẩn có khả nãng tạo nên các enzym sinh tổng hợp nhưng không tạo ra chúng. Trong cả hai trường hợp cảm ứng và ức chế, vi khuẩn tự điểu chỉnh (tự thích nghi) để sản sinh ra các enzym vốn là tối ưu đối với môi trường trực tiếp cùa nó, b) Đ iề u h o à ă m Biết rằng sự biểu hiện gen chắc là được điều hoằ tại mức khởi đầu phiên mã nhưng chưa rõ đó là sự diều hoà âm hay dương. Nhìn bé ngoài, ức chế có thể xuất hiện phài là âm và cám ứng là dương; nhưng trong trường hợp của cả hai lac và trp operon, sự điểu hoà là âm bới protein ức chế. Vấn đề quyết định là các protein tác động (effector proteins) có hiệu ứng ngược đối với chất ức chế trong sự cảm ứng với chúng (các protein tác động đó) thể hiện ra trong ức chế. Đối vởi cơ chế hoạt động, phân tử trong môi trường, ví dụ như lactose hoặc tryptophan, cần phải tạo ra hiệu úng thích đáng trên gen được điều hoà. Trong trường hợp cảm ứng lac, sự hiện diện của lactose phải ngăn chặn protein ức chế gắn vào trình tự điều hoà của nó. Trong trường hợp ức chế trp, bằng cách ngược lại, sự hiện diện của tryptophan phải cảm ứng protein ức chế gắn vào trình tự điều hoà của nó. Những phản ứng trà lời như vậy là trái ngược nhau vì nhu cầu cùa tế bào là đối nghịch trong con đường dị hoá ngược lại con đường dồng hoá. Trong các mục tiếp sau, chúng ta sẽ kiểm tra một cách chi tiết mỗi con đường nhằm chỉ rõ, bằng cách nào các mối tương tác prolein - ADN cho phép tế bào đáp ứng đối với các điều kiện môi trường. 1.2.5.3. Lac operon là điếu hoà âm bới chất ú t chê lac Sự điều hoà biểu hiện gen trong lac operon đã được sáng tỏ nhờ công trình cùa Jacques Monod và François Jacob. Lac operon gồm các gen vốn ghi mã các chức năng cần thiết để sử dụng lactose: 42 p - galactosidase ỤacZ), lactose permease (lacY), lactose transacetylase (lacA) và các miền điểu hoà cẩn thiết để điều hoà sự biểu hiện của các gen ấy (hình 1.23). Thêm vào đó, gen cho chất ức chế lac (L a cl) liên kết với phần còn lại của lac operon vả như vậy nó được xem là một phẩn của operon mặc dầu nó có vùng khởi động của riêng mình. Sự sắp xếp của các miền điều hoà ngược dòng với miển ghi mã là điển hình cùa hẩu hết các operon prokaryote, dù cho không có liên kết chất ức chế. Nơi gắn CAP điểu hoà lac Hình 1.23. Lac operon của Escherla co// Lac operon bao gổm vùng (gen) khởi động (promoter, pi), vùng vận hành (operator,o) và ba gen Ụac z, y và A) mã hoá các protein cấn cho Irao đổi lactose. Ngoài ra, có vị trí liên kết cho protein hoạt hoá chất trao đổi (CAP), vốn gây ảnh huởng đỗi với liên kẽt ARN polymerase vào vùng khởi động (promoter). Gen I mã hoá protein ứt chế, vốn có thể liên két vùng vận hành và phong toà sự phièn mã của lac operon. a) H o a t d ộ n g c ủ a c h ấ t ức c h ế Sự khởi đầu phiên mã được điểu phối bởi chất ức chế lac. Chất ức chế gắn vào gen vận hành vốn kề cận với vùng (gen) khời động (hình 1.23). Sự gắn kết dó ngãn chăn ARN - polymerase khôi mối liên kết vào vùng khởi động. Mối liên kết AD N là nhạy cảm đối với sự hiện diện cúa lactose: Chất ức chế liên kết ADN (gen vận hành) xảy ra khi vắng lactose, nhưng không liên kết khi hiện diện lactose (hình 1.24). b) T ương tá c c ủ a c h ấ t ức c h ế và c h ấ t cả m ứ n g Khi vắng lactose, chất ức chế lac gắn vào miẻn vận hành và operon bị ức chế (hình 1.24a). Chất tác động (effector) thực hiện điểu phối sự liên kết AD N cùa chất ức chế là một chất trao đổi của lactose, allolactose (allo là tiển tô' chỉ dạng bển hơn trong hai đổng phân), vốn được sinh ra khi sẵn có lactose. Allolactose gắn vào chất ức chế, gây biến đổi cấu hình của nó, do vậy nó không thể gắn kết vào vùng vận hành (hình 1.24b). Bây giờ operon đã được cảm ứng. V ì rằng allolactose cho phép cảm ứng của operon, nó thường được gọi là chấl cám ứng. Khi mức lactose giảm, allolactose sẽ không lâu sẵn có đế gắn kết vào chất ức chế, không bị liên kết, chất ức chế gắn kết trở lại vào ADN. Như vậy, hộ thống điều hoà âm như thê bới chất ức chế lac và chất cảm ứng của nó, allolactose, đảm bảo cho tế bào đáp ứng được các mức biến đổi của lactose trong môi trường. Thậm chí khi thiếu vắng lactose, lac operon được biểu hiện ở mức rấl thấp. Khi lactose trở nên sẵn có, nó được vận chuyển vào trong tế bào và allolactose dược sản ra đủ thì có thể xáy ra sự cảm ứng operon (Raven et al., 2010). 43 - Polypeptit ức chế lac — Nơi nói CAP CAP Gen ức chẽ lac Gen khỏi động cho lac operon ARN polymerase bị bao lac operon bị "ức chế" Chất ức chế lac (khỏng lactose) Không phiên mả. Không tạo ra các enzym phân huỷ lactose t vảy bởi chất ức chế lac Gen vận hành lac operon dược "cảm ứng" Allolactose (chất / cảm ứng) (cò fb-galactosidase N ' j s ' lactose) / j k l T — ► Dịchm ã — _ TransacelVlase I ' \ \ Permease ARN polymerase khỏng bị bao vây và phiên mả có thể xảy ra Chất ức chế L l . ' - ' lac không ARKJ 1 thể liên kết vào ADN 'V Tạo ra các enzym \ phản huỷ lactose -7 'B SSSZ Z 1Z ' Y ■ Hình 1.24. Cảm ứng lac operon (Theo Raven et al., 2010). 1.2.5.4. Sựhiện diện của glucose ngăn chặn s ự cảm úng của lac operon Sự ức chc glucose là sự sử dụng ưu tiên glucose khi hiện diện các loại đường khác như lactose. Nếu vi khuẩn đang sinh trưởng trong sự hiện diện của cả hai glucose và lactose, lac operon không được cảm ứng. Khi glucose được sử dụng nhiều, lac operon được cảm ứng, cho phép lactose phải được dùng như là nguồn năng lượng. Mặc cho tên gọi sự ức chê glucose, ca chế như thế liên quan với protein hoạt hoá vốn kích thích sự phiên mã từ các operon dị hoá, ké cả lac operon. Chất hoại hoá đó, protein hoạt hoá chất dị hoá (C A P ), protein hoạt tính với cA M P như là chất tác động. Protein ấy cũng được gọi là protein trả lời cAM P (CRP, cA M P response protein) vì rằng nó liên kết cAMP, nhưng chúng ta sẽ dùng thuật ngữ C A P để nhấn mạnh vai trò của nó như là chất điều hoà dương. C A P một mình không liên kết vào A D N , nhưng liên kết của chất tác động cAM P vào CA P làm biến đổi cấu hình cùa nó đến mức nó có thể gắn kết vào AD N (hình 1.25). Mức độ cA M P trong tế bào bị giảm Ihiểu khi hiện diện glucose, do vậy không có kích thích phiên mã từ các operon trả lời - CAP. Hê thống C A P - cA M P lừ lâu đã cho rằng phải là cơ chế duy nhất của sự ức chế glucose. Nhưng nghiên cứu mới đây nhất đã chí ra rằng, sự hiện diệo cùa glucose ức chế sự vận điuvển lactose vào trong tẽ bào. Sự tước đoạl tế bào như vậy cùa lac opcron cảm ứng. II allolactose. cho phép chất ức chế gắn vào vùng (gen) vận hành. Cơ chế như vậy, gọi là sự loại bó cám ứng, bây giờ cho rằng nó phải là dạng chù yếu của sự ức chế glucose cùa lac operon. Cho rằng xáy ra sự loại bỏ cảm ứng, vai trò của CA P khi thiếu váng glucose hình như là thừa. Nhưng Ihực tế, hoạt động của CA P - cAM P cho phép loại bó tối đa operon khi thiếu vắng glucose. Sự điểu hoà dương của CA P - cAM P là cẩn thiết vì vùng khới động của lac operon một mình không hiệu quả trong sự liên kết ARN polymerase. Khắc phục sự không hiệu quá bàng tác động cúa sự điểu hoà dương của chất hoạt hoá CA P - cAM P (hình ! .25). Mức glucose thấp, chất cảm ứng hiện hữu, gen (vùng) khỏi dộng được hoạt hoá cAMP ARN polymerase không bị bao cAMP hoạt hoá CA P bởi gây ^ nên sư biến đổi cấu dang vảy và phièn mã có thể xảy ra Mức glucose cao, vắng chất cảm ứng, gen khởi động không được hoạt hoá V Glucose nhiều, mức cAMP tháp Không gắn CAP ^ Chát ừc chế gản vào ADN A I f CAP không liên kết 0 tác động trống $ Nơi của chất < % /> rỗng và không ARN polymerase bị bao cỏ sự biên đoi vây bơi chất ức chế /ac cấu dạng ỏ dỏ Hinh 1.25. Hiệu ứng của glucose đối vói /ac operon Sự biểu hiện của lac operon được điếu hoà bởi chất điếu hoà âm (chất ức chế) và chất điểu hoà dương (CAP). Hoạt động của CAP* là nhạy cảm đối với các mức glucose, a) Để cho CAP gắn vào ADN, nó cần phải gắn vào cAMP. Khi mức glucose thấp, cAMP là nhiều và gắn vào CAP. Phức hệ CAP - cAMP làm cho ADN uốn cong quanh nó. Điéu đó gảy ra sự tiếp xúc của CAP với ARN polymerase (không chỉ ra trên hinh) làm cho polymerase liên kết vào gen khởi động hiệu quả hơn; b) Các mức glucose cao tạo ra hai hiệu ứng: cAMP trở nên khan hiếm do vậy CAP khỏng có khả nàng hoạt hoá gen khởi động và sự vận chuyển lactose bị phong toả (loại bỏ cảm ứng) (Theo Raven et al., 2010). 1.2.5.5. Trp operon duực diêu hoà bởi chất úc c h ế trp Tương tự Uic operon, trp operon bao gồm một loạt gen vốn ghi mã các enzym liên quan trong cùng một con đường hoá sinh. Trong trường hợp của ỉrp operon, những enzym ấy là cần thiết cho sự tổng hợp tryptophan. Miền điểu hoà có chức năng điểu phối sự phiên mã 45 các gen ấy được định cư ngược dòng của các gen. Trp operon được điều hoà bời chất ức chế được mã hoá bời gen định cư ở bên ngoài tip operon. T ip operon biểu hiện tiếp tục khi không có tryptophan và khổng biểu hiện khi có tryptophan. Chất ức chế trp là protein xoắn - vòng - xoắn vốn liên kết vào vị trí vận hành định cư gần vùng khởi động trp (hình 1.26). Chất ức chế như thế hoạt động theo cách ngược vói lac operon. Khi vắng tryptophan, chất ức chế trp không gắn vào vùng vận hành của nó, cho phép operon biểu hiện và sản sinh ra các enzym cẩn để tổng hợp tryptophan. Không có tryptophan, vùng khỏi động được hoạt hoá J E + 0 ▲ c O B Sản sinh các enzym tổng hợp tryptophan Gen khởi động Chất út chố trp bất hoạt (Không có tryptophan) ARN polymerase không bị phong cho trp operon toầ và có thể phiên mả Tryptophan Gen mâ hoá chất ức chế trp b) Có tryptophan, vùng khỏi dộng bị ức chò' sỵ Tryptophan gắn vào chất ứe chế, Khống sản ra các enzym cho sự tổng hợp tryptophan Hình 1.26. Trp operon được điểu hoà như thô' nào. Trp operon ghí mã các enzym cẩn cho sự tổng hợp tryptophan a) Chất ức chế tryptophan một mình không thể liên kết vào ADN. Vùng (gen) khởi động là hoạt động tự do và ARN polymerase phiên mă operon; b) Khi hiện diện tryptophan, nó gắn vào chất ức chế, làm biến đoi cấu hình của nó, do vậy bây giờ nó gắn được vào ADN. Phức hệ chất ức chế - tryptophan gắn chạt vào vùng điểu hành, ngăn cản ARN polymerase khỏi sự bắt đầu phiên mã (Theo Raven et al., 2010). Khi mức tryptophan gia tăng, sau đó tryptophan (chất dồng ức chế, corepressor) gắn vào chất ức chế và biến đổi cấu hình của nó, cho phép nó liên kết vào vùng vận hành cùa nó. Mối liên kết của phức hệ chất đồng ức chế - chất ức chế vào vùng vận hành ngăn chặn AI\N polymerase liên kết vào vùng khởi động. Sự biến đổi thực sự trong cấu trúc của chất ức chế là do mối liên kết tryptophan làm biến đổi sự định hướng của cặp hoạ tiết xoắn - vòng - xoắn, điều đó cho phép chúng nhận biết được các xoắn lương thích vào bên trong các rãnh lớn kế cận của AD N (hình 1.27). 