🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Giáo trình các chất điều hòa sinh trưởng thực vật - Nguyễn Như Khanh Ebooks Nhóm Zalo millN NHH khanh (chu bièn) B B B r M » G U Y Ẻ N VĂN ĐÍNH GIÁO TRÌIXIH CÁC d ì iu noi) SINH ĨRIÈTHƯC VÂT JYẺN IỆU GS. TS. NGUYEN NHƯ KHANH (Chủ biên) TS. NGUYỄN VĂN ĐÍNH GIAO TRINH CÁC CHẤT DIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG THỰC VẬT ■ ■ (Tái bản lần thứ nhất) NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM LỜI GIỚI THIỆU Giáo trình Các ch ấ t diêu hoà sinh trưởng th ư c vă t là giáo trình thuộc chuyên ngành Sinh lý học thực vật ở các trường Đại học Sư phạm và cấc trường khác. Giáo trình cập nhật những kiến thức mới nhất (đến năm 2010) về các chất điếu hoà sinh trưởng là hormon thực vật, những chất tự nhiên khác và những chất được con người tổng hợp nên có tác động điều hoà sinh trưởng thực vật. Giáo trình cập nhật kiến thức hiện đại về cơ chế sinh tổng hợp, các con đường vận chuyển trong cơ thể thực vật và cơ chê tác động của các chất điều hoà sinh trưởng đối với các chức nàng sinh lý, trao đổi chất của cơ thê thực vật. Giáo trình cũng giới thiệu khái quát về các hệ điểu hoà khác tồn tại trong cơ thể thực vật nhằm làm sáng tỏ vai trò và vị trí của hệ điều hoà hormon giữa các hệ diều hoà khác đảm bảo cho sự hoạt động hài hoà các chức năng sông của cơ thể thực vật. Trong giáo trình cũng giới thiệu các thành tựu ứng dụng các chất điểu hoà sinh trưởng vào hoạt động sản xuất của con người ở lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong nghề làm vườn và lâm nghiệp. Sách phục vụ cho sinh viên và học viên cao học của các khoa Sinh học, Sinh học - Kỹ thuật nông nghiệp, Sinh — Hoá học và Sinh học — Môi trường trong các trường Đại học, Cao đẳng Sư phạm, sinh viên các chuyên ngành có liên quan đến sinh học thực vật thuộc các trường Đại học khác. Sách cũng rất bô ích cho giáo viên trungr học trone việc nâne cao kiến thức sinh học thực vật nói chung, đặc biệt, sinh học cơ thể thực vật liên quan đến những kiến thức về hormon thực vật, cảm ứng, sinh trưởng phát triển và sinh sản thực vật thuộc chương trình Sinh học lớp 11 và điểu hoà hoạt động gen thuộc chương trình Sinh học lớp 12 ở trường THPT, cũng như chương trình Sinh học 6 và chương trình Sinh học 9 ở trường THCS. Sách sẽ là tài liệu tham khảo bổ ích cho các nhà làm vườn trồng cây lấy quả, các nhà lâm nghiệp cũng như cho những ai muôn tìm hiểu vai trò của các hệ điều hoà đối với các chức năng hoạt động sống của cơ thể thực vật. 3 Giáo trìn h gồm 9 chương: Chương 1. Tổng quan về các hệ điểu hoà trong cơ thể thực vật. Các chương từ chương 2 đến chương 9 giối thiệu vể các chất điều hoà sinh trưởng chính và vai trò của chúng đôi với thực vật cũng như những ứng dụng vào đòi sông sản xuất của con người. P h â n công biên soạn: GSTS. Nguyễn Như Khanh, chủ biên và tham gia viết các chương 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8. TS. Nguyễn Văn Đính tham gia viết chương 3 và chương 9. Mặc dù đã rất cố gắng trong quá trình biên soạn nhưng sách cũng không thể tránh khỏi nhưng sai sót, các tác giả rất mong sự đóng góp ý kiến của các bạn đồng nghiệp, các sinh viên và các bạn đọc để lần tái bản sau sách được tốt hơn. Mọi ý kiến đóng góp xin gửi về Công ty cổ phần sách Đại học — Dạy nghề, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 25 Hàn Thuyên, Hà Nội. Xin trân trọng cảm ơn. CÁC TÁC GIẢ 4 MỤC LỤC Lòi giói thiệu .........................................................................................................................................................3 N hặp m ò n .....................................................................................................................................................................7 1.1. Phytohorm on tà g ì? ............................................................................................................................................7 1.2. Đâc trưng c h u n g .................................................................................................................................................8 Chưong 1. TỒNG QUAN VẾ CÁC HỆ DIÊU HOÀ TRONG CƠTHỄ THỤC VẬT 1.1. Khai niệm c h u n g .................................................................................................................................................9 1.2. Điều hóà nội b à o ................................................................................................................................................9 1.2.1. Điều hoà hoạt tinh của en zy m ..............................................................................................................9 1.2.2. Điều hoà m à n g ............. ......................... ............................................................................................10 1.2.3. Điều hoà gẹn và truyền tin h iệ u .........................................................................................................12 1.3. C ác hệ thống điều hoà giữa các tế bào, mô và cơ q u an ....................................................................... 39 1.3.1. Điều hoà dinh d ư ỡ n g .........................................................................................................................39 1.3.2. Điều hoà điện sinh lỵ .........................................................................................................................40 1.3.3. Nhịp nội tại (đống ho sinh h ọ c)........................................................................................................ 43 1.3.4. Điếu hoà horm on....................... .........................................................................................................75 Chương 2. AUXIN 2.1. Lưặc sử phát minh a u x in ...............................................................................................................................76 2.2. Phần bô, sinh tổng hợp, dạng tốn tại, phân giải và vặn c h u y ể n ........................................................78 2.2.1. Phan bô'............ ......... ................ ................................. ...........................................................................78 2.2.2. Sinh tổng h ợ p ......................................................................................................................................... 78 2.2.3. Dạng tổn tại của AIA trong cờ thể thực vặt.....................................................................................87 2.2.4. s ir phân giãi AIA....................................................................................................................................88 2.2.5. Vận chuyển AIA trong c â y ................................................................................................................100 2.3. Hiệu ứng sinh lý sinh trưởng và phát triển cùa auxin.......................................................................... 112 2.3.1. Câp độ cớ th ể .......................................................................................................................................112 2.3.2. Cấp đổ tê b à o .......................................................................................................................................134 2.3.3. Cấp đổ phân tử .................................................................................................................................... 145 2.4 Auxin tổng hợp (nhân tạo )........................................................................................................................... 151 2.4.1. Cấu trúc chuncj cúa hợp chất có đậc tinh sinh lý như au x in .....................................................152 2.4.2. Sự phù hợp câu trúc giữa auxin và chất nhận n ó ......................................................................153 2.4.3. HÍện tượng đối kháng và họp lự c ....................................................................................................154 Chương 3. GIBBERELLIN 3.1. Lược sử phát hiên gibberellin......................................................................................................................156 3.2. Câu trúc, sinh tổng hợp, vận chuyển và dạng tồn t ạ i..........................................................................157 3.2.1. Câu trú c...... ........................... ................ ...............................................................................................157 3.2.2. Sinh tổng h ợ p .......................................................................................................................................159 3.2.3. Vặn chụyổn gibberellin trong cây ....................................................................................................185 3.2.4. Dạng tổn tại của gibberellin trong cơ thể thực v ậ t..................................................................... 185 3.3. Hiệu útig của gibberellin đến sinh lý sinh truởng và pliát triển của th ụ t v ật............................................. 186 3.3.1. C ap độ cơ th ể ......................................................................................................................................186 3.3.2. Cấp đô tế b à o ........... ......................................................................................................................188 3.3.3. C ấp đố ph ân tử .......... .......................................................................................................................190 Chương 4. XTTOKININ 4.1. Lược s ử phát hiên xytokinin....................................................................................................................... 209 4.2. Phan bố, sinh tổng hợp, dạng tốn tại và vận chuyển...........................................................................211 4.2.1. Phân b ố ............ ........... ......................' ............................................................................................. 211 4.2.2. Sinh tổng h ạ p .......................................................................................................................................211 4.2.3. Dạng tồn tại cùa xytokinin trong cơ thể thực v ậ t........................................................................220 4.2.4. Vần c h u y ể n .....................................................!..................................................................................222 4.3. Hiệu ứng sinh học của các xytokinin.....................................................................................................224 4.3.1. Hiệu ứng của xytokinin ở cấp độ cơ th ể ......................................................................................224 4.3.2. Hiệu ứng của xýtokinin à cấp độ tế b à o ......................................................................................230 4.3.3. Hiệu ứng của xýtokinin ở cấp đọ phản tử ........................................................ ...........................235 5 Chương 5. ETYLEN 5.1. Lược sử phát hiện e ty le n ............................................................................................................................ 244 5.2. Phắn bố, cấu trúc và ưnh chất, sinh tổng hơp, phân giải và liên kết, vận chuyển cùa etylen...............245 5 2.1 Phân bố . . .... .. .... .......... ^ .............7.....7.-245 5.2.2. Cấu trúc (công thức cấu tạo) và tính chất của e ty le n ...............................................................245 5.2.3. Sinh tổng hợp etylen.........................................................................................................................246 5.2.4. C ác tác nhân ảnh hưởng đến sinh tổng hợp ety len .................................................................. 249 5.2.5. Phân gài và liên kết etyién................... .............. ............................................................................253 5.2.6. Vặn chuyển của e ty le n ..................................................................................................................... 253 5.3. Hiệu ứng sinh lý và phát triển cùa etylen................................................................................................254 5.3.1. Hiệu ứng cùa étylen ở cấp độ cơ th ể ............................................................................................. 254 5.3.2. Hiệu ứng của etýlen ở cấp đồ tẽ bào và phân tử ....................................................................... 265 Chuững 6. AXIT ABXIXIC 6.1. Lược sử phát hiên axit abxixic...................................................................................................................274 6.2 Cấu trúc, phân bô', sinh tổng hợp, trao đổi và vận chuyển ABA ở trong cây...............................................276 6.2.1 Cẩu trúc hoá học . . ......................................... ..................................................................................276 6.2.2. Phân b ố ........... ................................................................................................................................... 276 6.2.3. Sinh tổng h ợ p ...................................................................................................................................... 277 6.2.4. Trao đổi và vặn chuyển ABA trong c â y ........................................................................................286 6.3. Hiêu I'.Tiq sinh hoc của ABA................... ................................................................................................ 289 6.3.1. Cạp độ cợ th ể ......................................................................... .....................................................290 6.3.2. Cấp độ tẽ’ b à o ...................................................................................................................................... 298 6.3.3. Hiệu úng ở cấp độ phân tử...............................................................................................................307 Chương 7. BRASSINOSTEROIT VÀ CÁC CHẤT cú HOẠT TÌNH SINH HỌC KHÁC 7.1. B răssinosteroit..................................................... ’......................... ' .......................................................... 313 7.1.1. Lươc sử nghiên c ứ u ...........................................................................................................................313 7.1.2. Cấu trúc.................................................................................................................................................313 7.1.3. Phân b ố .................................................................................................................................................314 7.1.4. Sinh tổng h ợ p ......................................................................................................................................314 7.1.5. Hiệu ứng sinh h ọ c...............................................................................................................................326 7.2. Polyamin..........................................................................................................................................................327 7.2.1. Sinh tổng hợp polyam in....................................................................................................................328 7.2.2. DỊ hoá polyam in..................................................................................................................................330 7.3. Axit jasm onic..................................................................................................................................................332 7.3.1. Lược sử nghiên cứu và cấu trúc hoá học cùa axit jasm o n ic.................................................. 332 7.3.2. Sinh tổng hợp (-)-axit jasm o n ic.............................. .....................................................................335 7.4. Axit salixylic....................................................................................................................................................339 7.4.1. Lược sử phát hiện axit salixylic (A S ).............................................................................................339 7.4.2. Sirih tổng hợp axit salixylic............. ................................................................................................340 7.4.3. Hiệu ứng sinh học của áxit salixylic.............................................................................................. 343 Chương 8. TƯƠNG TÁC GIỮA CÁC PHYT0H0RM0N VÁ cơ CHẾ TẢC ĐỘNG CỦA CHÚNG 8.1. Tương tác cạnh tranh tiền chất và phân nhánh trong sinh tong hợp phytohorm on............... 351 8 2 T ư ơ ng q u a n giữ a c á c h o rm o n kíc h th íc h v à ức chô' õ in h trư ở n g ...........................................................36 2 8.3. Tương quan giữa các hormon kích thích.............................................................................................353 Chuơng 9. CÁC CHẤT DIẾU HOÀ SINH TRƯỞNG TỔNG HỢP VÀ ÚNG DỤNG 9.1. Các chất điều hoà sinh trưởng tổng h ợ p ........... "..................... ............................................................355 9.1.1. Auxin tổng hợp (nhãn tạ o ).............................................................................................................. 355 9.1.2. C ác đối chất cùa gibberellin (antigibberellin).............................................................................358 9.1.3. Một sỏ’ các hợp chất tổng hợp có tác động bát chưâc hoặc đối kháng xytokinin............ 359 9.1.4. C ấc chất sản sinh ra e tỵ ĩe n ................... ...................................................... ................................. 360 9.2. Một số ứng dụng các chất điểu hoà sinh trưởng thực v ậ t................................................................. 360 9.2.1. Nguyên tắc ứng d ụ n g .......................................................................................................................360 9.2.2. Auxin và các chất tổng hợp thuộc nhóm auxin...........................................................................361 9.2.3. Gibberellin............................................................................................................................................366 9.2.4. Xytokinin............................................................................................................................................... 372 9.2.5. Etylen ..................................................................................................................................................... 374 9.2.6. C ác chất làm chậm sinh trường (retardant)................................................................................ 376 9.2.7. Axit salixylic (AS)................................................................................................................................380 Tài liệu tham k h ả o ............................................................................................................. .................................. 