🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Dược liệu học - tập 1 Ebooks Nhóm Zalo ĨRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH ĐỎ KHOAY-DƯỢC Dược • • • LIỆU HỌC Tập 1 SÁCH DÙNG CHO DẢo' TẠO Dược SỸ ĐẠI HỌC LƯU HÀNH NỘI BỤ TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH ĐÔ KHOA Y - DƯỢC Dược LIỆU HỌC • • • TẬP I DÙNG CHO ĐÀO TẠO Dược SỸ ĐẠI HỌC LƯU HÀNH NỘI Bộ MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU.....................................................................................................3 LỜI NÓI ĐẦ U........................................................ ..................................................5 CHƯƠNG 1. ĐẠI CƯƠNG VỀ D ược LIỆU................................................ 21 ĐỊNH NGHĨA MÔN HỌC.......................................................................................21 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN MÔN D ư ợ c LIỆU........................................................22 I. Một số nền y dược học thòi cổ đ ạ i.......................................................................23 II. Sự hình thành và phát triển của được học phương tây ...............................26 III. Lịch sử phát triển của dược học Việt N am .....................................................28 VỊ TRÍ CỦA DƯỢC LIỆU TRONG NGÀNH Y TẾ VÀ TRONG NỀN KINH TỀ q u ố c Dâ n ............. ...........................................................................................32 THU HÁI - CHẾ BIẾN VÀ BẢO QƯẢN D ư ợ c L IỆ U .......................................34 I. Thu hái dược liệ u .................................................................................................. 34 II. Ổn định dược liệu.................................................................................................36 III. Làm khô dược liệu................................................................................... ........ 37 IV. Đóng gói và bảo quản dược liệu.........................................................................39 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ DƯỢC LIỆU.................................................41 I. Cảm quan............................................................................................................... 41 II. Phương pháp soi kính hiển vi.............................................................................41 III. Phương pháp dựa vào các tính chất vật lý ..................................................... 41 IV. Thử tinh khiết........................................... .........................................................42 V. Phương pháp hoá học...........................................................................................44 VI. Phương pháp phổ học.........................................................................................44 1. Phổ tử ngoại và khả kiến................................................................................. 45 2. Phổ hồng ngoại................................................................................................. 46 3. Phổ khối lượng........................................................................ ..........................46 4. Phổ cộng hưỏng từ hạt n h ân ...........................................................................51 5. Các loại phổ khác.............................................................................................. 53 VII. Phương pháp sắc k ý .......................................................................................... 54 1. Sắc ký giây.................................................................................... ................... 57 2- Sắc ký lớp mỏng.................................................................................................58 3. Sắc ký lỏng cao á p ............................................................................................60 4. Sắc ký k h í....................................................................................................... 63 5. Điện di mao q u ản ...........................................................................................66 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ Dược LIỆU...........................69 I. Chiết xuất.............................................................................................................69 II. Phân lập các hoạt chất..................................................................................... 74 1. Kết tinh phân đoạn.........................................................................................74 2. Tách phân đoạn..............................................................................................74 3. Thăng hoa........................................................................................................75 4. Chưng cất phân đoạn.....................................................................................75 5. Các phướng pháp sắc ký......................................................................... .....75 5.1. Sắc ký cộ t................................................................................................. 75 5.2. Sắc ký lỏng áp suất trung b ìn h............................................................. 76 5.3. Sắc ký phân bô" ngược dòng.....................................................................77 CHƯƠNG 2. CARBOHYDRAT VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA CARBOHYDRAT ..................................................................... ........................................................... 80 ĐẠI CƯƠNG VỀ CARBOHYDRAT......................................................................80 I. Định nghĩa............................................................................................................80 II. Tinh bột............................................................... ............................................... 82 1. Cấu trúc hóa học của tinh bột.......................................................................82 1.1. Amylose.................................................................................................... 82 1.2. Amylopectin............................................................................................. 83 2. Sinh tổng hợp tinh bột....................................................................................84 3. Tính chất của tinh bột....................................................................................85 4. Chế tinh bột.....................................................................................................89 5. Định tính và định lượng.................................................................................90 6. Công dụng........................................................................................................ 91 III. Cellulose..........................................................................................................92 1. Cấu tạo............................................................................................................. 92 2. Các dẫn chất cellulose và công dụng............................................................ 93 IV. Pectin - gôm - chất nhầy.................................................................................95 1. Pectin............................................................................................................. 95 1.1. Cấu tạo....................................................................................................95 1.2. Tính chất của pectin................................... ..........................................97 1.3. Định tính - định lương.........................................................................98 1.4. Công dụng.................................................................................................. 99 2. Gôm - chất n h ầ y ................................................................................................ 99 2.1. Nguồn gốc và vai trò sinh lý của gôm và chất n h ầy ............................ 