46 Khi hiện diện Iryptophan và liên kết vào chất ức chế thì phức hệ ấy gắn được vào vùng vận hành, operon bị ức chế. Khi các mức tryptophan giảm thiểu, chất ức chế một mình không thể liên kết vào vùng vận hành, điểu đó cho phép operon biếu hiện. Trong trạng thái như thế, có thể nói là operon được loại ức chế, khác biệt với trạng thái cảm ứng (hình 1.26). Chìa khoá giúp mớ ra sự nhận thức bằng cách nào cả sự cảm ứng và sự ức chế có thế do sự điều hoà âm là kiến thức về cách thức hoạt động của các protein ức chế và các chất tác động (effectors) của chúng. Trong sự cảm ứng, chất ức chế một mình có thể gắn kết vào ADN và chất cám ứng ngăn cản sự liên kết ADN. Trong trường hợp của sự ức chế, chất ức chê chi gắn AD N khi liên kết vào chất đồng ức chế. Cảm ứng và ức chế là những ví dụ tuyệt vời chỉ rõ, bằng cách nào các mối tương tác của các phân tử ảnh hưởng Hình 1.27. Chất ức chè' tryptophan hoạt động như thồ'nào Mối liên kết cùa tryptophan vào chất ức chế làm tăng khoảng cách giữa hai xoắn nhận biết trong chất ức chế, cho phép chất ức chế phù hạp khít vào hai phần phản chia gắn nhau của rãnh lớn trong ADN. (Theo Raven et al„ 2010). đến cấu trúc của chúng và cấu trúc phân tử là quyết định đối với chức nàng như thế nào. 1.2.6. Bộ gen (genome) của cơ thể có nhân (eukaryote) và sự biểu hiện của nó Cần khái quát vể bộ gen (genome) của eukaryote, vốn là cơ sở của những khác biệt Irong quá trình biểu hiện gen eukaryote so với quá trình đó trong prokaryote, đổng thời đó cũng là cơ sỡ cho sự nhận thức về sự biểu hiện gen phân hoá trong sinh học phát triển. Từ khi các nhà sinh học đã làm sáng tỏ cấu trúc và sự biểu hiện phức tạp của gen trong các cơ thể tiền nhân (prokaryote), họ đã cố gắng khái quát và cho rằng "cái gì là đúng đối với E.coli cũng là đúng đối với con voi". Mặc dẩu nhiều kiến thức vể hoá sinh prokaryote cũng được áp dụng đối với eukaryote, câu nói đó có những hạn chế cùa nó. Có thể thấy rõ điều vừa nêu trong bàng 1.3 dưới đây, trong đó liệt kê một sô' những khác biệt giữa bộ gen cúa cơ thể prokaryote và cơ thể eukaryote. 1.2.6.1. Đặc điểm khác biệt của bộ gen eukaryote so với prokaryote - Bộ gen của cơ th ề có nhăn (eukaryote) lớn hơn và phức lạp hơn: So sánh bộ gen prokaryote và eukaryote đã phát hiện một số các đạc điểm khác biệt. Bộ gen cùa các eukaryote (trong giới hạn số lượng ADN đơn bội) là lớn hơn so với cơ thé prokaryote. Sự khác biệt ấy không gây ngạc nhiên, các nhà nghiên cứu cho rằng, trong các cơ thể đa bào có nhiểu kiếu tế bào, nhiểu việc phải làm và nhiẻu protein, tất cả được mã hoá bởi ADN là cẩn đê làm những việc ấy. Virut điển hình chứa đủ ADN để mã hoá cho một ít protein, khoáng 10.000 bp. Prokaryote được nghiên cứu tốt nhất là E.coli, vì chúng có đủ ADN (khoáng 4,5 triệu bp) để tạo vài nghìn protein khác nhau và điều hoà sự tổng hợp chúng. 47 Con người có nhiều gen và các chất điều hoà hơn. Khoảng 6 tý bp (2 met A D N ) được nhồi vào trong mỗi tế bào lưỡng bội của người. Tuy nhiên, ý tưởng về cơ thể phức tạp hơn thì cán nhiều ADN hơn hình như bị thất bại ở một số thực vật. V í dụ, cây hoa loa kèn (Lilium), loài cây nỡ hoa đẹp khi mùa xuân đến, sản sinh ra ít protein hơn con người, nhưng lại có lượng ADN gấpI8 lần nhiều hơn so với ÁDN của người (Purves W .K. et al., 2008). Bàng 1.3. So sánh các gen và các bô gen của cơ thể tiền nhân (prokaryote) cơ thể có nhản (eukaryote) (Theo Purvez et al , 2008). Các đặc điểm so sánh Tiển nhân (prokaryote) Có nhân (eukaryote) Kích thước bộ gen (cặp base)[genome size (base pairs)] 104- 107 108- 1011 Các trình tự lãp lại (repeated sequences) It Nhiều ADN không chứa mã bên trong các trinh tự chứa mã (Noncoding DNA within coding sequences) Phiên mả tách biệt khỏi dịch mã trong tế bào (Trancription and translation separated in cell) ADN được tách riêng bên trong nhân (DNA segregated within a nucleus ) Hiếm Phổ biến Không Có Không Có ADN Hên kết vào protein (DNA bound to protein) Môt số Phổ biến Gen khởi động (Promoters) Có Có Gen tãng cviòng (Enhances)/gen câm (Silencers) Hiếm Phổ biến Chụp mũ và nối đuôi cùa mARN (Caping and tailling of mRNA) Không Có Đòi hỏi phải phân cắt ARN (Spliceosomes) Hiếm Phổ biến Sô lượng nhiễm sắc thể trong bộ gen (Number of chromosomes in genome) Một Nhiều - Bộ gen của cơ tlìể có nhân (eukaryote) có nhiều hơn các trình tự điều hoà (regulatory sequences) và cũng có nhiều hơn các protein điểu hoà gắn vào chúng so với các bộ gen của cơ thể tiền nhân. Tính phức tạp nhiều của cơ thể có nhân đòi hỏi sự điều hoà nhiều hơn và đó là sự thật đã được chứng minh trong nhiểu quá trình và các điểm điều hoà liên kết với sự biếu hiện của bộ gen của cơ thể có nhân mà chúng ta sẽ xem xét chi tiết tiếp sau. - Nhiêu ADN eukaryote là không m ã hoá: Rải rác khắp bộ gen của các cơ thể có nhân, có các kiểu trình tự khác nhau của AD N lập lại vốn khổng được mã hoá protein. Thậm chí các miền mã hoá của các gen chứa các trình tự vốn không xuất hiện trong m ARN được dịch mã tại ribosom. - C ơ tliể có nhân (eukaryote) có nhiều nhiễm sắc th ể (NST): Bách khoa toàn thư bộ gen của các cơ thê’ có nhân được tách biệt thành nhiều miền. Sự tách biệt đó đòi hỏi ràng, mỗi nhiễm săc thể (NST) có lì nhất ba trình tự AD N xác định: miền khới dầu của tái bản dược nhận biết bới bộ máy tái bản ADN; miền tâm dộng vốn là tổng thê NST dược tái bàn trước nguyên phân; và trình lự telomere tại mỗi đầu cuối cùa NST (hình l .28). 4H Chuyển chỗ ARN mổi rút ngắn NST sau mỗi vòng tái bản. Sự rút ngắn NST cuối cùng làm chết tẽ bào ARN mổi / Một ARN trong telomerase hoạt động như là khuôn mẫu cho ADN. Enzym này thêm trinh tự telomere vào đầu 3’ của nhiễm sắc thể. Chiểu dài nguyên gốc của ADN nhiễm sắc thể đă được phục hổi. Có khoảng trông nơi mối cho sự tái bàn ADN đả bị loại bỏ. c) EEZE2Z3 3 Telomerase V* £ 4 ^ v V y UCI Hình 1.28. Các telomere và telomerase a) Sự chuyển chỗ ARN khởi dầu (ARN mổi) tại đầu 3' của thanh (sợi) nhiễm sắc dừng rời khỏi miền ADN không được tái bàn. b ) Enzym telomerase gắn vào dấu 3' và kéo dài thanh nhiễm sắc dừng của ADN. Một trinh tự ARN được gắn vào telomerase cung cấp khuôn mẫu, do vậy, nói chung, sợi ADN không bị rút ngắn; c) Các vệt sáng huỳnh quang đánh dấu các miền telomere trên cảc nhiễm sẳc thể người (Theo Purvez et al.. 2008). - Trong ca th ể có nhân, phiên m ã và dịch mã về mặt vật lý là tách biệt: v ỏ nhân tách biệt ADN và phiên mã nó (bên trong nhân) ra khỏi các nơi mà A R N được dịch thành protein (bên trong tế bào chất). Sự tách biệt cho phép có nhiều điểm điểu hoà trưởc khi bắt đẩu dịch mã: trong quá trình tổng hợp tiền mARN (m ARN phiên mã, m ARN sơ khai), trong quá trình vận chuyên nó vào tế bào chất để dịch mã (hình 1.29). ADN trong nhân chứa các gen mã hoá protein Các gen được phiên mã để tạo ARN thông tin (mARN) Phiên bản tiền mARN đã được sản sinh Tiền mARN được xử lý - các intron bi cắt bỏ, các exon được nối thành mARN vá mARN được xuất đến tẽ' bào chất Trong té bào chất, các ribosom dịch mARN tạo ra protein (polypeptit) được mă hoá bỏi gen Hinh 1.29. mARN eukaryote được phiên mã trong nhàn nhưng được dịch mã trong tế bào chất So sánh các bước của hinh này với các bước của prokaryote trong hình 1.5. 4-GTSNHHOCPT 49 Để so sánh sự phất triển của bộ gen (genome) trong các cơ thể có nhân (eukaryotes), so với bộ gen trong cơ thể tiền nhân (prokaryotes), chúng ta nghiên cứu bộ gen trong các Cơ thể có nhân đơn bào như nấm men. 1.2.6.2. Bộ gen (genome) của nấm men Bộ gen nấm men đã bổ sung các chức năng eukaryote vào mô hình prokaryote. So sánh với bộ gen của E.coli vốn chứa khoảng 4.500.000 bp trên một nhiễm sắc thể (NST) đơn (một phãn tử A D N vòng), bộ gen của nấm men Saccharomyces cerevisiae, một eukaryote đơn bào, có 16 NST tháng và chứa đơn bội hơn 12.068.000 bp. Hơn 600 các nhà khoa học khắp thế giới tham gia lập bản đồ và trình tự của bộ gen nấm men. Khi bắt đầu công việc, họ biết khoảng 1.000 gen nấm men mã hoá cho các A R N và các protein. Trình tự cuối cùng đã phái lộ 5.900 gen và các phân tích trình tự đã xác định vai trò có thể đối với khoảng 70 phần trăm cùa chúng. Một số trong các gen ấy là đồng hình với các gen đã được phát hiện trong prokaryote, nhưng nhiều gen thì không. Các chức năng cùa 30 phần trăm còn lại đang được khám phá bởi các nghiên cứu bất hoạt gen tương tự với các phương pháp đã được thực hiện đối với prokaryote (hình 1.30). Quá trình như thế đã phát hiện ra sản phẩm protein và chức năng của trình tự gen đã biết, được gọi là sự chú thích (annotation). Sự hoàn thành tốt đẹp như vậy đã làm cho nấm men trở thành mô hình cho các tế bào eukaryote, vì các quan sát và các giả thuyết từ các nghiên cứu trên nấm men có thể được ấp dụng và thử nghiệm đối với các eukaryote khác. Bây giờ có thể ước tính được các phần của bộ gen (genome) nấm men vốn ghi mã các chức năng trao đổi chất chuyên biệt. Rõ ra rằng, 11% của các protein nấm men hoạt động trong trao đổi chất chung, 3% trong sản xuất năng lượng và dự trữ, 3% trong tái bản ADN và sửa chữa, 12% trong tổng hợp protein, 6% trong các protein đích ("địa chỉ nơi đến") các bào quan và bài tiết ra ngoài tế bào. Nhiều trong 2/3 cùa các protein khác liên quan đến cấu trúc tế bào, phân chia tế bào và điểu hoà biểu hiện gen. Sự khác biệt ấn tượng nhất giữa bộ gen của nấm men và bộ gen của E.coli là trong các gen đối vái protein đích (bảng 1.4). Bảng 1.4. So sánh các bộ gen (genome) của E .co liv à nấm men (Purvez et al., 2008) E.coli Nấm men ü j c Chiều dài cùa genome (bp) 4.640.000 12.068.000 Số lượng c á c protein 4.300 6.200 Các protein có vai trò trong: Trao đổi chất 650 650 Sản xuất năng lượng/dự trữ 240 175 Vận chuyển qua màng 280 250 Tái bản ADN / sửa chữa/ tái tổ hợp 120 175 Phiên mả 230 400 Dịch mã 180 350 Protein hướng đích/ bài tiết 35 430 C ấu trúc tế bào 180 250 Cả hai sinh vật đơn bào ấy xuất hiện để sử dụng khoảng chừng cùng số lượng các gen đế thực hiện các chức năng cơ bản đối với sự sống sót của tế bào. Đó là sự tạo ngăn tế bào nấm men có nhân thành các bào quan vốn đòi hỏi điều đó đê’ có nhiều hơn các gen như vậy. Sự phát hiện ấy là trực tiếp, khẳng định số lượng của một số loại protein với vai irò của chúng, điều mà chúng ta đã phải mất hàng thế kỷ mới biết được. Về mặt cấu Irúc, tế bào có 50 nhân phức tạp hơn so với tế bào tiền nhân. Các gen mã hoá vài kiểu protein khác là hiện hữu trong nấm men và trong các bộ gen của eukaryote khác, nhưng không có các gen đồng hình trong prokaryote: * Các gen mã hoá các histon vốn đóng gói ADN vào trong các nucleosom (thể nhân). * Các gcn mã hoá các protein khung tế bào và mótơ như actin và tubulin. * Các gen mã hoá các kinase phụ thuộc - xyclin vốn điểu phối sự phân bào. * Các gen mã hoá các protein liên quan trong quá trình xử lý ARN. 1.2.6.3. Lóp Giun tròn bó’sung thêm tính phúc tạp của sựphát triển Sự hiện diện nhiều hơn so với tế bào đơn bổ sung thêm mức độ phức tạp mới đối với bộ gen eukaryote. Caenorhabitis elegans là giun tròn nhỏ xíu vốn thường sống trong đất. Nhưng nó cũng sống trong phòng nghiệm, nơi nó là sinh vật thuận lợi cho nghiên cứu của các nhà sinh học phát triển. Thực tế, giải thường Nobel năm 2002 trong ngành Sinh lý học và Y học đã được tặng cho các nhà nghiên cứu, những người đã sử dụng giun này để nghiên cứu sự phát triển và điều phối sự phân chia tế bào (Purvez et ai., 2008). Giun này có thân hình trong suốt, các nhà khoa học có thể theo dõi nó qua ba ngày khi trứng đã thụ tinh phân chia và hình thành nên giun irường thành chứa khoảng 1.000 tế bào. Mặc dầu với sô' lượng nhò các tế bào, giun đã có hệ thần kinh, tiêu hoá thức ăn, sinh sản hữu tính và già (có tuổi). Do vậy đã có cố gắng rất lớn để phát hiện trình tự của bộ gen cùa cơ thể này. Genome của Caenorhabitis elegans là 8 lẩn lớn hơn genome của nấm men (97 triệu bp) và có nhiểu gấp 4 lần các gen mã hoá protein (19.099). Tiến hành lập lại sự phân tích trình tự đã phát hiện nhiều gen hơn so với dự đoán. Khi những cố gắng bắt đầu phân tích trình tự, các nhà nghiên cứu ước tính rằng giun tròn có khoảng 6.000 gen và có lượng protein khoảng như vậy. Rõ là nó có nhiều ho«. Khoảng 3.000 gen trong giun có các đồng hình trực tiếp (direct homologs) trong nấm men. Những gen này ghi mã cho các chức năng cơ bản của tế bào có nhân (eukaryote). Phần gen còn lại có vai trò gì? Thêm vào sự sống sót, sinh trưởng và phân bào như các sinh vật dơn bào thực hiện, các sinh vật đa bào phải có các gen cho sự sắp xếp c.