381 6 NHẬP MÔN Trong cơ thể đa bào luôn tồn tại, phát triển và hoàn thiện theo tiến trình tiến hoá các hệ thông điều hoà, đảm bảo thực hiện sự tương tác giữa các quá trình phát sinh hình thái (hình thành các tế bào, mô và cơ quan của cơ thê), đó là hệ điều hoà dinh dưỡng, điêu hoà hormon và điểu hoà điện sinh lý. Các hệ điều hoà đó liên quan với nhịp nội tại (đồng hồ sinh học) vốn là phương tiện đo đếm nhịp phát triển nội tại trong mối tương quan thích nghi của cơ thế thực vật đối với ngoại cảnh (thay đổi ngày, đêm, mùa). Trong giáo trình này, chúng ta tập trung xem xét sâu hệ điều hoà hormon (phytohormon), nhưng để có khái niệm về vị trí và vai trò của hệ điểu hoà hormon giữa các hệ điều hoà khác, chúng ta cần có khái quát về các hệ điểu hoà trước khi đi sâu nghiên cứu các phytohormon (các chất điều hoà sinh trưởng) trong cơ thể thực vật. 1.1. PHYTOHORMON LÀ GÌ? Phytohormon (hormon thực vật) là các phân tử tín hiệu (truyền tin), tồn tại ở hàm lượng rất bé nhỏ (nồng độ ịig, ng), được hình thành tại một nđi nhưng gây hiệu ứng sinh học mạnh tại một nơi (mô, cơ quan) khác cách xa nguồn, do đó nó phải di chuyển. Sự biến đổi nồng độ hormon và cảm ứng của mô là trung gian của hàng loạt các quá trình diễn ra trong cây, nhiều quá trình trong đó liên quan với các tác nhân môi trường. Trong cơ thế thực vật, hormon điều hoà và phối hợp quá trình trao đổi chất, sinh trưởng và phát sinh hình thái thường phụ thuộc vào các tín hiệu hóa học từ một phần này đến một phần khác của cơ thể. Ý tưởng đó dã bát nguồn trong Ihế kỷ XIX từ nhà thực vậl học người Dức Julyus von Sachs (1832 — 1897). Sachs đã đê xuất rằng, các tín hiệu hoá học có vai trò điểu hoà đôi với sự hình thành và sinh trường của các cơ quan khác nhau của thực vật. Ồng cũng giả định rằng, các tác nhân bên ngoài như trọng lực có thê tác động đến sự phân bô' của các hợp chất trong cây. Mặc dầu Sachs chưa biết bản chất của các tín hiệu hoá học đó, ý tưởng của ông đã dẫn đến sự phát hiện ra chúng. Nhiều quan niệm của chúng ta về mổi liên hệ giữa các tế bào trong cơ thể thực vật xuất phát từ các nghiên cứu tương tự trong động vật. Trong cơ thể động vật, các tín hiệu hoá học vốn là phương tiện liên kêt 7 giữa các tê bào được gọi là horm on. Hormon tương tác với các protein đặc hiệu của tế bào gọi là chất nhận. Phytohormon, là những hợp chất hữu cơ, là sản phẩm tự nhiên bình thường do cơ thể thực vật tổng hợp nên, là nhũng phân tử tín hiệu với liều lượng rất thấp (j.ig hoặc thậm chí ng) gây nên hiệu ứng sinh học cao tại các mô cách xa nơi chúng được hình thành. Phytohormon đóng vai trò chủ đạo trong sự điều hoà các quá trình sinh trưởng, phát triển, phản ứng thích nghi đối vói môi trường và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác trong cơ thể thực vật. 1.2. ĐẶC TRƯNG CHUNG Phytohormon là những hợp chất phân tử thấp. Hàm lượng phytohormon trong mô rất ít (khoảng 1CT13 - 10-5 mol/1) nhưng có hiệu ứng sinh học rất cao. Hệ phytohormon ít chuyên hóa hơn so với hormon động vật bậc cao, nơi có tuyến nội tiết riêng biệt. Phytohormon di chuyển theo con đường chung vận chuyển vật chất trong cây, theo hệ mạch dẫn. Trong cơ thể thực vật, việc điều hoà bằng cách đóng hay ngắt các chương trình sinh lý và phát sinh hình thái đều do cùng một sô" các hormon vói tương quan hàm lượng khác nhau thực hiện. Có 5 hormon được phát hiện trước đây là auxin, gibberellin, xytokinin, axit abxixic, etylen và mối đây đã phát hiện thêm các chất cũng có vai trò điều hoà sự phát triển của cây là braxinosteroit, polyamin, axit jasmonic và axit salixylic. Phytohormon không chỉ tham gia điểu hoà quá trình sinh trưởng mà còn là tác nhân rất quan trọng trong các hiện tượng chín, già, phản ứng của cơ thể đối với môi trường, vận chuyển vật chất và nhiều chức năng khác của cơ thể. Hormon thực vật có nhiều ứng dụng trong thực tế sản xuất, đặc biệt trong ngành trồng trọt, trong công nghệ sinh học. Ngoài hệ điều hoà hormon, trong cơ thể thực vật tồn tại một sô' các hệ điều hoà khác góp phần đảm bảo sự hoạt động hài hoà các chức năng hoạt động sông của cơ thể. Do đó sẽ rất bổ ich khi chúng ta tổng quan lại các hệ điều hoà khác để thấy được vai trò của hormon trong tổng thể các hệ điều hoà chức năng của cơ thể thực vật. 8 Chương 1 TỔNG QUAN VỂ CÁC HỆ ĐlỂU HOÀ TRONG C ơ THỂ THựC VẬT 1.1. KHÁI NIỆM CHUNG Trước khi xem xét các phytohormon, chúng ta cần khái quát vê các hệ diêu hoà khác tồn tại trong cơ thể thực vật, trên nền điều hoà chung đó, chúng ta sẽ tìm hiếu sâu hơn và chi tiết hơn vê vai trò của các phytohormon. Thực vật với sự phân hoá thành hệ thống tổ chức phức tạp gồm các cơ quan, các mô chứa số lượng lớn các tế bào và bào quan chuyên hoá đòi hỏi phải hình thành hệ thống kiếm tra hoàn chỉnh đảm bảo điều phối hài hoà các hoạt động sông xảy ra bình thường trong phạm vi của tế bào cũng như trong toàn bộ cơ thế. Trong quá trình tiến hoá, trước tiên xuất hiện các hệ thống điều hoà nội bào bao gồm sự điều hoà enzym, điều hoà hoạt động của màng và sự diều hoà gen được thê hiện ở sự biếu hiện gen và truyền tín hiệu. Từ khi xuất hiện các cơ thế đa bào, hình thành các hệ điểu hoà giữa các tê bào trong mô và giữa các mô trong cơ quan và giữa các cơ quan trong cơ thế. Các hệ điểu hoà trong cơ thê thực vật bảo đảm sự tương tác của các quá trình trao dổi chất, các chức năng sinh lý dẫn tỏi sự nhịp nhàng, hài hoà trong quá trình phát sinh hình thái (hình thành tế bào, mô và các cơ quan của cơ thể), về bản chất, đó là hệ điều hoà dinh dưỡng, diều hoà hormon, điều hoà diện sinh lý trong mối tương tác liên quan với nhịp nội tại (đồng hồ sinh học). Thực vật sử dụng đồng hồ sinh học trong do đếm nhịp nội tại trong mối tương tác thích nghi đôi với ngoại cảnh (hiến đổi theo ngày đêm) thông qua sự điều biến của sắc tốphytocrom,... 1.2. ĐIỂU HOÀ NỘI BÀO Trong các hệ điều hoà nội bào, trước tiên chúng ta nghiên cứu sự điều hoà hoạt tính của các enzym. 1.2.1. Điều hoà hoạt tính của enzym Điều hoà hoạt tính enzym được thực hiện ở các trung tâm xúc tác. Trước hết là khả năng phản ứng và hướng hoạt động của trung tâm xúc tác phụ thuộc vào hàm lượng cơ chất, sự hiện diện của các coenzym (đối VỚI các enzym hai thành phần), các cofactor (các ion tác động đặc hiệu), các châ't hoạt hoá và các chất ức chế tác động ở trung tâm xúc tác cũng 9 quy định cường độ hoạt động của các enzym. Hoạt tính của enzym có thể liên quan với sự cạnh tranh cơ chất và coenzym chung. Đó là một trong các biện pháp tương tác của các chu trình trao đổi chất khác nhau. Ngoài ra, một số enzym còn có các miền nhận (phân bô’ tại các vị trí khác) để liên kết các chất điều hoà (các effector) là các chất có tác dụng hoạt hoá hoặc ức chế tác động của các enzym. Các chất điều hoà có thể là các chất trao đổi xác định hoặc các hormon, thậm chí các phân tử của cơ chết (hình 1.1B). Do sự liên kết của các chất điều biến tác động dương hoặc âm lên trung tâm miền nhận, toàn bộ cấu trúc của enzym bị biến đổi cấu hình đưa enzym vào trạng thái hoặc bị ức chế, dạng bất hoạt (hình 1.1A), hoặc trạng thái hoạt động (hình 1.1A, B). Qua các điểu vừa nêu, thấy rằng, điều hoà hoạt tính của enzym, ở mức độ xác định, phụ thuộc vào sự điểu hoà tính thấm của màng (cho các chất điều biến thấm qua màng). Enzym hoạt tính Nơi hoạt tính Chát hoạt hoá ổn với bốn phân đơn (một của bốn) định dạng hoạt tinh Miền điều 5 ÍSI ____ Chắt hoạt hoá Dạng hoạt tinh ÌẬ Dạng hoạt tính ốn định Liên két của phân tử cơ chắt vào nơi hoạt tinh của một đcrn phân khoá tát cá các đơn phân trong cẳu dạng hoạt tinh Ểầ. Dạng bất hoạt Dạng hoạt tính ổn định Chắt ức chế hoạt tinh làm Ổn định dạng bắt hoạt Miền không hoại dộng f Dạng bất hoạt Chât Dạng bét hoạt ức chê On định (A) Các ch ất hoạt hoá và ứ c chể hoạt tinh Cữ chẩt (B) Tính h ợ p tác Trong té bào, các chất hoạt hoá và ức ché hoạt tỉnh Một kiểu khác cùa sự hoạt hoá hoạt tinh, phân ly khi ở các nồng độ thắp, sau đó enzym có thể Dạng bất hoạt được chỉ ra ờ bên trái dao dao dộng trờ lại. động qua lại VỚI dạng hoạt tinh khi dạng hoạt tinh chứa cơ chát lâm ổn định. Hinh 1.1. Sự diều hòa hoạt tính của enzym 1.2.2. Điểu hoà màng Điều hoà màng được thực hiện thông qua các biến đổi trong vận chuyển qua màng, do sự liên kết hoặc giải phóng các enzym, protein điều hoà và bằng con đường biến đổi hoạt tính của enzym màng. Chẳng 10 hạn, sự truyền tín hiệu, vận chuyển các ion khoáng chất từ môi trường vào đến đích trong tê bào liên quan với các chất nhận phân bô" tại màng, cũng như các kênh vận chuyển (hình 1.2) và các bơm ion (hình 1.3) là các protein vốn là sản phẩm của sự biểu hiện gen tham gia điểu hoà sự vận chuyển qua màng, còn hoạt tính phân hoá của bản thân các gen (phiên mã như trên hình 1.4 và dịch mã như hình 1.4, 1.5) lại chịu sự kiểm soát của màng (cho hoặc không cho các chất cần thiết đối vối hoạt động của gen đi qua các màng vào nhân). Cơ sở của tất cả các dạng điều hoà nội bào là nguyên tắc cấu hình chất nhận. Đó là nguyên tắc xuất phát thông nhất. Trong mọi trường hợp, phân tử protein dù dó là enzym, chất nhận hoặc chất điểu hoà đều "nhận biết" tác nhân đặc hiệu đối với nó và khi tương tác, hình thành nên phức hệ với tác nhân đặc hiệu đó, phân tử protein biến đổi cấu hình của mình. Trong các phức hệ đa thành phần của các enzym, của gen và của màng, những biến đổi cấu hình của phân tử chất nhận được truyền phôi hợp đến toàn bộ phức hệ, ảnh hưởng đến hoạt tính chức năng của phức hệ (hình 1.1, 1.2 và 1.3). Phân tử tin hiệu Các ion (a) Q u á trình thõng tin Bẽn ngoài tể bào (b) Phối tử điều h ò a s ự đóng, m ờ kênh vặn ch uyển trong m àng (1) Hinh này cho thấy . .. chất nhận cúa kẽnh Phân tử tin hiệu \ Liên két tin hiệụ ' £ ion cổng - phối tứ gảy nèn các biến ' . ien vẫn đóng cho đén khi otein 3 đồi trong protein chất nhận . (2) Khi phối từ liên kết vào chất nhận và cổng SaM mờ ra. các ion đặc hiệu V I — cỏ thẻ trôi qua kénh và biến đối nhanh nàng độ ■của ion riêng biệt bên 'trong tế bào. Sự biến đổi ây có thể tác động „ a “ «**-’' ứng trực tiếp đến hoạt tinh cùa tể bào theo các ứng cách khác nhau (3) Khi phối từ tách khỏi chắt nhận áy, cổng đóng lại và các ion tạm dừng xâm nhập vào tế bào. H ình 1.2. Điếu hòa sự hoạt động của m àng 11 Tín hiệu (cortisol) Bẽn ngoài tế báo Bên trong tế bào Phức hệ Chaperon chất nhận khòng thẻ vào nhàn Protein chaperon Chắt nhận cortisol \ Cortisol vào té bào chất và liên kểt với „ chẩt nhận Hinh 1.3. C hất nhận ỏ trong tế bào chất C hất nhận đối với cortisol (tin hiệu) phải vượt q u a m àng sinh c h ấ t đ ể được g ắ n v ào protein chap ero n trong tế bào chất. Liên kết cùa tín hiệu giải phóng c h a p e ro n và ch o p h ép protein ch ất nhặn vượt q u a được m àng nhân váo nhân, nơi nó hoạt độn g n h ư là tá c n h ân phiên mã. 1.2.3. Điều hoà gen và truyền tín hiệu Trong mục này chúng ta xem xét sự biểu hiện gen và quá trình kích thích cảm ứng sự biểu hiện gen (truyền tín hiệu). 1.2.3.1. Biểu hiện gen Biểu hiện gen liên quan vối sự thu nhận thông tin từ gen và sử dụng nó để tạo ra các sản phẩm gen, có thể là ARN hoặc protein. Ở dạng đơn giản nhất, giáo lý trung tâm của sinh học phân tử phát biểu rằng, thông tin di truyền không trực tiếp từ ADN đến protein. Điều đó là sự thật đôi với hầu hết các gen của tế bào. Sự biểu hiện gen diễn ra qua hàng loạt các mức độ khác nhau trước khi thông tin từ gen được giải phóng như là sản phẩm cuốỉ cùng (Lincoln et al., 2006). Tồn tại hai mức lớn của sự biếu hiện gen là phiên mã và tông hợp protein, nhưng có nhiều giai đoạn trung gian điều hoà tinh tế vốn có thể sàng lọc và biến đổi thông tin. về nguyên tắc, bất kỳ giai đoạn nào trong đó đều có thể được điều hoà. Tính trội tương đối của sự điều hoà tại mỗi mức biểu hiện gen là khác biệt giữa prokaryota và eukaryota (Richard M. Tvvyman, 1998). Các tác nhân di truyền, đã được Mendel phát hiện, xác định các 12 tính trạng như màu của hoa, vị trí của hoa, hình dạng quả đậu, chiều dài thân, màu của hạt và hình dạng của hạt được gọi là các gen. Các gen là trình tự của ADN mã hoá các phân tử ARN trực tiếp liên quan trong sự tổng hợp các enzym và các protein cấu trúc của tế bào. Các gen được sắp xếp thắng hàng trên các nhiễm sắc thê tạo nên các nhóm liên kết, điều đó có nghĩa là các gen được di truyền cùng nhau. Tổng sô" lượng của ADN hoặc thông tin di truyền chứa trong tê bào, nhân hoặc bào quan (lược gọi là bộ gen (genome). Kê từ phát hiện của Mendel, nguyên tắc đã được xác lập một cách khang định là sinh trưởng, phát triển và phản ứng đôi với môi trường của sinh vật đã được quy định bởi một chương trình hoá của các gen. Trong các cơ thề đa bào, sự biểu hiện gen hoặc ngắt gen làm thay đổi sự bô sung enzym và protein cấu trúc của tế bào. Điểu đó cho phép tế bào phân hóa. Chúng ta sẽ xem xét kiến thức cơ sở của quá trình biểu hiện gen và truyền tín hiệu để hiểu được cơ chế tác động của các chất điểu hoà sinh trưởng thực vật ỏ cấp độ phân tử trong các chương tiếp theo. Những tín hiệu nội bào khác nhau là nhu cầu cần để phối hợp sự biểu hiện gen trong quá trình phát triển và giúp cho thực vật phản ứng đối với các tín hiệu từ môi trường. Các tác nhân tín hiệu bên trong (và cả bên ngoài) gây ảnh hưởng lên tế bào bằng trình tự của các phản ứng hoá sinh, được gọi là con đường truyền tín hiệu, vốn phóng đại rất mạnh tín hiệu ban đầu và dẫn đến kết quả cuối cùng là hoạt hoá hoặc ức chế các gen. Trong những năm gần đây đã có nhiều tiến triển trong nghiên cứu các con đường truyền tín hiệu trong thực vật. Tuy nhiên, trước khi mô tả những điều đã biết về các con đường ấy trong cơ thể thực vật, chúng ta khái quát ngắn về thông tin cơ sở của sự biểu hiện gen và truyền tín hiệu trong các cơ thể khác như vi khuẩn, nấm men và động vật để tham khảo, cung cấp kiến thức để hiểu các tác động của các phytohormon đối với cơ thể thực vật, vốn là nội dung chính của giáo trình này. Trước khi xem xét quá trình biểu hiện gen, chúng ta khái quát về một sô" đặc trưng của bộ gen (genome). a) K ích thước, tô chức và tín h p h ứ c tạp của bộ gen Kích thước của bộ gen liên quan đến tính phức tạp của cơ thể. Ví dụ: kích thước bộ gen của E. coli là 4.7 X 106Cb (cặp base, base pairs), của ruồi dấm (Drosophila) là 2 X 108Cb và của con ngưòi là 3 X 109Cb trong mỗi tế bào đơn bội. Tuy nhiên, kích thước bộ gen trong các cơ thể có nhân (eukaryota) là một chỉ số không đáng tin cậy về tính phức tạp vì không phải toàn bộ ADN mã hoá các gen. 13 Trong các cơ thể tiền nhân (prokaryota), hầu như tất cả ADN gồm từ các trìn h tự duy n h ấ t (unique sequences) vốn mã hoá protein và các phân tử ARN chức năng. Tuy nhiên, nhiễm sắc thể của cơ thể có nhân (eukaryota) chứa số lượng lớn ADN không mã hoá vốn có chức năng chính đôi với cấu trúc và tổ chức nhiễm sắc thể. Nhiều ADN không mã hoá chứa các trình tự có nhiều bản sao, được gọi là ADN lặp lại (repetitive DNA). Phần còn lại của ADN không mã hoá bao gồm từ các trình tự sao chép đơn được gọi là ADN chêm (spaser DNA). Phôi hợp lại, ADN lặp lại và ADN chêm tạo nên phần lớn của tổng thể bộ gen trong một sô’ cơ thể có nhân. Ví dụ: trong con người chỉ có khoảng 5% của tổng ADN chứa các gen, các trình tự duy nhất ghi mã đôi với ARN và tổng hợp protein (hình 1.4). Kích thưóc bộ gen thực vật biến động nhiều hơn so vâi bất kỳ nhóm cơ thể có nhân nào khác (Lincoln et al., 2006). Trong thực vật hạt kín, bộ gen dơn bội giới hạn từ khoảng 1,5 X 108Cb đối với Arabidopsis thalyana (bé hơn bộ gen của ruồi dấm) đến 1 X 10u Cb đôi với thực vật Một lá mầm Trillium, vốn lớn hơn đáng kể so với bộ gen của con người. Ngay cả các giông đậu có quan hệ thân thuộc của chi Viciba chứa ADN của bộ gen biến đổi trong phạm vi hơn 20 lần. Vậy vì sao kích thước của các bộ gen thực vật biến đổi nhiều như thế? Các nghiên cứu về sinh học phân tử thực vật đã chỉ ra rằng, hầu hết ADN trong tế bào thực vật với bộ gen lổn là ADN lặp lại. Arabidopsis có bộ gen bé nhất trong thực vật vì chỉ có 10% của ADN nhân của nó là ADN lặp lại. Kích thước của bộ gen cây lúa đã được xác định bằng khoảng 5 lần của Arabidopsis. Như vậy sự khác biệt của kích thưốc bộ gen giữa Arabidopsis và lúa (Oryza) chủ yếu là do ADN lặp lại và ADN chêm. Cho đến thời gian gấn đây, tổng lượng cúa các gen trong một bộ gen của cơ thể còn khó biết được. Nhờ các thành tựu của nhiều dự án xác định trình tự bộ gen, các sô" liệu về sô’ lượng gen của cơ thể đã trỏ nên phô biến, mặc dầu còn thiếu các giá trị chuẩn xác (Lincoln et al., 2006). Theo Milklos và Rubin (1996), số lượng các gen trong vi khuẩn biến động từ 500 đến 8.000 và trùng lặp một phần số lượng gen trong nhiều các cơ thể đơn bào đdn giản. Ví dụ: bộ gen của nấm men chứa khoảng 6.000 gen. Các cơ thể có nhân phức tạp hơn, chẳng hạn như động vật nguyên sinh, giun và ruồi, tất cả hình như có bộ gen với số lượng gen trong khoảng từ 12.000 đến 14.000. Bộ gen của Drosophila (ruồi dấm) chứa khoảng 12.000 gen. Như vậy, quan điểm hiện nay là cần khoảng 14 12.000 các kiểu gen cơ bản đế tạo nên một cơ thể có nhân, mặc dầu có thế đến 43.000 gen là chung, như là kết quả sao chép nhiều lần của các gen xác định, hoặc các họ đa gen. Bộ gen thực vật được nghiên cứu tốt nhất là của Arabidopsis thalyana. Chris Somerville và các cộng sự ở trường Đại học Stanford đã xác định bộ gen của Arabidopsis và thấy nó chứa khoảng 20.000 gen (Rounsley et al., 1996). Việc xác định ấy đã dựa vào nhiều phương pháp. Ví dụ: từ các miền lớn của của bộ gen đã được xác định trình tự, chúng La biết có một gen cho mỗi 5kb (kilobase) của ADN. Từ đó, một bộ gen nguyên vẹn có khoảng lOO.OOOkb, cần phải chứa khoảng 20.000 gen. Tuv nhiên, 6% của bộ gen mã hoá ARN ribosom và 2% bao gồm các trình tự lặp lại cao, do vậy sô' lượng có thể thấp hơn. Có khả năng các giá trị tương tự cũng sẽ được tìm thấy đôi vái các bộ gen của các loài cây khác. Hiện nay các nhà khoa học đã thông nhất rằng, các bộ gen của hầu hết thực vật sẽ được phát hiện chứa từ 20.000 đến 30.000 gen. Một sô' trong các gen ấy mã hoá protein, vốn thực hiện các chức năng giữ nhà, các quá trình tế bào cơ bản, mà rồi chúng sẽ tiếp tục hoạt động trong tấ t cả các kiểu phân hoá của tê bào. Các gen ấy thường xuyên hoạt động; như vậy, chúng được biểu hiện một cách cơ định. Các gen khác được điểu hoà mạnh, hoạt động hoặc ngắt tại các giai đoạn phát triển đặc hiệu, hoác trong các phản ứng đôi với kích thích của ngoại cảnh. Đơn vi mã hoá ARN được lặp lại nhièu lần (280 lần trong bộ gen ngưừi) A D N rARN ----!------r . 1 phièn mâ I Các bước xử lý loại bỏ các mièn đệm sơ cáp 1 ESH I ISB3BSB Ba rARN được hình thánh 18S 5.8S 28S Hinh 1.4. C ác m ã trinh tự lặp lại vãi mức vừa phải đối vói rAR N G en rARIN ấy, d ọ c th eo m iền đ ệm khòng được phiên m ã, lãp lại 2 8 0 lần trong bộ g e n người, cùng với c á c cụm trên năm nhiễm sắ c thể. Một khi gen ấy đ ă đư ợ c phiên m ă, q u á trinh xử lý sa u p h ièn m ã cắt bỏ c á c vùng đ ệm bên trong m iền đưọc phiên m ã và tách b ản phiên m ã sơ khai ra th à n h ba s ả n phẩm rARN cuối cùng (Theo W.K. P urve, David S a n d a v a , G ordon H. O rians, C raig Heller, 2008). 15 b) S ự biếu hiện gen ở các cơ th ể tiền n h ả n (prokaryota) Sự biểu hiện gen được thể hiện trong hai bưóc: Bước thứ nhất là p h iên m ã (transcription), đó là sự tổng hợp bản sao mARN của khuôn mẫu ADN vốn mã hoá protein (Alberts et al., 1994 và Lodish et al., 1995). Bưốc thứ hai được kế tiếp sau bưốc 1 và được gọi là d ịch m ả (translation), đó là sự tổng hợp protein trên ribosom. Các nghiên cứu phát triển đã cho thấy rằng, mỗi cơ quan thực vật chứa số lượng lớn các mARN đặc hiệu — cơ quan. Sự phiên mã được kiểm tra với các protein vốn được liên kết vối ADN và các protein liên kết ADN ấy tự bản thân chúng là đốì tượng cho các kiểu điều biến khác nhau. Nhiều hiểu biết của chúng ta vể các thành tô' cơ bản của sự phiên mã là từ các công trình trước đây về các hệ thống vi khuẩn. Vì vậy trưóc khi thảo luận về sự biểu hiện gen ở cơ thể có nhân (eukaryota), chúng ta khái quát ngắn về sự điều hoà phiên mã trong các cơ thể prokaryota. Tuy nhiên, hiện nay đã rõ rằng, sự điều hoà trong các cơ thể eukaryota phức tạp hơn nhiều so với prokaryota. Sự phức tạp trong sự biểu hiện gen ở các cơ thể có nhân (eukaryota) cho phép các tế bào, các mô phân hoá và tạo khả năng cho sự đa dạng các chu trình sống của thực vật và động vật. P ro te in (ch ất ức chế) liên k ế t ADN d iều hoà q u á trìn h p h iên m ả tro n g cơ th ể tiề n n h ân (P ro k ary o ta). Trong vi khuẩn (cơ thể tiền nhân), các gen xếp thành các operon. O pero n là dãy các gen k ế tiếp gồm các gen cấu trúc và các trinh tự điều hoà. Ví dụ nổi tiếng nhất là operon lactose (lac operon), được Franẹois Jacob và Jacques Monod của Viện Pasteur ở Paris mô tả lần đầu trong năm 1961. Lac operon là một ví dụ của o p ero n cảm ứng (inducible operon), đó là một trong các chất trung gian trao đổi chìa khoá cảm ứng sự phiên mã của các gen. Lac operon chịu trách nhiệm sản xuất ra ba protein liên quan trong việc sử d ụ n g d ia ac ch a rit lactose. O poron n à y gồm b a gon cốu trú c v à b a trình tự điều hoà. Các gen cấu trúc (z, y và a) ghi mã đối với trĩnh tự của các axit amin trong ba protein: a-galactosidase, enzym xúc tác sự thuỷ phân lactose thành glucose và galactose; permease, đó là protein chất mang để vận chuyển lactose qua màng vào trong tế bào; và transacetylase mà vai trò của nó còn chưa biết. Ba trình tự gồm gen điều hoà i, trình tự khởi động p (miền khởi đầu, miền khỏi động p ) và trình tự vận hành (trình tự chỉ huy, miền vận hành) o kiểm tra sự phiên mã của mARN trong quá trình tổng hợp các protein ấy (hình 1.5). Gen điểu hoà i mã hoá p ro te in ức c h ế (repressor protein), protein ức chế này nhận biết và liên kết với một trình tự nucleotit đặc hiệu, được gọi là m iền vận h àn h o (operator ó). Miền vận hành o, định 16 cư xuôi dòng (có nghĩa là tại đau 3') của trình tự khởi động, p (promoter, p), nơi ARN - polymerase gắn vào operon để khỏi động sự phiên mã và ngược dòng trực tiếp (có nghĩa là tại đầu 5') của vị trí khởi động phiên mã, nơi sự phiên mã bắt đầu. (VỊ trí khới dộng được cho rằng phải là tại đầu 5' của gen. dù rằng ARN — polymerase phiên mã từ đầu 3' đến đầu 5' dọc theo sợi đôi diện. Sự quy ưổc ấy đã được chấp nhận, do vậy trình tự của mARN sẽ cặp đôi với trình tự ADN của gen). A Lac operon ngẳt (khõng có lactose) Lactose operon ADN ... Gen điếu hoà 1 Mién khởi đấu p Miẻn vãn hanh 0 Gene z Gene y Gene a ARN polymerase gản váo mièn khới đâu p Các gen cấu trúc Nơi bắt đàu phién mâ ' Dich mả Phièn mâ bị phong toá khi protein ức chế gán vào mièn vặn hành o; khỗng tạo được mARN z, y. a và Chất ức ché gắn vao gen chỉ huy o do đô không sản xuắt được các enzym Hình 1.5. Lac operon của E. coli sử dụng sự kiểm tra cảm ứng âm A. Khi không có lactose. Gen điếu hoà /, định vị ngược dòng của operon, được phièn mã để tạo ra mARN vốn mã hoá protein ức chê (repressor protein). Protein ức chế liên kết vào mién vặn hành o (operator o). Miền vân hành là môt đoan ngắn của ADN đinh vi giữa trinh tư khải đầu p (nơi ARN - polymerase gán vao AUN) va ba gen cáu trúc 2. y và a. Khi áp sat vào miên vặn hành, chát ức chê ngăn càn sự lièn kết cùa ARN - polymerase vào vị trí khởi đấu phiên mã; B. Khi có lactose (chất cảm úng) đươc bổ sung vào môi trướng và được tế bào hấp thụ, lactose liên kết vào chất ức chế và làm bất hoat nó. Chất ức chế đã bị bất hoạt không có khả nâng gắn kết với miền vặn hành o, nhờ vậy phièn mã va dịch mã đuọc thực hiện,... mARN được tạo nên có