99 2.2. Tính ch ất................................................................................................ 102 2.3. Đánh giá một dược liệu chứa gôm hoặc chấVnhầy........................... 102 2.4. Công dụng..............................................................................................103 V. Các polysaccharid khác......................................................................................104 1. Beta glucan......................................................................................................104 2. Inulin - Fructan.............................................................................................. 107 DƯỢC LIỆU CHỨA CARBOHYDRAT.................................................................111 I. Dược liệu chứa tinh bột....................................................................................... 111 Mạch n h a ............................................................................................................. 113 Ý dĩ........................................................................................................................ 114 S en ........................................................................................................................116 Hoài sơn................................................................................................................118 Trạch t ả ................................................................................................................120 II. Dược liệu chứa cellulose.................................................................................... 121 Bông...................................................................................................................... 121 III. Dược liệu chứa gôm và chất nhầy................................................................... 124 Gôm arabic............................................................................................................ 124 Gôm adragant.......................................................................................................126 Sâm bố chính........................................................................................................ 127 Bạch cập......................................................... ' .................................................129 Mã đ ề ..................................................................................................... ...............130 Thạch..............:..................................................................................................132 Tảo bẹ.....................................................................................................................134 Linh chi..................................................................................................................135 CHƯƠNG 3. GLYCOSID (HETEROSID),,.......................................................... 140 ĐẠI CƯƠNG VỂ GLYCOSID..................................................................................140 I. Định nghĩa về glycosid.....................................................................................140 1. O-Glycosiđ.........................................................................................................141 2. C-glycosid..................................................................................................... 143 3. S-glycosiđ..................................................................................................... 143 4. iV-glycosid..................................................................................................... 144 • 5. Pseudoglycosid.............................................................. ..............................144 II. Tính chất..........................................................................................................144 1. Lý tín h ..............:.......................................... ................................................ 144 2. Hoá tín h ....................................................................................................... 145 III. Chiết xuất......................................................................................................146 CHƯƠNG 4. GLYCOSID TIM VÀ D ư ợ c LIỆU CHỨA GLYCOSID TIM 148 ĐẠI CƯƠNG VỂ GLYCOSID TIM ................................................................... 148 I. Định nghĩa.........................................................................................................148 II. Cấu trúc hóa h ọ c............................................................................................149 1. Phần aglycon............................................................................................... 149 1.1. Nhân hydrocarbon............................................................................... 149 1.2. Vòng lacton...........................................................................................150 2. Phần đưòng.............................................................................. .......... ......... 151 III. Liên quan giữa câu trúc và tác dụng..........................................................151 IV. Tính chất, định tính, định lượng................................................................. 152 1. Tính chất.......................................................................................................152 2. Các thuốc thử định tính và định lượng.....................................................153 3. Sắc ký............................................................................................................ 156 4. Quang phổ......................................................................................... ........... 157 5. Định lượng....................................................................................................157 6. Đánh giá bằng phương pháp sinh vật.......................................................157 7. Bảo quản...................................................................................................... 158 V. Phân bô" trong tự nhiên...................................................................................158 DƯỢC LIỆU CHỨA GLYCOSID TIM.............................................................. 159 Lá Trúc dào....................................................................................................... 159 Hạt Thông thiên.............................................................................................. 164 Strophanthus................................................................................................... 166 Strophanthus ỏ Việt N am ..............................................................................171 Digitalis............................................................................................................ 173 Digitalis tía .......................................................................................................174 Digital lông...................... ................................................................................ 180 Hạt Đay..............................................................................................................184 Hành biển......................................................................................................... 187 MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÁC CHỨA GLYCOSID T IM .................................. 190 CHƯƠNG 5. SAPONIN VÀ Dược LIỆU CHỨA SAPONIN........................191 ĐẠI CƯƠNG VỂ SAPONIN..................................................................................191 I. Khái niệm chung về saponin..........................................................................191 II. Cấu trúc hóa học và phân loại.......................................................................192 1. Saponin triterpenoid...................................................................................193 1.1, Saponin triterpenoid năm vòng............................................................ 193 1.2. Saponin triterpenoid bôn vòng..............................................................197 2. Saponin steroid.............................................................................................. 