ác tế bào lại với nhau để tạo nên các mô, đối với sự phân hoá tế bào để phân chia nhiệm vụ giữa các mô và phối hợp các hoạt động của các tế bào, mỏ trong cơ thể (bảng 1.5). Nhiều gen đã được nhận biết này là không có trong nám men, thực hiện các vai trò như thế sẽ được mô tả tiếp trong phần còn lại của chương và chương tiếp theo. Bàng 1.5. Các gen của c. elegans ( ) thiếỉ yếu đối với tinh đa bào (Purvez et al., 2008) Chức năng Protein / miền Sô lượng các gen Điểu hoà phiên mả Ngón kẽm; hộp đổng nguồn 540 Xử lý ARN Các miền liên kết ARN 100 Truyền xung thẩn kinh Các kênh cổng ion 80 Hình thành mô Các colagen 170 Tương tác tế bào Các miền ngoại bào glycotransferases 330 Tín hiêu tẽ bào - tế bào Các chất nhận liên kết - G protein; các kinase protein; các protein phosphatase 1.290 51 1.2.6.4. Bộ gen (genome) của ruồi giấm (Drosophila melanogaster) không có nhiéu gen Bộ gen cùa ruồi giấm ít gen một cách ngạc nhiên. D rosophila m elanogaster là cơ thể lớn hơn c . elegans, cả về kích thưởc (ruồi có số tế bào lớn hơn giun tròn 10 lần) và độ phức tạp. Không ngạc nhiên rằng bộ gen của ruồi cũng lớn hơn (khoảng 180.000 bp). Các công nghệ phán tích trình tự mới được vi tính hoá đã tạo ra khả năng xác lập trình tự của nguyên vẹn bộ gen D rosophila [ ] trong khoảng một năm. Thậm chí trước khi Ihực hiện giải trình lự đã có tuyên bô ràng, hàng chục năm nghiên cứu di truyền đã nhận biết được ước chừng 2.500 gen khác nhau trong con ruồi giấm. Những gen ấy đã được phát hiện tất cả trong thực hiện phãn tích trình tự A D N , cùng với nhiều các gen khác mà chức năng của chúng còn chưa biết. Nhưng có sự ngạc nhiên lớn rằng, trình tự genome D rosophila đã là tổng số lượng của cấc miền mã hoá protein. Đáng lẽ có nhiều gen hơn so với giun tròn, ruồi có ít gen hơn: chỉ có 13.600 gen. Một nguyên nhân của điều đó là giun tròn có một số họ gen lõm hơn, vốn là các nhóm gen liên quan đến trình tự và chức năng của chúng. V í dụ, c . elecgans có 1.100 gen liên quan hoặc trong sự truyền tín hiệu tế bào thần kinh, hoặc trong phát triển; ruổi giấm chỉ có 160 gen cho hai chức nãng như vậy. Một sự biểu hiện gen lớn khác trong giun tròn là trong các gen mã hoá protein vốn là các hoá chất cảm ứng trong môi trường cùa nó. Nhiều gen hiện hữu trong bộ gen cùa giun đất có các đồng hình với các trình tự tương đổng trong AD N của ruổi giấm. Hơn thế, khoảng một phần nửa các gen của ruồi giấm có các dồng hình trong động vật có vú. Các so sánh genomic (so sánh genome của các sinh vật khác nhau) đã tạo được sự đóng góp quan trọng đối với y học qua việc phát hiện ra các đổng hình trong các sinh vật khác của các gen vốn liên quan đến các bệnh trong con người. Thường vai trò của các gen như vậy có thể được làm sáng tỏ trong cơ thể đơn giản hơn, cung cấp đẩu mối: bằng cách nào gen có thê’ hoạt động trong bệnh của con người. Bộ gen của ruồi giấm chứa 177 gen với các trình tự giống với các gen vốn cũng tồn tại trong bộ gen của người và liên quan trong các bệnh cùa người, bao gồm ung thư và các bệnh thần kinh. 1.2.6.5. Cá nóc là động vật có xương sõng với bộ gen (genome) chặt Cá nóc (Fiigu nibripes) đã đoạt giải thưởng bếp núc (nấu nướng) thế giới khi một thông tin người sành ăn uống từ nước Nhật nói rằng, cần phải được chuẩn bị rất cẩn thận vì nó chứa chất độc chết người, gọi là tetrodotoxin, là chất ức chế các kênh vận chuyển qua màng trong các tế bào thần kinh. Trong giới sinh học, nó được giải thưởng vì bộ gen của nó vốn là chặt nhất được biết giữa các sinh vật có xương sống. Bộ gen của nó chứa 365 triệu bp và khoảng 30.000 gen. So sánh bộ gen cùa cá nóc và bộ gen của người cho thấy rằng, nhiều gen trong hai sinh vật là lương tự, do vậy, như Brenner Sydney, nhà khoa học dẫn đầu (người cũng đã nghiên cứu bộ gen của c . elecguns) đã nêu ra vấn đề đó, "Bộ gen Fiign là một biến thể tường thuật cúa độc giả của Sách về Người". Sự khác biệt lớn giữa hai bộ gen là các trình tự AD N lặp lại, vốn chiếm tới 40 phần trăm của bộ gen người nhưng với tỷ lệ bé hơn nhiều trong cá nóc. Ý nghĩa của phát hiện đó là còn chưa rõ. Tất nhiên, rõ là người phức lạp hơn nhiều so với cá; bằng cách nào chúng ta đạt được điều đó với bộ gen, thậm chí ít hơn về số lượng so với cá, là chưa biết, nhưng một số điểm xác định chỉ rõ sự thật rằng, không chỉ một mình các gen quy định tính phức tạp cùa sinh vật (Purvez et al., 2008). 52 1.2.6.6. B ộ gen (genom e) câ y lúa phán ánh b ộ gen của A ra b id o p sis (thụt vật mô hình) Khoảng 250.000 loài thực vật có hoa thống trị trên mặt đất và nước ngọt. Nhưng trong lịch sử của sự sống, thực vật có hoa là khá trẻ, xuất hiện chừng khoảng 200 triệu năm về trước. Dần dà xảy ra đột biến AD N và các biến đổi di truyền khác, sự khác biệt giữã các thực vật này là dường như tương đối nhỏ bé - ớ mức điều hoà và tổng hợp protein hơn là trong các gen. Như vậy, mặc dầu đó là các bộ gen của thực vật được con ngưòi sử dụng làm thức ăn và lấy sợi vốn có sự hấp dăn đối với chúng ta, điểu đó không gây ngạc nhiên rằng, thay thế cho phân tích trình tự của các bộ gen lớn của lúa mỳ (16 tỷ bp) hoặc ngỏ (3 tỷ bp), các nhà khoa học đã chọn trước tiên thực vật có hoa đơn giản nhất (Arabidopsìs) để phân tích trình tự. Arabidopsis thaliana, cây cải xoong, là thuộc họ Cải (Brassica) và từ lâu dã trờ thành sinh vật mô hình ưa thích trong các nghiên cứu của các nhà sinh học thực vật. Nó rất nhò bé (hàng trăm cây có thể sinh trưởng và sinh sản trong không gian chỉ bằng trang giấy A4), rất dễ thao tác, chỉ có 10 phần trăm AD N lặp lại và có bộ gen nhỏ bé (119 triệu bp). Trình lự ADN của nó phát lộ khoảng 26.000 gen mã hoá protein, nhưng rất ấn tượng, nhiều trong chúng là bản sao của các gen khác và chắc rằng có nguồn gốc từ sự tái sắp xếp nhiễm sắc thế. Khi trừ đi các gen tái bản ấy ra khỏi tổng số, còn lại duy nhất khoảng 15.000 gen. Số lượng không quá khác nhau so với bộ gen của ruổi và giun tròn. Thay thế, nhiều các gen dược phát hiện trong các động vật không xưcmg sống ấy có các đồng hình trong thực vật, điều đó giả thiết rằng, thực vật và động vật có tổ tiên chung. Nhưng A rabidopsis có các gen làm cho nó khác biệt (bảng 1.6). Các gen ấy bao gồm những gen liên quan trong quang hợp, trong vận chuyển nước vào bên irong r ỉ và khắp toàn cây, trong tập hợp vách tế bào, trong sự hấp thụ và trao đổi các hợp chất vô cơ từ mõi trường và trong sự tổng hợp các phân tử đặc hiệu được dùng để bảo vệ chống lại các sinh vật ãn thực vật. Bảng 1.6. Các gen A rabidopsis là duy nhất đối vói thực vật (Purvez, 2008) Chức năng Số lượng các gen Vách tế bào và sinh trưởng Các kênh vận chuyển nước Quang hợp Bảo vệ và trao đổi chất 420 300 139 94 4 5--J Chứng minh vị thế của nó như là ihực vật mô hlnh, các gen "thực vật" như thế trong Arabidopsis cũng dã dược phát hiện Irong genome cùa cây lúa mà trình tự cùa nó đã được xác lập. Thực tế, hai trình tự O ryza saliva đã được giải mã: trình tự của Oryza sativa indica, lúa sinh trướng ở hầu khắp châu Á nhiệt đới và trình tự cùa O ryza sativa japónica, vốn sinh trướng ớ nước Nhật và tại các nước vùng ôn đới (chẳng hạn như nước Mỹ). Cả hai bộ gen (genome) là khoáng cùng kích thước (430 triệu bp), còn trong bộ gen lớn ấy có tập hợp các gen giống một cách ấn tượng với lập hợp các gen như thế của Arabidopsis (bảng 1.7). Nhiều các gen trong lúa cũng hiện diện trong các bộ gen lớn hơn cúa ngô và lúa mỳ. 53 Tất nhiên, lúa như là loài nguyên vẹn và mỗi loài phụ có tập hợp riêng các gen cùa chính nó vốn lảm cho nó trở thành độc nhất vỏ nhị. Loài phụ Indica được ước tính có 46.000 - 55.000 các gen như vậy và Japónica có 32.000 - 50.000, cả hai thành phần cao hơn so với Arabidopsis. Các gen "đặc biệt" như vậy bao gồm các gen cho các tính trạng là đặc hiệu đối với lúa, chảng hạn như tính trạng sinh lý vốn cho phép cây lúa sinh trưởng được trong thời kỳ mùa ngập nước, tạo các hạt dự trữ dinh dưỡng duy trì cuộc sống con người; chống lại một số bệnh thực vật, ví như virut và nấm. Bảng 1.7. So sánh bộ gen (genome) của lúa và Arabidopsis (Theo purvez et al., 2008) Hiện hữu của bộ gen Chức nảng (genome) Lúa (Oryza sativa) Lúa ArabidopsisArabidopsis Cấu trúc tế bào Các enzym 9 10 20 \ í 21 Các liên kết phối tử 10 10 K (ligand binding)'¿Vi í ✓ 'V y &y Lien kết ADN 10 10 r\\ j/¥ Truyền tín hiệu 3 3 Vận chuyển qua màng 5 5 Sinh trưởng cùa tế bào 24 22 ĩ và duy tri Các chức năng khác 18 20 1.2.6.7. Các trinh tự lặp lại trong bộ gen (genome) của c ơ th ể có nhân (eukaryote) Bộ gen cùa cơ thể có nhân chứa một số trình tự bazơ vốn được nhắc lại nhiều lần. Một số các trình tự này là hiện hữu trong hàng triệu các bản sao trong bộ gen đơn (single genome). Bây giờ chúng ta sẽ kiểm tra tổ chức và vai trò có thể của các trinh tự lặp lại này. a) C ác tr ìn h tự lặ p l a i c a o là h iệ n h ữ u tr o n g s ố lư ợ n g lở n c á c b ấ n sa o Đã phát hiện ra ba kiểu của các trình tự lặp lại cao trong các eukaryote. - Các đoạn kèm (satellites) là các trình tự dài 5-50 cặp bazơ (bp), được lặp lại sát nhau đến hàng triệu lần. Các đoạn lặp lại thường là hiện hữu tại tâm động của các NST. Sự xuất hiện của chúng phải là quan trọng trong liên kết các protein chuyên biệt vốn tạo nên tâm động. - Các đoạn kèm mini (minisatellites) dài 12 - 100 bp và được lặp lại vài nghìn lần. Vì lằng, ADN polymerase có xu thế tạo nên các sai lệch trong sao chép các trình tự này, số lượng các bản sao hiện diện biến động giữa các cá thể. V í dụ, một người có thể có 300 đoạn kèm mini hoặc các đoạn khác, 500. Sự biến động đó cung cấp các đánh dấu di truyền phân tử vốn có thể được sử dụng để nhận biết cá thể. - Các vi doạn kèm (microsatellites) là các trình tự rất ngắn (1-5 bp), hiện diện trong các lập hợp nhỏ của 10-50 bản sao. Chúng rải khắp bộ gen. Các trình tự lặp lại cao như vậy là không được phiên mã thành A R N . Trong các phòng thí nghiệm, các nhà khoa học đã dùng các trình tự này trong các nghiên cứu di truyền, vai trò của chúng trong eukaryote còn chưa sáng tò. b) C ác tr ìn h tư lã p la i vừ a p h ả i là dư ơc p h iê n m ã Trẽn hình 1.28 đã dần ra N ST mà tại đầu cuối cùa nó có trình tự gọi là telemere, đó là một kiểu trình tự lặp lại với mức độ vừa phải. Các telemere duy trì chiểu dài và tính toàn vẹn của NST như các bản sao. Các trình tự này không được phiên thành ARN . Ngược lại, một sô' các trình tự AD N lặp lại mức vừa phải là được phiên mã. Các trình tự này mã hoá đối với các tARN và rARN , vốn là được sử dụng trong tổng hợp protein. Tế bào phiên mã các tARN và rARN một cách ổn định, nhưng thậm chí với tốc độ phiên mã cực đại, các bản sao đơn cùa các trình tự AD N mã hoá chúng đáng tiếc là không tương ứng đê’ hầu hết các tế bào sừ dụng số lượng lớn các phân tử cần thiết này; vì lý do đó, bộ gen có nhiều bản sao của các trình tự ấy. Từ khi các trình tự lặp lại vừa phải này được phiên mã thành A R N , chúng được gọi mội cách thích hợp là các "gen" và chúng ta có thể nói về các gen rARN và các gen tARN. Trong động vật có vú, có bốn phân tử rARN khác biệt tạo thành ribosom: 18S, 5,8S, 28S và 5S các rARN . (Thuật ngữ "S"(size) mô tả kích thước của phân từ hợp chất được thể hiện ra trong máy ly tâm). 