tên là "đa gen" (polycitronic) vì nó ghi mã đa gen. Nhãn thây rằng quá trình dịch mã bắt đấu trong khi phièn mã còn đang tiếp diễn. Khi k h ô n g có lactose, lac operon ngắt (hình 1.5A), chất ức chế lactose tạo phức bền chặt với trình tự vận hành o và phong toả sự tương tác cúa ARN — polymerase với vị trí khởi động phiên mã, ngăn chặn có hiệu quả sự phiên mã. Khi có lactose, lac operon đóng (hình 1.5B), lactose liên kết vói protein ức chế, hình thành phức hệ lactose - chất ức chế (protein), cấu hình của chất ức chế bị biến đổi. Vối cấu hình mới, chất ức chế không có khả năng 2-G T. THỰ C VẬT-A 17 liên kết với miền vận hành o và miền này vẫn duy trì trạng thái đóng, ở trạng thái này, enzym ARN-polymerase có thể liên kết với miền khởi động p và từ đó nó bắt đầu trượt ngược dòng từ 5' đến 3’ theo các gen của operon dẫn đến sự tổng hợp các enzym: a-galactosidase, permease và acetylase. Chất ức chế lac là một ví dụ về cơ chế điểu h o à (kiểm tra ) âm vì chất ức chế phong toả sự phiên mã ngay sau khi liên kết vào miền vận hành o (còn gọi là gen chỉ huy) của operon. Lac operon cũng được cơ chế điểu hoà (kiểm tra ) dương (hình 1.6). (A) ADN • Gen đièu hoà / Lactose operon 1 Mièn khỏi đàu p Mén vậnhànho Gene z Gene y Gene a \ Phửc hệ C A P - CAMP oARN - polymerase (B) Protein hoạt hoá chát dị hoá ADN' Gen đièu hoà i [Mièn khỏi đầu p Vận hành 0 Gene 1 Gene y Gene a Thực hiện phiên mâ mARN Hình 1.6. C ác protein hoạt hoá chất dị hoá (C A P) và A M P m ạch vỏ n g (cA M P) kích thich sự phiên mã CAP không có ả n h hường đ ế n phiên m ã cho đ ến khi cAMP g ắn v ào nó. A. P h ứ c h ệ CA P - cAMP g ắn vào trinh tự ADN đ ă c hiệu cạn h m iền khởi đ ầu p c ủ a lac op ero n ; B. S ự liên kết củ a phức h ệ CAP - cAM P làm cho m iền khởi đ ầ u p d ễ tiếp c ậ n hơn đối với ARN - p o ly m erase và tốc dộ phiên m ã dược gia tăng. Cđ chế này được phát hiện khi nghiên cứu hiện tượng gọi là hiệu ứng glucose. Nếu bổ sung glucose vào môi trường dinh dưỡng đã có lactose, các tê bào E. coll trao dổi glucose và bỏ qua lactose. Glucose loại bỏ lactose. Glucose gây ra hiệu ứng ấy bằng cách giảm thiểu nồng độ của AMP mạch vòng (cAMP). Khi mức glucose thấp, mức cAMP là cao, cAMP gắn vào một p ro te in h o ạ t hoá (activator protein), protein hoạt hoá chất dị hoá (catabolyte activator protein, CAP), chất này nhận biết và liên kết vối một trình tự nucleotit đặc hiệu trực tiếp ngược dòng của lac operon và các vị trí của miền khởi đầu p (hình 1.6). Ngược vối hoạt động của protein ức chế lactose, khi CAP được tạo phức với chất điều biến của nó, cAMP, ái lực đối với vị trí liên kết ADN của nó gia tăng đột ngột (từ đó quy chiếu về sự điều hoà dương). Phức hệ ba cấu tử được hình thành từ CAP, cAMP và các trình tự ADN lactose operon cảm ứng liên kết Clia'ADN, vốn hoạt hoá sự phiên mã các gen 18 2-GT THỰCvAT-B cấu trúc của lactose operon bỏi sự gia tăng ái lực của ARN — polymerase đối với vị trí của miền khởi đầu p bên cạnh. Vi khuẩn tổng hợp cAMP khi glucose trong môi trường sinh trưởng của chúng đã cạn kiệt. Như vậy, các gen của lactose operon chịu sự điều hoà đổi nghịch bởi sự hiện diện hoặc thiêu vắng glucose (nồng độ cao của cAMP) và sự hiện diện của lactose, vì rằng glucose là một chất dị hóa của lactose. Trong vi khuẩn, các chất trao đổi cũng có vai trò như chất đồng ức chế, hoạt hoá chất ức chế protein vốn phong toả sự phiên mã. Uc chế sự tổng hợp enzym thường liên quan với sự điều hoà các con đưòng sinh tổng hợp mà trong đó một hoặc nhiều enzym chỉ được tổng hợp nếu thiếu vắng sản phẩm cuối cùng, ví dụ: một axit amin. Trong trường hợp ấy, axit amin hoạt động như là chất đồng ức chế. Nó tạo phức với chất ức chế protein và phức chất ấy gắn vào miền vận hành o, ngăn chặn sự phiên mã. Tryptophan (trp) operon trong E. coli là một ví dụ về một operon vốn hoạt động theo kiểu đồng ức chế (hình 1.7). Chúng ta thử áp dụng mô hình biểu hiện gen ở vi khuẩn (prokaryota) vừa được xem xét để nghiên cứu sự biểu hiện gen ỏ cơ thế có nhân (eukaryota). A. Không có tryptopha n Tryptophan operon ADN 5 ' Gen 1 Gen khỏi đầu p Gen vận hành 0 Gene D điều hoà i _n j “ l_ mARN mARN Dịch mâ B. Có tryptopha n polymerase Ẽ ũ . . . Chát ửc ché (bát hoạt)ARN - polymerase ĩ Tryptophan operon ADN S '- 1 Miên khỏi đàu p ỈMiẻn vận hành 0 Gene E Gene D Gene c Gene B Gene A 1----------------- \ U I 1-------------------- Phièn mâ Phiên mã bị phong toả Dịch mả ìeraso 40 ù ũ—1 Chảt ức ché Chầt đồng ức ché tryptophan ''Phức hê chât ưc ché - chát dỏng ưc ché (hoai tinh) Hình 1.7. Tryptophan (trp) operon của E. co // T ryptophan (trp) là sà n p hẩm cuối cùng c ủ a con đưởng được tryptophan sy n ta s e và các enzym k h ác xúc tác. S ự phiên m ã củ a c á c g en ch ất ú t c h ế d ẫn đ ế n kết q u ả là s ả n sinh ra protein c h ấ t ức ch ế. Tuy nhiên, ch ất ức c h ế bất hoạt cho đ ến khi nó tạ o phứ c với c á c ch ất đóng ức c h ế c ủ a nó, Trp. A. Khi không có Trp, xảy ra phiên m ã v à dịch m ã.; B. Khi có Trp, phức h ệ c h ấ t ức c h ế - ch ất đổn g ức ch ẽ (tryptophan) được h o ạt h o á d ẫ n đ ế n s ự phong toả quá trình phiên m ã b ằ n g cách liên kết vào m iền vận hành o (T heo Lincoln, e t al, 2006). 19 c) S ự biếu hiện gen ở cơ thê có n h â n (eukaryota) Sự biểu hiện gen ở cơ thế vi khuẩn (prokaryota) có thể cung câp mô hình đế xem xét sự biểu hiện gen ở các cơ thể có nhân (eukaryota). Tuy nhiên, chi tiết của quá trình đó ở eukaryota hoàn toàn khác biệt và phức tạp hơn nhiều. Trong các cơ thể prokaryota (vi khuẩn), sự dịch mã gắn liền vối sự phiên mã. Khi các chuỗi phiên mã (trong tài liệu được gọi vâi các tên như tiền mARN, ARN phiên mã, mARN sơ khai) kéo dài ra, chúng gắn vào các ribosom và bắt đầu tổng hợp các protein (dịch mã). Tuy nhiên, trong eukaryota, vỏ nhân tách biệt bộ gen ra khỏi bộ máy dịch mã. Các chuỗi phiên mã trước hết cần được vận chuyến đến tê bào chất, chịu thêm mức kiểm tra khác (mức dịch mã). AUG (nơi mở đàu phiên mâ) 1 ADN Nơi mở đầu dịch mâ 1 Nơi ngừng dịch mâ ĩ ARN - polymerase II Mũ m'G Tièn mARN mARN Polysom Xảy ra phiên mã Phiên mâ (+ Chup mũ vá gắn đuôi polyA) Tách tièn chát AAAAn Vặn chuyén mARN ra Khói nhân váo té bào chát AAAAn Cẳc polypeptit được giâi phóng ọ ậ Hình 1.8. Biểu hiện gen trong eukaryota ARN - polym erase II g ắn vào mién khởi dầu p củ a các g en mã hoá protein. Không giống với c á c gen prokaryota, các g en eukaryota không tụ tập trong operon và mỗi g en được p h ân chia thánh các oxon và các intron Phièn m ã từ thanh nhiễm sắ c khuôn m ẫu diễn ra trono hướno 3’ đ ến 5' tại vị tri mở đ ầu phiên m ã và chuỗi ARN đan g lớn dài thêm m ột nucleotit từ m ột lấn phiên m ã theo hướng 5' đ ến 3'. Sự dịch m ã mở đ ầu với AUG đầu tiên d a n g m ã hoá metionin, như trong prokaryota và kết thúc với codon ngừng Phiên bản tiền mARN được chụp m ũ đầu tiên bởi cho thêm 7-m etylguanilat (m 'G ) vào d ầu 5'. Đ ầu 3' bị rút ng án lại một ít bởi s ự phản cắt tại vị tri đ ặc hiệu và dược gắn đuôi poly-A. Tiền mARN (ARN phiên m ã) được chụp mũ và polyadenin hoá, sa u đó đuọc kết nối bởi phức hệ th ể kết nối (splycesom e cOM PIex) vá các intron bị loại bỏ. mARN trường thành rời khỏi nhân qua c á c lỗ nh ân và bắt đầu dịch m ã trên các ribosom trong xytosol. Vì mỗi ribosom tiến tới đ ầu 3' c ù a mARN, c á c ribosom mói g ắn vào đ ầu 5' và bắt đ ầu dịch m ã dẫn dến s ự hình thành các poiysom (T heo Lincoln, et al, 2006). Các tiền ARN (pre-mARN) của nhân Gukaryota cần phải dược sự xứ lý tiếp: Eukaryota củng có khác biệt trong tổ chức các bộ gen (genome) của chúng. Trong hầu hết các cơ thể eukaryota, mỗi gen mã hoá một 20 polypeptit đơn. Bộ gen của các cơ thể có nhân (eukaryota) không chứa các operon, trừ một ngoại lệ (khoảng 25% của các gen trong giun đất Caenrhabditis elegans được sắp xếp thành các operon). Các tiền mARN được phân thành các mARN cá thể vốn mã hoá các polypeptit đơn, các mARN đơn gen này được phôi hợp bởi sự phân cắt, polyadenin hoá (polyA) và ghép nốỉ (Kuersten et al., 1997)). Hơn nữa, các gen eukaryota đưực phân chia thành các miền mã hoá gọi là các exon và các miền không mã hoá gọi là các in tro n (hình 1.8). Vì vậy, chuỗi phiên mã đầu tiên, hoặc tiền mARN (mARN sơ khai) cần được xử lý đế loại bỏ các intron. Xử lý ARN liên quan đến nhiều bước. Tiền — mARN vừa mới được tống hợp tức khắc được đóng gói vào chuỗi các cấu tử chứa protein nhỏ, đưdc gọi là các câu tử ribonucleo — protein dị nhân (heteronuclear ribonucleo — protein particles), hoặc các cấu tử hnRNP. Một sô’ trong các cấu tử ấy gồm từ các protein, các ARN nhân bé nhỏ và được gọi là các ribonucleo - protein nhân bé (smalnuclearribonucleoproteins) hoặc các snRNPs. Tập hợp các snRNP khác nhau vào các phức hệ ghép nôi (splyceosom cOMPlexes) tại các ranh giới của tiền mARN và thực hiện phán ứng ghép nối. Trong một sô' trường hợp, tiền mARN có thể được nốỉ theo các cách khác nhau. Quá trình đó được gọi là nối ARN th a y thế, hoặc là nối ARN xen kẽ (alternative RNA splycing). Chẳng hạn, một exon vổn hiện hữu trong một biến thể của chuỗi phiên mã đã được xử lý có thê được ghép nối vói biến thề khác. Bằng cách ấy, một gen có thể tạo thành các chuỗi polypeptit khác nhau. Khoảng 15% các gen của con người dưực xử lý bằng sự ghép nối thay thế (xen kẽ). Mặc dầu sự ghép nốì xen kẽ là rất hiếm trong thực vật, nó liên quan vói sự tổng hỢp ẹnzym hoạt hoá rubisco (trong quang hợp), ARN - polymerase II và sản phẩm gen của gen đồng hộp (homeobox gene) của cây lúa cũng như các protein khác (Golovkin và Reddy, 1996). Trưốc khi hôi, tiền mARN được biến đổi trong hai con đưòng quan trọng: 1) C hụp m ủ 7 -m ety lg u an y lat (m7G cap) vào đầu 5’ của chuỗi ARN phiên mã bằng cách liên kết 5' đến 3'. Tiền mARN đltdc c h ụ p m ũ h ổ u n h ư tức k h ắ c n g ay sau k h i b ắ t đ ầ u tô n g h đ p m A RN . Một trong các chức năng của mũ 5' là bảo vệ chuỗi ARN phiên mã đang lớn khỏi bị NAase (ribonuclease) phân giải. 2) Nối đuôi poly-A. Tại giai đoạn cuối trong sinh tổng hợp chuỗi phiên mã sơ khai, đầu 3' bị phân cắt tại vị trí đặc hiệu và đuôi poly-A (AAAn), thường bao gồm khoảng từ 100 đến 200 các gốc axit adenylic, được nôi thêm bởi enzym poly-A polymerase (hình 1.8). Đuôi poly-A có một sô’ các chửc năng lậ;.l) Bảo vệ chông lại các NAase và do vậy gia tăng độ ổn định của các phân tử mARN trong tế bào chất; 2) c ả đuôi poly-A và mũ 5' là cần thiết để chuyển mARN qua lỗ nhân; 3) Đuôi poly-A gia tăng hiệu quả dịch mã trên các ribosom. Nhu cầu của các mARN eukaryota có cả hai đầu 5' và đuôi poly—A đảm bảo được rằng chỉ có các chuỗi phiên mã đã được xử lý đúng thì mới 2 1 đến ribosom và sẽ được dịch mã. Mỗi một bước trong sự biếu hiện gen của tế bào eukaryota có tiềm năng điều hoà sô' lượng sản phẩm gen trong tế bào tại mọi thời điểm (hình 1.9). Tương tự với sự khởi đầu phiên mã, quá trình nôi cũng có thể được điều biến. Ví dụ: để thoát ra khỏi nhân, một mARN cần phải có mũ 5', một đuôi poly-A và nó phải được nối đúng. Các chuỗi phiên mã được xử lý không hoàn thiện ỏ lại trong nhân và chúng sẽ bị phân giải. Các m ức kiếm tra biểu hiện gen Bộ gen (Genome) í E ® x ử lý và di chuyển ARN C h ít nhiễm s ic Khuếch đại gen (hiếm) Tái sắp xép ADN (hiếm) Khứ ngưng tụ chất nhiẽm sắc Metyl hoá ADN ADN sẵn sàng cho sự biểu hiện gen Nhân ( 2 ) Phiẽn mã 1 ARN - polymerase II /TS Xử lý tiền ARN (ARN sơ khai) v â ' và chuyển dịch V Bản phiẽn ARN sơ khai Xử lý (chụp mũ 5', gán đuôi polyA, loại intron, nối exon với nhau) và luân chuyển mARN trong nhân Vận chuyển mARN đi qua vỏ nhân mARN trong xytosol Tê bào chắt Dịch mã ^5^ Sau dịch mâ -------------------------------- -- Phân giải mARN (luân chuyẻn) Dich mâ cá khả nâng hướng đlch đến LNSC (ER) Sản phẩm polypeptít trong xytosol hoặc trong LNSC Gắp nép và tập hợp protein Có th i phin cắt polypeptit Cố thẻ cái biến polypeptit Cố thẻ nhập các protein vảo các bào quan Protein chửc năng \Phân giãi protein (luân chuyển) Hình 1.9. Đ iểu hoà nhiếu mức sự biểu hiện gen trong tế bào eu karyo ta 1) Đ iều h o à g e n bởi s ự k h uếch đại gen, tái sắ p xếp ADN, khử ngưng tụ h o ă c ngưng tụ chất nhiễm sắ c, h o ặ c metyl h o á ADN; 2) Điều h o à phiên m ã; 3) x ử lý ARN và luân ch u y ển ARN trong nhân và ch u y ển dịch mARN ra khỏi nhân; 4) Kiểm tra dịch m ả (b ao gồm liên kết vào LNSC trong m ột s ố trưởng hợp); 5) Kiểm tra sa u dịch m ả b ao gổm luân ch u y ển mARN trong xytosol và g ấ p n ếp , tậ p hợp, ph àn cắt polypeptit, cải biến và n h ập c á c protein v ào c á c bào qu an (T heo B eck er et ãl., 1996). 22 Hiện đã biết được một số cơ chế điều hoà sau phiên mã khác nhau. Độ ôn định và tốc độ luân chuyển của các phân tử mARN là khác biệt nhau và biến dộng giữa các mô khác nhau phụ thuộc vào các điều kiện sinh lý. Ví dụ: trong cây đậu (Vicia faba), nhiễm nấm bệnh gây ra sự phân giải nhanh mARN vốn mã hoá các protein giàu prolin PvPRPl của vách tê bào câv đậu. Có thế dẫn một ví dụ khác về sự điều hoà biểu hiện gen hằng cách phân giải mARN, là sự diều hoà quá trình biêu hiện của một Irong các gen đối vối phân đơn vị bé của rubisco trong các rễ của loài bèo tấm (Lemna gibba). Rễ của bèo tấm thực hiện quang hợp và do vậv biểu hiện gen đối với phân đơn vị của rubisco, nhưng sự biểu hiện của một trong các gen (SSU5B) là rất thấp ở trong rễ so với trong các lá. Peter và Silverthorne (1995) cho rằng, mức độ thấp của SSU5B trong rễ là do tốc độ luân chuyển cao của tiền mARN SSU5B trong nhân. Thêm vào sự luân chuyến mARN, độ ổn đ ịn h d ịch m ã (khả năng dịch mã) của các phân tử mARN cũng là biến động. Chẳng hạn, các ARN xếp gấp vào trong các phân tử với các cấu trúc bậc hai và bậc ba, điêu đó có thế ảnh hưỏng đến tính nhạy cảm của codon khởi đầu dịch mã (trình tự AUG đầu tiên) đến ribosom. Một tác nhân khác cũng có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của mARN là việc sử dụng codon (mã). Sự dư thừa trong các mã bộ ba đặc hiệu của axit amin đã cho trong khi dịch mã và mỗi tế bào có tỷ lệ đặc trưng của các tARN sẵn có đã được axit amin hoá khác nhau được gọi là độ lệch codon (độ lệch mã, codon bias). Nếu tín hiệu (mARN) chứa sô" lượng lớn các mã bộ ba vốn là hiếm đôi với tế bào đó, sô’ lượng ít của các tARN đã được ấn định sẵn sàng cho các codon ấy sẽ làm chậm sự dịch mã. Cuối cùng, vị trí của tế bào nơi xảv ra sự dịch mã hình như cũng ảnh hưỏng đến tốc độ biểu hiện gen. Các polysom tự do có thể dịch các mARN vối các tốc độ rất khác biệt so với tốc độ dịch mã của các polysom được gắn với lưỏi nội sinh chất (LNSC); thậm chí bên trong LNSC, ở đấy tốc độ dịch mã có thế khác nhau. Mặc dầu các ví dụ về sự điều hoà sau phiên mã đã được chứng minh đối với mỗi bước đã được mô tả ỏ trên và đã được tóm tắt trong hình 1.9, sự biểu hiện của hầu hết các gen eukaryota, tương tự các cơ thê prokaryota, được điều biến ở mức phiên mã. - Sự phiên mã trong các cơ thể có nhân (eukaryota) được điểu biếnbởi các trình tự điều hoà hoạt động dạng - cis: Trong sự tổng hợp của hầu hết các protein của eukaryota được điểu hoà ở mức phiên mã. Tuy nhiên, sự phiên mã trong các cơ thê eukaryota phức tạp hơn nhiều so vói trong các cơ thể prokaryota: Đầu tiên, tồn tại 23 ba ARN - polymerase khác nhau trong eukaryota: I, II và III. ARN - polymerase I định cư trong nhân và hoạt động tổng hợp hầu hết các ARN ribosom. ARN - polymerase II, định cư trong chất nhân, chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền mARN (các ARN phiên mã, các ARN sơ khai). ARN - polymerase III, cũng định cư trong chất nhân, tổng hợp các ARN bé nhỏ, chẳng hạn như tARN và rARN 5S. Sự khác biệt quan trọng thứ hai giữa sự phiên mã trong eukaryota và trong các cơ thể prokaryota là các ARN - polymerase eukaryota đòi hỏi phải có các protein bổ sung, được gọi là các tá c n h â n p h iên m ả chu n g (general transcription factors) vào đúng vị trí tại nơi phiên mã xuất phát. Trong khi đó, các ARN — polymerase prokaryota cũng đòi hỏi các polypeptit phụ trợ, được gọi là tác n h ân sigm a (ơ), những polypeptit ấy được coi như là các đdn phân của ARN — polymerase. Ngược lại, các tác nhân phiên mã chung eukaryota được tạo nên từ phức hệ khởi động phiên mã lớn, gồm nhiều đơn phân. Ví dụ: bảy tác nhân phiên mã chung cấu thành phức hệ khởi động của ARN — polymerase II, mỗi một trong chúng cần phải được bô sung theo trật tự đặc hiệu trong thời gian tập hợp (hình 1.11). Theo một mô hình hiện tại, phiên mã được khởi đầu khi tác nhân phiên mã cuôi cùng, TFIIH (tác nhân phiên mã đốĩ vối ARN — polymerase II protein H), nôi với phức hệ và gây nên sự phosphorin hoá ARN T- polymerase. Sau đó, ARN - polymerase II tách ra khỏi phức hệ khởi đầu và được tiến hành dọc theo sợi đối cảm (antisense strand) theo hướng từ 3' đến 5'. Trong khi một sô’ các tác nhân phiên mã chung tách ròi khỏi phức hệ tại điểm đó, còn các tác nhân khác vẫn liên kết vối phâr) tử ARN — polymerase khác và bắt đầu vòng phiên mã mới. Sự khác biệt thứ ba giữa sự phiên mã trong prokaryota và trong eukạryota là tính phức tạp của các trình tự khởi động (promoter), các trình tự ngược (5') của vị trí khởi động là các trình tự điều hoà sự phiên mũ. Cú lliể chia .cấu trúc của miền khởi dộng (promoter) eukaryota thành hai phần, lõi hoặc khởi động tối th iểu (core or minimum promoter) gồm trình tự ngược (upstream) tối thiểu cần cho sự biểu hiện gen và các trìn h tự đ iều hoà bô sung, vô’n kiểm tra hoạt tính của phần khỏi động lõi (core promoter) (Lincoln et al., 2006). Mỗi một trong ba ARN - polymerase có kiểu khác nhau của trình tự khối động. Một ví dụ về trình tự khởi động của ARN - polymerase II điển hình như đã chỉ ra trong sơ đồ trên hình 1.10. Phần lõi (core promoter) của các gen đã được phiên mã bởi ARN- polymerase II kéo dài điển hình khoảng 100 cb (bp) ngược vị trí khởi động phiên mã và bao gồm một sô" các trình tự thành phần được coi là các trìn h tự gần m iền khởi động 24 (proximal promoter sequences). Khoảng 25 đến 35cb ngược trên (upstream) vị trí khởi động phiên mã là một trình tự ngắn được gọi là hộp TATA (TATA box), bao gồm trình tự TATAAA (A). Hộp TATA đóng vai trò quyết định trong phiên mã vì nó đóng vai trò như là vị trí tập hợp của phức hệ khơi động phiên mã. Khoảng 85% các gen của thực vật có trình tự như vậv hầu như được chứa trong các hộp TATA. TATA TFIID ° C ì . r ■ * u L TFIIB 2 d Hình 1.10. Trật tự tập hợp của các tác nhân phiên mã chung cấn cho sự phiên mã bỏi A R N -po lym erase II 1) TFIID, m ột phức h ệ đ a phân, g ắn vào hộp TATA bằng con đường protein liên kết - TATA; 2) TFIIB nối phức hệ; 3) TFIIB g ắn vào ARN — polym eroso II liôn kết vói phút) hộ, cùng với TFIIE và TFIIH. T ập hợp c á c protein được coi như là phức h ệ khởi đ ầ u phiên m ã; 4) TFIIH, m ột protein kinase, phosphorin h o á ARN - polym erase, m ột trong c á c tá c n h ân phiên m â chung được giải p h ó n g và b ắ t đ ầu phiên m ã (T heo A lberts et al., 1994). Ngoài hộp TATA, các phần lõi (các phần khởi động tôi thiểu) của các cơ thể eukaryota còn chứa hai trình tự điểu hoà bổ sung: h ộ p CAAT (CAAT box) và h ộ p GC (GC box) như trên hình 1.11A. Hai trình tự ấy là các vị trí liên kết của các tác nhân phiên mã, đó là các protein gia tăng tô’c độ phiên mã bằng cách xúc tiến sự tập hợp của phức hệ khỏi động. Bản thân các trình tự ADN được gọi là các trìn h tự d ạ n g cis (cis - acting sequences), vì rằng chúng ỏ kế cận các đơn vị phiên mã mà chúng điều hoà. Các tác nhân phiên mã vốn gắn vào trình tự dạng CIS 25 được gọi là các tá c n h â n d ạn g trans (trans — acting factors), vì rằng các gen mã hoá chúng định cư ở đâu đó trong bộ gen (genome). Nhiều các trình tự dạng cis định cư ngược dòng xa hơn của các trình tự khởi động gần (proximal promoter sequences) có thể sử dụng sự kiêm tra hoặc dương, hoặc âm đối vói các miền khởi động eukaryota. Các protein điêu hoà gen Các tác nhân phiên mã chung I--------1 ARN polymease II ADN GC box CAAT box I— Thành tố kiểm tra cận tâm — I C a n a X - I______ I Miền kiểm V. ADN ™ r r r TATA box Miền khởi động tra gen gen X B Protein ức chế mạnh Tập hợp protein hoạt động yéu Gen điều hoà Tập hợp 4 T*p hw , . h o ^ n g -ÍU " r ein ARN - polymerase II và các tác nhân phiên m3 chung Hình 1.11. T ổ c h ứ c và điếu hoà gen eukaryota điển hình A). C ác nét đ ặ c trutig c ủ a m iền khởi động tối thiểu (lõi) cù a ARN - p o ly m erase II eukaryota điển hinh và các protein điều hoà s ự biểu hiện gen. ARN - poly m erase II định c ư tại hộp TATA (TATA box) trong liên kết với c á c tác nhân phiên m ã chung khoảng 25 bp n g uọc dòng vị tri bẳt đ ầu phiên m ã. Hai trình tự điều hoà dạng cis hoạt động làm tăng h o ạt tính củ a ARN - polym erase II là hộp CAAT và hộp GC, định cư tại khoảng 80 và 100 bp ngược dòng, m ột cách tương ừng, c ủ a vị irl khởi đổng phlẽn m a. C ăc protein AGN vởn g ắn v ào c á c than h ph án ấy đa được nhận biết; B). Điều h o à sự phiên m ã bởi các trình tự điều h o à từ xa và c á c tá c nh àn dạng trans. C á c tá c nh ân dạn g trans được g ắn vào các trinh tự diều h o à từ xa có th ể h o ạt độn g trong quan h ệ hoạt hoá phiên m ả bởi s ự tiếp xúc vật lý trực tiếp-vối phức hệ khởi dộn g phiên m ã. Chi tiết củ a q u á trinh này chư a hoàn to àn sá n g tỏ (Theo Alberts et al., 1994). Những trình tự ấy được gọi là các trìn h tự đ iều h o à từ xa (distal regulation sequences) và chúng thường định cư bên trong 1.000 cb của miền khởi động phiên mã. Giống như vối prokaryota, các tác nhân phiên mã có tác động dương liên kết