200 2.1. Saponin steroid.......................................................................................200 2.2. Nhóm saponin steroid alkaloid..............................................................203 2.3. Các nhóm khác........................................................................................204 III. Tính chất của saponin..................................................................................... 204 m . Kiểm nghiệm dược liệu chứa saponin............................................................205 1. Dựa trên tính châ't tạo bọt.............................................................................205 2. Dựa trên tính chất phá huyết...................................................................... 206 3. Dựa trên độ độc đôi với c á ............................................................................ 208 4. Khả năng tạo phức với cholesterol...............................................................208 5. Các phản ứng màu..........................................................................................208 6. Sắc ký lớp mỏng................................... .......................................................... 209 7. Xác định bằng quang phổ.............................................................................. 210 8. Định lượng................................................................................................... 210 IV. Chiết xuâ't.........................................................................................................211 V. Phân bô" trong thực v ậ t.....................................................................................212 VI. Tác dụng và công dụng....................................................................................213 DƯỢC LIỆU CHỨA SAPONIN...........................................................................215 Cam thảo............................................................................................................. 215 Viễn chí............................................................................................................... 223 Cát cánh.............................................................................................................. 227 Bồ kết........................................................................................... ....................... 231 Ngưu tấ t...............................................................................................................233 Rau má.................................................................................................................237 Ngũ gia bì chân chim......................................................................................... 240 Nhân sâm........................ .............. ................................................... ................. 243 Tam th ấ t............................................................................................................ 251 - CỔ yếm ..................................................................................................................256 Rau Đắng biển..... :.............................................................................................. 258 Táo nhân...............................................................................................................261 Cam thảo dây........................................................................ .............................. 264 Tỳ giải...................................................................................................................266 Dứa M ỹ.................................................................................................................269 Khúc khắc............................................................................................................271 Mạch m ôn............................................................................................................273 Thiên môn............................................................................................................275 CHƯƠNG 6. DƯỢC LIỆU CHỨA MONO VÀ DITERPENOID GLYCOSID ............. ................ ............’........................ ......... ....................................................277 MONOTERPENOID GLYCOSID..........................................................................277 I. Sơ lược cấu trúc hóa học.......................................................................................278 II. Phân loại..............................................................................................................279 1. Iridoid có aglycon đủ 10 carbon.................................................................... 279 2. Iridoid không đủ 10 carbon...........................................................................280 3. Iridoid có trên 10 carbon..... ......................................................................... 281 4. Secoiridoid.......................................................................................................282 5. Iridoid dimer................................................................................................... 282 6. Các iridoid và secoiriđoid phức tạ p ...............................................*........... 282 III. Tính chất, định tín h .......................................................................................... 282 1. Tính chất..........................................................................................................282 2. Định tín h .........................................................................................................283 IV. Phân bô" trong tự nhiên.....................................................................................284 V. Tác dụng và công dụng...................................................................................... 285 DITERPENOID GLYCOSID.................................................................................. 286 DƯỢC LIỆU CHỨA MONOTERPENOID GLYCOSID......................................287 Sinh địa.................................................... .............................................................287 Dành dành............................................................................................................289 Lá Mơ...............................................................................................................291 Huyền sâm ............................................................................................................293 Đại..........................................................................................................................294 MỘT SỐ CÂY THUỐC KHÁC CHỨA IRIDOID GLYCOSID..........................296 Kim ngân........................................................................................................... 296 Cỏ roi ngựa .......................................................................................................296 Mã đ ê ................................................................................................................. 296 DƯỢC LIỆU CHỨA DITERPENOID GLYCOSID........................................... 297 Xuyên tâm liên.......................................... .............. ........................................ 297 Ké đầu ngựa........................................................................................................301 Hy thiêm .............................................................................................................302 Cỏ ngọt.......................................................................................;.....................304 CHƯƠNG 7. ANTHRANOID VÀ D ư ợ c LIỆU CHỨA ANTHRANOID... 307 ĐẠI CƯƠNG VỀ ANTHRANOID........................................................................ 307 I. Khái niệm chung về anthranoid...................................................................... 307 II. Phân nhóm............ ...................... .................................................................... 309 1. Nhóm phẩm nhuộm.......................................................................................309 2. Nhóm nhuận tẩy.............................................................................................311 3. Các anthranoid đim er...................................................................................312 III. Phân bô" trong tự nhiên...................................................................................314 IV. Tính chất..... ..................................................................................................... 317 V. Định tính............................................................................................................317 1. Định tính hoá học..........................................................................................317 2. Định tính sắc k ý ...........................................................................................318 3. Định tính bằng phương pháp quang phổ.....................................................319 VI. Định lượng........................................................................................................ 319 1. Phương pháp cân của Daels và Kroeber..................................................319 2. Phương pháp so m àu........................................... ......................................319 3. Phương pháp đo màu sử dụng magnesi acetat....................................... 320 4. Phương pháp thể tích của Tschừch và Schm itz..................................... 321 5. Các phương pháp khác....................................................................... 321 VII. Chiết xuất............................................................. ...........................................321 VIII. Tác dụng và công dụng......................................................... ........................322 DƯỢC LIỆU CHỨA ANTHRANOID........ ....................................................... 323 CÁC DƯỢC LIỆU CHỨA ANTHRANOID THUỘC CHI SENNA................... 323 Phan tả điệp.................................................................................<.................. 323 Thảo quyết m inh............................ .....................................:....................... 327 Cốt khí muồng................................................................... ......................... . 329 Muồng trâ u ................................................................................ ................. . 330 Ô môi.................................................................................................................332 DƯỢC LIỆU CHỨA ANTHRANOID THUỘC HỌ RAU RẢM - POLYGONACEAE.................................................... ......................................... 333 Đại hoàng..........................................................................................................333 Cốt khí củ..........................................................................................................339 Hà thủ ô đỏ.......................................................................................................340 Chút chít........................................................................................................... 343 Ba kích............................. ................................................................................ 344 N hàu................................................................................................................. 346 Lô hội................................................................................................................ 348 CHƯƠNG 8. FLAVONOID VÀ Dược LIỆU CHỨA FLAVONOID......... 353 ĐẠI CƯƠNG VỀ FLAVONOID..........................................................................353 I. Khái niệm chung về ílavonoid.........................................................................353 II. Cấu trúc hóa học..............................................................................................354 1. Khung của ílavonoid.................................................................................... 354 2. Phân loại flavonoid...................................................................................... 356 2.1. Euflavonoid:.......................................................................................... 356 2.2. Isoflavonoid........................................................................................... 369 2.3. Neoflavonoid......................................................................................... 372 2.4. Biflavonoid và triflavonoid.................................................................. 373 III. Tính chất - định tính - định lượng............................................................... 374 1. Tính chất....................................................................................................... 374 2. Định tín h ......................................................................................................375 2.1. Định tính hóa học................................................................................. 375 2.2. Sắc ký.....................................................................................................376 2.3. Quang phổ..............................................................................................377 3. Định lượng....................................................................................................378 3.1. Phương pháp cân .................................................................................. 378 3.2. Phương pháp đo phổ tử ngoại.............................................................. 379 3.3. Phương pháp đo m àu............................................................................379 IV. Chiết xuất....................................................................................................... 379 V. Phân bố ílavonoid trong tự nhiên.................................................................. 380 VI. Tác dụng sinh học của flavonoid................................................................. 381 DƯỢC LIỆU CHỨA EUFLAVONOID..............................................................384 Hoa hòe............................................................................................................. 384 NHỮNG NGUỒN D ư ợ c LIỆU KHÁC ĐỂ CHIẾT RUTIN.........................389 Diếp c á ............................................................................................................. 390 Râu mèo............................................................................................................ 392 Rau nghể.......................................................................................................... 395 Núc nác............................................................................................................. 397 Hoàng cầm........................................................................................................399 Kim ngân hoa.................................................................................................. 401 Actisô................................................................................................................ 405 Dâu.....................................................................................................................409 Bạch quả........................................................................................................... 413 Cúc gai.............................................................................................................. 416 CÁC DƯỢC LIỆU THUỘC CHI CITRUS - RUTACEAE..............................420 Hồng hoa.......................................................................................................... 421 DƯỢC LIỆU CHỨA ISOFLAVONOID........................................................... 424 Xạ c a n ...............................................................................................................424 Dây m ậ t........................................................................................................... 425 Hạt củ đ ậ u ....................................................................................................... 