18S, 5,8S và 28S rARN được phiên mã từ các trình tự ADN lặp lại như là các tiền chất cùa phân tử ARN , vốn là hai lần kích thước của ba sản phẩm cuối cùng (hình 1.30). Một số các bước sau phiên mã cắt tiền chất thành ba sản phẩm rARN cuối cùng và thải bỏ A R N hoặc "phẩn đệm” không còn sử dụng. Trình tự mã hoá các ARN ấy là các trình tự lặp lại vừa phải trong con người: tổng của 280 bản sao của trình tự định cư trong các tập hợp trên 5 NST khác biệt. Các trình tự lập lại vừa phải này vẫn còn được cô' định trong các vị trí trẽn bộ gen. Tuy nhiên, một lớp khác của các trình tự lặp lại vừa phải có thể biến đổi vị trí của chúng, làm chuyển dịch bộ gen. ADN Ị ADN Í B i ~ 18S 5,8S 28S Bản phiên ^ sơ khai ARN I — y — Quá trinh cắt bỏ các đoạn đệm ren Q B B M Hinh thành 3 rARN 18S 5,8S 28S Hỉnh 1.30. Trinh tự lặp lại vừa phải mã hoá rARN Gen rARN này cùng vùng đệm không được phièn mã của nó, là được lặp lại 280 lần trong bộ gen người, với các tụ tập trên 5 NST. Một khi gen này đã được phiên, quá trình sau phiên mã loại bỏ các đoạn đệm bên trong vùng được phiên và tách bản phiên sơ khai (mARN sơ khai) thành 3 sàn phẩm rARN cuối cùng (Theo Purvez et a l., 2008). c) C ác g e n n h ả y (Lransposons) d ic h c h u yển bô g e n (genome) Hầu hết các trình tự AD N lặp lại vừa phải còn lại rải rác không hoà nhập ổn định vào bộ gcn. Các trình tự như vậy được gọi là các gen nháy (hạt chuyển). Chúng chiếm khoảng 55 45% của bộ gen người, nhiều hơn so với 3 - 10% được phát hiện trong các eukaryote đã dược phân tích trình tự khác. Có 4 kiểu chủ yếu của các gen nhảy trong eukaryote: 1) SINEs (các thành phần ngắn ở giữa) dài 500 bp và được phiên mã, nhưng không được dịch mã. 2) LINEs (các thành phần dài ờ giữa) dài 7.000 bp và một số được phiên, được dịch thành các protein. Chúng cấu thành khoảng 15% của bộ gen nguời. Cả hai thành phần này hiện diện trong hơn 100.000 bản sao. Chúng dịch chuyển trong bộ gen theo các con đường khác nhau: Chúng tạo nên bản sao A R N cùa bàn thân chúng, bán sao này hoạt động như khuôn đúc đối với AD N mới, vốn sau đó tự chèn vào vị trí mới trong bộ gen. Trong cơ chế "sao chép và dán" này, trình tự nguyên gốc vẫn ở tại chỗ cũ và bán sao tự chèn vào vị trí mới. 3) Cúc gen nhảy ngược (retrotranposons) cũng tạo nên bản sao A R N của chính chúng khi chúng dịch chuyển trong bộ gen. Chúng cấu thành 17% của bộ gen người. Một sô' trong chúng mã hoá một vài protein cần thiết cho sự dịch chuyển của bản thân chúng và không làm các thứ khác. Kiểu đon cùa các gen nhảy ngược, chiếm tỷ lệ 11% bộ gen người: nó hiện diện trong hàng triệu bản sao rải khắp toàn bộ các nhiễm sắc thể. 4) Các gen nhảy A D N là tương tự với các prokaryote tương ứng của chúng. Chúng không sử dụng trung gian A R N , thực tế di chuyển đến điểm mới trong bộ gen mà không tái bán (hình 1.31). 1) Gen nhảy mang gen đối với transposase, vốn kích thích sự vận động của ADN Gen nhảy ADN B M m i ^ r â m ã i Ẽ ĩ ! ! \ \ -— «— ' - Lặp lại đào đoạn I Lặp lại đảo đoạn Gen mã hoá protein 2) Transposase cho phép ADN tạo vòng cuộn và di chuyển đến nơi mới trong bộ gen 3) Gen nhảy đã tự cài được vào bên trong gen mã hoá protein, phá vờ nó Gen bị phá vờ / Gen bị phá vỡ ___________________| \ / 4) ...và mARN không hoạt đông và/hoăc protein Hinh 1.31. Các ADN gen nhảy và chuyên đoạn (chuyển gen). Tại đầu của mỗi ADN gen nhảy là trinh lự lặp lại đã đào đoạn vốn giúp quá trình chuyển gen (Theo Purvez et al., 2008). Các trình tự di chuyển này có vai trò gì trong tế bào? Đã có vài trả lời cho câu hỏi này. Cho đến nay câu trả lời tốt nhãt hình như phải rằng các gen nhảy là các ký sinh tế bào vốn tự tái bán giản đơn. Nhưng các tái bản này có thể dẫn đến sự cài (chèn) gen nhảy tại vị trí mới có thể gây ra các hậu quả quan trọng. V í dụ, cài gen nhảy vào vùng mã hoá của gen làm xuất hiện dột biến (hình 1.31). Hiện tượng này đã được phát hiện Irong các dạng hiếm của một số bệnh di truyền ớ người, bao gồm bệnh ưa chày máu và bệnh loạn dinh dưỡng. Nếu xáy ra sự cài gen nhảy vào dòng tế bào mầm (gốc), giao tử bị các đột biến mới. Nếu cài vào tẽ bào soma, có thể bị ung thư. Nếu gen nhảy tái bản không chính xác bản thân nó, nhưng gen lân cận cũng như vậy, kết quả có nhân dôi gen. Gen nhảy có thế mang gen hoặc phần cùa nó đến chỗ mới trong bộ gen, chuyên vặt liệu di truyền và tạo các gen mới. Rõ là sự chuyển chỗ kích thích cái bầy di truyền trong bộ gen eukaryote và bằng cách đó góp phẩn vào sự biến dị gen. Bây giờ chúng ta xem xét các gen mã hoá các protein. 1.2.6.8. Cấu trúc của cá c gen mã hoá protein Giống với các phần tưcmg đổng prokaryote của chúng, nhiều gen mã hoá protein là các trình lự ADN sao đơn. Nhung các gen eukaryote có hai đặc trưng khác biệt vốn không phổ biến giữa các prokaryote. Thứ nhất, chúng chứa các trình tự ờ giữa không mã hoá vả thứ hai, chúng tạo nên các họ gen - các nhóm gen liên quan về cấu trúc và chức năng trong bộ gen (genome). a) C ác g e n m ả hoá p r o te in c h ứ a c á c tr ìn h tự sư ờ n v à g iữ a k h ô n g g h i m ã Trước miền mã hoá (ghi mã) của gcn eukaryote là vùng (gcn) khởi động (promoter), nơi ARN polymerase gắn vào để bắt đẩu quá trình phiên mã. Tuy nhiên, không giống vói enzym prokaryote, A R N polymerase eukaryote tự nó không nhận biết được trình tự khởi động, đòi hỏi sự trợ giúp từ các phân tử khác. Tại một đầu khác cùa gen, sau vùng mã hoá, là trình tự ADN được gọi một cách tương ứng là vùng kết thúc (terminator), vốn tín hiệu kết thúc sự phiên mã khi nó đã được tổng hợp (hình 1.32). Mã khỏi Chỗ nối Hình 1.32. Cấu trúc và phiên mã của gen eukaryo te Gen |Ị - globin dài khoảng 1.600 bp. Các exon là các trinh tự mã hoá proteih, chứa 441 cặp baza (các mă bộ ba cho 146 axit amin cộng bộ ba dừng). Các intron là các trinh tự ADN không mã hoá nằm giữa các mã 30 và 31 (dài.130 bp) vã giữa các mã 104 và 105 (dài 850 bp) là được phiên khởi đầu, nhưng được cắt bỏ khỏi tiển mARN {Pre - mARN), bản phiên ARN sơ khai (initial RNA trans - cript) (Theo Purvez et al., 2008). 57 Các gen mã hoá protein eukaryote cũng chứa các trình tự bazơ không mã hoá, được gọi là các intron. Một hoặc nhiều intron ờ giữa các miền mã hoá vốn được gọi là các exon. Các bản phiên của các intron xuất hiện Phương pháp nghiên cứu trong bản phiên sơ khai, được gọi là tiền - m ARN (mARN sơ khai, pre - mRNA), nhưng theo thời gian, mARN trưởng thành (mARN sẽ được dịch mã) rời khỏi nhân, chúng dã dịch Cẩn thận thời điểm gia nhiệt. Hai sợi của phân tử ADN biến tính (tách ra) Nếu sợi thử là ADN sợi đơn hoăc thêm ARN để biến Ưnh ADN... ...nó liên kết sợi ADN khuôn, tạo nên các phàn tử lai sợi kép chuyển. Các đoạn phiên (transcripts) intron đã bị cắt khỏi tiền mARN (pre - mARN) và các đoạn axon được nối vói nhau. Các intron ở đâu bên trong gen eukaryote? Con đường dễ nhất để phát hiện ra điều đó là bằng cách lai axit nuclcic, phương pháp vốn đã có nguồn gốc phát hiện được sự tồn tại của các intron. Những nét chủ yếu cúa phương pháp này được phác 5’ 3' ỉ Làm biến tính Hình 1.33. Lầi axit nucleic tháo trẽn hình 1.33 đã là quyết định đối với sự nghiên cứu quan hệ giữa các gen và các bán phiên mã (transcripts) cùa chúng. Căp đôi base cho phép khám phá trình tự bổ sung đối vỏi sợi ADN thử (sợi ADN dò, probe). ÍTheo Purvez et al.. 2008V Các nhà sinh học đã sử dụng phép lai axit nucleic để kiểm tra gen p - globin, vốn mã hoá một trong các protein cấu thành hemoglobin (hình 1.34). Trước hết họ làm biến tính ADN p - globin bằng cách gia nhiệt cho nó, tiếp theo bổ sung m ARN p - globin trưởng thành. Như mong đợi, m ARN gắn vào ADN bời cặp bazơ bổ sung. Các nhà nghiên cứu đã mong chờ thu nhận được cặp mạch thẳng của m ARN đối với A D N mã hoá. Sự mong đợi đã được đáp ứng chỉ một phẩn: đã có các đoạn thay thế của sự lai A D N - A R N , nhưng cũng đã nhìn thấy vài cấu trúc vòng. Những vòng này là các intron, các đoạn AD N vốn không có các bazơ bổ sung trên m ARN trưởng thành. Các nghiên cứu muộn hơn đã chỉ ra rằng, sự lai m ARN cúa tiền m ARN (pre - m ARN ) vào AD N đã hoàn thành, làm lộ rõ ra các intron thay thế được phiên mã. Một nơi nào đó trên con đường từ bản phiên mã sơ khai (pre - m ARN) đến m ARN trưởng thành, cấc intron đã bị loại bỏ và các exon đã được nối với nhau. Chúng ta sẽ kiểm tra ngắn gọn quá trình nối này. Hấu hết (nhưng không phải tất cả) các gen cùa dộng vật có vú chứa intron như nhiều gen của các cơ thể eukaryote khác (và thậm chí một ít gen prokaryote). Các intron phá vỡ sự liên tục, nhưng không trộn lẫn, trình tự AD N vốn mã hoá chuỗi polypeptit. Trình tự bazơ của exon sắp xếp theo trật tự, là bổ sung đối với trình tự của m ARN trưởng thành. Do vậy, các intron tách biệt khỏi vùng mã hoá protein của gen thành các vùng khác biệt - các exon. Trong một số trường hợp, các exon được tách biệt ghi mã cho các vùng chức năng khác nhau hoặc các miền (domains) của protein. V í dụ, các protein globin cấu thành hemoglobin có hai miền: một là để gắn vào sắc tố không protein, được gọi là hem và miền khác đổ liên kết vào các đơn phân globin khác. Hai miền này được mã hoá bời các exon khác nhau trong các gen globin. Thực nghiçrn Cáu hói: Có các vùng bên trong trìnli tự mã lioá cùa gen vốn kliông lioạt động trong mARN của nó? Phương pháp Exon 1 Exon 2 Exon 3 \ mARN globin được phiên mã từexon 1 và exon 2 1) ADN chuột bị biến tinh cục bỏ và được lai vào mARN từ gen chuột. 2) mARN lai với ADN khuôn của gen nó, tạo ra các sợi kép dày. Cảc vòng mỏng cũng được hình thành bởi các sợi không làm khuôn của ADN vốn được mARN thế chỗ Kết quà Có intron: Sợi không làmkhuỏn rn A R N 3) Intron sợi kép được gia cỏng thành vòng bỏi mARN, mang hai exon lại với nhau 7 4) Nốu không có intron, ADN Sợi ADN sẽ lai vâi mARN trong sợi lôn tục. được thế chỗ K ế t lu ậ n : ADN chứa các miền không mă hoá bên trong các gen vốn không hiện diện trong mARN trưởng thành. Hình 1.34. Lai axit nucleic đã phát hiện ra ADN không mã hoá Khi bản phiên mARN của gen p - globin đã dược lai thực nghiệm với ADN sợi kép của gen đó, cc intron trong "vòng nhô ra" của ADN, chứng minh rầng vùng mă hoá của gen eukaryote có thể chứa ADN không mã hoá vốn là không hiện diện trong bản phiên mã mARN trưởng thành. b) Nhiều gen eukaryote là thành phần của các họ gen Nhiều gen của tất cả các gen eukaryote mã hoá protein hiện diện trong chỉ một bản sao trong bộ gen đơn bội (haploid genome). Phần còn lại có nhiẻu bàn sao. Thường, khống chính xác, các bản sao không chức năng của các gen riêng biệt, được gọi là các gen giả (pseudogenes), liên kết chặt vào các gen chức năng. Các bản sao này có thê phát sinh bới sự kiện không bình thường trong sự trao đổi chéo NST trong giảm phân hoặc bởi tác động cùa các gcn nhảy (transposons). Tuy nhiên, trong các trường hợp khác, bộ gen chứa các gen bị biến đổi nhẹ của các gen chức năng. Tập hợp các bàn sao hoặc các gen liên quan được gọi là họ gen (gene family). Một số họ gen, ví như các gen mã hoá các globin vốn là thành phần của hemoglobin, chỉ chứa một Í1 thành phẩn; các họ gen khác, ví như các gen mã hoá các immunoglobulin vốn tạo nên các kháng the (antibodies), có hàng trăm thành phần. Tương tự thành phần của bất kỳ họ nào; 59 các trình tự ADN trong họ gen thường là khác biệt với nhau. Một thành phẩn còn lại càng lâu trong trình tự ADN gốc và ghi mã như thế cho protein đúng, các thành phần khác có thể đột biến nhẹ, nặng hoặc hoàn toàn không. Tính sẩn có của các gen "thái cực" như vậy là quan trọng đối với các "thực nghiệm" trong tiến hoá. Nếu gen bị đột biến là hữu ích, nó có thề được