vào các vị trí ấy được gọi là các c h ấ t h o ạ t ho á (activators), còn những chất ức chế sự phiên mã được gọi là các c h ấ t ức c h ế (repressors). Như sẽ được trình bày trong các chương sau, các hormon thực vật điều hoà sự biểu hiện gen liên quan với trạng 26 thái bất hoạt của các protein ức chế. Các trình tự dạng cis liên quan với sự điểu biên gen bởi các hormon và các chất truyền tín hiệu được gọi là các th à n h tô trả lời. Như sẽ thảo luận trong các chương sau (về hormon thực vật), nhiều thành tô trả lòi. vốn điểu hoà sự biểu hiện gen, đã được nhận biết trong thực vật. Thêm vào các trình tự điều hoà đã có bên trong bản thân miền khởi động, có thể chịu sự điều hoà của các thành tô" kiểm tra của hàng nghìn cập bazơ (cb) định cư cách xa vị trí khởi động. Các trình tự điều hoà dương tính định cư từ xa được gọi là các gen tă n g cường. Các gen tăng cường có thế định cư hoặc ngược dòng, hoặc xuôi dòng so vói trình tự (gen) khởi động. Đã chứng minh rằng, trong cơ thể thực vật, nhiều gen thực vật quan trọng về mặt phát triển phải chịu sự điểu hoà của các gen tăng cường (Sundarsan et al., 1995). Các protein liên kết ADN trên các trình tự dạng cis điểu hoà sự phiên mã bằng cách nào? Trong khi hình thành phức hệ khỏi động, ADN giủa phần lõi của trình tự khởi động và các thành tố kiểm tra ở xa nhất được cuộn hở theo cách cho phép tất cả các tác nhân phiên mã gắn được vào đoạn của ADN đế tạo được sự tiếp xúc vật lý với phức hệ khởi động (hình 1.11B). Thông qua sự tiếp xúc vật lý đó, tác nhân phiên mã thực hiên sự kiểm tra của nó, hoặc là dương, hoặc là âm đổi với sự phiên mã. Sô’ lượng lớn của các thành tô’ kiểm tra đã được nói đến có thể biến đổi hoạt tính gen khởi động đơn, các khả năng đôi với sự điều hoà gen theo cách khác nhau trong các cơ thể eukaryota là hầu như vô hạn. - Các tác nhân phiên mã chứa các hình mẫu cấu trúc đặc hiệu: Các tác nhân phiên mã chung có ba miền đặc trưng cấu trúc: miền liên kết ADN, miền hoạt hoá phiên mã và miền liên kết — phối tử. Đe Bắn được vào các trình tự đặc hiệu của ADN, miền liên kết ADN phải có tưdng tác mạnh với xoắn kép thông qua sự hình thành các liên kết hydro, liên kết ion và liên kết ghét nước. Mặc dầu sự phối hợp riêng biệt và sự phân bố không gian của các mốì tương tác như vậy là độc nhất đối vối mỗi trình tự, sự phân tích nhiều protein liên kết ADN dẫn đến sự nhận biết sô’ lượng nhỏ các hình mẫu cấu trúc liên kết ADN được bảo toàn cao. Các mẫu hình đó được tóm tắt trong bảng 1.1. Hầu hết các tác nhân phiên mã được đặc trưng đến mức đó trong thực vật thuộc vể lớp zipper (dạng cấu trúc kiểu khoá kéo) cơ sở (bZIP) của các protein liên kết ADN. Các protein liên kết ADN chứa miền finger kẽm (zinc của các protein liên kết ADN) là tương đôi hiếm thấy trong thực vật. 27 Bảng 1.1. Các hình mẫu liên kết - ADN (Theo Lincoln et al., 2006) T ên C á c ví d ụ c ủ a các p ro te in C á c n é t c â u trú c c h ủ y ếu (ch ìa k h o á) M inh h o ạ Xoán - vòng - xoắn (H elix-turn-helix) Phím kẽm (Zinc finger) Xoắn - cuộn - xoắn (Helix-loop-helix) C á c tá c nhãn phiên m ã điều hoà các gen trong con đưửng sinh tổng hợp anthoxyanin. COP1 trong Arabidopsis. Protein liên kết - thành phần GT cùa các gen đirtpc phytocrom điều hòa. Hai xoắn a tách biệt nhau bời vòng xoắn trong chuỗi polypeptit, hoạt động như c á c nhị phân. C á c cấu trúc khác nh au trong đó kẽm có vai trò cấu trúc quan trọng; liên kết vào ADN hoặc là đơn phân hoặc là nhị phân. X oắn a n g ắ n d ư ợ c nối cuộ n v ào vòng x o ắn a dài hơn; h o ạt độ n g như là nhị phân. COOH M ojfo L M ị_L Z ipper leuxin (Z ipper leucine) F o s và Jun. Một xoắn a có khoảng 35 axit am in chứ a leuxin tại mỗi vị trí thứ bày; s ự nhị ph ân hoá diễn ra d ọ c th eo bề m ạt gh ét nưóc. ^ NH’' c o o - cõ o - COÒ- co o - Y Z ipper cơ sở (b a sic zipper, viết tắt bZip) 2 protein mờ đục trong ngô, các tác nhân hộp G cùa các gen đuỌc phylocrom điều hòa, các tác nhân phiên mã vốn đuọc gắn vào các thành to phan ứng ABA. S ự biến đổi củ a m ẫu hình zipper leuxin trong đó c á c axit am in g h ét nước khác thay th ế leuxin và m iền liên kết ADN chứ a c á c axit amin. / * NHS — C ác prot.fiin r ù n g m iôn (hom podom ain p ro tp in s) là lóp đ ặc hiộcủa các protein xoắn — vòng - xoắn (helix — turn - helix): Theo Lincoln et al., 2006, thuật ngữ "protein cùng miền" ("homeodomain proteins") xuất phát từ nhóm các gen Drosophila gọi là các gen chọn lọc (selector genes) hoặc các gen đồng dạng, có tài liệu còn gọi là gen ch u y ê n ho á cù n g nguồn (homeotic genes). Các gen đồng dạng Drosophila mã hoá các tác nhân phiên mã vổn quy định cấu trúc nào phát triển tại các vị trí đặc hiệu trên cơ thể con ruồi dấm; các cấu trúc đó hoạt động như thiết bị chuyển đổi (cầu dao đóng ngắt) được phát triển để hoạt hoá số lượng lỏn các gen vốn cấu thành toàn bộ chương trình gen đôi với cấu trúc riêng biệt. Các đột biến trong các các gen đồng dạng gây nên sự p h á t triể n đồng dạn g (homeosis), sự chuyển đổi của 28 một bộ phận cơ thể thành bộ phận cơ the khác. Ví dụ: sự đột biến đồng dạng (đồng nguồn) trong gen ANTEN - NAPEDIA gây ra hiện tượng chân được hình thành tại vị trí của râu (anten). Khi so sánh các trình tự của các gen đồng dạng khác nhau trong Drosophila đã phát hiện ra rằng, tất cả đều chứa đoạn gồm 60 axit amin được bảo toàn cao và được gọi là hộp dồng d ạ n g (homeobox). Các trình tự của hộp đồng dạng tương ứng hiện nay đã được nhận biết trong các gen quan trọng về mặt phát triển của động vật có xương sống và thực vật. Không phải tất cả các gen vốn mã hoá các protein miền dồng dạng trong thực vật là các gen đồng dạng và ngược lại. Như dã biết trong sinh học phát triển thực vật, bôn gen đồng dạng trong hoa của thực vật mã hoá các protein với mẫu hình xoắn — vòng — xoắn (helix — turn — helix) liên kết ADN được gọi là miền MADS (hầu hết các gen đồng dạng thực vật thuộc lớp các trình tự liên quan được biết như là các gen hộp MADS). 1.2.3.2. Truyền tín hiệu Các tế bào phản ứng đôl vói môi trường sống bằng cách tái tổ chức cấu trúc của chúng, điều hoà hoạt tính của các protein và biến đổi hình mẫu biếu hiện gen. Sự kích thích đối vối các phản ứng như vậy được gọi là tín hiệu (signal, hình 1.12) và các tín hiệu có thể là các phân tử bé, các đại phân tử, hoặc là các tác nhân vật lý, như ánh sáng. Cũng theo cách như đôi vói hiện tượng biểu hiện gen, trước tiên chúng ta xem xét quá trình truyền tín hiệu trong vi sinh vật và động vật để áp dụng vào thực vật. Màng sinh chất Tẻ bào chất Nhặn tin hiệu Truyền tin hiệu Phản ứng trà lời Hoạt hoá phán ứng của tế bào Các phin từ rơle (truyền) trong con đường truyèn tín hiệu Hình 1.12. Tổng quan về tin hiệu tế bào T ừ phối c ả n h củ a tế b ào đ a n g n h ận tin hiệu, tín hiệu tế b ào có th ể đư ợ c p h ân ch ia th àn h ba giai đ o ạn : 1) N hận tín hiệu; 2) T ruyền tin hiệu và 3) P h ản Lfrig trà lời c ủ a tế b ào . Khi d iễn ra s ự n h ậ n tín hiệu tại m àng sinh ch ất, như được chỉ ra trên hình, giai đ o ạ n truyền tín hiệu thường là con đư ờ ng gốm m ột s ố bước, với mỗi phân tử trong co n dường g ãy n ên s ự biến dổi trong ph ân tử tiếp th eo . P h á n tử cuối cùng trong con đường kích h o ạt c á c p h ản ứng c ủ a tế b ào (T heo C am pbell và R e e c e , 2004). 29 a) Truyên tín hiêu trong p ro ka ryo ta Các tế bào prokaryota không thể tồn tại qua hàng tỷ năm tiến hoá mà không phát triển tuyệt vời khả năng cảm ứng môi trường sông của chúng. Như đã trình bày ở trên, vi khuẩn phản ứng đôi với sự hiện hữu của chất dinh dưỡng bằng cách tổng hợp các protein phục vụ cho việc hấp thụ và trao đôi chất dinh dưỡng đó. Vi khuẩn cũng có thế phản ứng dôi với các tín hiệu không dinh dưỡng, cả vật lý và hoá học. Các vi khuẩn di động có thê điều chỉnh sự vận động của chúng phù hợp với gradient đang tồn tại của ánh sáng, oxy, thẩm thấu, nhiệt độ và các hoá chất độc trong môi trường. Các cơ chế cơ sở cho phép vi khuẩn cảm nhận và phản ứng đối với môi trường của chúng là chung cho tất cả các hệ thông cảm thụ của tế bào. bao gồm kích thích thăm dò, khuếch đại tín hiệu và phản ứng trả lòi thích hợp. Nhiều con đường truyền tín hiệu vi khuẩn đã có sự tồn tại của các đơn vị điều biến được gọi là miên truyền (transmiter) và miền nhận (receiver). Những thế điều biến ấy tạo nên cơ sỏ của cái gọi là các hệ th ố n g diều biến hai th à n h phần. - Vi khuẩn sử dụng các hệ thống điều biến hai thành phần đê cảmnhận các tín hiệu ngoại bào: Vi khuẩn cảm nhận các hoá chất trong môi trường nhờ họ bé các châ't nhận bề mặt của tế bào, mỗi chất nhận liên quan vói phản ứng đối với một nhóm hoá chất xác định (sau đây được coi như là các phối tử). Protein trong màng sinh chất vi khuẩn gắn trực tiếp vào phối tử hoặc liên kết vào protein hoà tan vốn đã gắn với phổi tử, trong sinh chất vùng biên giữa màng sinh chất và vách tế bào. Trưốc khi liên kết, protein màng chịu sự biên đổi cấu hình đã được truyền qua màng vào miền xytosol (tế bào chất) có protein chất nhận. Sự biến đổi cấu hình như vậy lỉhííi đ ầ u con đư ờ ng tru y ồ n tín h iệ u d ẫ n đôn p h ả n ứ n g tr ả lời. Sự phản ứng nhiều mặt của vi khuẩn bao gồm điều hoà thẩm thấu, tính hướng hoá và sự hình thành bào tử là được điều biến bởi hệ thống hai thành phần. Theo Parkinson (1993), các hệ thông hai thành phần gồm protein cảm biến và protein điều hoà phản ứng (hình 1.13). Chức năng của protein cảm biến (sensor) là nhận tín hiệu và chuyển tín hiệu đến miền điều hoà phản ứng gây nên phản ứng trả lời của tế bào (biêu hiện gen miền truyền), nơi truyền tín hiệu đến miền điều hoà phản ứng trả lời của tế bào gồm miền nhận, nơi nhận tín hiệu từ miền truyền của protein cảm biên và miền ra, chẳng hạn như miền liên kết ADN, nơi gây ra phản ứng trả lời. 30 ------- Protein cám biến Tin hiệu váo m i l Miến vàoj— Miền truyền ------- Protein điều hoà phàn ứng------- í (p ) Tín hiệu ra — Miền ra ^ II III t Hinh 1.13. Các hệ thống hai thành phán của con đường truyền tín hiệu vi khuẩn Protein cảm biến ph át hiện kích thích tại miền vào và truyền tín hiệu đ ế n m iền truyền bằng c á c h biến đổi cấu hinh (các mũi tên ngắt quăng đậm n ét đ ầu tiên). S a u dó m iền truyền của c ả m biến liên hệ với ch ất diều khiển phản ứng trả lời bằn g c á c h phosphorin h o á protein của m iên nhận , s ự phosphorin hoá miền nhận cảm ứng n ên s ự biến đổi c ấ u hình (các mũi tên n g ắt q u ãn g đậm nét thứ hai) vốn hoạt hoá miền ra và g ây n ên ph ản ứng trả lời củ a tế b ào (T heo Parkinson, 1993). Tín hiệu được gửi từ miền truyền đến miền nhận bằng con đường phosphorin hoá protein. Các miền truyền có khả năng tự phosphorin hoá, sử dụng ATP, trên gốc histidin đặc hiệu cạnh bên axit amin đầu cuô'i (hình 1.14A). Đối vối nguyên nhân đó, các protein cảm biến chứa các miền truyền được gọi là các kinase histidin tự phosphorin hoá. Các protein ấy thường hoạt động như là nhị phân, trong đó vị trí xúc tác của một đơn phân phosphorin hoá vị trí chất nhận trên đơn phân khác. Ngay tức khắc, sau khi miền truyền trở nên được tự phosphorin hoá trên gốc histidin, gốc phosphat được truyền đến gốc aspartat đặc hiệu cạnh điểm giữa của miền nhận trong protein điều hoà phản ứng (hình 1.14A). Kết quả là gốc aspartat đặc hiệu của protein điều hoà phản ứng trá lòi lại được phosphorin hoá (hình 1.14B). Sự phosphorin hoá gốc aspartat làm cho protein điều hoà phản ứng chịu sự biến đổi cấu hình dẫn đến kết quả là nó (protein điều hoà phản ứng) được hoạt hoá. b â y giờ ch ứ n g ta xem vi k h u ẩ n p h á t h iệ n tá c n h â n c ủ a m ôi trư ờ n g (ví dụ: áp suất thẩm thấu trong môi trường sống của chúng) bằng cách nào? - Vi khuẩn phát hiện độ thẩm thấu bằng hệ thống hai thành phần: Ví dụ về hệ thống hai thành phần tương đôi đơn giản là hệ thông tín hiệu liên quan vối sự cảm nhận độ thẩm thấu trong E. coli. E. coli là vi khuẩn Gram âm và thực sự có hai màng tế bào, một màng trong và một màng ngoài, tách biệt nhau bởi vách tế bào. Màng trong là màng cản thấm sơ cấp của tế bào. Màng ngoài chứa các lỗ lồn bao gồm hai kiểu các protein lỗ (porin proteins), OmpF và OmpC, các lỗ được cấu thành bởi OmpF lán hơn so với các lỗ được cấu thành từ OmpC. 31 A Miền truyền (T): M H Miền nhặr Các vị tri phosphorín hoá D D D Phosphorin hoá < * > Hình 1.14. Cơ c h ế tin hiệu phosphorin hoá của các hệ thống hai th àn h phẩn vi khuâ’n A) Miền truyền c ủ a protein cảm biến chứa histidin đưọc b ảo toàn (H) tại N - đ ầ u cuối củ a nó, trong khi m iền nh ận cù a ch ất điều h o à ph àn ứng trả lởi chứa g ố c a s p a rta t b ảo toàn D; B) Mién truyền tự phosphorin h o á tại gốc histidin b ảo to àn củ a nó và truyền g ố c p h o sp h a t đ ến a s p a rta t củ a ch ất điều khiển ph àn ứng trà lời. S a u đó ch ất điều h o à p h àn ứng trả lời chịu s ự biến đổi c ấ u hình d ẵn đ ến trà lời (T heo Parkinson, 1993). Khi E. coli tiếp xúc với độ thẩm thấu cao trong môi trường, nó tổng hợp nhiều OmpC hơn OmpF, kết quả là tạo nên các lỗ bé hơn trên màng ngoài. Các lỗ bé đó lọc bỏ các chất tan ra khỏi tê bào chất miên bièn, bảo vệ màng trong tránh khỏi tác động của nồng độ chất tan cao trong môi trường bên ngoài. Khi vi khuẩn ơ trong môi trường với độ thẩm thấu thẫp, nhiều OmpF được tông hợp và kích thước trung bình của các lỗ dược tăng lôn. Sự biêu hiện các gcn, như được chỉ ra trên hình 1.15 cho thấy rằng, các gen mã hoá hai protein lỗ được hệ thông hai thành phần điều biến. Protein cảm biến, EnvZ, định cư trên màng trong. Nó gồm miền vào của sinh chất vùng biên đầu cuổì -N vốn phát hiện những biến đổi thẩm Ihấu trong môi trường nằm giữa hai đoạn mạch protein xuyên qua màng và miền truyền qua tế bào chất có đầu cuối —c. Khi độ thẩm thấu của môi trường gia tăng, miền vào chịu sự biến đôi cấu hình vốn được truyền qua màng đến miên truyền. Sau đó, miền truyền tự phosphorin hoá gổc histidin của nó. Gôc phosphat được truyền nhanh chóng đến gốc aspartat của miền nhận của chất điều hoà phản ứng, OmpR. N - đầu cuối của OmpR gồm miền liên kết ADN. Khi được hoạt hoá bởi phosphorin hoá, miền đó tương tác với ARN - polymerase tại trình tự khởi động của các protein lỗ (porin proteins) 32 làm gia tăng sự biểu hiện của OmpC và ức chế sự biếu hiện của OmpF. Trong điều kiện độ thẩm thấu tronịỊ môi trường thấp, dạng không được hoạt hoá của OmpR kích thích sự biểu hiện của OmpF và ức chê s ự biêu hiện của OmpC. Trong con đường ấy, độ thẩm thấu kích thích được truyền tới các gen. Đõ thấm thấu cúa môi trườ ng K hông gian ngoại biên M áng sinh ch ất E nvZ »Miền liên kết ADN Kiểm tra biéu hiện protein lỗ Hình 1.15. Hệ th ốn g điếu hòa thẩm thấu hai thành phẩn của E .c o li Khi độ th ẩm th ấu c ủ a mỏi trường cao, protein cảm biến m àng, EnvZ (ở d ạn g nhị phân), hoạt động n h ư là m ột enzym k in ase histidin tự phosphorin hoá. S a u đó EnvZ d ã được phosphorin h o á p hosphorin h o á ch ất điều hòa phản ứng trả lời, Om pR, ch ất này đ ã có m iền liên kết ADN O m pR đ ã đư ợ c p hosphorin hoá gắn kết vào c á c gen khởi đ ầ u c ủ a hai g en lỗ, Om pC và OmpF, gia tăn g s ự biểu hiện gen của Om pC và ức ch ế s ự biểu hiện g en c ủ a OmpF. Khi độ th ẩm th ấu c ủ a môi trường thấp, EnvZ hoạt động như là m ột protein p h o sp h a ta se thay cho k in ase v à d ep h o sp h o rin h o á O m pR . Khi dạng không được phosphorin h o á củ a O m pR liên kết v ào c á c g en khởi đ ầ u c ủ a hai gen sự biểu hiện củ a OmpC bị ức c h ế và s ự biểu hiện củ a O m pF dược kích thích (T heo Parkinson, 1993). Hệ thông hai thành phần như vậy cũng đã được phát hiện trong các cơ Lhể có nhân (eukaryota). 3-GT. .THỰC VẬT-A 33 - Mô hình của con đường truyền tín hiệu: Mặc dầu tồn tại sự khác biệt nhất định trong con đường truyền tín hiệu giữa prokaryota và eukaryota, tồn tại những bưóc cơ sỏ chung trong tết cả các cơ thể sống. Trước tiên, chúng ta tìm hiểu các cơ sở chung trong mô hình của con đưòng truyền tín hiệu đã được xác lập ở vi khuẩn E. coli (hình 1.16). Môitruờng Chát tan' (tin hiệu) Các chất tan thắm vào không gian giữa hai màng qua các 16 lớn trong mâng ngoài cũa £ coli. Protein máng EnvZ bién đổi hình dạng trong phản úng dổi vút nâng dò ctiắt tan cao, đang xúc tâc sự bổ sung phosphat lừ ATP. Phosphal tứ EnvZ duọc truyén dén .protein OfflpR. ....vi OmpR đâ dưoc phosphorrin hoá bién dổi cáu hlnh làm cho nó liên kết dược vào ADN vả klch thich sự phièn mâ cùa qen OmpC, Protein , được găn vảo máng ngoài, ngảọ cáp châ} lan xâm nhập váo vá giữ áp suất thầm cântrong mỏi tfuong bên ngoái được . Không gian giữa màng Màng ngoài cùa vi khuẩn Vách té bào Hình 1.16. Mô hlnh của con đưdng truyến tin hiệu E. coli phản ứng đối với sự gia tăng nổng độ chất tan trong môi trưởng sống của nó. Các bước cơ bản của con đường này diễn ra trong mọi cơ thể sống. 3 4 3-0T...TKỰCVẶT-B b) Hê th ô n g h a i th à n h p h ầ n liên q u a n đã đươc p h á t h iên trong eu ka ryo ta Cách nay không lâu, các protein điều hoà phản ứng cảm nhận phối hợp liên quan đến hệ thông hai thành phần đã được phát hiện trong nấm men và trong thực vật. Ví dụ: gen SLN1 của nấm men Saccharmyces cerevisae mã hoá protein 134 kDa vốn có trình tự tương đồng đối với cả miền truyền và miền nhận của vi khuẩn và thể hiện chức năng điều hoà thẩm thấu (Ota và Varshavsky, 1993). Đã có minh chứng rằng, một sô’ hệ thông truyền tín hiệu thực vật có quan hệ với hệ thống hai thành phần vi khuẩn. Chẳng hạn, sắc tố hấp thụ ánh sáng đỏ/đỏ — xa, phytocrom, hiện nay đã được minh chứng trong khuan lam (Cyanobacteria) và nó xuất hiện phải có quan hệ đến protein cảm nhận vi khuẩn. Thêm vào đó, các gen vốn mã hoá các chất nhận giả định đối với hai hormon thực vật: xytokinin và etylen, cả hai chứa các miền kinase histidin tự phosphorin hoá (xem thêm chương 4 và 5), cũng như các hoạ tiết điều hoà phản ứng kê cận. c) Truyền tín h iệu trong eukaryota Nhiều các loài vi sinh vật có nhân (Eukaryota) sử dụng các tín hiệu hoá học trong sự truyền tin giữa các tế bào. Chẳng hạn, trong loài mốc nhầy (Dístyostelium), khi bị đói, một sô* tế bào bài tiết ra AMP mạch vòng (cAMP). cAMP được tiết ra khuếch tán qua cơ chất và cảm ứng các tế bào bên cạnh liên kết lại thành cụm nấm giông ốc sên. Các tác nhân kiểu giao phôi của nấm men là một ví dụ khác của sự truyền tin hoá học giữa các tế bào của các vi sinh vật đã có bước tiến lón về độ phức tạp khi các tế bào eukaryota bắt đầu liên kết lại với nhau như là các cơ thể đa bào. Tiếp sau sự tiến hoá của tính đa bào, xuất hiện xu th ế luôn luôn tăng sự chuyên hoá, cũng như phát triển các mô và cơ quan để tạo thành các chức năng chuyên biệt. Trong các cơ thể đa bào, sự phối hợp của các phản ứng phát triển và môi trường đòi hỏi phải xuất hiện các cơ chế truyền tín hiệu. Trong cơ thể động vật, hình thành và phát triển hai cơ chế chủ yếu liên quan, đó là thần kinh (hình 1.17) và nội tiết (hình 1.18). Thực vật không có hệ thần kinh, nhưng chúng phát triển hệ các hormon như là các tín hiệu hoá học. Vì là các cơ thể quang hợp, thực vật cũng phát triển cơ chế thích nghi sự sinh trưỏng và phát triển của nó đôi với sô" lượng và phẩm chất ánh sáng. 35 Trong các chương từ chương 2 đến chương 7, chúng ta sẽ làm rõ các cơ chế truyền tín hiệu trong thực vật. Mặc dầu con đường truyền tín hiệu trong thực vật khác biệt với động vật nhưng các cơ chế cơ sở của con đường truyền tín hiệu trong c ơ thể động vật và thực vật có những nét tương đồng. Do vậy, để nghiên cứu quá trình truyền tín hiệu trong thực vật được thuận lợi, chúng ta xem xét khái quát một vài ví dụ về con đường truyền tín hiệu trong cơ thê động vật. Sự truyền tín hiệu qua hệ thần kinh ở động vật ở mức độ khái quát vâi ví dụ truyền tín hiệu khứu giác từ môi trường bên ngoài vào bộ não người được minh hoạ như trên hình 1.17. Tin hiệu đến não Tế bào thằn kinh V I Các phân tử bỗc mùi Bên ngoài tê bào(1) Liên kết phân tứ bốc mùi vào chắt nhặn hoat hoá G protein (2) G protein hoạt hoá sự tàng hợp cAMP bời adenyl xydase (3) cAMP hoạt hoá mở các kênh lon G protein Bên tro n g tê bào Na' . Ca1' ■J Kênh còng cAMP cAMP (4) Biến đổi nống dộ ion bên trong té bâo oùri tin hiêu dén mién dặc hiệu của nao, noi tin hiệu được nhặn như mùi thom Tin hlíu vâo nảo Hình 1.17. Con đường truyển tín hiệu dẫn đến sự mở các kênh ion T rong con đường truyền tín hiệu đối với s ự cảm nhặn khứu giác, hiệu ứng cuối cù n g là m ở c á c kênh Na*. Kết q u ả là dòng Na* đi vào kích thích s ự truyền tin hiệu mùi đ ế n m iển ch u y ên biệt c ủ a não. Trẽn cơ sở của cơ chế biểu hiện gen và truyền tín hiệu đã được xem xét, chúng ta nghiên cứu tác động của các phytohormon như là các chất điểu biến (effectors), đóng vai trò như là hệ điều hoà giữa các tế bào, các mô và các cơ quan đôi với các chức năng sinh lý và phát triển của cơ thể thực vật trong các chương tiếp theo. 36 (A) Các tin hiệu cục bộ Các tin hiệu tự tiét lièn kél Các ín hiệụ cận tiél liên két vâo câc chắt nhặn ờ trên vào càc chất nhận ò trên các té bào tiét ra chủng tẽ báo lân cặn Các tê’ bào khống có cấc chất nhặn khang phản ứng dôi vđi tín hiêu riêng biệt (B) Các tin hiệu từ xa Câc tín hiệu tuắn hoần được vặn chuyển theo hê thống tuán hoàn vâ liên két vào các chất nhận ở trên các té bâo cách xa Hình 1.18. Minh hoạ các con dưàng truyền tín hiệu cụ c bộ và tín hiệu từ xa trong cơ thê dộng vật C á c h ệ thống tín hiệu hoá học: P h ân tử tin hiệu có thể tá c độ n g lên tế b à o vốn s ả n sinh ra nò, h o ậ c c a c tê b ào lân cận (A). N hiều tín hiệu tác dộng lên c á c tế b à o ở c á c h xa, nơi phân tử tin hiệu đư ợ c vận chuyển d ến th eo h ệ thống tu ần hoàn c ủ a cơ th ể (B). Vối sự xuất hiện cơ thể đa bào, hình thành, phát triển và hoàn thiện các hệ thống điêu hoà giữa các tê bào, các mô và các cơ quan trong cơ thể. Hệ thông điều hoà như vậy ít ra bao gồm hệ điêu hoà dinh dưỡng, hormon (chính là nội dung của giáo trình này) và điện sinh lý. Những tương tác như vậy giữa các tế bào xuất hiện tức khắc trong nuôi cấy cách ly các bộ phận hoặc cơ quan thực vật. Trong mọi trường hợp, để duy trì sự sông của các bộ phận cách ly cần phải bô sung vào môi trường nuôi cấy các tác nhân dinh dưỡng và hormon vói liều lượng giông như được các cơ quan khác trong cơ thể cung cấp như khi cây nguyên vẹn. d) T in hiệu th ứ hai - Quan niệm vê tín hiệu thứ hai: I là n g lo ạ t tín h iệ u đ ạ t đôn bề m ặ t tc bào đòi h ỏ i p h a i có oố lư ợ n g các chất nhận tương ứng. Nhiều tín hiệu làm cho tê bào hoặc phân chia, hoặc rời khỏi chu trình tế bào, những tín hiệu khác cảm ứng sự biểu hiện các nhóm gen đặc hiệu liên quan với khả năng bảo vệ tế bào khỏi điều kiện bất lợi của môi trường. Nhưng vùng phân bô' của các phản ứng trả lời thì ít hơn nhiều. Vì vậy, các con đường truyền tín hiệu sớm hội tụ vào một sô' các mạng tín hiệu nội bào thành các tín hiệu hoá sinh giản đơn trong tế bào chất. Những phân tử liên quan đến quá trình đó được gọi là tín hiệu thứ hai (hình 1.19A). — Một sô đại diện tín hiệu thứ hai: + Hiện nay đã biết 7 tín hiệu thứ hai: 37 1) 3',5-AM P vòng (3’,5'-cAMP); 2) 3',5'-GMP vòng (3',5'-cGMP); 3) Ribose-ADP vòng; 4) Tín hiệu thứ hai thuộc hợp chất lipit, đó là 1,2-diaxylglyxerol (DAG; 5) Inositol (1,4,5-triphosphat, viết tắt là IP3); 6) Nitơ oxit (NO); 7) lon canxi (Ca2+)- + Dưới đây (hình 1.19A) là công thức cấu tạo của các tín hiệu thứ hai đó: A) ~0—p 3’,5'-AMP vòng 3',5'-GMP vòng Ribose-ADP vòng (cADPR) C H ,— (c Hy)(,— c — o — CHị ° I C H 3— |C H 2)„— c — o — CH °CHjOH Các nhóm axit béo Glyxerol 1. 