chọn lọc cho các thế hệ kế tiếp. Nếu gen bị mất hoàn toàn (gen giả), bản sao chức năng còn ớ đâu dó được cứu vớt. Họ gen mã hoá các globin là ví dụ tốt cho các họ gen được phát hiện trong dộng vật có xương sống. Những protein này đã được tìm thấy trong hemoglobin cũng như trong myoglobin (protein liên kết ôxy hiện hữu trong cơ). Các gen globin xuất phát từ gen đơn tổ tiên chung từ xa xưa. Trong con người có 3 thành phần chức năng của tập hợp a - Tụ tập gen Ị$ - globin ADN "chêm" dược phát hiện giữa các thành phần của họ gen Hình 1.35. Họ gen globin C á c tập hợp a - globin và p - globin của cjen qỊobin người định CƯ trên cẩ c N S T khác nhau. C á c gen cua môi tập hơp đữợc tách biệt bởi ADN "chêm " không mã hoá. C á c gen già không chức năng được chỉ ra trong hình bởi chữ H y Lạp ỹ (p si). globin và 5 trong tập hợp p — globin cnưc nang aưọc cm ra irong ninn DOI cnư ny Lạp Y (psi). (hình 1.35). Trong cơ thể trường thành, mỗi phàn tử hemoglobin là tứ phân chứa bốn sắc tố hem (mỗi hem ở bên trong đơn phân polypeptit globin), hai đơn phân a - globin y hệt nhau (hình 1.36). Các a _ đan phân Các p - đơn phân Heme Hỉnh 1.36. Cấu trúc bậc bốn của protein Hemoglobin gồm 4 đơn phản polypeptit cuộn xếp tự tập hợp thành cấu trúc bậc bốn được chì ra trèn hình. Trong hai đổ hoạ dại diện này, mỗi kiểu đơn phân có màu khác nhau. Các nhóm hem chứa sắt và là các nơi mang ôxy. Thêm vào các gen mã hoá các protein, họ gen globin bao gổm các gen giả không chức năng được ký hiệu bòi chữ Hy Lạp \ụ (đọc là psi). Các gen giả (pseudogenes) này là "vận đen" của bất kỳ họ gen nào: chúng là kết quả từ các đột biến dẫn tới sự mất chức năng hơn là tăng cường, hoặc gen mới. Trình tự ADN cùa các gcn giả không khác biệt nhiều so với các thành phần khác của họ gen. V í dụ, nó có thổ đơn giản là thiếu vùng khởi động (promoter) và như vậy mất khả năng được phiên mã. Hoặc I1Ó có thế thiếu nơi nhận biết cần dế loại bỏ các intron (quá trình sẽ được mô tả trong phẩn tiếp theo) và như vậy được phiên thành tiền mARN (pre - m ARN), nhưng không được cắt nối chính xác thành mARN trướng thành. Trong một số họ gen, các gen giả vượt quá số lượng các gen chírc năng. Vì ràn» một số các thành phần của họ là hoạt dộng, ớ dó xuất hiện một áp lực chọn lọc nhẹ đối với tiến hoá để loại bỏ các gen giả. (>0 1.2.6.9. Cát nôi A R N (quá trinh cát nói tiến mARN thành mARN trướng thành) Như đã biết trong phần trước, các gen mã hoá protein eukaryote chứa một số các trình tự không xuất hiện trong mARN trướng thành vốn được dịch thành các protein. Để tạo ra m ARN trướng thành, bản phiên sơ khai (pre - mARN) phải được cắt nối theo một sô' con dường: các intron phải được loại bó, các exon được nối với nhau, bổ sung các bazơ vào cả hai đầu. (ỉ) B ả n p h iê n m ã sơ k h a i (tr a n s c r ip t) củ a g e n m ã h o á p r o te in dư ợ c b iên dổ i tạ i cả h a i d ầ u Hai bước sớm nhất trong quá trình xứ lý (cắt nối) tiền m ARN (pre - inARN ) xảy ra trong nhân (hình 1.37). , Miến mã hoá của phiên Enzym phàn cắl ARN đã hem mu cua G TP bản s ơ | ^a cây lúa (O^za sativa) cây ° ° ngũ cốc, cung cáp trực tiẽp 1/3 khau phan lương đối vối sự sống của con người không phải thực cho loài người, mới đây đã được xác lập trinh vàng, ngọc bích, mà là hạt ngũ cốc: lúa (hình ,ư *đâ đư?° bàn đ° 9en>- 1.39), lúa mỳ, ngô, cao lương, kê. Đối với chúng ta, lúa chiếm vị trí hàng đầu. Mới đây các nhà khoa học đã công bô các trình tự bộ gen (genome) của lúa. Tương tự các cơ thể eukaryote khác, lúa có nhiều AD N hơn so với cơ thể prokaryote điển hình - khoảng 430 triệu cập bazơ (base pairs, bp). Nhưng không đóng gói chặt như bộ gen prokaryote, bộ gen của lúa chứa nhiẻu intron (đoạn ADN không mã hoá protein hoặc ARN), số các trình tự ấy là các AD N chèm (spacer) hoặc là không có chức năng, hoặc chưa tìm ra chức năng. Các trình tự khác là những trình tự lặp lại, ví như AD N telomere tại các đẩu cuối cùa các nhiễm sắc thể (hình 1.286). Ngoài các gen cẩn cho sự trao đổi chất tương tự như ở các cơ thể tiển nhân, các cơ thể có nhân có các gen vón làm cho chúng trò thành cơ thể phức tạp: các gen địa chi, hoặc đích, các protein đi đến các bào quan và các gen cho sự tương tác tế bào - tế bào và sự phân hoá tế bào. Sự phiên mã và quá trình cắt, nối mARN phức tạp hơn trong eukaryote so với trong prokaryote. Bộ máy phân tử tinh vi cho phép điều hoà chính xác sự biểu hiện gen, cần cho lất cả mọi tế bào của cơ thể để phát triển và hoạt động. 1.2.7. Điểu hoà biểu hiện gen ở cơ thể có nhân (eukaryote) Cơ thể đa bào với các tế bào và các mô chuyên biệt, mỗi tế bào chứa nhiều gen trong bộ gen của cơ thể. Để phát triển, quá trình phải bình thường, đối với mỗi tế bào phải có và duy trì được chức năng chuyên biệt của bản thân nó. Một số protein phải được tổng hợp chính xác vào đúng thòi 4>ian và đúng tế bào. Như vậy sự biểu hiện gen của các gen eukaryote phải được điều hoà chính xác. Sự biểu hiện gen có tính chọn lọc cao. Sự biểu hiện gen phải được điều hoà tại một số điểm (hình 1.41): trước phiên mã, trong phiên mã, sau phiên mã và trước dịch mã, trong dịch mã hoặc sau dịch mã. Chúng ta sẽ mô tả dẫn đến kết quả trong sự phiên mã chọn lọc cùa các gen chuyên biệt (đặc hiệu). Mộl số các cơ chế này liên quan đến các protein nhân vốn làm thay đổi cấu Irúc và chức năng cùa NST. 63 Trong các trường hợp khác, điều hoà phiên mã liên quan đến những biến đổi trong bản thân AD N : các gen được tái bàn một cách chọn lọc để cung cấp nhiều hơn các khuôn cho sự phiên mã, hoặc thậm chí tái sắp xếp trên NST. Điều hoà sự phiên mã trong các eukaryote phức tạp nhiều hơn so với trong prokaryote. Các quan điểm về mối tương lác protein - AD N vẫn còn giá trị, nhưng bản chất và số lượng các protein tương tác là lớn hơn nhiều do có một số các khác biệt lõ rệt. Thứ nhất, các AD N eukaryote được tổ chức thành cromatin (chất nhiễm sắc, sẽ được mô tả trong mục 1.2.8), làm phức tạp rõ rệt các mối tương tác AD N - protein. Thứ hai, như đã nói ở trên, sự phiên mã eukaryote xảy ra ở trong nhân và sự dịch mã được thực hiện trong tế bào chất; trong prokaryote, các quá trình này được liên kết về không gian và thời gian. Điẻu đó cung cấp nhiều hơn các cơ hội cho việc điều hoà trong eukaryote so với trong prokaryote. ADN trong nhản chứa các gen mả hoá protein Các gen đã đưọc phiên mả để tạo mARN Phièn bản tiền mARN được sản ra Tiền mARN đã được cát nôì - một phấn đã đuọc cắt bỏ, các đẩu cuổi đã thêm vào và mARN kết quà được chuyển đến tế bào chất Trong té' bào chất, các ribosom dịch mARN thành protein (polypeptit) được mã hoả bởl gen Hlnh 1.40. mARN eukaryote được phiên mã trong nhân nhưng được dịch mã trong tế bào chất. So sánh các bước của hình này với các bước của prokaryote trong hình 1.5. V ì có những khác biệt như thế, số lượng của A D N liên quan trong sự điểu hoà các gen eukaryote lớn hơn rất nhiều. Cần có cấp độ cao của sự điều hoà linh hoạt là đặc biệt quan trọng đối với các eukaryote đa bào, với các chương trình phát triển phức tạp của chúng và các kiểu mồ đa dạng. 1.2.7.1. Các tác nhân phiên mã có th ể là chung hoặc chuyên biệt Điều hoà phiên mã ớ các cơ thể có nhân đòi hói hàng loạt các tác nhân phiên mã, những tác nhân protein này có hai loại: các tác nhăn phiên m ã cluing và các tác nlián phiên mữ chuyên biệt (dặc hiệu). Các tác nhân phiên mã chung cần cho tập hợp của bộ máy phiên mã và liên kết A R N polymerase II vào vùng khởi động. Các tác nhân chuyên biệt gia tăng mức độ phicn mã trong các kiểu tế bào xác định, hoặc trong phản ứng đối với các tín hiệu. a) Các tác nhân phiên m ã chung Sự phiên mã của các khuôn A R N polymerase II (phần lớn phải là các gcn mã hoá các 6 ‘1 sán phẩm protein) đòi hỏi nhiều hơn so với đúng A R N polymerase II để khới đầu phiên mã. Nhiều tác nhãn phiên mã chung cũng cần thiết đé xác lập sự khới đầu hiệu quả. Những tác nhân này cẩn để cho sự phiên mã xảy ra. Nhưng chúng không gia tăng tốc độ vượt tốc độ cơ sớ này. Các lác nhân phicn mã chung được đại tên với các chữ ký hiệu theo chữ viết tắt T FII, cho tác nhân phiên mã ARN polymerase II (theo chữ đầu của từ tiếng Anh "transcription factor RNA polymerase II"). Quan trọng nhất của các tác nhân này, TFIID , chứa các protein liên kết - T A T A vốn nhận biết trình tự hộp T A T A được phát hiện trong nhiều vùng khởi động eukaryote (hình 1.41). Tiếp theo sự liên kết cùa T F IID là liên kết của T F IIE , T F IIF , T FIIA , TFIIB. TFIIH và nhiều các tác nhân phụ trợ, được gọi là các tác nhân phối hợp - phiên mã (transcription — associated fa cto rs), T A F s. Pliícc hệ Vùng khỏi động thymidin kinase _A _ ^ A ^ _ Gen ' '• thymidin GX XAAT GX TATA : kinase -100 bp -8 0 b p -6 0 bp -2 5 bp : „ t i \ ■ .Nơi: I____________ l - — khỏi (+1) ỉ--------------------------------------; đầu cạp base (bp) Hình 1.41. Vùng khởi động (promoter) eukaryote Vùng khởi động này là đối với gen mã hoá enzym thymidin kinase. Sự hình thành phức hệ khởi đầu phiên mã bắt đẩu với tác nhân phiên mã chung gắn vào hộp TATA (TATA box). Có ba trinh tự ADN khác điếu khiển mối liên kết của các tác nhân phiên mã chuyên biệt. khởi đẩu (initiation complex) (hình 1.42) là phức tạp hơn rất nhiều so với holoenzym ARN polymerase vi khuẩn gắn vào vùng khởi động. Còn có ihêm mức phức tạp khác: phức hệ khởi đầu, mặc dầu có thể khỏi đầu sự tổng hợp protein ở mức cơ sở, không đạt đến sự phiên mã ỏ mức cao mà không có sụ tham gia của các tác nhân chuyên biệt khác. b) C á c tá c n h ã n p h iê n m ã c h u y ê n b iệ t (đặc hiệu) Các lác nliân phiên m ã chuyên biệt tác động trong mô - hoặc kiểu phụ ihuộc thời gian để kích thích các mức phiên mã cao hơn so với mức cơ sờ. Số lượng và sự đa dạng của các tác nhân này là vượt trội hoàn toàn. Một sô' hướng có thể được thực hiện sự tăng sinh này của các tác nhãn bằng cách tập trung trên hoạ tiết gắn kết AD N , tương phản với ARN polymerase II các tác nhân chuyên biệt. Đề tài mớ lối chung đã xuất hiện từ sự nghiên cứu các tác nhân này là các tác nhân phiên mã chuyên biệt, dược gọi là các chất hoại lioá, có lổ chức miền. Mỗi lác nhân bao gồm Hình 1.42. Sự hình thành phức hệ khởi đẩu eukaryote Các tác nhản phiên mã chung, TFIID, gắn vào hộp TATA và dược nối bỏi các tác nhân phiên mả khác, TFIIE, TFIIF, TFIIB và TFIIH. Phức hệ này được thêm vào bởi thành phần của các tác nhân phối hợp phiên mã (TAFs) vốn cùng nhau tiếp nhận phân tử polymerase II vào lõi của vùng khởi động. (Raven et ai., 2010). WT.S«HHỌCPT 65 miên liên kết AD N và miên hoạt hoá tách biệt vốn tương tác với bộ máy phiên mã và các miền này chú yếu là độc lập trong protein. Nếu các miền liên kết A D N được "trao đổi" giữa các tác nhân khác biệt, tính đặc hiệu liên kết đối với tác nhân được chuyển đổi mà không gây ảnh hưởng đến khả năng của chúng đối với sự phiẽn mã. 1.2.7.2. Các miến khởi dộng và các miền nhân phiên mã Các miền khởi động (promoters), như đã được nói đến ở trẽn, tạo nên các vị trí liên kết cho các tác nhân phiên mã chung. Sau đó các tác nhân này là trung gian gắn AR N polymerase II vào miền khởi dộng và cũng như sự gắn kết của A R N polymerase I và III vào các miền khởi động dặc hiệu cùa chúng). Ngược lại, phẩn holoenzym của A R N polymerase của các prokaryote có thể trực tiếp nhận biết miền khới động và gắn kết vào nó. C ác micn tăng cường về nguồn gốc đã được định nghĩa như là các trình tự ADN cần thiết đối vởi các mức cao của sự phiên mã vốn có thể hoạt động độc lập của vị trí và định hướng. Trước hết, quan điểm đó hình nhu phàn lại trực giác, đặc biệt từ khi các nhà sinh học dã có điều kiện sử dụng các hệ thống prokaryote đé dự đoán các vùng điều hoà phải là ngược dòng trực tiếp của miền mã hoấ xuất hiện tình huống các miền tăng cường là nơi liên kết của các tác nhân phiên mã chuyên biệt. Khả năng của các miẩn tăng cường tác động từ xa đã là sự bối rối thứ nhất, nhung bây giờ các nhà nghiên cứu cho rằng, tác động này được thực hiện bởi sự uốn cong A D N để tạo nên dạng vòng đẩy trình tự tăng cường vào vị trí áp sát miền khởi động. Mặc đầu quan trọng hơn trong các hệ Ihống eukaryote, sự tạo vòng như vậy đã là minh chứng đầu tiên sử dụng các protein liên kết A D N (hình 1.43). Điểm 66 tăng cường là các vị trí liên kết dôi với các tác ADN cuộn quanh do vậy chất hoạt hoá đến tiếp xúc với ARN polymerase. ARN polymerase Chất hoạt hoá Gen tâng cường Tổng hợp mARN ■•Gen tăng cường Chất hoạt hoá kích hoạt ARN polymerase và bắt đầu phiẽn mã. AON thảo cuộn. Hình 1.43. Các protein gây nên vòng ADN Khi chất hoạt hoá vi khuẩn NtrC gắn vào trình tự tăng cường, nó làm cho ADN tạo vòng khắc phục được vị trí cách xa nơi ARN polymerase được liên kết, do vặy hoạt hoá được sự phiên mã. Mãc dầu các trình tự tăng cưởng là hiếm trong các prokaryote, chúng phổ biến trong eukaryote (Theo Raven et al., 2010). quan trọng là khoảng đường thẳng tách biệt hai vị trí trên N ST đã khỏng thể hiện ra khoảng cách vật lý lớn, vì rằng tính thích ứng của AD N cho phép uốn cong và tạo vòng. Chất hoạt lính gắn vào miền tăng cường có thể phải tiếp xúc với các tác nhân phiên mã được gắn vào miền khới động từ xa (hình 1.44). Tác nhân Hỉnh 1.44. Các gen tăng cường hoạt động như thế nào Vị tri miền tăng cưởng là định vị cách xa gen phải được điều hoà. Liên kết cùa chất hoạt hoá vào miền tăng cưòng cho phép chất hoạt hoá tưong tác với các tác nhân phiên mã liên hợp với ARN polymerase, klch Ihich sự phiên mã. 1.2.7.3. Các chất đóng hoạt hoá và chất trung gian liên kết các tác nhàn phiên mã vào ARN polym erase II Các tác nhân phiên mã khác trung gian một cách đặc hiệu tác động của các tấc nhân phiên mã. Các chất đồng hoại lioá (coactivators) và các chất trung gian (mediators) cũng là cẩn thiết cho sự hoạt hoá phiẽn mã bởi tác nhân phiên mã. Chúng tác động bằng cách gắn một số các tác nhân phiên mã và sau đó liên kết vào phần khác của bộ máy phiẽn mã. Các chất trung gian là thiết yếu cho sự hoạt động của một vài tác nhân phiên mã, nhimg không phải toàn bộ các tác nhân phiên mã đòi hỏi chúng. Số lượng các chất dồng hoạt hoá ít hơn nhiều so với sô' lượng của các tác nhân phiên mã, vì nhiều các tác nhân phiên mã có thể sử dụng cùng một chất đổng hoạt hoá. 1.2.7.4. Tập hợp các thành 'phẩn của p h út hệ phiên mã Mặc dầu một vài nguyên tắc chung áp dụng phạm vi rộng của các tình huống, hầu như mỗi gen eukaryote - hoặc nhóm các gen vói sự điều hoà được phối hợp - giới thiệu một trường hợp duy nhất. Hầu như tất cả các gen là được phiên mã bởi A R N polymerase II cần một bộ các tác nhãn chung để tập hợp phức hệ khởi đẩu, nhưng tập hợp phức hệ này và mức phiên mã cuối cùng của nó phụ thuộc vào các tác nhân phiên mã chuyên biệt vốn phối hợp tạo nên phức hệ phiên mã (hình 1.45). Do vậy, sự hình thành các vùng khởi động là, hoặc rất đơn giản, nếu chúng ta chỉ xem xét cái gì là cần cho phức hệ khởi đầu; hoặc rất phức tạp, nếu chúng ta xem xét tất cà các lác nhân vốn có thể gắn vào bên trong phức hệ và ảnh hướng đến phiên mã. Kiểu này cùa sự điều hoà phối hợp gen dẫn đến tính linh động lớn, vì 67 nó có thể phán ứng đối với nhiểu tín hiệu tế bào có thể nhận được sự phiên mã hiệu quả, cho phép tích hợp các tín hiệu này (Raven et al., 2010). Các tảc nhân chung Các gen hoà này gắn vào ADN tại các ndi xa được biết như là các miền tăng cường. Khi ADN uốn cong do vây miển tăng cường được mang vào gần với phức hệ khởi đầu, các protein hoạt hoá tương tác với phức hệ làm tăng tốc dộ phiên mã Các chất đống hoạt hoá Các tác nhân phiên mâ này truyền các tín hiệu từ các protein hoạt hoá đến các tác nhân chung. Lõi của gen khỏi động Các tác nhân chung Các tác nhàn phièn mả này định vị ARN polymerase tại ndi khỏi hành của trình tự mả hoả protein và sau đó giải phóng polymerase để bát dầu phiẻn mả. Hình 1.45. Các tương tác của các tác nhân khác nhau bên trong phức hệ phiên mã Tất cả các tác nhản phiên mã chuyên biệt gắn vào các trinh tự tăng cường vốn có thể là cách xa miền khởi động. Các protein này sau đó tương tác với phức hệ khởi đẩu nhờ vòng ADN mang các tác nhân đến gần với phức hệ khởi đầu. Như đã mô tả chi tiết trong kênh chữ, một số các tác nhân phiên mã, được gọi là các chất hoạt hoá, có thể tương tác trực tiếp với ARN polymerase II hoặc phức hệ khỏi đẩu, trong khi các tác nhân khác đòi hỏi phải có thêm các chất đổng hoạt hoá. (Theo Raven et al., 2010). 1.2.8. Cấu trúc crom atin (chrom atin) eukaryote Các cơ thể có nhân (eukaryotes) có sự biểu hiện gen bổ sung vượt rào A D N sở hữu vốn được đóng gói vào cromatin. Sự đóng gói A D N lần thứ nhất vào các N ST rồi sau đó vào các cấu trúc thứ bậc cao hơn của cromatin mà hiện nay cho rằng phải liên quan trực tiếp đến sự điều hoà biểu hiện gen. Cấu trúc cromatin ở mức thấp nhất của nó là sự tổ chức của A D N và các protein histon vào các th ể nhân (nucleosome). Các thể nhân này có thể phong toả sự liên kết của các tác nhân phiên mã và A R N polymerase II tại miền (gen) khởi động (promoter). Tổ chức thứ bậc cao hơn của cromatin, vốn chưa hiểu được hoàn toàn, xuất hiện sự phụ thuộc vào trạng thái của các histon trong các thể nhân. Các histon có thể được biến đổi cho ra kêì quả cô đặc hơn cromatin làm cho các miền khởi động còn ít tiếp nhận đối với các tương tác ADN - protein. Phức hệ tái tạo hình mẫu cromatin rời khỏi có thể làm cho ADN được liếp nhận hơn. 1.2.8.1. Cả ADN và các protein historì có th ể bị biển dối Sự metyl hocí A D N phải có vai trò lớn trong sự điều hoà biểu hiện gen trong các tế bào động vật có xương sống. Bổ sung nhóm metyl vào xytosin tạo nên 5' - metylxytosin, nhưng sự biến dổi này không ảnh hướng đến sự cặp đôi bazơ của nó với guanin (hình l .46). Tương tự, bố sung nhóm metyl vào uraxyl sản sinh ra thymin, vốn rõ là không ảnh hưởng den cặp dôi ba/.ơ với adenin. 68 Nhiều gen động vật có vú bất hoạt là bị metyl hoá và đưa đến kết luận ràng metyl hoấ gây nên sự bất hoạt. Nhưng bây giờ sự metyl hoá được xem như ít có vai trò trực tiếp, phong toá sự Phosphate phiên mã ngẫu nhiên của cấc gen "đã tắt". Các tế bào động vật có xương sống rõ là sớ hữu protein vốn gắn kết vào các tập hợp cùa 5' - metylxytosin, ngãn chặn các chất hoạt hoá phiên mã không Nhóm metyl Hình 1.46. Metyl hoá ADN cho lối vào AD N . Như vậy, sự metyl hoá ADN (rong động vật có xương sóng dám bảo dược rằng mỗi khi gen đã tắt, nó sẽ bị loại. Xytosin bị metyl hoá, tạo nên 5' - metylxytosin. Vì rằng nhóm metyl được định vị tại phía bên, nó không can dự với các liên kết hydro của cặp base G—X; nhưng nó có thể bị các protein nhận biết. Các protein histon vốn tạo nèn lõi cúa thể nhân (nucleosome) cũng có Ihổ bị biến đổi. Sự biến đổi này được hiệu chỉnh với các vùng hoạt tính ngược với vùng bất hoạt của cromatin, tương tự đối với sự metyl hoá A D N như vừa mô tả. Các histon cũng có thể bị mctyl hoá và sự thay đổi này nói chung được phát hiện trong các vùng bất hoạt của cromatin. Cuối cùng, các histon có thể bị biến đổi bời sự bổ sung của nhóm axetyl và sự bổ sung này được hiệu chỉnh với các vùng hoạt tính cùa cromatin. 1.2.8.2. Một s ô chất hoạt hoá phiên mã biến dổi cấu trúc cromatin Điều hoà phiên mã đòi hỏi sự hiện diện của nhiều tác nhân khác nhau đé’ hoạt hoá sự phiên mã. Một số chất hoạt hoá hình như tương tác trực tiếp với phức hệ khởi đầu, hoặc là vối các chất đổng hoạt hoá vốn tự chúng tương tác với phức hệ khởi đầu. Các trường hợp khác là không rõ như thế. Nổi lên sự đồng thuận rằng, một số chất đồng hoạt hoá đã nêu là phải axetyl hoá histon. Trong các trường hợp này, sự phiên mã đã gia tâng nhà sự dịch chuyển cấu trúc cromatin trật tự cao hơn vốn có thé ngăn cản sự phiên mã (hình 1.47). Một số chất đổng ức chế (corepressors) đã nêu cũng phải loại các nhóm axetyl. Các quan trắc này đã dẫn đến sự già định rằng "mã hislon" phải tồn tại, dồng hình đối với mã di truyền. Mã histon này được công nhận là đổ nhấn mạnh sự điều hoà cấu trúc cromatin và như vậy, công nhận lối vào của bộ máy phicn mã đến ADN. Các nucleosom phong toả mổi liên kết của ARN polymerase II vào gen khỏi động — Axit amin đuôi histon đầu cuối BỔ sung các nhóm axetyl vào các đuôi histon thay dổi selenoit do vây ADN sử dụng được cho phiên mã ADN có thể dùng được cho phiên mă Hình 1.47. Sự biến đổi histon ảnh hưởng đến cấu trúc cromatin ADN trong các eukaryote được tổ chức truớc hết vào các thể nhản (nucleosomes) và sau đó vào các cấu trúc của cromatin thứ bậc cao hơn. Các histon tạo nên lõi của thể nhân có các đuòi axit amin nhô ra. Các đuôi axit amin này có thể bị biến đổi bởi sự bổ sung các nhóm axetyl. Sự axetyl hoá biến đổi cấu trúc của cromatin làm cho nó trỏ nên được tiếp nhận vào bộ máy phiên mã. (Theo Raven et al., 2010). 69 1.2.8.3. Các phúc hệ thay dôi chất nhiém sác (cromatirì) cũng biến dổi cấu trúc của nó (chất nhiém sác) Phác thảo về những thay đổi cấu trúc của chất nhiễm sắc có thể điều hoà như thế nào sự biểu hiện gen là sự bắt đẩu của ý tướng. Phát hiện mở đường là sự tồn tại của cái gọi là phức hệ thay đổi chất nhiễm sác (croinatin). Những phức hệ lớn này của các protein bao gồm các enzym vốn biến đổi các histon và A D N và cũng thay đổi bản thân cấu trúc cromatin. Một lớp các tấc nhân cải tân này (các tác nhân thay đổi cromatin phụ thuộc ATP) hoạt động như là các động cơ phân tứ vốn ảnh hướng đến A D N và các histon. Các tác nhân cải tân này sử dụng nãng lượng từ A TP để thay đổi tưcmg quan giữa các histon và AD N . Chúng có thể xúc tác 4 sự biến đổi khác nhau trong liên kết histon/ADN (hình 1.48): 1) thể nhân (nucleosome) trượt dọc theo A D N làm thay đổi vị trí của thể nhân trên A D N ; 2) tạo trạng thái thay đổi nơi AD N được tiếp nhận hơn; 3) chuyển dời các thể nhân khỏi ADN; 4) chuyển chỗ của các histon với các histon biến thể. Tất cả các chức năng này hoạt động để làm cho A D N được tiếp nhận hơn đối với các protein điều hoà, vốn đến lượt, gây tác động tới sự biểu hiện gen. Tác nhân cải tân phụ thuộc A TP Al)l* 4 (J) 2. Thể nhân được thay dổi 3. Thể nhân đổi chỗ 4. Thay thế histon Hinh 1.48. Chức n ỉn g của các tác nhãn thay đổi hình mẵu phụ thuộc ATP Các tác nhân thay đổi hình mỉu phụ thuộc ATP sử dụng năng luọng từ ATP để thay đổi cấu trúc cromatin. Chúng có thể (1) truợt các nucleosom dọc theo ADN để lộ ra các vị tri liên kết cho các protein; (2) tạo nên trạng thái thay đổi hình máu của cromatin noi AON đuọc tiếp nhận hờn; (3) chuyển dời hoàn loàn các thể nhân khỏi ADN và (4) thay thế histon trong các thể nhân với các histon biến thể. 1.2.9. Điều hoà sau phiên mã ở tế bào có nhân (eukaryote) Sự tách biệt phiên mã ở trong nhân và dịch mã ở trong tế bào chất trong eukaryote cung cấp các điểm có thể cho việc điều hoà vốn không tồn tại trong prokaryote. Đã nhiều nãm chúng ta nghĩ về điều đó như là các dạng điều hoà "thay đổi", nhưng bây giò đã xuất hiện điều rằng chúng đóng vai trò trung tâm hơn nhiều so với đã nghi ngờ trước đày. Trong phần này chúng ta sẽ xem xét một số cơ chế kiểm tra sự biểu hiện gen bắt đầu với lĩnh vực mới hứng thú về điều hoà bởi các A R N bé (smal RN As). 