2 - Diaxylglyxerol (DAG) B) Vách tê bào Tê bào chất 2. Truyền Ọ P O Ỉ' _l6 I / vO H h o / _ _ , V - ¥ 0P0? (IP3) 3. Phản ứng N = o Nito oxit © lon canxi Protein truyền và các tin hiệu thứ hai Màng sinh chắt Hoại hoá phan ứng của lể bào Hình 1.19. C ác tín hiệu thứ hai và sự tham gia của ch ún g và o các con dường truyến tín hiệu A) Cấu tạo của 7 tin hiệu thứ hai; B) Mò hinh khái quát dối với các con đuởng truyền tín hiệu có sự tham gia của các tin hiệu thứ hai (Theo Campbell et al., 2009). 38 Tiếp theo, chúng ta sẽ xem xét các hệ thống điêu hoà trong các cơ thể đa bào. 1.3. CÁC HỆ THỐNG ĐIỂU HOÀ GIỮA CÁC TẾ BÀO, MÔ VÀ cơ QUAN Trong cơ thề đa bào tồn tại các hệ điêu hoà sự tương tác giữa các tế bào trong cùng một mô và giữa các mô trong một cơ quan, cũng như giữa các cơ quan trong cơ thể nguyên vẹn. Điều đó đảm bảo cho các quá trình sông diễn ra một cách nhịp nhàng, hài hoà thông qua các hệ điều hoà dinh dưỡng, điện sinh lý, nhịp nội tại (đồng hồ sinh học) và hormon. Trong mục này chúng ta tìm hiểu khái quát về ba hệ thông điều hoà trưổc khi đi sâu nghiên cứu về vai trò của hormon trong cơ thể thực vật vốn là nhiệm vụ chủ yếu của giáo trình này. 1.3.1. Điều hoà dinh dưỡng Đó là inô"i tương tác thông qua các chất dinh dưỡng, một phương thức giản đơn nhát của mối liên hệ giữa các tế bào, mô và cơ quan, ở thực vật, rễ và các cơ quan dị dưỡng khác phụ thuộc vào sự cung cấp các chất đồng hoá được hình thành trong lá trong quá trình quang hợp. Đến lượt mình, các cơ quan trên mặt đất lại cần các chất dinh dưỡng và nưốc được rễ hấp thụ từ đất. Rễ sử dụng các chất đồng hoá đến từ cành cho nhu cầu riêng của bản thân, còn một phần các chất hữu cơ đã được chuyến hoá tại rễ sẽ di chuyển theo hưâng ngược lại. Trong điều kiện vô trùng của thực nghiệm, để phát triển bình thường, ngoài các chất dinh dưỡng khoáng và đưòng còn cần một sô' vitamin như Bj, B6 và axit nicotinic. Rõ ràng rằng, vitamin xâm nhập vào rễ từ hệ cành. Sự biến động về hàm lượng các nguyên tô' dinh dưỡng khác nhau gây ảnh hưởng đến trao đổi chất, đến các chức năng sinh lý và quá trình p h á t e in h h ìn h th á i c u a cơ th ể th ự c v ậ t. C h ú n g t a c ũ n g đ ã b iố t rõ n h ữ n g biến đối đặc trưng do thiếu hoặc thừa các nguyên tô" dinh dưỡng nào đó trong cơ thể thực vật. Khi cây bị đói, xuất hiện sự cạnh tranh của các miền khác nhau đối vối sản phẩm dinh dưỡng. Điều đó ảnh hưỏng đến quá trình phát sinh hình thái. Trong các điều kiện không thuận lợi về mặt dinh dưỡng, thực vật bậc thấp chuyển sang phát triển sinh sản. Thực vật ngày dài sinh trưởng trong điều kiện ngày dài gia tăng ra hoa khi hàm lượng các hợp chất hydrat cacbon cao và hàm lượng các hợp chất nitơ tương đối thấp; còn sự ra hoa của thực vật ngày ngắn sống ở điều kiện ngày ngắn được tăng tốc khi hàm lượng hydrat cacbon thấp và hàm lượng các hợp chất nitơ cao. 39 Tuy nhiên, sự điều hoà dinh dưõng mang đặc trưng định lượng nhiều hơn định tính. Thường khi điều kiện dinh dưỡng hạn chế, sự phát triển của cây được tiếp tục phù hợp với quy luật nội tại, ở chúng hình thành nên những cơ quan với kích thước bé nhỏ và giảm sô’ lượng lá, quả và hạt. Điều lý thú là kích thước cuối cùng của hạt đã hình thành, thậm chí chỉ có một hạt, ít khác biệt với mức bình thường. Tất cả điều đó chứng tỏ rằng, song song với mối tương tác về mặt dinh dưỡng, trong cơ thể thực vật tồn tại các hệ điều hoà hoàn chỉnh hoạt động, đảm bảo được mối liên hệ của tất cả các phần của cơ thể. 1.3.2. Điểu hoà điện sinh lý Cơ thể thực vật khác biệt với cơ thể động vật là không có hệ thần kinh. Tuy vậy, mối tương tác điện sinh lý giữa các tế bào, các mô và các cơ quan đóng vai trò quan trọng trong sự phối hợp hoạt tính chức năng và phát sinh hình thái. Giữa các bộ phận khác nhau của cơ thể thực vật tồn tại một hiệu điện thế (điện trường và dòng điện) tĩnh, hay đúng hơn là điện thế biến động chậm. Chúng ta cũng đã quan sát được th ế điện tác động cục bộ và lan truyền. Những dạng hoạt tính điện như vậy tạo nên hệ thống điều hoà điện sinh lý. 1.3.2.1. Trường điện trường và dòng diện trong cơ thể thụt: vật Những chuyển dịch các dòng ion trong tế bào của mô và cơ quan khác nhau do các nhân tố ngoại cảnh hoặc nội tại gây nôn và dẫn tới sự biến đổi trị số điện thế màng trong các tế bào và làm xuất hiện, hoặc biến đổi diện thê giữa các miền ấy và tại các miên khác của cơ thê thực vật. Ví dụ: đỉnh sinh trưởng của tảo Chara, nón nấm và chồi đỉnh đang phát triển của thực vật bậc cao thường là tích điện dương so với các phần nằm gần gốc hơn. Phần lõi của thân tích điện dương so với mặt ngoài, đỉnh bao lá m ầm tích điện âm ao vối gốc của nó (Polcvôi, 1989). T ại rỗ cây m ạ, d ẩ u rỗ (ktíoảng từ 0 đến l,5mm) và lông hút tích điện dương. Trong sô'lớn trường hợp, phần trên mặt dất tích điện dương so với rễ. Giữa các miền ấy của cây xuất hiện một dòng diện khoảng 0,1- 0,4|xA. Mọi biểu hiện hoạt động sông của tê bào và mô thường kèm theo sự biến đổi điện thế. Ví dụ: chiếu sáng các lá đã được che bóng trước đó làm xuất, hiện phản ứng điện sinh lý đặc trưng, xử lý mô bằng auxin gây nên sự tích điện dương tạm thời tại miền cây được xử lý (đường dẫn ngoại bào). Hiện tượng tích điện dương ở thực vật thường liên quan vói sự hoạt hoá bơm hydro (H+ — ATPase) và là đặc trưng đôi với các mô có hoạt tính trao đổi chất cao. 40 Đã có minh chứng rằng, các điện trường tĩnh và dòng điện trường có thê tham gia vào sự điểu hoà các mốì tương tác trong cơ thê thực vật. Cho dòng điện với cường độ 2 - 6|J.A truyền qua đoạn bao lá mầm cây ngô (diện cực dương ở đầu điinh) làm gia tăng tốc độ sinh trưởng dãn dài. Cho dòng điện (5 - 25ịìA) đi qua miền đỉnh bao lá mầm trong thời gian 2 phút cảm ứng tạo nên sự uôYi cong. Dí một hiệu điện thế 25(xA xác định vị trí hình thành dạng rễ (từ phía điện cực dương) ở tế bào trứng của loài tảo biển Fucus và xác định sự định hướng của trục đôi xứng của thân tương lai của cây. Các nhà nghiên cứu điện sinh học cho rằng, dưối tác động của trường điện trường, trong tê bào xảy ra sự chuyên dịch bên của phức hệ lipoprotein tích điện thực hiện các chức năng chuyên hoá khác nhau. Như vậy, vì mọi sự biến đổi của điện trường trong mô có thể phân bô’ lại các thành phần protein di động trong màng, do đó xuất hiện một trạng thái sinh lý mới của tê bào. 1.3.2.2. Thê hoạt dộng (TĐ) Ớ các tế bào được kích thích có hiện tượng giảm TĐ (có tài liệu gọi thế tác dụng, thê tác động) đến một mức tới hạn, sau đó TĐ trở về trị sô’ gần với giá trị xuất phát. TĐ có khả năng lan truyền (hình 1.20). Lần dầu tiên hiện tượng này đã được Ostergaut mô tả trong những năm 30 của th ế kỷ XX. Ostergaut sử dụng các tế bào khổng lồ của loài tảo Chara. Sau đó TĐ đã được nghiên cứu ở các loài thực vật "vận động" như cây trinh nữ (Mimosa pudica), cây bắt ruồi hay còn gọi là cây gọng vó (Drozera rotundifolya),... Trong các thập niên gần đây đã xác lập được rằng, tấ t cả các loài thực vật, trong những điều kiện xác định có khả năng tái tạo TĐ. TĐ lan truyền ở tế bào thực vật và động vật có nhiều điếm chung, tuy nhiên ở thực vật chúng lan truyên chậm. Tốc độ lan truyền của TĐ ở cây trinh nữ bằng 4cm/giây, ở cây gọng vó là 25cm/giây, còn ở phần lớn các loài cây là khoảng 0,08 - 0,5cm/giây. TĐ lan truyền thoo màng sinh chất và cầu sinh chất nôi các tê bào nhu mô của mạch rây và tiền mạch gỗ trong các bó mạch dẫn. Cơ chế ion cụ thể làm xuất hiện TĐ trong các tế bào thực vật còn chưa được sáng tỏ hoàn toàn. Các nhà nghiên cứu cho rằng, pha phân cực liên quan với sự xâm nhập vào tê bào của các ion Ca2+ và sự thải C1 (ở tảo). Hiện tượng tái phân cực (hình 1.20) là do sự thoát ra khỏi tế bào của ion K*. Sau đó các bơm H+ (H+- ATPase) và bđm K+ (K+- ATPase) phục 41 hồi lại sự cân bằng ion đã bị phá hoại. Các dịch chuyển ion và điện th ế là cơ sở của TĐ, là cơ chế vạn năng mà thông qua đó TĐ gây ảnh hưỏng đến các quá trình sinh lý trong tế bào. 0 các loài thực vật có khả năng vận dộng nhanh, vai trò tín hiệu của TĐ là hết sức rõ ràng. Nhưng ở các loài cây khác, TĐ cũng thể hiện chức năng thông tin. Ví dụ: sự nảy mầm của hạt phấn trên núm nhuỵ của cây ngô kèm theo sự tái sinh các xung lan truyền theo nhuỵ dạng sợi cho đến bầu nhuỵ. Sự biến đổi lớn các điểu kiện tồn tại trong miền rễ, gây ra các xung đơn lẻ. Xung đơn lẻ này khi đạt đến lá, gia tăng sự trao đổi khí và cũng như tăng tốc độ vận chuyển của các chất đồng hoá theo mô mạch rây. Khi kích thích đỉnh cành bằng cách biến đổi nhiệt độ hay cường độ chiếu sáng, các xung đơn lẻ gia tăng tốc độ hút các chất dinh dưỡng khoáng ở rễ. Tất cả những dẫn liệu đó chỉ ra sự tồn tại ở thực vật mổi liên hệ điện nhanh chóng. Tuy nhiên, lượng thông tin được lan truyền theo phương thức đó là không nhiều. Tất cả các hệ thông điều hoà giữa các tế bào: dinh dưỡng, hormon, điện sinh lý tương tác lẫn nhau một cách chặt chẽ. Ví dụ: auxin gây ra các chuyến dịch điện thế, vốn ảnh hưởng đến sự vận chuyển vật chất qua màng. Một trong các hệ thôYig ấy tác động lên tế bào thông qua hệ điều hoà nội bào, có nghĩa là bằng cách biến đổi hoạt tính chức năng của các enzym và của màng, gây ảnh hưởng đến cường độ và hướng của sự tổng hợp các axit nucleic và protein. Bằng cách đó tạo nên hệ thông điều hoà thứ bậc vốn xác định mối tương tác của tất cả các phần của cây. Điều này lại chịu ảnh hưởng chi phối của nhịp nội tại (đồng hồ sinh học) vốn tồn tại trong các tế bào của cơ thể. Hình 1.20. Thê' ho ạt dộng (TĐ) trong thực vật A) TĐ và dòng ion trên màng tế bào tảo nitella (Chara) (Từ Polevỏi, 1989). B) TĐ trong thể gối cây trinh nữ (Mimosa pudica) (Theo Buchanan et al., 2002). 42 1.3.3. Nhịp nội tại (đồng hố sinh học) 1.3.3.1. Khái niệm về nhịp nội tại (dồng hố sinh học) Các quá trình trao đổi chất khác nhau trong cơ thể thực vật diễn ra theo chu trình xen kẽ qua các pha hoạt tính cao và hoạt tính thấp với c:hu kỳ đều dặn khoảng 24 giờ. Các biến đối nhịp nhàng như vậy được coi như là nhịp ngày đêm (carcađian rhythms, từ tiếng Latin circadiem có nghĩa là "khoảng một ngày đêm"). Chu kỳ của nhịp là thời gian trôi qua giữa các đỉnh kế tiếp, hoặc là các miền trũng trong chu trình và vì nhịp dược duy trì cả khi không có các tác nhân ngoại cảnh, nó được coi là n h ịp nội tại Bản chất nội sinh của các nhịp ngày đêm giả định rằng chúng được diều khiển bđi cái gọi là sinh nhịp nội tại (internal pacemker) có tên là dao dộng lử (cấu tử dao động, oscillator). Dao động tử nội sinh được gắn kết với sự biên động cúa các quá trình sinh lý. Đặc điếm quan trọng của dao dộng tử (nhịp ngày đêm) là nó không chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, nhịp ngày dêm dảm bảo cho đồng hồ hoạt động bình thường trong điều kiện rất đa dạng của nhũng biến động khí hậu và mùa. Ánh sáng là một tác nhân điều biến mạnh của các nhịp nội tại trong cả thực vật và động vật. Mặc dầu các nhịp ngày đêm vốn được duy trì trong các điều kiện được kiếm tra trong phòng thí nghiệm thường có chu kỷ dài hơn hoặc ngắn hơn một vài giò so với 24 giờ. Trong tự nhiên, các chu kỳ của chúng đều hướng tới 24 giò vì tồn tại các hiệu ứng đồng điệu hoá của ánh sáng tại thời điếm chuyến ngày sang đêm, được cho như là sự khởi động. Trong thực vật, hiệu ứng ánh sáng đỏ (red light) là quang thuận nghịch bởi ánh sáng đỏ — xa (far - red light), điều đó chỉ báo vê' sự liên Cịuun củ a să c tô phytocrom ; h iệ u ứ n g á n h sá n g x a n h (b lu e lig h t) q u a trung gian hấp thụ là các quang thụ thể (photoreceptors). Vậy, phytocrom là gì? Đó là một sắc tô" hiện hữu trong tất cả các nhóm thực vật và trong một ít chủng tảo lục (green algae), nhưng không có trong các sinh vật nguyên sinh (protist) khác, bacteria hoặc nấm. Các hộ thông phytocrom chắc là liên quan giữa các tảo lục và đã có mặt trong tố tiên chung của thực vật (Raven et al., 2010). Phytoerom là phân tử tồn tại trong hai dạng: dạng thứ nhất, Pr, hấp thụ ánh sáng đỏ tại bước sóng 660nm; dạng thứ hai, Pfr, hấp thụ ánh sáng dỏ xa tại 730nm, hai dạng đó chuyến hoá lẫn nhau dưối tác động của ánh sáng với các bước sóng thích hợp tương ứng. Pfr là dạng hoạt 43 tính sinh học, còn Pr là dạng bất hoạt (xem tiếp chi tiết về câu trúc, tính chất và chức năng ở mục 1.3.3.3). Ánh sáng Mặt Trời chứa nhiều ánh sáng đỏ hơn ánh sáng đỏ — xa. Đê minh chứng vê vai trò của phytocrom trong sự phát sinh nhịp ngày đêm ở thực vật, chúng ta xem xét sự tham gia của sắc tố này trong sự vận động ngủ của lá. 1.3.3.2. Phytocrom điều hoà sựvận động ngủ của lá Các vận động ngủ của lá, được nói đến như là ứng động cảm đêm (nystinasty), là ví dụ đã được mô tả khá tốt vê nhịp ngày đêm của thực vật. Trong sự vận động cảm đêm, các lá và/hoặc lá chét mở ngang ra để đón nhận ánh sáng trong ngày và xếp thẳng đứng lại với nhau (đóng) khi màn đêm buông xuống (hình 1.21). Đó là sự vận động được ánh sáng điều biến. Sự vận động cảm đêm của lá được thể hiện ở nhiều loài cây bộ Đậu (Leguminosae), chang hạn, như cây trinh nữ (Mimosa), muồng xanh (Albizia) và muồng ngủ (Samanea), cũng như các thành viên của họ Chua ìne đất (Oxalis). Các biến đôi trong gôc lá hoặc trong gốc lá chét do nhịp điệu biến đổi áp suất trương trong các tế bào của thể gôì, một câu trúc chuyên hoá tại gốc của cuông lá gây nên. A) B) Hinh 1.21. Vận động cảm đèm (nyctinasty) của lá cây trinh nữ (M ym o sa pu dica) A) C á c lá ch ét mở; B) C á c lá chét khép lại. Một khi đã bắt dầu, nhịp mở và đóng được duy trì (thậm chí t r o n g tối) ôn định, cả trong các cây nguyên vẹn và trong các lá chét cách ly (hình 1.22). Tuy nhiên, pha của nhịp có thể chuyển đổi nhanh dưói tá c động của các tín hiệu bên ngoài khác nhau, bao gồm ánh sáng đỏ và xanh. Ánh sáng cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự vận động của lá: ánh 44 sáng xanh kích thích các lá chét đã đóng mở ra và ánh sáng đỏ trong bóng tôi tiếp theo sau làm cho các lá chét đóng lại. Các lá chét bắt đầu đóng sau 5 phút từ khi cây được chuyển vào bóng tối và đóng hoàn toàn sau 30 phút. Vì rằng hiệu ứng của ánh sáng đỏ có thế bị ánh sáng đỏ — xa (far — red light) loại bỏ, do vậy phytocrom là sắc tô" điều biến sự đóng các lá ch ét. Thời gian Hình 1.22. Nhịp ngày - đêm (circadian rhythm ) trong sự vận động ngày đêm củ a các lá cây m uống xanh (A lb izia ) C á c lá được nâng lên vào buổi sáng và hạ xuống vào chiều tối. Song song với hiện tượng lá được n ân g lên và h ạ xuống, c á c lá ch ét mở ra và đóng lại. Nhịp duy trì ở biên đ ộ th ấ p đối với thời g ian bị h ạn c h ế trong tọng thời gian tối (T heo Lincoln T aiz e t al., 2006). Cơ chế sinh lý của sự vận động của lá đã được nghiên cứu tốt. Sự vận động như vậy Ịà kết quả của các biến đổi sức trương trong các tế bào định cư tại phía đối diện của thể đệm gốì (pulvmus), được gọi là các tế bào động cơ bụng (ventral motor cells) và các tế bào động cơ lưng (dorsal motor cells), như được chỉ ra trên hình 1.23. Những biên đổi trong áp suất trương phụ thuộc vào dòng K+ và c r qua các màng sinh chất của các tế bào động cơ lưng và bụng. Các lá chét mở khi các tế bào động cơ lưng tích luỹ K+ và c r dẫn tới sự gia tăng sức hút nưốc và tế bào trương phồng lên, trong khi các tế bào động cơ bụng giải phóng K+ và c r , làm cho các lá chét teo xẹp xuống. Sự chuyển đổi ngược lại như vậy của các quá trình đó làm cho các lá chét đóng lại. Do đó sự đóng lá chét là một ví dụ về phản ứng nhanh đôi với phytocrom vốn liên quan vối dòng ion qua màng (xem phần sau: rriụe 1.3.3.5). Như vừa nêu, phytocrom có vai trò trong phản ứng đóng và mở của lá 45 cây bộ Đậu theo nhịp nội sinh trong mối liên quan vói sự chuyên đổi của ánh sáng từ ngày sang đêm và ngược lại, dưới tác động của ánh sáng đỏ và đỏ — xa. Chúng ta thảo luận thêm về sự chuyên hoá của sắc tô' này. Bây giờ chúng ta sẽ tìm hiểu sự phát hiện phytocrom và hiện tượng chuyển hoá quang thuận nghịch, các tính chất quang hoá và hoá sinh của sắc tô’ này và những biến đổi hình dạng tế bào do ánh sáng gây nên. Các kiểu khác nhau của phytocrom được các thành phần khác biệt của họ đa gen mã hóa và những phytocrom khác nhau điều hoà các quá trình khác biệt trong cây. Các phản ứng phytocrom khác biệt ấy được phân loại phù hợp với số lượng và thành phần ánh sáng cần để tạo nên hiệu ứng. Cuối cùng, chúng ta cũng sẽ xem xét cơ chế tác động của phytocrom ở mức tế bào và phân tử bao gồm sự điểu hoà biểu gen và các con đưòng truyền tín hiệu. H ình 1.23. Các dòng ion giữa các tế bào động cd bụng và các tế bào dộ ng cơ lưng tro n g th ể gối của c â y m uốn g xanh (A lblzia) điểu hoà sự m ả và đóng các lá ch ét (T heo G alssto n , 1994). 1.3.3.3. Câc tính chất quang hoá vá hoâ sinh của phytocrom Phytocrom, đó là một sắc tô’ với khối lượng phân tử khoảng 125kDa, chưa được nhận biết như là loại hoá chất duy nhất cho đến 1959, chủ yếu là vì những khó khăn về mặt kỹ thuật tách chiết và tinh chế protein. Tuy nhiên, nhiều các tính chất sinh học của phytocrom đã được xác lập từ trước trong các nghiên cứu trên cây nguyên vẹn. Những manh mối đầu tiên về vai trò của phytocrom trong sự phát triển của cây đến từ các nghiên cứu đã được bắt đầu trong những năm 1930 về các phản ứng phát sinh hình thái được ánh sáng đỏ cảm ứng, đặc biệt sự nảy mầm của hạt. Bảng liệt kê các phản ứng như vậy hiện 46 đang dài thêm và bao gồm một hoặc nhiều các phản ứng tại hầu hết mỗi giai đoạn trong chu trình sông vối phạm vi rộng của các thực vật màu lục khác nhau (bảng 1.2). Bảng 1.2. Các phàn ứng quang thuận nghịch điển hình được phytocrom cảm ứng trong nhiều thực vật bậc thấp và bậc cao (Từ Lincoln et al., 2006) N hóm C hi (G e n u s) Giai đ o ạ n p h á t triển H iệu ứ n g c ủ a á n h s á n g đ ỏ A n g io s p e rm s (H ạt kín) G ym no sp erm s (H ạt trần) P terido ph ytes (Thực vật h o a ẩn c ó m ạch) B ryop hytes (N gành R êu) Latuca (rau diếp) Hạt Khởi độ n g n ảy m ầm . A vena (yến m ạch) Cây mạ (bị úa vàng) Khỏi độ n g s ự loại bỏ m àu úa vàn g (lá m ỏ ra). Sinapis (m ù tạc) C ây m ạ Khởi độ n g s ự hình th àn h m ầm lá, p h á t triển c ủ a c á c lá sơ c ấ p và tạ o antoxianin. P isum (cây đ ậu ) Trường thành ứ c c h ế sự d ã n dái c ủ a lóng. X anthium (cây ké) Trưởng thành ứ c c h ế s ự ra h o a (phản ứng ch u kỳ q u an g ). P inus (cây thông) C ây mạ Gia tăng tốc độ tích luỹ diệp lục. O noclea (dường xỉ) T hể giao tử non Khởi động sinh truởng. P olytrichum (rêu) Cây m ầm Khởi động tái bàn các lạp thể. C hlo ro ph ytes (Ngành Tảo lục) M ougeotia (tào) T hể giao tử trưởng thành Khởi động sự định hướng của các lục lạp đối với ánh sáng m à trực tiếp. Như đã biết, ánh sáng đóng vai trò chìa khoá, như là nguồn năng lượng trong quang hợp. Tuy nhiên, cần rất ít ánh sáng và thởi gian để khởi động sự chuyển cây từ trạng thái úa vàng thành màu lục. Như vậy, trong sự chuyển đổi của cây từ trong bóng tốì (cây có màu úa vàng, tái nhợt, thường cao, vóng) ra sinh trưởng ngoài sáng (cây khoẻ chắc), ánh sáng tác động như là một kích hoạt sự phát triển hơn là nguồn năng lượng trực tiếp (hình 1.24). Nếu như không che chắn, cứ để cho cây phơi sáng, thì trong một tuần hoặc tương tự như thế, sẽ xuất hiện hầu như toàn màu lục giông như cây cỏ xung quanh. Mặc dầu không thấy được bằng m ắt thường, thực tế. những biến đổi như vậy đã bắt đầu hầu như tức khắc ngay sau 47 khi phơi sáng. Ví dụ: trong vòng một giờ áp dụng loé sáng tương đối yếu đối với cây mầm đậu mọc trong tối trong phòng thí nghiệm, người ta đã đo được một sô các biến đổi phát triển: giảm tốc độ dãn dài của thân, bắt đầu uô’n thẳng móc câu đỉnh, khởi động sự tổng hợp các sắc tô' màu lục đặc trưng của thực vật. A. N gô m ọc ngoài sá n g B. Ngô m ọc trong tối ' y .vioc câu S M B 9 W M 8 B M H r x 1 ESK1lưới lá mầm ■ ■ """W V~ ~ V )' ' À> c. Đ ậu m ọc ngoài sá n g D. Đ ậu m ọc trong tối Hinh 1.24. C ây ngô non (Zea m ays) (A và B) và cây đậu (P haseo lus vulgaris) (C và D) sinh trưỏng hoặc ngoài sáng (A và C) hoặc trong tối (B và D) D ấu hiệu củ a s ự ú a vàn g (etiolation) trong cảy ngô, cây Một lá m ầm , là không h o á lục, không d ãn dải b ao lá m ầm v à trụ gian lá m ầm . Trong cây đậu, cây Hai lá m ầm , c á c d ấ u hiệu úa vàng gồm s ự không h o á lục, giảm kích thước lá, d ãn dài trụ dưới lá m ầm v à duy tri m óc c ảu đình. Ánh sáng đã tác động như một tín hiệu cảm ứng sự biến đổi hình dạng cây mầm, từ dạng vốn xúc tiến sự mọc xuyên qua đất (dạng móc cảu) đến dạng thích nghi hơn đôi vối sự sinh trưởng trên m ặt đất (dạng 48 mọc thẳng). Khi không có ánh sáng, cây mạ sử dụng dự trữ dinh dưỡng dược tích luỹ dầu tiên trong hạt cho sự sinh trưởng của cây úa vàng. Tuy nhiên, thực vật có hạt, bao gồm các loài cỏ, không tích luỹ đủ năng lượng dể duy trì sự sinh trưởng vô hạn. Chúng đòi hỏi năng lượng ánh sáng không chí để cung cấp nhiên liệu cho quang hợp, mà còn để khởi dộng sự chuyển đổi phát triển từ sinh trưởng tổì sang sinh trưởng sáng. Quang hợp không thê là động lực của sự chuyển đối ấy, vì trong thòi gian đó diệp lục chưa xuất hiện. Loại bỏ hoàn toàn hiện tượng úa vàng không đòi hỏi quang hợp, nhưng những biến đồi khởi đầu nhanh chóng dưực cảm ứng bởi ánh sáng khác biệt nhau, được gọi là q u an g p h á t sinh h ìn h th á i (photomorphogenesis). Trong các sắc tố khác nhau vôri có thể khởi động các phản ứng quang phát sinh hình thái trong thực vật. quan trọng nhất là các sắc tố hấp thụ ánh sáng dỏ và xanh. Các chất nhận ánh sáng xanh liên quan với sự diều hoà quá trình đóng và mỏ khí khổng và quang hướng động. Trong chương này, chúng ta chỉ tập trung chú ý vào sắc tô" liên quan đến nhịp ngày dêm, đó là phytocrom , một sắc tô protein vốn hấp thụ ánh sáng dỏ và dỏ xa rất mạnh, nhưng cũng hấp thụ cả ánh sáng xanh. Phytocrom đóng vai trò chìa khoá trong quá trình phát triển sinh sản và sinh dưỡng được ánh sáng điều khiển. Một sự đột phá mở dường trong lịch sử phát minh ra phytocrom là sự phát hiện rằng, các hiệu ứng của ánh sáng đỏ (650 - 680nm) đối vối sự phát sinh hình thái có thể thuận nghịch bởi sự chiếu xạ tiếp theo vói ánh sáng có bưốc sóng (710 - 740nm), được gọi là ánh sáng đỏ - xa (far - red light). H iện tư ợ n g đó lầ n đ ầ u được ch ứ n g m in h tro n g các h ạ t đ a n g náy mầm, nhưng cũng dã quan sát trong tương quan vói sinh trưởng của lá và thân, cũng như cảm ứng ra hoa. Quan sát đã cho thấy rằng, sự nảy mầm của các hạt rau diếp (Latuca) được ánh sáng đỏ kích thích và bị ánh sáng đỏ — xa ức chế. Nhưng sự đột phá thực tế được thực hiện nhiều năm vể sau, khi các hạt rau diếp đã được phơi dưới ánh sáng xen kẽ đỏ và đỏ — xa. Gần như 100% các hạt đã được chiếu ánh sáng đỏ lần CUÔÌ đều đã nảy mầm; tuy nhiên, trong các hạt đã được xử lý ánh sáng đỏ - xa lần cuối, sự nảy mầm bị ức chế mạnh (hình 1.25). 4-GT...THỰC V Ạĩ -A, 49 Đó Đò-xa Đò Đỏ Đò-xa Đỏ Đỏ-xa Hình 1.25. Sự này m ầm của hạt cây rau diếp (L atu ca) là m ột phàn ứng q u an g thuận nghịch điển hình dược ph yto crom diều hòa Anh sán g đỏ khỏi động sự này m ầm của hạt rau diếp, nhưng hiệu ứng ấy bị đ ả o ngược bởi ánh sáng đỏ - xa. C á c hạt đ ã hút đù nước được xử lý xen kẽ án h sá n g đỏ và án h sá n g đỏ - xa tiếp sau. Hiệu quà củ a xử lý án h sá n g phụ thuộc vào lần xử lý sa u cùn g (Ảnh củ a M.B. Wilkin). a) Phytocrom có thê chuyên hoá lẫn n h a u g iữ a các d ạ n g P r và Pfr Ớ cây mọc trong bóng tối hoặc cây úa vàng, phytocrom hiện diện ở dạng hấp thụ ánh sáng đỏ, được ký hiệu là Pr vì nó được tổng hợp trong dạng đó. Pr, sắc tô' đôn m ắt người là màu xanh, được chuyển hoá bởi ánh sáng dỏ thành dạng hấp thụ ánh sáng dỏ - xa dược gụi là Pfr, vốn là xanh - lục (blue - green). Pfr, đến lượt, có thể được chuyển hoá ngược lại thành Pr bởi ánh sáng dỏ - xa. Đã biết rằng do tính quang thuận nghịch, tính chất chuyển hoá/tái chuyển hoá ấy là đặc trưng khác biệt nhất của phytocrom và nó có thê được biểu hiện ra ở dạng tóm tắt như dưới đây và trên hình 1.28C. p r _ ____Ảnh sáng đỏ___ i pfr Ánh sáng dỏ -xa Pr: Dạng phytocrom hấp thụ ánh sáng đỏ; Pfr: Dạng phytocrom hấp Ihu ánh sáng dỏ -xa. Sự chuyển hoá tương hỗ của các dạng Pr và Pfr có 50 4 -G T ...T x ụ c v Ạ T -e thê do được in vivo hoặc in vitro. Thật ra, hầu hết các tính chất quang phố của phytocrom đã dược tinh chế cẩn thận đo được in vitro đúng như phytocrom quan sát được in vivo. Khi các phản tử Pr được phơi ánh sáng đỏ, hầu hết chúng hấp thụ nó và được chuyên hoá thành Pfr, nhưng một sô’ phân tử Pfr cũng hấp thụ ánh sáng đỏ và dược chuyển hoá trở lại Pr vì cả Pr và Pfr đều hấp thụ ánh sáng đỏ (hình 1.26). 0 8 0.6 0.2 30 400 500 600 700 Bước sóng (nm) Phổ khả kiến 800 Hổng ngoại Hinh 1.26. P h ổ hấp thụ của cây yến m ạch (A vena) tron g d ạn g Pr và p(r gối lên nhau (Theo Viestra và Quail, 1983). Như vậy, tỷ lệ của phytocrom trong dạng Pfr sau khi bão hoà chiếu xạ bởi ánh sáng đỏ chỉ khoảng 85%. Một cách tương tự, lượng rất ít của ánh sáng đỏ — xa được Pr hấp thụ làm cho nó không có khả năng chuyển hoá hoàn toàn Pfr thành Pr bởi ánh sáng đỏ — xa. Thay vào đó, một sự cân bằng của 97% Pr và 3% Pfr là được. Sự cân bằng như vậy được gọi là trạ n g th á i q u a n g tĩn h (photostationary State). Bố sung vào sự hấp thụ ánh sáng đỏ, cả hai dạng phytocrom hấp thụ ánh sáng trong vùng xanh của quang phổ (hình 1.26). Do vậy, hiệu ứng phytocrom có thể có dược bởi ánh sáng xanh, miền sáng có thế chuyển Pr thành Pfr và ngược lại. Các phản ứng ánh sáng xanh cũng có thểMà kết quả từ tác động của một hoặc nhiêu các chất nhận ánh sáng khác. Phytocrom có liên quan hay không trong phản ứng đốì với ánh sáng xanh thường được xác định bởi phép thử khả năng của ánh sáng đỏ - xa đảo ngược phản ứng, vì chỉ có các phản ứng được phytocrom cảm ứng là được đảo ngược bởi ánh sáng đỏ - xa. Một con đường khác để phân biệt giữa các chất nhận ánh sáng là nghiên cứu các thể đột biến vốn đã bị khiêm khuyết một trong các chất nhận ánh sáng. 51 Cuộc sông ngắn ngủi của các dạng phytocrom trung gian: Quang chuyển hoá của Pr thành Pfr và của Pfr thành Pr không phải là quá trình một bước. Bằng cách chiếu loe sáng rất ngắn lên phytocrom, chúng ta có thể quan sát được những biến đổi hấp thụ xảy ra trong thòi gian ngắn hơn một phần nghìn giây. Tất nhiên, ánh sáng Mặt Trời là sự trộn lẫn tất cả các bưóc sóng khả kiến. Dưới ánh sáng trắng như vậy, cả Pr và Pfr đểu bị kích động và các chuyển hoá phytocrom tiếp diễn giữa hai dạng. Trong tình huống đó, các dạng trung gian của phytocrom tích luỹ và gia tăng phần đáng kể trong phytocrom tông số. Các chất trung gian như vậy thậm chí có thê đóng vai trò trong sự khởi động hoặc khuếch đại các phản ứng phytocrom dưới ánh sáng Mặt Trời tự nhiên, tuy nhiên vấn đề này còn cần phải được nghiên cứu tiếp. b) D ang h o a t tín h sin h lý của phytocrom Trong hai dạng phytocrom, Pfr là dạng hoạt tính sinh lý. Vì rằng các phản ứng phytocrom được ánh sáng đỏ cảm ứng, về lý thuyết, chúng có thê là kết quả hoặc là từ sự xuất hiện của Pfr hoặc từ sự biến mất của Pr. Trong hầu hết các trường hợp được nghiên cứu, tương quan định lượng được giữ yên giữa cường độ của phản ứng sinh lý và sô' lượng của Pfr được ánh sáng tạo ra, nhưng không phải như vậy là tương quan nêu trên được giữ yên giữa phản ứng sinh lý và sự biến mất của Pr. Minh chứng cho kết luận rằng Pfr là dạng hoạt tính sinh lý của phytocrom. Trong các trường hợp mà trong đó đã chỉ rõ rằng, phản ứng phytocrom không có tương quan định lượng đối với giá trị tuyệt đôi của Pfr, đã giả định tỷ lệ giữa Pfr và Pr, hoặc giữa Pfr và tổng sô' phytocrom, quy định cường độ của phản ứng. Kô’t lu ậ n rằ n g P fr là d ạn g hoạt tín h sin h lý c ủ a p h y to cro m đ ã được các nghiên cứu sử dụng các thể đột biến của Arabidopsis ủng hộ. Các nghiên cứu đó đã cho thấy các thể đột biến của Arabidopsis không có khả năng tổng hợp phytocrom. Trong các cây non kiểu hoang dã, ánh sáng trắng ức chế rất mạnh sự dãn dài của trụ dưới lá mầm và phytocrom là một trong các chất nhận ánh sáng liên quan trong phản ứng ấy. Khi sinh trưởng trong điều kiện ánh sáng trắng liên tục, đã phát hiện ra các cây non đột biến với các trụ dưới lá mầm dài và đã đặt tên là các thể đột biến hy (từ thuật ngữ bằng tiếng Anh hypocotyl). Các thể đột biến hy khác biệt được đánh dấu theo sô’ thứ tự: hyl, hy2 và,... Vì rằng ánh sáng trắng là sự trộn lẫn của các bưóc sóng (bao gồm ánh sáng đỏ, đỏ - xa và xanh), một 52 số, nhưng không phải tất cả, các thể đột biến h y đã chỉ ra sự khiếm khuyết một hoặc nhiều các phytocrom chức năng. Các kiểu hình của các thể đột biến khiếm khuyết — phytocrom đã có ích trong việc nhận biết các dạng phytocrom hoạt tính sinh lý. Nếu phytocrom phản ứng đôi vối ánh sáng trắng (ức chế sự sinh trưởng của trụ dưói lá mầm) được gây nên bởi sự thiếu vắng Pr, các thể đột biến thiêu phytocrom như thê (vôn có hoặc Pr, hoặc Pfr) sẽ có các trụ dưới lá mầm ngắn hơn cả ở trong tôi và ngoài ánh sáng trắng. Thay vào đó, điều ngược lại sẽ xảy ra, rằng chúng có các trụ dưối lá mầm dài cả trong tối và ngoài ánh sáng trắng. Sự thiếu vắng Pfr ngăn chặn không cho các cây mạ phản ứng đôi với ánh sáng trắng. Nói một cách khác, Pfr gây nên phản ứng sinh lý. Nhóm mang sắc: Phytocromobilyn ________________ _ A _______________ ■tíQ- . . pQ. ạ. < \ Liên kểt thioete H Pr Ánh sáng đỏ chuyển c/s thành trans Cis đồng phân Trans đồng phân H ình 1.27. Cấu trú c của các dạng Pr và Pfrcủa ph yto cro m và m iển peptit liên kết vào nhóm m ang sắc qua liên kết th ioete Nhóm m a n g s ắ c chịu sự đổng ph ân hoá cis - trans của c a c b o n 15 trong p h ản ứng đối với án h sá n g đ ỏ v à đ ỏ - xa (T heo A ndel et al., 1997). c) P hytocrom là m ộ t n h ị p h â n gồm h a i p o ly p e p tit Phytocrom tự nhiên là một protein hoà tan có khỗì lượng phân tử khoảng 250kDa. Đó là một nhị phân gồm từ hai đơn phân đương lượng. Mỗi một đơn phân lại gồm hai thành phần phân tử sắc tô" hấp thụ ánh 53 sáng được gọi là nhóm m an g sắc và chuỗi polypeptit dược gọi là ap o p ro tein . Trong thực vật bậc cao, nhóm mang sắc cúa phytocrom là một tetrapyrol mạch thắng được đặt tên là phytocromobilin. Chỉ có một nhóm sắc trên một đơn phân cua apoprotein và nó liên kết vào protein qua cầu nối thioete tại gốc xystein (hình 1.27). Các nhà nghiên cứu đã nhìn thấy bằng mắt dạng Pr của phytocrom khi sử dụng kính hiến vi điện tử và tán xạ tia X và Nakasako cùng cộng sự (1990) đã đề nghị mô hình như trên hình 1.28C. Polypeptit cuộn gấp vào hai miền lớn được tách biệt bởi vùng "bản lề". Miền đầu cuối -N lớn là khoảng 70kDa và mang nhóm mang sắc; miền đầu cuốỉ -C bé hơn là khoảng 55kDa và chứa vị trí nơi hai đơn phân gắn vói nhau đê tạo nên nhị phân. Hai đơn phân chuyên hoá lẫn nhau như một cầu dao phân tử dưới tác động của ánh sáng đỏ và đỏ - xa. trong đó Pfr là dạng hoạt tính thúc hạt nảy mầm, kiểm soát sự ra hoa,... (hình 1.28D). Miến liên kết nhóm Hình 1.28C. c ấ u trúc của nhị phân phytocrom C á c đơn ph ản đ ản h d ấu I và II. Mỗi đơn phàn gổm m iền liên kết nhóm m ang s ắ c (A) và m iền không m ang sắ c b é hơn (B). P h à n tử nguyên vẹn giông như m ột elipsoit hơn là dạng hinh cầ u (Theo Tokutoni e t al., 1989). Nhôm mang sắc p ụ A / t í . Các phán ứng: Tồng — V ỉ ».;_*» V m. M aw * - Hạt nảy mầm U J s - Đó xa \ ----— I [ \ — Chuyến hoá / V Phân giải chậm trong tối - - * bới enzym (ớ một sô cãy) Hinh 1.28D. Phytocrom là một cơ chè cấu dao phân tử H ấp thụ ánh sá n g đỏ ch uyển p, th á n h p,f. Ánh sá n g đỏ - xa đ ảo ngược s ự ch u y ển h o á đó. P lr là d ạn g ho ạt tinh sinh học. 54 d) I1 hytocrom obilyn dươc tống hợp trong các lap thê Apoprotein phytocrom một mình không thể hấp thụ ánh sáng đỏ hoặc ánh sáng đỏ - xa. Ánh sáng chỉ có thể được hâ'p thụ khi polypeptit liên kết cộng hoá trị với phytocromobilin đê tạo nên haloprotein. Phytọcromobilin được tổng hợp bên trong các lạp thê và là dẫn xuất của axit 5-aminolevulynic theo con đường vốn được phân nhánh từ con dường sinh tổng hợp diệp lục. Điều đó dược cho là một lỗ rò của lạp thể vào xytosol bởi quá trình thụ động. Các cây đột biến khiếm khuyết khả năng tổng hợp nhóm mang sắc cũng khiếm khuyết trong các quá trình vốn đòi hỏi tác động của phytocrom, mặc dầu các polypeptit apoprotein là hiện hữu. Ví dụ: một số các thể đột biên hy đã nêu ở trên, theo đó ánh sáng trắng không có khả năng loại bỏ sự dãn dài của trụ dưói lá mầm, đã có các khiếm khuyết trong sinh tổng hợp nhóm mang sắc. Trong các cây đột biến h yl và hy2, mức apoprotein là bình thường, nhưng rất ít hoặc holoprotein không hoạt tính quang phổ. Khi cung cấp tiền chất của nhóm mang sắc cho các cây non ấy, sinh trưởng bình thường dược phục hồi. Kiểu đột biến như vậy cũng đã quan sát được ở các loài khác. Chẳng hạn, thê dột biến lục — vàng của cà chua cũng có các tính chất tương tự như các thể đột biến hy. Điều đó giả định rằng, đó cũng là thể đột biến nhóm mang sắc. e) N hóm m a n g sắc và p ro tein đêu chịu sư chuyển dôi cấu da n g Vì nhóm mang sắc hấp thụ ánh sáng, các biến đổi cấu dạng trong protein được khởi đầu bởi những biến đổi trong nhóm mang sắc. Theo Andel et al., 1997, ngay trước khi hấp thụ ánh sáng, nhóm mang sắc chịu sự biến đôi đồng phân hoá cis — trans của liên kết kép giữa các nguyên tử cacbon 15 và 16 và quay liên kết đơn C14 - c ,5 (hình 1.27). Trong thời gian chuyển hoá của Pr thành Pfr, một nửa protein của holoprotein phytocrom cũng chịu sự biến đổi cấu dạng tinh tế. Một sô' các dòng các cá thể minh chứng rằng, sự chuyển đổi do ánh sáng cảm ứng trong cấu dạng của polypeptit xảy ra trong cả miền liên kết nhóm mang sắc N— đầu cuốỉ và trong miền C - đầu cuối của protein. f) Các m iên chức n ă n g của phytocrom Điều làm chúng ta khó hiểu là bằng cách nào mà một chất nhận ánh sáng giản đơn, một phân tử, có thế’ điều biến được nhiều quá trình sinh học đa dạng trong tế bào thực vật? Nghiên cứu về sinh học phân tử đã phát hiện rằng, phytocrom được các thành phần của các họ đa gen 55 mã hoá mà mỗi một trong chúng có hình mẫu biểu hiện gen riêng của bản thân. Điều đó đã cung cấp một sự giải thích đáng tin hơn: Các phản ứng được phytocrom làm trung gian được điều hoà bởi phytocrom đặc hiệu, hoặc là bởi mối tương tác giữa các phytocrom đặc hiệu. Như đã nêu ở các phần trên, giả thuyết đó đã được các kiểu hình của các thể đột biến khiếm khuyết hoặc phyA, hoặc phyB ủng hộ. Như một hệ quả tự nhiên đôì với giả thuyết đó, tiếp theo nó được giải thích rằng, các miền đặc hiệu của protein PHY phải được chuyên hoá đê cho phép chúng hoàn thiện các chức năng khác biệt nhau. Sinh học phân tử đã cung cấp cho chúng ta công cụ trả lời những câu hỏi hắc búa như vậy. Chúng ta sẽ mô tả những gì khoa học đã biết vê các miên chức năng của holoprotein trong phytocrom (hình 1.29). Đúng như các đột biến làm giảm sô' lượng phytocrom riêng biệt, đã thu được thông tin về vai trò của nó (phytocrom riêng biệt). Những cây đã được công nghệ hoá vê mặt di truyền để biểu hiện quá mức phytocrom đặc hiệu cũng có ích. Thứ nhất, chúng cho phép mỏ rộng giới hạn của mức phytocrom có khả năng thử trong tương quan đôi với chức năng. Thứ hai, như sẽ thấy, trình tự phytocrorrv đặc hiệu có thê bị biến đổi và được tái nhập vào cây bình thường để thử hiệu ứng kiểu hình của nó. Tinh đặc hiệu Phytocrom A/B Truyèn tin hiệu Thể ma C_L ng sắc ÌTD Miền Vị tri điều hoà phân bố rộng r n n : ■ s m ■ ! ỉ u ĩ QPH (quang phàn huỷ) Vị tri I unhi phân hoá 74kDa 55kDa Miền đâu cuối -N Miền đằu cuối -C H ình 1.29. Sơ đồ của holoprotein phytocrom chi rõ các m iến chức năng khác búệt VỊ trí g ắ n kết th ể m ang s ắ c và trình tự QPH (quang phàn huỳ) được định c ư trong m iền đ ấu cuối -N vốn m an g tinh đ ă c hiệu đối với phân tử - đó là nó phản ứng đối với ánh sáng đ ỏ liên tụ c và á n h sá n g đỏ - xa. Miền đ ầu cuối - C chứa vị trí nhị phân h o á và vùng điều hoà. Miển đ ầ u cuối - C truyền c á c tin hiệu đ ến c á c protein vốn hoạt động xuôi dòn g c ủ a phytocrom (T h eo Lincoln et a l.. 2006). Các cây biểu hiện một cách không bình thường quá mức gen PHYA hoặc PHYB, đã được chuyển nhập vào, có kiểu hình biến đổi đột nigột. Những cây được chuyển gen như vậy thường là lùn, có màu lục thẫnn do 56 gia tăng hàm lượng diệp lục và lộ rõ sự ưu thế đỉnh bị giảm thiểu. Kiểu hình như vậv đòi hỏi một mức độ gia tăng sự nguyên vẹn, holoprotein quang hoạt tính, vì sự biêu hiện quá mức của dạng phytocrom đột biến vôn không có khả năng phối hợp với thể mang sắc của phytocrom có kiểu hình bình thướng. Một cách tương tự, cây chỉ biếu hiện miền đầu cuối — N của mỗi phvtocrom có kiểu hình bình thường, mặc dầu mức gia tăng của phân doạn quang hoạt tính đã được tích luỹ. Mặc dầu sự biểu hiện quá mức làm rối loạn sự trao đổi chất bình thường của tế bào. do đó làm xuất hiện các thành phần giả tạo, những nghiên cứu như vậy vê cấu trúc và chức năng giúp xây dựng được một bức tranh vê phytocrom như là một phân tử có hai miền liên kết bởi bản lề: một miên N - đầu cuôi nhạy cảm ánh sáng mà trong đó có tính đặc hiệu ánh sáng, định cư ổn định và miền đầu cuối -C chứa các trình tự truyền tín hiệu (hình 1.29). Miền đầu cuối —c cũng chứa vị trí cho sự hình thành nhị phân phytocrom và vị trí đế bổ sung ubiquitin, đích cho sự phân giải. 1.3.3.4. Sự định cư của phytocrom trong các mô và tê bào Nhận thức đáng giá về chức năng của phytocrom có thể thu được từ việc xác định vị trí định cư của nó là ở đâu. Bởi vậy, không ngạc nhiên rằng đã có nhiều nỗ lực công hiến cho việc nghiên cứu sự định cư của phytocrom trong các cơ quan và mô, cũng như bên trong các tế bào. a) P hương p h á p xác đ ịn h phytocrom trong các mô Có thể phát hiện phytocrom trong các mô bằng phương pháp quang phố kế. Tính chất quang chuyển hoá thuận nghịch độc nhất của phytocrom có thể được vận dụng để định lượng sắc tô* trong các cây nguyên vẹn nhò việc sử dụng quang phổ kế. Vì rằng màu của nó có thể bị diệp lục che khuất, phytocrom khó được phát hiện trong mô lục. Trong thực vật mọc trong tối, ở chúng không có diệp lục, phytocrom đã được phát hiện trong nhiều loại mô của thực vật hạt kín — cả ở cây Một lá mầm và Hai lá mầm — cũng như trong thực vật hạt trần, quyết, rêu và tảo. Trong các cây non vàng úa, mức phytocrom cao nhất thường được tìm thấy trong các miền mô phân sinh, hoặc trong các miền mối đây đã từng là mô phân sinh, chẳng hạn như chồi hoặc mấu đầu tiên của cây đậu (hình 1.30), hoặc các miền đỉnh và mấu của bao lá mầm trong cây yến mạch. Tuy nhiên, các khác biệt trong hình mẫu biểu hiện gen giữa 57 thực vật Một lá mầm và Hai lá mầm và giữa phytocrom kiểu I và kiếu II lộ rõ khi sử dụng những phương pháp khác nhạy cảm hơn. b) Phytocrom dươc biêu hiên khác n h a u ở trong các mô khác nh a u Việc chọn dòng các gen cá thế PHY đã cho phép các nhà nghiên cứu xác định được hình mẫu biểu hiện gen cua các phytocrom cá thê trong các mô chuyên biệt bằng một số phương pháp. Các trình tự có thể được dùng trực tiếp đe thử các mARN chiết ra từ các mô khác nhau, hoặc đế phân tích hoạt tính phiên mã nhờ phương tiện gen thông báo (reporter gene), vốn giúp thấy được các vị trí của sự biếu hiện gen. Trong cách tiếp cận thứ hai, miền khởi đầu của gen PHYA hoặc PHYB được nôi với phần mã hoá của gen thông báo, chang hạn, như gen đôi với enzym P“ glucuroniđase, enzym được gọi là GUS (nhớ rằng miền khởi đầu là trình tự ngược dòng của gen cần cho sự phiên mã). Lợi thế của việc sử dụng trình tự GUS là nó mã hoá enzym, thậm chí ở lượng rất ít, chuyển hoá cơ chất không màu trở thành nhuộm màu sớm khi cd chất được cung cấp cho cây. Do đó, các tế bào chứa miền khỏi đầu (miền khởi động) của gen PHYA hoạt tính sẽ nhuộm màu xanh, các tế bào khác sẽ không có màu. Gen lai hoặc dung hợp sau đó được đưa trở lại vào cây thông qua việc sử dụng Ti — plasmit của Agrobacterium tumefaciens như là vector. Khi phương pháp đó được sử dụng để kiêm tra sự phiên mã cua hai gon PHYA khác biệt trong cây thuốc lá, đã phát hiện thấy các cây non mọc trong tôi chứa hàm lượng chất màu cao nhất trong các móc câu đỉnh và đỉnh rễ, điều này phù hợp với các nghiên cứu miễn dịch trước đây (Adam et al., 1994). Hình mẫu của sự nhuộm màu trong các cây non mọc ngoài sáng cũng là tương tự, nhưng như dự đoán, độ đậm màu thấp hơn. Các nghiên cứu tương tự với các dung hợp PHYB - GƯS và PHYA - GUS cúa cáy Arabidopsis đả được đặt trớ lạí vão Arabidopsis đã khảng định PHYA là kết quả cho thuỗic lá và đã chỉ rõ rằng PHYB - GUS được biêu hiện ở mức rất thấp so với PHYA - GUS trong tất cả các mô (Somer và Quail, 1995). Nghiên cứu mới đây so sánh hình mẫu biểu hiện của sự dung hợp các gen PHYB - GUS, PHYD - GUS và PHYE - GUS trong Arabidopsis đã phát hiện ra rằng, mặc dầu các gen khởi động kiểu II ấy ít hoạt tính hơn so với gen khởi động kiêu I, chúng chỉ ra hình mẫu biểu hiện khác biệt (Goosey et al., 1997). Như vậy lộ ra bức tranh chung từ các nghiên cứu ấy là các phytocrom được biểu hiện trong các hình mẫu khác biệt nhưng gối lên nhau. 58 Tóm lại, phytoerom là rất nhiều trong các mô non chưa phân hoá (hình 1.30), trong các tế bào nơi có nhiều nhất các mARN và các gen khỏi động hoạt tính nhâ't. Tương quan chặt giữa mức phong phú phytocrom và các tế bào vốn chứa các tiềm năng của sự biến đổi động học phát triển là phù hợp vói vai trò quan trọng của phytocrom trong sự kiếm tra các biến đôi phát triên như vậy. Vì ràng các hình mẫu biểu hiện của các phytocrom riêng biệt gối lên nhau, không ngạc nhiên rằng chúng hoạt động phôi hợp, mặc dầu, chắc là chúng cũng sử dụng các con đường truyền tín hiệu khác biệt. Nghiên cứu các thê dột biến p h y t o c r o m cũng đã ủng hộ ý tưởng đó. - Mâu đâu tièn r r I I í r r ■ E S I iưăsắ ttằỉS ? _l___ I___ I___ I— _J____ I____I____ L Nồng độ phytocrom ---------------- H ình 1.30. Phytocrom hầu như tập trung trong c á c m iền nơi xảy ra s ự biến đổi p h át triển m ạn h nhất: c á c m ô ph ân sinh đỉnh của trụ dưới lá m ầm và c ủ a rễ. T rên hình chỉ ra sự p h ân bố củ a phytocrom trong m ột cây đ ậu non ú a vàng, như đ ã được đo trên m áy q u an g phổ kế (Từ K endrick và Frankland, 1983). 