1.2.9.1. Các ARN bé tác dộng sau phiên mã dếđiéu hoà biểu hiện gen Nghiên cứu sự phát triển đã dẫn đến nhiều nhận thức quan trọng trong sự điều hoà sự biếu hiện gen. V í dụ nổi bật là sự phát minh ra các A R N bé gây ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen. Mộl thế đột biến dược cách ly trong giun c. elecgans được gọi là lin - 4 đã biết làm thay đổi thời gian phát triển, thể đột biến dị ihời được gọi như vậy. Các nghiên cứu di 70 truyền đã chỉ ra rằng, gen ấy được một gen khác, lin - 14, điều hoà. Khi gen !in — 4 được Ambros, Lee và Feinbaum phân lập năm 1992, các nhà nghiên cứu này đã cho thấy rằng nó không mã hoá sản phẩm protein. Thay vào đó, gen lin - 4 đã mã hoá chỉ hai phân tử ARN bc, một có 22 nt và một có 61 nt (nucleotit). Tiếp theo A R N 22 nt đã xuất phát từ A R N dài 61 nt. Công trình tiếp theo đã chi ra rằng, A R N bé này đã bổ sung cho vùng trong gen dị thời khác, ỉin - 14. Mô hình đã được phát triển nơi A R N lin - 4 đã tác động như là một chất ức chế dịch mã của m ARN lin - 14 (hình 1.49). Mặc dầu nó đã không được gọi đúng lúc, đó đã là lần đầu tiên nhận biết được vi A R N (micro RN A) hoặc m iARN. Hướng khác biệt hoàn toàn đòi hỏi liên quan việc sử dụng các A R N sợi kép để loại bỏ sự bieu hiện gen. Điều đó đã được chỉ ra đối với hoạt động bằng con đường của lớp khác của ARN bé, được gọi là các A R N bé gây nhiễu, hoặc các siA RN . Chúng có thể được đưa vào bằng thực nghiệm, xuất phát từ các virut xâm nhập hoặc thậm chí được mã hoá trong bộ gen (genome). Sử dụng siA RN để điều hoà sự biểu hiện gen đã phát hiện ra sự tồn tại cúa các cơ chế đối với sự điều hoà biểu hiện gen bằng con đường của các A R N bé. Từ khi phát hiện ra điều đó, sự gây câm gen (làm bất hoạt gen) bởi các A R N bé đã là nguồn hứng thú lớn đối với cạ các sử dụng thực nghiệm và như một sự giải thích về sự điều hoà sau dịch mã của biểu hiện gen. V ì các A R N bé này đã được nghiên cứu trong nhiều hệ thống, dẫn đến sự tăng các thuật ngữ để mô tả chúng. Nghiên cứu mới đây đã phát hiộn ra sự phong phú về các kiểu mới của các A R N bé, nhưng chúng ta tự hạn chế đối với hai iớp của m iARN và siA RN , vì chúng đã được xác lập tốt và đã sáng tỏ bộ máy gây câm ARN . Ý tưởng khoa học Giả thuyết: Vùng của gen Un - 14 bổ sung cho miARN lin - 4 điều hoà biểu hiện gen lin - 14. Dự đoán: Nếu vùng bổ sung lin - 4 của gen Un - 14 được nối vào gen thông báo (reporter gene), sau đó gen thõng báo này sẽ chỉ dẫn sự điều hoà tương tự đối với lin - 14. Thử nghiêm: ADN tài tổ hợp được dùng để tạo hai chuyển đổi của gen thông bào (P~ galactosidase). Trong giun (C. elegans) chuyển gen, sự biểu hiện của gen thông báo sinh ra màu xanh (blue color). 1. Gen p - galactosidase vởi vùng khổng được dịch chứa vùng bổ sung lin - 4. 2. Gen p - galactosidase vởi sự điểu hoà vùng khổng dịch mả 3' thiếu vắng vùng bổ sung lin - 4. Kèt qua: Vùngmảhoá U n- 4 bổ sung 1. Các con giun chuyển gen vởi gen thông báo cộng thêm vùng không dịch mã 3' lin - 14 chỉ dẫn sự biểu hiện gen trong ấu trùng L1 nhưng không phải ấu trùng giai đoạn L2. Đó là hình mẫu được trồng chờ đối vời gen lin - 14 vốn được điều hoà bỏi lin - 4. 2. Các con giun chuyển gen vởi gen thông báo cộng thêm vùng khổng được dịch mã 3' đối chứng không chỉ ra hình mẫu biểu hiện được trồng chờ đối vởi sự điều hoà bởi lin - 4. Kết luận: Vùng không dược dịch mã 3' từ lin - 14 là đủ để loại bỏ sự biểu hiện gen trong ấu trùng L2. Các thực nghiệm tiếp theo: Hình mẫu biểu hiện nào sẽ được bạn dự đoán đối vòi các cấu trúc trong thể đột biến thiếu chức nàng lin - 4? Gen Un -14 ( 5 5 Ẽ I I Vùng mả hoá J Gen p-galactosidase(5ĩ Ấu trùng L1 Ấu trùng L2 Lin - 14 3' không được dịch Đối chứng 3' không được dịch Hình 1.49. Điểu hoà sự biểu hiện gen lin - 14 Gen lin -1 4 được điều hoà bởi gen lin - 4. Điều này được trung gian bởi vùng của vùng không đuợc dịch 3' cùa mARN lin —14 vốn là bổ sung cho miARN Un - 4. (Từ Raven et al., 2010). 71 a) C ác g e n m iA R N Phát minh ra vai trò của các m iARN irong sự biểu hiện gen xuất hiện ban đầu bị hạn chế đối với giun tròn vì gen lin — 4 không có bất kỳ các dồng hình rõ ràng nào trong các hệ thống khác. Bảy năm sau đó, một gen thứ hai, let - 7, đã được phát hiện trong con đường như thế trong c. eìegans. Gen let - 7 cũng đã mã hoá A R N 22 nt vốn đã có thể ảnh hưởng đến dịch mã. Trong trường hợp này, các đổng hình đối với let - 7 đã được phát hiện ra ngay cả trong Drosophilla và trong con người. Vì gia tăng sô' lượng các m iARN đã được phát hiện trong những cơ thể khác nhau, sự phát hiện gen m iARN đã phải nhò sự giúp đỡ nghiên cứu của máy tính và các phương pháp năng suất cao như các vi mạng (microarrays) và phân tích trình tự năng suất cao mới. Cơ sở dữ liệu cho bản liệt kê hiện tại các m iARN đã biết 695 các trình tự m iARN cùa người. Các gen đối với m iARN đã phát hiện được trong nhiều vị trí bao gồm cả các intron của các gen đã biểu hiện và lhường tập hợp với nhiều loại m iARN trong đơn vị phiên mã đơn. Cũng dã phát hiện ra chúng trong các vùng của bộ gen vốn đã được coi như ARN polymerase lĩ Gen microARN ¡Pri - microARN [Droshal Pre - microARN Exportĩn 5 miARN trưởng thành mARN Phân cắt mARN B k mARN Hình 1.50. Phát sinh sinh vật và chức năng của miARNCác gen đối với miARN được phiên mã bỏi ARN polymerase II để sinh ra Pri - miARN. Điều đó được tiến hành bỏi Drosha nuclease để tạo ra Pre - miARN ( tiền miARN), vốn được xuất xứ lừ nhãn gắn vào tác nhân xuất (export factor) Exportin 5. MỘI khi đã ỏ trong tế bào chất, Pre - miARN được xử lý bởi Dicer nuclease để tạo ra miARN trưởng thành. miARN được tài vào RISC, chất này có thể tác động để, hoặc là phân cắt các mARN đích, hoặc để ức chế sự dịch mã của các mARN đích. (Theo Raven el al., 2010). câm phiên mã. Sự phát hiện này đặc biệt lý thú vì công trình khác đang quan sát sự phiên mã qua các bộ gen (genome) động vật đã phát hiện thấy rằng, nhiều thứ chúng ta nghĩ là câm phiên mã, ihực tế là không phải. b) P h á t s in h s in h v ậ t v à ch ứ c n ă n g c ủ a m iA R N Sự sản sinh ra m iA R N chức năng bắt đầu từ trong nhân, kết thúc trong tế bào chất với A R N 22 nt vốn hoạt động để ức chế sự biểu hiện gen (hình 1.50). Nơi phiên bản khới đầu của gen m iARN là bởi A R N polymerase II sinh ra phiên bản gọi là Pri - m iARN. Vùng cúa phiên bản này chứa m iA R N có thổ cuộn xếp ngược lại lên bản ihân nó và cặp base tạo nên cấu trúc thân và vòng. Cấu trúc này được cắt ớ trong nhân bới nuclease gọi là Drosha vòn cắt tia m iARN để cho đúng cấu trúc thân và vòng vốn bây giò được gọi là Pre - miARN (tiền-m iARN). Pre - m iARN này được xuất ra khỏi nhân qua lỗ nhân được gắn vào protein exportin 5. Một khi đã ờ trong tế bào chất, Pre - m iARN tiếp tục được phân cắt bới nuclease khác được gọi là Dicer để sản sinh ra A R N sợi kép ngắn chứa m iARN. miARN này được tải vào trong phức hệ các protein được gọi là phức hệ gây câm (làm bất hoạt) dược A R N cám ứng, hoặc R ISC (các chữ cái dầu từ Anh ngữ: RN A induced silencing complex - phức hệ gây câm được ARN cảm ứng). R ISC bao gồm protein gắn kết ARN được gọi Argonaute (Ago), protein này tương tác với m iARN . Sợi bổ sung này là, hoặc bị loại bỏ bới nuclease, hoặc bị chuyến dời trong quá trình tải. Tại điểm này, R IS C được hướng đích để ức chế sự biểu hiện của các gen khác dựa vào tính bổ sung lành tự đối với 1ĨÚARN. Vùng bổ sung thường là trong vùng 3' không dược dịch mã cúa các gen và kết quả có thê là m ARN bị phân cắt hoặc ức chế dịch mã. Trong dộng vật, sự úc chế dịch mã xuất hiện phổ biến hơn so với sự phân cắt m ARN , mặc dầu cơ chế chính xác của sự ức chế này còn chưa rõ. Trong thực vặt, sự phân cắt của m ARN bới RISC là phó biến và có lẽ phải liên quan đến sự bổ sung chính xác hơn, điểu đã được phát hiện giữa các m iARN thực vật và các đích được so sánh cùa chúng đối với động vật. c) N h iễu A R N (R N A interference) Gây câm gen được A R N bé trung gian đã được biết tới nhiều năm. Đã có một vài lộn xộn xảy ra do những quan sát trong các hệ thống khác biệt dẫn đến nhiểu tên gọi cho hiện lượng giống nhau. Thực vậy, sự nhiễu A R N , sự đổng ức chế (cosuppression) và gây câm sau phiên mã, tất cả tác động thông qua các cơ chế hoá sinh tương tự. Thuật ngữ nhiễu A R N hiện tại là phổ biến nhất và liên quan với sự hình thành các siA RN . Sản sinh ra siA R N là tương tự với m iARN ngoại trừ rằng chúng xuất hiện từ A R N sợi kép dài (hình 1.51). Đó có thể hoặc là một vùng rất dài của sự tự bổ sung, hoặc từ hai ARN bổ sung. Các A R N sợi kép dài này được tiến hành bởi Dicer đế thu được nhiều siA RN vốn định dsARN ngoại sinh, gen nhảy, virut Dicer cắt lặp lại PJ£C'ỊK ỈÍỈỈỈ& ^M £!M ỵ£ Ị£ĩ ” MW££í£í££^' siARN trong RISC mARN ỷ r r s iv J - jv J W M r r s < r i■srrrrsrrĩTL, Phân cắt mARN đích Hình 1.51. Phát sinh sinh vật và chức năng của các siARN Các siARN có thể xuất hiện từ các nguồn tạo nên các vùng sợi kép dài của ARN. Các ARN sợi kép được Dicer nuclease xử lý để sản ra nhiều siARN vốn là mỗi một được tải vào bản thân RISC của chúng. Sau đó RISC này phân cắt mARN đích. (Từ Raven et al., 2010). .vị (rong Ago chứa RISC. Các R ISC thường có tính bổ sung gần như hoàn chỉnh đối với các mARN đích cùa chúng và kết quá là phân cắt m ARN bới siA R N chứa RISC. Nguồn của các A R N sợi kép để sản sinh ra các siA RN có thế hoặc là từ tế bào, hoặc là từ bên ngoài tế bào. Từ bán thân tế bào, có các gen sản sinh ra các A R N với các vũng dài 73 cùa sự tự bổ sung vốn cuộn xếp ngược lại để tạo nên cơ chất cho Dicer trong tế bào chất. Chúng cũng có thể xuất hiện từ các vùng lặp lại của bộ gen, nơi có chứa các thành phẩn dễ chuyển dịch. Các A R N sợi kép ngoại sinh có thể được đưa vào bằng con đường thực nghiệm hoặc do bị nhiễm virut. Nguồn cuối cùng (do nhiễm virut) của các A R N sợi kép có thế là điểm cho sự tiến hoá của bộ máy gây câm A R N như là dạng bảo vệ chống lại virut. d.) P h ả n b iệ t c á c m iA R N v à c á c s iA R N Sự phát sinh sinh vật của cà hai m iA R N vả siA R N liên quan với sự phân cắt bời Dicer và sự hợp nhất vào phức hệ R ISC . Vấn đề chủ yếu là phân biệt được hai kiểu này cùa các phân tử là các đích của chúng: các m iA R N có đích là ức chế các gen khác nhau về nguồn gốc cúa chúng, trong khi các siA R N nội sinh hướng tới sự ức chế các gen mà từ Ợó chúng xuất hiện. Các SỈARN bổ sung được dùng bằng cách thực nghiệm để loại bỏ sự biểu hiện gen. Đó là lợi thế của bộ máy tế bào dể ngắt gen dựa vào A R N sợi kép phù hợp với gen được quan tâm. Có nhiểu sự khác biệt giữa hai lớp A R N bé. Khi đã kiểm tra được nhiểu loài, các m iARN hướng tới phải được bảo tổn tiến hoá trong khi các siA R N thì không. K hi mà sự phát sinh sinh vật là giống nhau trong các thuật ngữ của các nuclease liên quan, cấu trúc thực cùa các A R N sợi kép không phải là như vậy. Phiên bản (transcript) của các gen m iARN tạo nên các cấu trúc vòng — thân (stem - loop structures) chứa m iA R N trong khi các A R N sợi kép tạo ra siA R N có thể nhị phân, hoậc các vòng - thân rật dài. Những vùng sợi kép dài này dẫn đến nhiều kiểu siA R N trong khi chỉ có m ịA R N đơn được tạo ra từ tiền m iARN (pre - m iARN ). 