1.3.3.5. Chức năng sinh thái của các phytocrom (sự chuyên hoá phytocrom) Phytocrom được mã hoá bởi hệ đa gen, được ký hiệu từ PHYA đến PHYE. Tuy rằng cấu trúc của các phytocrom là rất tương tự nhau, mỗi một trong các phytocrom ấy thực hiện các chức năng khác biệt trong đòi sông của thực vật. Dưói đây chúng ta tìm hiểu khái quát về các chức năng sinh thái của các phytocrom. 59 a) P hytocrom B điêu hoà các p h ả n ứng đôi với á n h sá n g dỏ liên tục hoặc á n h sá n g trắ n g Đầu tiên phytocrom B bị nghi ngờ có vai trò trong các phản ứng đôi với ánh sáng liên tục vì thể đột biến hy 3 (bây giò được gọi là phyB), vốn có các trụ dưới lá mầm dài dưới ánh sáng trắng liên tục, đã tìm thấy gen phyB biến đổi. Trong các thể đột biến đó, PHYB -mARN đã bị giảm thiểu vê sô’ lượng hoặc không có và đã không phát hiện được protein phyB. Ngược lại, hàm lượng của PHYA — mARN và protein PHYA là bình thường. PHYB điều hoà sự tránh bóng tôi bằng cách điều hoà độ dài của trụ dưới lá mầm trong phản ứng đối vói ánh sáng đỏ đã cho trong các loé sáng yếu, hoặc chiếu sáng liên tục và như đã có thể dự đoán, thể đột biến phyB không có khả năng phản ứng đôi vói bóng tối bằng cách gia tăng trụ dưới lá mầm. Thêm vào đó, những cây này tăng chiểu dài của trụ dưới lá mầm trong phản ứng đốì với ánh sáng đỏ — xa (red - far) được chiếu vào thời điểm cuối mỗi quang chu kỳ gọi là p h ản ứng đỏ - xa cuối ngày (end-of-day far-red response), c ả hai phản ứng ấy có khả năng liên quan với sự cảm nhận tỷ lệ phytocrom thành phần (Pfr)/phytocrom tổng sô (Ptotal). Mặc dầu phyB là trung tâm liên quan trong phản ứng tránh bóng tối, bằng chứng giả định rằng các dạng phytocrom khác cũng đóng vai trò quan trọng (Smith và Whitelam, 1997). Thể đột biến phyB thiếu diệp lục và thiếu một ít các mARN vein mã hoá các protein lục lạp và nó bị suy yếu trong khả năng phản ứng đôi với các hormon thực vật. Vì sự đột biến trong PHYB dẫn đến kết quả làm hư hại sự tiếp nhận ánh sáng đỏ liên tục, sự hiện diện của các phytocrom khác không đủ để bảo đảm tính phản ứng đôi với ánh sáng đỏ hoặc ánh sáng trắng liên tục. Phytoorom B cũnK tham KÍa điều hoà sự nảy mầm Q'lfinK thuận nghịch của hạt, một hiện tượng bắt nguồn cho sự phát minh ra phytocrom. Các hạt của cây Arabidopsis kiểu hoang dã, đòi hỏi ánh sáng đế nảy mầm và phản ứng cho thấy tính thuận nghịch đỏ/đỏ — xa trong giới hạn cường độ thấp. Các thế đột biến thiếu phyA phản ứng bình thường đôi vối ánh sáng đỏ cường độ yếu (Shinomura et al., 1996). Bằng chứng thực nghiệm ấy giả định một cách mạnh mẽ rằng phyB điều hoà sự nảy mầm quang thuận nghịch của hạt. b) P hytocrom A điều k h iển p h ả n ứng dối với á n h sá n g đỏ - xa liên tuc Không có các đột biến gen phytocrom nào khác ngoài phyB đã được 60 phát hiện trong bộ sưu tập hy nguyên gốc, do đó sự nhận biết các thể đột biến phyA đòi hỏi sự phát triển các kiểu sàng lọc độc đáo hơn. Như đã biết trước đây, vì HIRs (các phản ứng bức xạ cường độ cao) đỏ — xa đã biết đòi hỏi phytocrom ánh sáng không ổn định (kiểu I), đã có nghi ngờ rằng phyA phải là chất nhận ánh sáng liên quan trong sự tiếp nhận ánh sáng dỏ — xa liên tục. Nếu điều ấy là sự thật, thì các thể đột biến phyA sẽ không phản ứng đôi với ánh sáng đỏ — xa liên tục và mọc cao vóng mảnh khảnh dưới điêu kiện ánh sáng như vậy. Tuy nhiên, các thể đột biến thiếu nhóm mang màu sẽ cũng có vẻ như th ế vì rằng phyA có thể phát hiện được ánh sáng đỏ — xa liên tục chỉ khi được tập hợp vối nhóm mang màu trong holophytocrom (phytocrom tổng số). Đe chọn được chính xác các thể đột biến phyA, các cây con vổn mọc cao vóng lên dưới ánh sáng đỏ - xa liên tục sau đó sinh trưởng dưới ánh sáng đỏ liên tục. Các thê đột biến thiếu phyA có thê sinh trưỏng bình thường trong điều kiện như vậy, nhưng các thể dột biến thiếu nhóm mang màu, vốn đồng thời cũng thiếu phyB chức năng, không có phản ứng. Các cây mầm thể đột biến PHYA đã được chọn lọc trong phép sàng lọc như vậy đã không có kiều hình rõ ràng khi sinh trưởng trong ánh sáng trắng bình thường, điểu đó khẳng định rằng phyA không có vai trò rõ ràng trong cảm nhận ánh sáng trắng. Điều đó cũng giải thích tại sao các thể đột biến phyA đã không phát hiện được trong phép sàng lọc trụ dưổi lá mầm dài nguyên gốc. Thật vậy, PHYA thể hiện vai trò hạn chế trong quang phát sinh hình thái, bị giới hạn trứổc hết đôi vối sự loại bỏ màu úa vàng và các phản ứng ánh sáng đỏ - xa. Chẳng hạn, phyA có thể là quan trọng khi hạt nảy mầm dưới tán cây, vốn có tác dụng loại bỏ nhiều ánh sáng đỏ. Bảng 1.3. So sánh bức xạ biến đổi rất thấp (VLFR), bức xạ biến đổi thấp (LFR) và các phản ứng bức xạ cao (HIR) Kiểu p h ả n ứ n g T ín h q u a n g th u ậ n n g h ịc h T ính tư ơ n g h ỗ C á c đ ỉn h c ủ a phô’ tá c đ ộ n g T h ụ t h ể á n h s á n g VLFR K hỏng Có Đỏ, xanh phyA.phyE* LFR C ó C ó Đỏ, đỏ xa phyB, phyD , phyE HIR K hông Không M ọc tối: đ ỏ - xa, xanh, M ọc tối: phyA, — UV-A, m ọc sá n g : đỏ M ọc sá n g : phyB * phyE c ẩ n ch o h ạt nảy m ầm nhưng không phải đối với c á c p h ả n ứng VLFR kh ác đ u ọ c phyA điều h o à. 61 Có thể thấy rõ điều đó từ kiểu hình ánh sáng dỏ - xa ổn định vốn không phải vì thiếu phytocrom nào khác đối với sự tiếp nhận ánh sáng đỏ xa ổn định và mặc dầu tất cả các phytocrom có khả năng hấp thụ ánh sáng đỏ - xa và ánh sáng đỏ, ít nhất là phyA và phyB có vai trò khác biệt trong vấn đề này. Phytocrom A cũng liên quan trong sự nảy mầm dưới tác động của bức xạ biến đổi rất thấp (very-low-fluence, VLFR) của các hạt Arabidopsis. Thực vậy, theo Shinomura et al., 1996, các thể đột biến thiếu phyA không thế nảy mầm trong phản ứng đổi với ánh sáng đỏ trong giới hạn biến đổi rất thấp, nhưng chúng thể hiện phản ứng bình thường đôi với ánh sáng đỏ trong giới hạn biến đổi thấp (LFR). Kết quả đó đã chứng minh rằng phyA hoạt dộng dưói ánh sáng đỏ trong giới hạn biến đổi thấp (LFR). Kết quả đó đã chứng minh rằng phyA hoạt động như là chất nhận ánh sáng sơ cấp đối với VLFR đó, mặc dầu minh chứng gần đây giả thiết rằng phyE cần cho thành phần đó của sự nảy mầm (Hennig et al., 2002). Trong bảng 1.3 ở trên tóm tắt các vai trò khác nhau của phyA, phyB và các chất nhận ánh sáng khác trong các phản ứng đa dạng được phytocrom điều hoà. c) Vai trò q u a n trọ n g của các phytocrom c, D và E đ ố i với sự p h á t triển của thự c vật Các phyocrom c, D và E cũng có các vai trò quan trọng đối vổi sự phát triển của thực vật. Một trong sô’ các vai trò của các phytocrom khác trong sự sinh trưởng và phát triển của thực vật mới đây đã b ắt đầu được rút ra từ các thực nghiệm trên các cây đột biến. Vì rằng các phytocrom ấy có các chức năng gối lên chức năng của phyA và phyB, điều đó là cần thiết để sàng lọc đối vối các thể đột biến trong các nền đột biến không phyA đối với các đột biến không che lấp. Ví dụ: cả phyD và phyE giúp làm trung gian cho phản ứng lẩn tránh bóng tối, phản ứng được phyB làm trung gian lần đầu. Sáng tạo ra các thể đột biến ba và kép làm xuất hiện khả năng phát hiện được vai trò tương đôi của mỗi một phytocrom trong phản ứng đã cho. Thật vậy, đã tìm thấy rằng tương tự phyB, phyD giữ vai trò trong điều hoà sự dãn dài của cuông lá, cũng như trong thời gian ra hoa. Các phân tích tương tự đã ủng hộ ý tưởng rằng phyE tác động thêm (một cách không cần thiết) với phyB và phyD trong các quá trình dó, nhưng cũng tác động thêm (một cách không cần thiết) cùng với phyA và phyB trong sự ức chế quá trình dãn dài của lóng. 62 về các phytocrom của Arabidopsis, phyC được biết kém nhất. Tuy nhiên, dù rằng các thể đột biến bộ bôn phyAphyBphyDphyE thể hiện các phiín ứng bình thường đổì vối tỷ lệ ánh sáng đỏ: đỏ — xa vẫn có các khác biệt trong sự biếu hiện gen được phytocrom điều hoà. Như vậy, phyC, phyD và phyE thể hiện các vai trò đối với hầu hết phần thừa (không cần thiết) vói vai trò của phyA và phyB. Trong khi phyB thê hiện mối liên quan trong sự điều hoà tất cả các giai đoạn phát triên, các chức năng của các phytocrom khác bị hạn chế trong các phản ứng hoặc các bước phát triển đặc hiệu. d) Phytocrom diêu hoà sự nảy m ầm của m ô t sô'loài h a t Môi tương tác phytocrom có vai trò quan trọng trong thời gian đầu của sự nảy mầm. Các phyA và phyB hấp thụ tách biệt ánh sáng đỏ và đỏ - xa liên tục (hình 1.31). Anh sáng đỏ liên tục được phyB hấp thụ đã kích thích sự khử úa vàng (de-etiolation) bằng cách duy trì các mức cao của PírB. Ánh sáng đỏ xa liên tục được PfrB hấp thụ ngăn chặn sự kích thích ấy bằng cách giảm thiểu hàm lượng PfrB. Kích thích sự khử vàng úa bởi phyA phụ thuộc vào trạng thái quang tĩnh của phytocrom như dược chỉ rõ trên hình 1.31A bằng các mũi tên vòng. Ánh sáng đỏ xa liên tục kích thích sự khử úa vàng (de-etiolation) khi ánh sáng đỏ -xa đó được hệ thông phyA hấp thụ; ánh sáng đỏ liên tục ức chê phản ứng. A) . , . B) Chiếu sáng liên tục Ấ n h sáng A n h sáng Hình 1.31. C á c vai trò đ ố i n g h ịc h n h a u c ủ a p h y A v à p h y B (T heo Quail e t al., 1995). Các h iệu ứng của phyA và phyB đ ế n sự p h á t triể n củ a cây m ầm ỏ ngoài sáng ngược với bóng tôi dưới tán cây (nơi giàu ánh sáng đỏ - xa) như đã được chỉ ra trên hình 1.31B. Ớ ngoài nắng vốn giàu ánh 63 sáng đỏ so với bóng tối dưới tán cây, sự khử úa vàng được thực hiện trước hết bỏi hệ phyB (ở bên trái trong hình). Cây mầm nhú lên dưới tán che, nơi giàu ánh sáng đỏ - xa, khởi đầu sự khử úa vàng trước tiên qua hệ phyA (ở giữa hình 1.31B). Vì rằng phvA không bền, tuy nhiên, phản ứng diễn ra mạnh hơn phyB (bên phải). Khi có sự chuyển ưu thế vê' phyB, sinh trưởng của thân đã hết bị ức chế (hình 1.31B, cây ngoài cùng, bên phải), cho phép gia tăng tốc độ dãn dài của thân vốn là một phần của phản ứng tránh bị che bóng. e) Đặc trư ng p h ả n ứng đươc phytocrom điểu biến ở cây nguyên vẹn Sự đa dạng của các phản ứng phytocrom trong cây nguyên vẹn tự nhiên là rất lớn. Trong bảng 1.3 dẫn ra ba kiểu phản ứng và chất lượng ánh sáng cần đế gây ra phản ứng. Nghiên cứu sự đa dạng ấy sẽ cho thấy sự khác biệt đến mức nào trong các hiệu ứng của kiểu ánh sáng đơn giản — đó là sự hấp thụ ánh sáng bởi phytocrom dạng Pr vốn được thể hiện rõ khắp trong toàn bộ cơ thế thực vật. về mặt sinh học, có thể gộp các phản ứng do phytocrom điều biến thành hai nhóm: 1) Các sự kiện hoá sinh nhanh; 2) Những biến đổi hình thái chậm bao gồm sự vận động và sinh trưởng. Một số các phản ứng hoá sinh sớm tác động đối vối các phản ứng phát triển muộn về sau. Bản chất của các sự kiện hoá sinh ấy gồm có cả các con đường truyền tín hiệu mà sẽ được xem xét muộn hơn. Bây giò chúng ta tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của phytocrom đối với các phản ứng của cây nguyên vẹn. Các phản ứng ấy có thể được phân thành các kiểu khác nhau tuỳ thuộc vào sô’ lượng, thời gian đòi hỏi của ánh sáng và quang phổ hoạt động của chúng. - Các phản ứng đối với phytocrom biến động về thòi gian tiềm ẩn vthời gian thoát: Có thể thấy được các phản ứng phát sinh hình thái đối với sự quang hoạt hoá của phytocrom sau một thời gian tiềm ẩn, thời gian giữa sự kích thích và phản ứng quan sát được. Thời gian tiềm ẩn có thể ngắn chỉ trong khoảng vài phút hoặc dài đến vài tuần. Các phản ứng nhanh hơn trong chúng thường là các vận động thuận nghịch của các bào quan trong tế bào, hoặc những biến đổi thuận nghịch của thể tích (sự trương phồng, sự teo xẹp), nhưng thậm chí cũng có một sô’ các phản ứng sinh trưởng cũng nhanh khác thường. Sự ức chế bởi ánh sáng đỏ (red - light) đôi vối tốc độ dãn dài của thân cây rau muôi (Chenopodium album) đã quan trắc được trong thời 64 gian 8 phút sau mức gia tăng tương đôi của Pfr. Những nghiên cứu động hục sử dụng Arabidopsis đã khẳng định các quan trác đó và còn chỉ thêm rằng phyA hoạt động chỉ sau vài phút sau khi được phơi ra ánh sáng dỏ (Parks và Spalding, 1999). Trong các nghiên cứu ấy, sự tham gia khỏi đầu của phyA đã được phát hiện khoảng hơn 3 giò khi mà protein phyA dã không thể phát hiện dược lâu hơn bằng việc sử dụng kháng thế. còn sự tham gia của phyB tăng lên (Morgan và Smit, 1978). Đế cảm ứng ra hoa, thòi gian tiềm ẩn lâu hơn vài tuần. Thông tin về thời gian tiềm ẩn của phản ứng phytocrom đã giúp các nhà nghiên cứu đánh giá dược các kiểu phản ứng hoá sinh vốn đã diễn ra trước dó và ]à nguyên nhân gây ra phản ứng. f) Ca c h ế tê bào và p h ả n tử Tất cả các biến đổi được phytocrom điêu biến xảy ra trong cây bắt đầu từ khi sắc tô’ đó hấp thụ ánh sáng. Sau khi hấp thụ ánh sáng, các tính chất của phytocrom bị biến đổi hầu như chắc chắn gây nên các trình tự truyền tín hiệu trong đầu cuối -C để tương tác với một hoặc nhiều thành phần của con dường truyền tín hiệu mà cuối cùng dẫn tối nhủng bicn đôi trong sinh trưởng, phát triển hoặc vị trí của cơ quan (xem bảng 1.2). Một số những cơ sở chủ yếu truyền tín hiệu đã xuất hiện đế’ tương tác vâi các con đường truyền tín hiệu nhiều loại, những cơ sở khác xuất hiện là duy nhất dê tương tác vỏi một con đường đặc hiệu truyền tín hiệu. Hơn thế. điểu dó là hợp lý để chấp nhận rằng các protein phytocrom khác nhau sử dụng Lập hợp đa dạng các con đường truyền tín hiệu. Kỷ thuật hoá sịnh và sinh học phân tử đã giúp làm sáng tỏ các bước sốm trong tác động của phytocrom đến các con đường truyền tín hiệu vốn dăn dến các phản ứng sinh lý hoặc phát triến. Các phản ứng ấy gồm hai kiểu: 1) Các phản ứng sức trương tương đối nhanh liên quan đến dòng ion.. 2) Các quá trình chậm, thời gian dài gắn kết vối quang phát sinh hình thái liên quan đến sự biến đổi trong biểu hiện gen. Bây giờ chúng ta sẽ xem xét các hiệu ứng của phytocrom đối vói tính thấm của màng và sự biểu hiện gen cũng như chuỗi các sự kiện cấu thành các con đưòng truyền tín hiệu vôYi gây nên các hiệu ứng ấy. - Phytocrom điểu biến thế năng màng và dòng ion: Phytocrom có thể làm biến đổi nhanh các tính chất của màng. 5-GT...THỤCVẬT-A 65 Chúng ta đã biết rằng, ánh sáng đỏ vói cưòng độ thấp là cần thiết trước chu kỳ tối để gây nên sự đóng nhanh các lá chét trong hiện tượng cảm đêm (hiện tượng ngủ) và rằng các dòng K+ và c r đi ra và đi vào các tế bào động cơ lưng và động cơ bụng trong các đệm gối là trung gian của các phản ứng vận động ngủ (khép lá vào ban đêm). Tuy nhiên, sự nhanh chóng trong vận động khép lá ở trong tối vối thòi gian tiềm ẩn khoảng 5 phút đã bác bỏ cơ chế dựa trên sự biểu hiện gen. Thay vào đó, những biến đổi nhanh do phytocrom cảm ứng xảy ra chắc phải liên quan đến tính thấm của màng và sự vận chuyển qua màng. Trong thòi gian lá chét khép lại do phytocrom cảm ứng, pH gian bào của các tế bào động cơ lưng (các tế bào này căng phồng lên trong khi lá chét khép lại) giảm sút, trong khi đó pH gian bào của các tế bào động cơ bụng (các tế bào này xẹp xuống trong thòi gian các lá chét khép lại) tàng lên. Như vậy, bơm H+- ATPase màng sinh chất được bóng tôi hoạt hoá (lúc này phytocrom ở dạng hoạt tính Pfr hấp thụ ánh sáng đỏ - xa) và bơm H* trong các tế bào động cơ bụng xuất hiện để phản hoạt hoá trong cùng điểu kiện (hình 1.23). Đã quan trắc được hình mẫu của hiện tượng biến đổi thuận nghịch của độ pH gian bào trong thòi gian lá chét mở. Kim et al., (1993) cũng đã tiến hành các nghiên cứu về sự điều hoà phytocrom đối với các kênh vận chuyển K+ trong các tế bào trần (nguyên sinh chất) cách ly của các tế bào động cơ lưng và bụng từ các lá cây muồng ngủ (Samanea saman, Mimosa saman, Albizia). Khi nồng độ của K+ ngoại bào gia tăng, K* xâm nhập vào chất nguyên sinh và làm giảm thế năng màng chì khi các kênh K* mỏ. Khi nguyên sinh chất của các tê bào động cơ lưng và bụng được chuyển vào điều kiện tối ổn định, các tế bào trần đó thể hiện tính nhịp nội tại trong thài gian chu kỳ ngủ 21 giờ, và hai kiểu tế bào biến động thuận nghịch đúng như chúng đã hoạt động in vivo. Như vậy, khi các kênh K* của các tế bào động cơ lưng mở, thì các kênh K* của các tế bào động cơ bụng đóng và ngược lại. Vậy thì, theo Lincoln et al., (2006), nhịp nội tại của sự vận động của lá có nguồn gốc từ nhịp nội tại của sự mở kênh K+. Dựa trên cơ sở của các minh chứng chắc chắn như vậy, chúng ta có thể kết luận rằng, phytocrom gây nên Bự khép các lá chét bằng cách điểu hoà sự hoạt động của các bơm H* BƠ cấp (H+- ATPase màng sinh chất) và các kênh K+ trong các tế bào động cơ lưng và bụng. Mặc dầu hiệu ứng nhanh, nhưng nó không phải tức thì, do vậy đó không phải là hiệu ứng trực tiếp của phytocrom đối với màng. Thay vì, 66 6-QT...TMỰC V Ạ T -* phytocrom tác (lộng gián tiếp bằng một hoặc nhiều các con đường truyền tín hiệu, như trường hớp của sự điều hoà biểu hiện gen bỏi phytocrom. Tuy nhiên, một sô hiệu ứng của ánh sáng đỏ và đỏ — xa đôi với màng cũng nhanh do vậy phytocrom có thể tương tác trực tiếp với màng. Sự điều biến nhanh như thế đã quan trắc được trong một sô" tê bào riêng lẻ và các nhà khoa học đã suy luận vê các hiệu ứng của ánh sáng đỏ và dỏ xa đôi với thô năng bề mặt của rễ và của bao lá mầm cây yến mạch (Avena) khi thời gian tiềm ân giữa sự hình thành Pfr và loạt các biên đổi thê nâng màng là 4,5 giây để tăng mạnh sự phân cực. Sự biến đổi thế điện kép của tê bào dẫn đến những biến đổi các dòng ion qua màng sinh chất. Các nghiên cứu sự cách ly màng đã cung cấp minh chứng cho thấy một phần nhỏ của phytocrom tổng sô’ được gắn chặt vào các màng bào quan khác nhau. Những phát hiện đó đã dẫn một số các nhà nghiên cứu đi đến giả định rằng, phytocrom liên kết màng là một tiểu phần hoạt tính sinh lý và ràng tất cả những hiệu ứng của phytocrom lên sự biểu hiện gen được khởi đầu bơi những biến đổi trong tính thấm của màng. Tuy nhiên, trên cơ sỏ của các phân tích trình tự, bây giò đã rõ rằng, phytocrom là một protein ưa nước không có các miền xuyên qua màng. Quan niệm hiện tại là nó có thể liên kết trực tiếp vối các vi ông vốn được định vị trực tiếp phía dưới màng sinh chất, ít nhất là trong trường hợp của loài tảo, Mougeotia (đã thực nghiệm bức xạ các lục lap với các bện xoắn thành các búi nhỏ để định vị phytocrom trong loài tảo lục Mougeotia dạng sợi này). Nếu phytocrom gây ảnh hưởng đến màng từ một khoảng cách xa, không quan trọng là ít bao nhiêu, chắc có sự can dự của tín hiệu thứ hai và canxi là một ứng viên tốt. Với sự biến đổi nhanh hàm lượng Ca2+ trong xytosol, canxi tự do (Ca2t) có thế’ liên quan như là tín hiệu thứ hai Irong một vài con đường truyền tín hiệu. Đõ có bằng chứng vồ vai trò của canxi trong sự vận động của lục lạp ở loài tảo Mougeotia. - Phytocrom điều biến sự biểu hiện gen: Vì rằng chúng ta đang bàn chủ để về vai trò của phytocrom trong quang phát sinh hình thái (photomorphologenesis), vốn liên quan đến những biến đổi trong quá trình phát triển của thực vật dưới ảnh hưởng trực tiếp của ánh sáng. Cây mọc trong tối thể hiện các triệu chứng úa vàng như thân khẳng khiu, các lá nhỏ bé (ở thực vật Hai lá mẩm) và không có diệp lục. Một sô' các dấu hiệu do ánh sáng gây nên đó chỉ có thể xảy ra bởi những thay đổi trong sự biểu hiện gen. 67 Sự kích thích và ức chê quá trình phiên mã bđi ánh sáng có thế rất nhanh với thời gian tiềm ẩn chỉ trong 5 phút. Sự biểu hiện gen sớm như vậy dường như phải được sự biểu hiện gen do các tác nhân phiên mã hoạt hoá bởi một hoặc nhiều các con đường truyền tín hiệu do phytocrom khỏi động. Các tác nhân phiên mã sau đó xâm nhập vào nhân, nơi chúng kích thích sự phiên mã các gen đặc hiệu. Một sô" trong các sản phẩm của gen sớm đó tự thân chúng là các tác nhân phiên mã, vốn kích hoạt sự biểu hiện của các gen khác. Sự biểu hiện các gen sớm, vổn cũng được gọi là các gen phản ứng sơ cấp, những gen sớm này không phụ thuộc vào sự tổng hợp protein. Sự biểu hiện của các gen muộn, cũng được gọi là các gen phản ứng thứ cấp, đòi hỏi phải có sự tổng hợp protein mới. Quang điều biến sự biểu hiện gen liên kết trên các gen nhân vốn mã hoá các mARN cho sinh tổng hợp protein lục lạp: những đơn phân bé của ribulose—1,6-diphosphatcacboxylase /oxygenase (rubisco) và các protein liên kết diệp lục a/b hấp thụ ánh sáng hợp thành một phức hệ lớn được gắn vối phức hệ hấp thụ ánh sáng của PSII (các protein LHCIIb). Các protein ấy có vai trò quan trọng trong sự phát triển của lục lạp và lục hoáv Phytocrom có vai trò điều biến quan trọng trong sự biểu hiện gen hình thành các protein vừa nêu và đã được righiên cứu chi tiết. Các gen mã hoá cả hai protein ấy là RBCS và LHCB (còn được gọi là CAB trong một sô' tài liệu) hiện diện ở dạng các bản sao đa hình (multiple copies) trong bộ gen (genome). Các nhà nghiên cứu đã có thể minh hoạ sự điều biến phytocrom đôi vối sự dư thừa mARN (có nghĩa là các RBCS mARN) bằng thực nghiệm chiếu một loé ngắn cường độ yếu sáng đỏ hoặc đỏ — xa lên cây úa vàng để gợi lại bóng tối đổi vối chúng nhằm cho phép thực hiện con đường tru y ề n tín h iộu, rồ i a a u đó xốc đ ịn h m ức độ dư th ừ a c ủ a m A R N đ ặc hiộu trong tổng số mARN đã được chuẩn bị từ mỗi nhóm cây. Nếu sự dư thừa mARN đó được phytocrom điều biến, thì mARN thiếu vắng hoặc hiện diện ở mức thấp trong các cây úa vàng nhưng nó tăng lên khi được chiếu ánh sáng đỏ. Sự gia tăng trong biểu hiện gen có thể là thuận nghịch bởi sự xử lý ngay tức khắc bằng ánh sáng đỏ - xạ, nhưng ánh sáng đỏ - xa một mình có hiệu ứng rất thấp đối với sự dư thừa mARN. Sự biểu hiện của;một số các gen khác cũng chịu ảnh hưởng dưới các điều kiện ấy. Ánh sáng đỏ vừa mới kích thích hạt rau diếp (Latuca) nảy mầm đã tương quan với sự gia tăng dạng hoạt tính sinh học của hormon gibberellin. 