1.2.9.2. Các ARN bé có th ể trung gian hình thành chất dị nhiễm sắ c (heterochromatin) Các con dường gây câm A R N cũng liên quan trong sự hình thành chất dị nhiễm sắc trong nấm men phân đôi (fission yeast), thực vật và ruổi giấm (D rosophila). Trong nấm men phân đôi, sự hình thành chất dị nhiễm sắc tâm động (centromeric heterochroma tin) được khới động bởi các siA R N được sinh ra do tác động của Dicer nuclease. Sự hình thành chất dị nhiễm sắc cũng liên quan với sự biến đổi cùa các protein histon và như vậy liên quan đến sự nhiều A R N cùng với phức hộ thay đổi cromatin trong hệ thống này. Điểu còn chưa rõ là nó được phổ biến bằng cách nào. Trong D rosophila, có bằng chứng di truyền vẻ sự liên quan của bộ máy nhiễu A R N trong sự hình thành chất dị nhiễm sắc. Điều đó đặc biệt rõ trong dòng mầm, nơi chuyên biệt của A R N bé xuất hiện phải liên quan việc gây câm các gen nhảy trong sự sinh tinh trùng và sinh trứng. Cũng đã có bằng chứng rằng, cơ chế tương tự có thể tác động trong động vật có xương sống. Thực vật là trường hợp hấp dẫn, chúng có nhiều các loại A R N bé. Con đường nhiễu A R N là phức tạp hơn so với động vật với sự đa dạng của các protein Dicer nuclease và các protein liên kết A R N Ago. Một lớp của siA R N nội sinh có thể dẫn đến sự hình thành chất dị nhiễm sắc bới sự metyl hoá A D N và sự biến đổi histon. 1.2.9.3. Gây câm thay dối (xen kẽ) có th ế tạo ra nhiều protein từm ột gen Như đã thảo luận ớ trên, sự cắt, nối tiền m A RN (pre - m A RN ) là một trong các quá trình dẫn đến m A RN trướng thành. Nhiều cách nối có thể tạo ra các m A RN khác nhau từ một phiên bàn sơ khai đơn (single primary transcript - m ARN sơ khai, tiền m ARN) bằng sự nối thay đổi. Cơ chế này cho phép mức khác của sự điều hoà biểu hiện gen. Sự nối thay đổi có thể biến đổi các sự kiện nối vốn xảy ra trong các giai đoạn khác nhau của sự phát triển hoặc trong các mõ khác nhau. Một ví dụ về các phân hoá phát triển dã dược phát hiện trong Drosophila, trong đó sự xác định giới tính là kết quả cùa loạt phức tạp cùa các sự kiện nối thay đổi (xen kẽ) vốn khác biệt trong con đực và con cái. Một ví dụ tuyệt diệu của sự nối thay đổi đặc hiệu mô trong tác động được phát hiện tiong hai cơ quan khác nhau của con người: tuyến giáp (thyroid gland) và vùng dưới đổi (hypothalamus). Tuyến giáp chịu trách nhiệm vê sự sản xuất các hormon vốn kiém tra các quá trình như nhịp trao đổi chất. Vùng dưới đổi, định vị trong não, thu gom thông tin từ thân thê’ (ví dụ, sự cân bằng muối) và giải phóng các hormon, vốn đến lượt, điều hoà sự tiết các hormon từ tuyến khác, như luyến yên (pituitary gland). Nghiên cứu đầy đủ vể các tuyến đó trong chương 3 của phẩn một này. Hai cơ quan này sản ra hai hormon khác biệt: canxitonin và CGRP (calcitonin gene - related peptit, peptit liên quan gen canxitonin) như là phần chức năng của chúng. Canxilonin điều phối sự hấp thụ canxi và cân bằng canxi trong các mô, chẳng hạn như các xương và răng. C G R P liên quan trong số các chức năng nội tiết và thần kinh. Mặc dầu hai hormon này được dùng cho rất nhiều mục đích sinh lý khác nhau, chúng được sản ra từ cùng một phiên bàn (transcript, m ARN sơ khai) như trên hình 1.52. 1 Đuôi 3' poly - A Phiên bản ARN sơ khai I U ể E x o n I Các intron bị cát tách / \ Ị B In lío n Hinh mẫu nối tuyến giáp Hinh mẫu nối vùng dưới đổi 3 5 6 - J T 7 : aăH H i y Đuôi 3’ Mủ 5' - * Mũ 5' ' W p o ly-A mARN trưởng thành Canxitonin I - Hình 1.52. Sự cắt nôi xen kẽ mARN trưởng thành C G R P Nhiều phiên bản sơ khai có thể được nối theo các cách khác nhau để xuất hiện đa mARN. Trong ví dụ này, trong tuyến giáp (thyroid gland) phiên bản sơ khai được nối chứa bốn exon mã hoá protein canxitonin (calcitonin). Trong vùng dưới dổi (hypothalamus) exon thứ tư, vốn chứa vị trí poly - A được sử dụng trong tuyến giáp, là được bỏ qua (nhảy cách quãng) và hai exon bổ sung được thêm vào để mã hoá protein peptit liên quan gen canxitonin (CGRP). (Raven et al., 2010). Sự tổng hợp một sản phẩm tốt hơn so với sàn phẩm khác được xác định bởi các tác nhân đặc hiệu mô vốn điểu hoà quá trình sự cắt nối phiên bản sơ khai (primary transcript). Trong trưởng hợp cùa canxitonin và CG RP, sự nối tiền m ARN được điéu phối bời các tác nhân vốn là hiện diện trong tuyến giáp và trong vùng dưới đồi. 1.2.9.4. Sựhiệu chinh ARN làm thay dồi mARN sau phiên mã Trong một vài trường hợp, sự hiệu chỉnh các phiên bản m ARN trướng thành có Ihể sản 75 ra mARN bị thay dối vốn không đích thực dược mã hoá trong genome, một khả năng không mong đợi. Lần đầu tiên đã phát hiện ra sự hiệu chỉnh A R N như là sự cài các gốc uraxil vào trong một số các phiên bản (transcripts) trong động vật nguyên sinh (protozoa) và đã nghĩ rằng đó phải là sự bất thường. Sự hiệu chỉnh A R N của các loại khác biệt đã có từ khi phát hiện ra trong các loài động vật có vú, gổm cả con ngưòi. Trong trường hợp này, sự hiệu chỉnh liên quan đến sự biến đổi hoá học của base gây nên sự biến đổi các tính chất cặp base của chúng, thường bởi sự loại amin. V í dụ, cả sự loại amin cùa xytosin đối với uraxil và loại amin của adenin đối vỏi inosin đã quan sát được (các cặp inosin như là G sẽ có trong khi dịch mã). a) A p o lip o p r o te in li Protein người apolipoprotein B có liên quan trong sự vận chuyển cholesterol và triglyxerit. Gen mã hoá protein này, apoB, là lớn và phức tạp, gồm 29 exon hầu như rải qua 50 kilobase (kb) cửa A D N . Protein này tổn tại ớ hai dạng: dạng APOBIOO dài đẩy đủ và dạng APOB48 bị cắt cụt. Dạng cắt cụt này là do một sự thay đổi cùa m ARN vốn biến đổi mã (codon) liên quan với glutamin của mã vốn là mã dừng. Còn xa hơn thế, sự hiệu chính này xảy ra theo cách đặc hiệu mô; dạng được hiệu chỉnh xuất hiện chỉ trong ruột, trong khi gan chỉ tạo ra dạng dài đáy đù. Dạng A IX )B I00 dài đầy đú là bộ phận của cấu tử lipoprotein tỷ trọng thấp (low density lipoprotein, L D L ) là chất mang cholesterol. Các mức cao của huyết thanh (serum) L D L dược cho ràng phải là chỉ số quan trọng báo trước của bệnh xơ vỡ động mạch trong con người. Không thấy sự hiệu chỉnh có hiệu ứng nào đối với các mức của phiên bản đặc hiệu ruột (Raven et al., 2010). b) C h ấ t n h ậ n s e r o to n in 5 - H T Sự hiệu chỉnh A R N cũng đã quan sát được trong một số chất nhận của não bộ đối với các thuốc có chứa thuốc phiện trong con người. Một trong các chất nhận này, chất nhận serotonin 5 - HT, là được hiệu chỉnh tại nhiều nơi để sản sinh ra toàn bộ 12 dạng đổng phân khác biệt cúa protein. Chưa rõ các dạng này cùa sự hiệu chỉnh A R N được phổ biến như thế nào, nhưng chúng là bằng chứng tiếp theo rằng, thông tin được mã hoá bên trong các gen chưa phải đoạn kết cúa câu truyện về sự hình thành protein. 1.2.9.5. mARN phải duợc vận chuyển ra khỏi nhân d ể dịch mă Các phiên bàn m A RN được xử lý rời nhân qua các lỗ nhân. Sự di chuyển cùa phiên bán (tiền m A RN , m A RN sơ khai) xuyên qua màng nhân là một quá trình chủ động vốn dòi hói phiên bản phải được các chất nhận lót mặt trong của lỗ nhận biết. Các phần chuyên biệt của phiên bán, như đuôi poly - A, dường như có vai trò trong sự nhận biết này (Raven et al., 2010). Có bàng chứng ít chặt chẽ rằng, sự biêu hiện gen được điều hoà tại điểm này, mặc dầu nó phái có thế. Trung binh, khoảng 10% của các phiên bản sơ khai bao gồm các exon vốn sẽ lạo ncn các trình tự m A RN , nhưng chi khoảng 5% của lổng các m A RN đã được sản ra luôn luôn dạt dến tế bào chất. Sự quan sát này đề nghị rằng, một nửa các exon trong các phiên bản sơ khai không bao giờ rời nhân, nhưng chưa rõ sự biến mất của m ARN này là được chọn lọc. 1.2.9.6. Điêu hoà s ự khởi dẩu dịch mã Sự dịch mã của phiên bản m ARN đã được xử lý bời các ribosom trong tế bào chất liên quan đến phức hệ cấc protein được gọi là các rác nliân dịch m ã (translation factors). Tại ít nhất trong một số trường hợp, sự biểu hiện gen được điểu hoà bằng cách biến đổi của mộl hoặc nhiều các tác nhân này. Trong các trường hợp khác, protein ức chê dịch mã (translation repressor protein) ngắt sự dịch mã bời sự liên kết vào nơi bắt đầu của phiên bản, do vậy nó không thế gắn vào ribosom. Trong con người, sự sản sinh ferritin (một protein tích lũy sắt) binh thường bị ngắt bới protein ức chế dịch mã được gọi là aconitase. Aconitase gắn vào trình tự 30 nt tại nơi bắl đầu của m ARN ferritin, tạo nên một vòng ổn định mà các ribosom không thể gắn vào đó. Khi sất xâm nhập vào tế bào, mối liên kết cùa sắt vào aconitase làm cho aconilase phân ly khỏi m ARN ferritin, m ARN đang tự do phải được dịch mã và sự sản sinh ferritin tăng lên 100 lần. 1.2.9.7. Điều hoà s ự phân giải mARN Tính ổn định cúa các phiên bản m ARN trong tế bào chất cũng ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen. Không giống với các phiên bản m ARN prokaryote, vốn điển hình có nửa thời gian sống (half - life) khoảng 3 phút. Các phiên bản m ARN eukaryote là rất ổn định. V í dụ, phiên bản gen [3 — globin có nửa thời gian sống trẽn 10 giờ, một thời gian dài dường như vô tận trong cuộc sống trao đổi chất vận dộng nhanh của tế bào. Tuy nhiên, các phiên bản mã hoá các protein điéu hoà và các tác nhân sinh trường thường là rất ít ổn định, với chu kỳ nửa thời gian sống ngắn hơn 1 giờ. Cái gì đã làm cho các phiên bản đặc biệt này không ổn định như vậy? Trong nhiều trường hợp, chúng chứa các trình tự đặc hiệu ở cạnh các đầu 3' vốn làm cho chúng trở thành các đích cho các enzym phân giải m ARN . Các trình tự của các nucleotit A và u cạnh đuôi 3' poly - A của phiên bàn khới động sự loại bỏ đuôi, vốn làm giảm ổn định của m ARN . Mất đuôi poly - A dẫn đến sự phân giải nhanh bởi 3' đến 5' A R N exonuclease (nuclease bên ngoài, ngoại nuclease). Hậu quả khác của việc mất đuôi poly - A này là sự kích thích các enzym loại bỏ mũ (decapping enzyms) vốn chuyển dịch mũ 5' dẫn đến sự phân giải bởi 5' đến 3' A R N nuclease. Các phiên bàn m A RN khác chứa các trình tự cạnh các đẩu 3' là các vị trí nhận biết đối với các endonuclease (các nội nuclease), vốn gây nên sự tiêu hoá nhanh các phiên bản này. Nửa thời gian sống ngắn của các phiên bàn m ARN cùa nhiểu các gen điểu hoà là quan trọng dối với chức năng của các gen này, vì chúng giúp cho các mức cao cùa các protein trong tế bào phái biến đổi nhanh. Khái quát lại các phương pháp khác biệt về sự điều hoà sau phiên mã của biểu hiện gen dược dẫn ra trong hình 1.53 dưới đây. 77 S ự khởi đẩu 2. phiên mã Hẩu hết sự kiểm tra biểu hiện gen đạt dược bời sự điểu hoà tần SỐ của sự khỏi đẩu phiên mã. Biên đổi sau mã Phosphorin hoá hoậc các đổi hoá học khác biến đổi hoạt tính của protein sau khi nó được sản sinh. Hình 1.53. Các cơ chế điều hoà sự biểu hiện gen trong các tế bào có nhân (eukaryotes) 1. Khởi đẩu phiên mã: Hầu hét sự điều hoà biểu hiện gen đạt được bằng cách điều phối tẩn số của khỏi đấu phiên mă; 2. Cắt nối ARN: Sự biểu hiện gen có thể được điều hoà bởi sự biến đổi tốc độ cắt nối trong eukarryote. Sự cắt nối thay đổi (xen kẽ) có thể tạo ra nhiều mARN từ một gen; 3. Đi qua màng nhân: Có thể điều hoà sự biểu hiện gen bằng cách kiểm tra lối vào hoặc hiệu quả của các kênh vận chuyển; 4. Tổng hợp protein: Nhiều protein có phần trong quá trình dịch mả và điều tiết sự sẵn sàng của bất kỳ protein nào trong chúng làm thay đổi tốc độ biểu hiện gen bằng cách tăng hay giảm sự tổng hợp protein; 5. Sự nhiễu ARN: Sự biểu hiện gen được điều hoà bởi các ARN bé. Các phức hệ protein chứa siARN và các mARN đăc hiệu đích miARN cho sự phản huỷ hoặc ức chế sự dịch mã cùa chúng (các mARN); 6. Sự biến đổi sau dịch mã: Phosphorin hoá hoặc các biến đổi hoá học khác có thể biến đổi hoạt tính của protein sau khi nó được tổng hợp. (Raven et al., 2010). 78