68 Anh sáng đỏ đã gây nên sự gia tăng mạnh trong sự biểu hiện gen mã hoá enzym chìa khoá trong con đường sinh tổng hợp gibberellin (Toyomasu et al., 1998). Hiệu ứng của ánh sáng đỏ thuận nghịch với ánh sáng đỏ — xa là chỉ báo của phytocrom. Vì rằng gibberellin có thế thay thế ánh sáng đỏ trong sự kích thích hạt rau diếp nảy mầm. Điều đó rõ là phytocrom khởi động sự nảy mầm bằng cách gia tăng sinh tổng hợp hormon gibberellin mà sẽ được nghiên cứu tỷ mỷ trong chương 3. - Phytocrom phôi hợp cùng nhịp nội tại (đồng hồ sinh học) điều hoLHCB. Tác nhân phiên mã liên quan MYB (gen sản sinh ra protein điều hoà) với mức mARN của chúng tăng nhanh khi Arabidopsis được chuyển từ trong tối ra ngoài sáng liên quan đến sự biểu hiện của các gen LHCB được phylocrom làm trung gian (hình 1.32). Tác nhân phiên mã ấy dường như gắn vào miền khởi đầu của các gen LHCB xác định và điểu hoà sự phiên mã của chúng vốn như hình 1.32 chỉ rõ, xảy ra muộn hơn so với sự gia tăng của protein liên quan - MYB (Wang et al., 1997). Gen mã hoá protein liên quan - M YB, do vậy, chắc phải là gen phản ứng sơ cấp và gen LHCB chắc phải là gen phản ứng thứ cấp. H inh 1.32. Thời g ian đ ể cảm ứ n g s ự p h iê n m ã C ác dộng học c ủ a s ự c ảm ứng nên c á c bản phiên mã đối vâi tá c n h â n p h iên m ã liên q u an - M YB và protein liên kết - diệp lục a/b thu ánh sáng (LHCB) trong Arabidopsis s a u khi chuyển cây non từ tron g tối ra án h sáng trắng liên tục (Theo W ang el al., 1997). Công trìn h nghiên cứu mới đây đã cho thấy rằng, protein liên quan — MYB, bây giờ được biết như là đồng hồ sinh học (nhịp ngày đêm) liên kết 1 (circadian clock ạssosiated 1-CCAl), cũng có vai trò trong sự điều hoà nhịp ngày đêm của sự biểu hiện gen LHCB. Gen liên quan — MYB thứ hai, nhưng khác biệt, trụ dưới lá mầm được kéo dài muộn (LH Y được gọi từ tập hợp từ late elongated hypocọtyl) cũng đã được định rõ 69 như là một gen đồng hồ tiềm năng (potential clock gene). Sự biểu hiện của CCA\ và LH Y dao động theo nhịp ngày đêm. Sự biểu hiện cơ định của CCA 1 loại bỏ một sô" nhịp ngày đêm và ngăn cản sự biểu hiện của cả hai gen CCA 1 và LHY. Khi CCA 1 bị đột biến do đó sản sinh ra gen không hoạt động. Nhịp ngày đêm và sự điểu hoà phytocrom của cả bốn gen bao gồm LHCB bị ảnh hưởng. Những quan sát ấy giả định rằng CCA\ và LH Y liên kết với đồng hồ sinh học (circadian clock). Protein kinase (CK2) có thể tương tác với CCA1 và phosphoryl hoá nó. Protein kinase là protein nhiều đơn phân với hoạt tính kinase serin/treonin. Đơn phân điều hoà của CK2 được gọi là CKB3. Đã phát hiện rằng, CKB3 tương tác với CCA1 và phosphoryl hoá nó ở in vivo. Các đột biến trong CKB3 làm rối loạn hoạt tính của CK2, và đến lượt làm biến đổi chu kỳ của sự biểu hiện theo nhịp ngày đêm của CCAl. Các đột biến ấy tác động nhiều đến đầu ra của đồng hồ từ sự biểu hiện gen đến thời gian ra hoa. Điều đó đưa đến giả thiết rằng CK2 liên quan đến sự điểu khiển đồng hồ sinh học bằng con đường tương tác với CCA1 (Cygano et al., 1999). — Dao động tử (oscilator) ngày đêm liên quan với vòng phản hồi âphiên mã: Ngày nay các dao động tử ngày đêm (circadian oscilators) ỏ Cyanobacteria (Synechococus), nấm (Neurospora crasa), chuột (Mus musculus) đã được sáng tỏ. Trong các sinh vật ấy, dao động tử ngày đêm bao gồm một sô' các "gen đồng hồ" liên quan vối vòng phản hồi âm dịch mã - phiên mã. Cho đến nay, ba gen đồng hồ lớn đã được định rõ trong Arabidopsis: TOC1, LH Y và CCA1. Tất cả các sản phẩm protein của ba gen ấy là các protein điều hoà. TOC1 không liên quan đến các gen đồng hồ của các cơ thể khác, giả thiết ràng dó là dao dộng tử Ihực vật Uuy nhất. Theo mồ hình mới đây (Alabadi et al., 2001), ánh sáng và protein điều hoà TOC1 hoạt hoá sự biểu hiện gen LHY và CCA1 vào lúc rạng đông (hình 1.33). Sự gia tăng LH Y và CCA1 ức chế sự biểu hiện của gen TOC1. Vì TOC1 là chất điều hoà dương tính của các gen LH Y và CCA1, sự ức chế sự biểu kiộn của TOC1 làm giảm liên tục nồng |’Ộ của LHY và CCA1, vốn đạt liến các mức cực đại vào cuối ngày. Do có sự giảm sút về mức của LHY và CCA1, sự biểu hiện gen của TOC1 được giải phóng khỏi sự ức chế. TOCl đạt đến cực đại vào thời điếm cuối ngày khi LHY và CCA1 ở mức tối thiếu. Sau đó TOCl hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp kích thích sự biểu hiện của LH Y và CCA1, rồi chu kỳ bắt đầu trỏ lại. 70 4. Giảm liên tục mức biểu hiện của CCA1 và LHY ban ngáy cho phép gia tăng mức phiên mã và đạt mức cưc đại đến cuối ngày 3. CCA1 và LHY ức chẽ TOC1 và các gen ban chiều khác 5. TOC1 gia tăng sự biểu hiện của LHY và CCA1 vốn dạt các mức cực đại vào lúc rạng đỏng, bắt đầu chu kỳ mâi 1. Ánh sáng hoạt hoá sự biểu hiện i-HYvà CCA1 vào lúc rạng đồng. Ánh sảng 2. LHYsià CCA1 hoạt hoá sự biểu hiện của LHCB và các gen ban sáng khác Hinh 1.33. Mô hình dao dộng tử (oscilator) ngày đêm ch ỉ cho thấy các mối tương tác giữa cac gen TOC1 và MYB L H Y và CCA1 Ánh sá n g tác độn g tại phía dưới gia tăng s ự biểu hiện LH Y và CCA1. LH Y và CCA1 hoạt dộng đê’ điểu hoà c á c g en ban ngày và các gen buổi ch iều khác. (T heo Lincoln et al., 2006). Hai protein điều hoà MYB — LHY và CCAl — có chức năng kép. Ngoài vai trò như là các thành phần của dao động tử, chúng điều hoà sự biểu hiện của các gen khác, chẳng hạn như LHCB và các gen ban sáng khác, và chúng ức chế sự biểu hiện gen vào ban chiểu. Ánh sáng tác động củng cô’ hiệu ứng của gen TOC1 trong khởi động sự biểu hiện gen LH Y và CCA1. Sự củng cố đó làm nổi lên cơ chế của sự lôi kéo. Các protein khác, chẳng hạn như kinase CK2, tác động lên hoạt tính của CCA1 và bằng cách đó nó điều hoà đồng hồ. Phytocrom và các quang thụ thê ánh sáng xanh CRY2 làm trung gian của các hiệu ứng ánh sáng xanh và đỏ tương ứng. - Các trình tự điều hoà kiểm tra sự phiên mã được ánh sáng điều khiển: Đã nghiên cứu khá nhiều các trình tự điều hoà dạng cis cần để so sánh sự ảnh hưỏng của ánh sáng đôi với sự biểu hiện gen. Hầu hết các miền khỏi đầu trong cơ thể có nhân đối với các gen mã hoá các protein bao gồm hai vùng chức năng khác biệt: trình tự ngắn xác định vị trí khởi đầu phiên mã (các hộp TATA, được gọi theo mức phong phú nucleotit của nó) và các trình tự ngược dòng (upstream), được gọi là các thành tô” điều hoà dạng cis, các trình tự này điểu hoà sô' lượng và hình mẫu phiên mã. Các trình tự điều hoà ấy gắn các protein đặc hiệu được gọi là các tác 71 nhân dạng trans. Các tác nhân này điều biến hoạt tính của các tác nhân phiên mã chung vốn tập hợp quanh vị trí khởi động phiên mã với ARN polvmerase II. Nhìn chung, bức tranh đốì vói các miền khởi đầu ở thực vật được ánh sáng điểu hoà là tương tự đôi với gen ỏ các cơ thể có nhân khác: bộ sưu tập về các thành tô’ điều biến, sô’ lượng, vị trí và các trình tự bên và những hoạt hoá liên kết của chúng có thể dẫn tới giới hạn rộng của các hình mẫu phiên mã. Không phải trình tự ADN giản đơn hoặc protein liên kết là chung đối vói tất cả các gen được protein điều hoà. Trưốc tiên, có thể xuất hiện một nghịch lý rằng, các gen được ánh sáng điểu hoà lại có phạm vi các thành phần như vậy, bất kỳ sự phổi hợp nào của chúng đều có thể thảo luận về sự biểu hiện gen do ánh sáng điều hoà. Tuy nhiên, sự phô bày như vậy của các trình tự tạo thuận lợi cho sự điều hoà đặc hiệu mô và đặc hiệu ánh sáng khác biệt của nhiều gen thông qua hoạt động của nhiều chất nhận ánh sáng. Các tác nhân điều hoà: Như có thể dự đoán trưốc rằng, giới hạn khác biệt của các trình tự điều hoà phytocrom có thể gắn kết một sự đa dạng lớn của các tác nhân phiên mã. ít nhất đã có 50 tác nhân phiên mã như vậy đã được định rõ mới đây nhò sử dụng các sàng lọc phân tử và di truyền (Tepperman et al., 2001). Theo Hoecker và Quail (2001), SPA1 là trung gian truyền tín hiệu đặc hiệu phyA vốn hoạt dộng như chất ức chế của quang phát sinh hình thái trong cây non Arabidopsis. Các protein SPA1 có miền protein xoắn thành ông giúp cho nó tương tác vói tác nhân khác, COP1 (quang phát sinh hình thái cấu trúc 1). Tác nhân này hoạt động xuôi dòng đối với cả phyA và phyB. Protein COP1 này đã được định rõ trong sự sàng lọc đôi với các thể đột biến quang phát sinh hình thái cấu trúc vôn đã thu được một sô' tác n h â n lchác h o ạ t động xuOi dòng của các c h ấ t n h ậ n á n h sá n g (các gen loại bó quang phát sinh hình thái). COP1 là E3 ubiquitin ligase nhằm vào các protein khác để phân huỷ bỏi proteosom 26S (Theo Lincol et al., 2006). — Phytocrom di chuyển vào nhân: Như đã nói ở trên, phytocrom điều hoà sự biểu hiện gen ở giai đoạn phiên mã, nhưng ỏ cơ thể eukaryota, gen ở trong nhân. Đồng thời ta cũng biết rằng phytocrom hiện diện trong xytosol. Vậy bằng cách nào để phytocrom hiện diện ở trong nhân? Trong một thời gian dài, điều đó đã là một bí ẩn. Công trình đầy phấn khích mởi đây đã giúp mơ hộp đen giũa sự biểu hiện gen và phytocrom. Sự phát hiện gây ngạc nhiên nhất 72 là trong một sô trường hợp, phytocrom tự nó di chuyển vào nhân theo cách phụ thuộc ánh sáng, sở dĩ theo dõi dược sự vận động đó là nhò khả năng gắn phytocrom với chất đánh dấu thấy được, protein huỳnh quang ánh sáng lục (GFP), vôn có thế’ bị hoạt hoá bởi ánh sáng của bước sóng tương ứng đã được chỉ ra trong tế bào thực vật. Một lợi thê lón của sự gắn kết GFP là có thể nhìn thấy được chúng trong các tê bào sống làm cho nó trở nôn thấy được trong các quá trình động thái tiếp theo bên trong các tố bào sông dưới kính hiển vi. Hình 1.34. C á c protein gắn p h y - G F P định c ư nhân trong c á c tế b ào biểu bi củ a trụ duứi lá m ẩm cây Arabidopsis. A rab id opsiss biểu hiện phyA - G FP (trái) h o ặ c phyB - G F P (phải) d ã q u an sá t được dưới kính hiển vi huỳnh q u ang. Chỉ thấy được nhân. C ây được ch u y ển vào điều kiện h o ậ c ánh sá n g đ ỏ - xa liên tục (trái) ho ặc ánh sá n g trắng (phải) đ ể cảm ứng n ên s ự tích tụ trong nhân. C á c điểm m àu lục sá n g bên Irong nhân được gọi là "các đốm ". Ý nghĩa c ủ a .c á c đốm lá chư a rõ (Y am aguchi et al., 1999; từ Lincoln et al., 2006). Cả hai phyA — GFP và phyB - GFP chi’ ra sự di chuyển vào nhân được ánh sáng hoạt hoá (hình 1.34) (Sukamoto và Nagatami, 1996; Sharma, 2001). Liên kết phyB chuyển động vào nhân chỉ ở dạng Pfr, vận chuyển chậm và phải mất vài giờ đê’ động viên hoàn toàn. Ngược lại phyA có thể di chuyển ở dạng Pfr hoặc dạng Pr, điều đó cung câp thông tin rằng, nó tuần hoàn qua Pfr đầu tiên. Sự vận động của phyA nhanh hơn nhiều so với phyB và chỉ mất khoảng 15 phút. Hài lòng nhất là quan sát thấy rằng sự vận chuyên của phyB — GFP được khởi dộng bởi ánh sáng đỏ và bị ức chế bởi ánh sáng đỏ — xa. Trong khi đó sự vận động của phyA — GFP đạt cực đại dưới ánh sáng đỏ — xa liên tục. Hơn th ế nữa, sự chuyển dịch vào nhân của phyB chịu sự điều khiển của nhịp ngày đêm. Như dự đoán, vì phyB điều hoà sự biểu hiện các gen đồng hồ (nhịp ngày đêm), các điều kiện ấy là những thứ đã biết 73 phải là chịu trách nhiệm đôi với sự hoạt hoá phyA và phyB và sẽ phải tương ứng với hoạt tính của chúng ở trong nhân. Điều gì sẽ xảy ra khi Pfr chuyển vào nhân? Hai protein nhân vốn tương tác với phytocrom đã được nhận biết, mặc dầu ở đấy chắc phải có các đích bổ sung. Thứ nhất là tác nhân tương tác phytocrom 3 (PIF3), phản ứng vói đầu cuối -C của phyA hoặc phyB. Tuy nhiên nó ưu tiên tương tác vối protein phyB dài đầy đủ theo cách phụ thuộc árh sáng và dường như nó phải là chất kèm phản ứng chức năng sơ cấp đốĩ với phytocrom ấy. Mặc dầu chức năng chính xác của nó còn chưa biết, PIF3 tương tự như là tác nhân phiên mã gắn vào thành phần đặc biệt trong miền khởi đầu trong tế bào thực vật. Hộp G linh động tạo thuận lợi cho sự điều biến ánh sáng đôì với các gen. Cũng đã biết rằng, phyB ở dạngPír có thể tạo phức với PIF3 gắn kết vào ADN đích của nó. Do đó xuất hiện hình ánh trong đó một số gen phytocrom được hoạt hoá trực tiếp bởi sự vận động của phyB vào nhân dưói dạng Pfr. Một khi đã ở trong m ân, phyB tương tác với các tác nhân phiên mã như PIF3. Trên hình 1.35 là mô hình hoạt hoá trực tiếp sự biểu hiện gen bởi phyB trong nhân. 1. phyB được tổng hợp trong té' bào chất ở dạng hoạt tinh PrB 2. Khi đưọc chuyển thành dạng hoạt tinh PfrB bài ánh sảng đo, nó di chuyển vào nhản 3. PfrB liên kết vào nhị phân cùa tác nhân phiên mã PIF3, vốn được gán vào các thành phẩn hộp G của miền khỏi đẩu cùa gen MYB 4. Thèm phía trén của phức hệ tiến khởi dầu (PIC), phiên mã của các gen MYB gom CCA1 và LHY. đươc hoạt hoá 5. Các tác nhân piiôn mả MYB đến lượt hoạt hoá SJ phiỗn mã của các geri khác fhứ LHCB Hinh 1.35. Điểu hoà trực tiếp sự biểu hiện gen bởi sự vặn chuyển phyE tới nhàn (T heo Quail, 2000). Như đã nói ở trên, sau khi đã tổng quan các hệ điều hoà thác trong cơ thể thực vật đa bào, chúng ta đi sâu nghiên cứu hệ điều h)à hormon (các chất điều hoà sinh trưỏng) thực vật. 74 1.3.4. Điều hoà hormon Mổì tương tác giữa các tê bào, mô và cơ quan của cơ thể thực vật được phối hợp nhịp nhàng nhờ sự hoạt động của các hormon thực vật (phytohormon). Chúng là những chất với hàm lượng rất ít, được hình thành tại một nơi, cần cho sự khởi động và điều biến các chương trình sinh lý và phát sinh hình thái, tại một nơi khác cách xa nơi chúng được sinh ra, của cơ thể thực vật. Phytohormon không chỉ tham gia điều hoà các quá trình sinh trưỏng mà còn có vai trò quan trọng trong sự điều hoà quá trình chín, già, thích nghi đôi với môi trường sông, vận chuyển vật chất và trong nhiều quá trình hoạt động sông khác. Chúng ta sẽ xem xét sâu và chi tiết các phytohormon từ chương 2 đến chương 7. 75 Chương 2 AUXIN 2.1. LƯỢC SỬ PHÁT MINH AUXIN Năm 1880, Charles Darwin và con trai, Francis Darwin, dã tiến hành một số thực nghiệm đốỉ với cây mạ cây yến mạch (A v e n a thuộc họ Lúa (Poaceae) về hiện tượng hướng quang và đã phát hiện một hormon thực vật quan trọng. Họ đã thấy rằng, các cây mầm (bao lá mầm) của cây yến mạch hướng vể nguồn sáng chỉ khi còn đỉnh. Trên hình 2.1, năm cây mầm đầu tiên là thí nghiệm của Darwin dẫn đến kết luận là đỉnh cây mầm (bao lá mầm) là nơi tiếp nhận ánh sáng. Darwin cũng nhận thấy phản ứng sinh trưởng gây ra sự uốn cong bao lá mầm về phía ánh sáng thực sự xảy ra phía dưối đỉnh. Bởi vậy, Darwin suy đoán có tín hiệu nào đó đã được truyền từ đỉnh bao lá mầm xuống phía dưối đến miền sinh trưởng của cây mầm. Nàm 1881, Charles Darwin đã công bô" bằng chứng thực nghiệm đầu tiên vê sự tồn tại của tín hiệu gây nên sự vận động sinh trưởng cua thực vật trong sách của ông The Power of Movemoents in Plants. Năm 1913. nhà thực vật học Đan Mạch Peter Boysen — Jensen tiếp tục thử nghiệm ý tương về tín hiệu hoá học của Darwin: hai cây cuối trên hình 2.1 minh hoạ những phát hiện của Boyen — Jensen. Ong đã đặt một mẩu gelatin vào giữa đỉnh và phần dưối của bao lá mầm làm ngăn cách sự tiếp xúc tế bào ở hai phần của cây mầm nhưng cho các hoá chất khuếch tán qua. Bao lá mầm vối mẩu gelatin vẫn uôn cong bình thường về phía ánh sáng (cây sô" 7 trên hình 2.1). H ình 2.1. N h ữ n g th ự c n g h iệ m kinh đ iể n (só m ) về h ư ớ n g q u a n g 1. Nguổn sán g ; 2. C ây đối chứng; 3. C ây bị c ắ t đỉnh; 4. Đỉnh cây chụp mũ c h ắ n sá n g ; 5. Đỉnh cây chụp mũ trong suốt; 6. G ốc cây được b ao phủ bằn g vòng ch ắn sá n g ; 7. Đinh cây bị cách ly bởi khối gelatin; 8. Đỉnh cây bị cách ly bởi phiến mica. 76 Trong nhóm cây thứ hai, Boyen - Jensen cài một mảnh mica vào phía dưới đỉnh bao lá mầm. Mica là vật cản không thấm nước và cây mầm có mảnh mica không có phản ứng hướng quang (cây số 8 trên hình 2.1). Những thực nghiệm đó đã ủng hộ ý niệm của Darwin rằng tín hiệu gây ra sự uốn cong hướng quang là một hoá chất di động. Năm 1919, Paál cung cấp bằng chứng rằng sự kích thích khởi động sinh trướng được sản ra trong đỉnh bao lá mầm có bản chất của tín hiệu hoá học (hình 2.3). Trong năm 1926, nhà thực vật học Hà Lan Fritz W ent đã biến đổi kỹ thuật của Boysen - Jensen và đã phát hiện được sứ giả hoá học của hiện tượng hướng quang. Went đã cắt các đỉnh bao lá mầm và đặt chúng lên mấu thạch (agar) như minh hoạ trên hình 2.2. Ong suy luận rằng, sứ giả (tín hiệu) hoá học từ đỉnh bao lá mầm phải khuếch tán vào mẩu agar và mẩu thạch dó chắc phải thay thê được cho đỉnh cây mầm. Went dã thử nghiệm hiệu ứng cua mẩu agar lên các cây mầm m ất đỉnh, rồi đặt các câv m ất đỉnh với mẩu agar đó vào buồng tối để loại bỏ ảnh hưâng của ánlh sáng Mặt Trời nhằm thử nghiệm riêng về hoá chất. Đầu Liên, ông đặt mẩu agar đã xử lý lên các bao lá mầm đã bị cắt đỉnh. Những cây mầm này mọc thắng, trong lúc đó các bao lá mầm cắt đỉnh đổí chứng hoàn toàn không sinh trưởng. Went đã kết luận: mẩu agar đã hấp thụ tín hiệu họá học được sinh ra trong đỉnh cây mầm và di chuyển xuống dưới kích thích cây mầm sinh trưởng. Tiếp theo, Went đặt mẩu âgar lên mặt cắt của bao lá mầm khác, lần này mẩu agar được đặt chệch về một phía trên mặt cắt bao lá mầm. Nhận thấy rằng, bao lá mầm vẵn sinh trưởng uốn cong về phía có phần mặt cắt không có mẩu agar (cây mầm bị cắt đỉnh số 6, 7 trên hình 2.2). H ình 2.2. T hực n g h iệm c ủ a W e n t 1. Cảy m ầm (bao lá m ầm ) yến m ạch (Avena), 2. Đình cây m ầm đ ạ t trẽn khối th ạch (agar); 3. Cây m ầm bị cắit đỉnh (đối chứng); 4 Đình bao lá m ầm được đ ạ t lên khối a g a r h o á chất (AIA) khuếch tán từ đình bao lá m ầm vào agar; 5. Mẩu a g a r d ã ch ứ a h o á ch ất kích thích (AIA); 6, 7 C ác rm ẩu a g a r chứa hoá chất kích thích sinh trưởng uốn cong; 8, 9. C ác m ẩu a g a r không chứa hioá chất không gãy ra hiệu ứng sinh trưởng. 77 Went kết luận rằng, bao lá mầm sinh trưởng uổn cong về phía chiếu sáng là do nồng độ cao của tín hiệu hoá học ở phía tôi của cành (bao lá mầm). Went đã gọi tín hiệu hoá học đó là auxin (từ tiếng Hylạp: auxein có nghĩa là tăng lên). Công trình của Went đã làm dấy lên những nghiên cứu về các chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Những thực nghiệm tiếp theo đã chứng minh rằng, đỉnh của cành đang sinh trưởng tiết ra auxin bằng nhau ở trong tôi hoặc ngoài sáng. Khi cành được chiếu sáng từ một phía, auxin khuếch tán từ phía sáng vào phía tối của cành và kích thích tê bào ở đấy sinh trưởng. Trong lúc đó tôc độ sinh trưỏng của các tê bào ở phía sáng có thể bị giảm sút do nồng độ auxin giảm. Năm 1935, nhà hoá học ngưòi Hà Lan Kogl đã xác lập được sự giông nhau y hệt giữa giữa auxin do Went tìm ra và phân tử hữu cơ bé nhỏ được các tế bào thực vật sản ra từ axit amin tryptophan, đó là axit indol-3-axetic (AIA) như trên hình 2.6. Có thể tóm tắt các thực nghiệm sớm vê nghiên cứu auxin như trên hình 2.3. Nhờ công sức của nhiều nhà khoa học (Thiman, 1935; Hagev Smith 1942, 1946,...) đã khẳng định AIA (tiếng Anh là IAA) là auxin chủ yếu, quan trọng nhất ở thực vật bậc cao cũng như bậc thấp. 2.2. PHÂN BỐ, SINH TổNG HỢP, DẠNG TỒN TẠI, PHÂN GIẢI VÀ VẬN CHUYỂN Auxin phân bô' rộng rãi từ vi khuẩn đến thực vật bậc cao. 2.2.1. Phân bô' Ở thực vật bậc cao, AIA tập trung nhiều trong các chồi, lá đang sinh trưởng, trong tầng phát sinh, trong hạt đang lốn, trong phấn hoa. 2.2.2. Sinh tổng hợp 2.2.2.1. Vị trí tổng hợp auxin (AIA) trong cây Các mô phân sinh, lá non, quả và hạt đang phát triển là nơi tổng hợp AIA trong cây. AIA được tổng hợp trong đỉnh sinh trưởng của thân, cành. Hình 2.3 cho thấy, bao lá mầm nhạy cảm đô'i với ánh sáng, đặc blột là ánh sáng xanh (blue - light). Nếu được chiếu bởi xung ngắn ánh sáng xanh lò mò tại một phía, các bao lá mầm sẽ uốn cong về phía nguồn sáng trong một giờ. Darwin đã phát hiện rằng đỉnh bao lá mầm tiếp nhận ánh sáng, 78 nhưng sự uốn cong diễn ra ỏ phía dưới, gọi là miền sinh trưởng, ỏ cách đỉnh vài milimet về phía dưới. Tứ câc thực nghiệm vé hướng sáng của bao lá Cây yến mạch P 4 ngày t u ổ i ------- Bao lả mãm _ DARWIN (1880) Ánh sáng măm. Darwin (1880) dẳ két luặn rằng sự kích thích sinh truớng được sinh ra trong đính bao lá mấm vâ được truyén đễn mién sính tnràng. Cây nguyên vẹn (uốn cong) BOYSEN- JENSEN (1913) A Phiến mica được xen Đỉnh bao lá mám Đặt mũ mờ đục bị loại bỏ (không lên đỉnh (không uổn cong) uón cong) 0 Năm 1913, p. Boysen - Jensen phât hiện rằng kích thích sinh trvởng thám qua gelatin nhưng khống qua được các vặĩ chắn không thắm nước như mica. / vao phía tói (không uÁn cong) Phién mìca dược cắt bò dinh Gelatin giữa vẵn uốn cong xen váo phía đinh vé thân hướng sáng dương sáng (uốn cong) PAÁL (1919) < 2 Cắt bỏ dinh WENT (1926) c»c đinh bao lá mắm trên gelatin Cl Đình duợc dặt lên Uốn cong sinh truởng một phía cùa thân không có klch thich cùa bao IỂI m ỉm ành sáng từ một phía r Loẹi bỏ céc đỉnh bao lá Đặt mỗi khối gelatin mám; cắt tắm gelatin thành lên một phla của thân các khíi nhỏ bao lá mám 20 1S ? 10 Nâm 1919, A. Paàl