428 DƯỢC LIỆU CHỨA NEOFLAVONOID..........................................:............... 429 Tô mộc...............................................................................................................429 CHƯƠNG 9. COƯMARIN VÀ Dược LIỆU CHỨA COUMARIN............ 432 ĐẠI CƯƠNG VỀ COƯMARIN...........................................................................432 I. Khái niệm chung về coumarin........................................................................432 II. Phân loại coum arin....................................................................................... 433 1. Coumarin đơn giản......................................................................................434 2. Furanocoumarin (furocoumarin) ...............................................................435 3. Pyranocoumarin (pyrocoumarin)..............................................................438 III. Đặc điểm về cấu trúc............................................................... .....................442 IV. Tính chất.......................................................................... .............................. 443 1. Lý tín h .......................................................................................................... 443 2. Hóa tín h ........................................................................................................ 443 V. Các phương pháp phân tích coumarin.........................................................444 1. Định tín h .....................................................................................................444 2. Định lượng....... ...........................................................................................447 VI. Chiết xuất..................................................................................................... 447 VII. Phân bố trong tự nhiên.............................................................................. 448 VIII. Tác dụng và công dụng.............................................................................449 DƯỢC LIỆU CHỨA COUMARIN.................................................................... 451 Ba dót............................................................................................................... 451 Mần tưới........................................................................................................... 452 Bạch ch ỉ........................................................................................................... 453 Tiền hồ............ ................................................................................................457 Xà sàn g ...................................................... ..................................................... 459 Ammi visnaga..................................................................................................461 Sài đất.............................................................................................................. 461 Cỏ mực............................................................................................................. 464 Mù u ........................ .........................................................................................465 ' CHƯƠNG 10. DƯỢC LIỆU CHỨA GLYCOSID CYANOGENIC................470 ĐẠI CƯƠNG VỀ GLYCOSID CYANOGENIC.................................................470 I. Khái niệm chung về glycosid cyanogenic.............................................. ......470 II. Phân loại......................................................................................................... 471 1. Các glycosid tương tự như amygdalin....................................................... 471 2. Các glycosid tương tự như linamarin........................................................ 472 3. Glycosid có vòng cyclopenten.....................................................................472 4. Pseudocyanogenic glycosid.........................................................................472 III. Định tín h ....................................................................................................... 473 DƯỢC LIỆU CHỨA GLYCOSID CYANOGENIC.......................................... 474 Quả mơ..............................................................................................................474 Hạt đào.............................................................................................................476 CHƯƠNG 11. TANIN VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN................................477 ĐẠI CƯƠNG VỀ TANIN.................................................................................... 477 I. Khái niệm chung vể tan in .............................................................................. 477 II. Phần loại........ ................................................................................................ 478 1. Tanin thủy phần được................................................................................ 478 2. Tanin ngưng tụ ............................................................................................481 3. Tanin hỗn hợp................................................................... v.......................482 III. Chiết xuất....................................................................................................482 IV. Tính chất và định tín h ........................................ ......................................482 1. Tính chất.................................................................................................... 482 2. Định tín h ............................................................ ........... ...........................483 2.1. Định tính hóa học.............................................................................. 483 2.2. Sắc ký.................................................................................................. 484 V. Định lượng.................................................................................................... 484 1. Phương pháp bột da...................................................................................484 2. Phương pháp oxy hoá (Phương pháp Lowenthal)....................................485 3. Phương pháp tạo tủa vói đồng acetat.......................................................485 4. Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin................................................ 486 5. Phương pháp đo màu với thuốc thử phosphomolibdotungstic...............486 6. Phương pháp sử dụng sắc ký lỏng cao á p ............................................... 487 VI. Tác dụng và công dụng............................................................................... 487 DƯỢC LIỆU CHỨA TANIN :........................................................................... 489 Ngủ bội tử ...................................................................................................... 489 Ổ i.......................................................................................................................... •......490 Mãng cụt......................................................................................................... 492 MỘT SỐ c t o KHÁC CH.ỦẰTẦNIÌSÍ..............................................................494 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH................................................................. 495 MỤC LỤC TRA CỨƯ TÊN Dược LIỆU........................... ........................497 BÀI GIẢNG Dime ■ ■ LIỆU Tập I SÁCH DÙNG CHO SINH VIÊN Dược MỰC TIÊU MỒN HỌC Cung cấp cho sinh viên những kiến thức về: 1. Những hiểu biết chung cơ bản về công tác dược liệu. 2. Cấu trúc hoá học, tính chất, phương pháp định tính, định lượng của các nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều ứng dụng thường gặp trong dược liệu (carbohydrat, glycosiđ tim, saponosid, iridoid glycosid, flavonosid, anthranoid glycosid, coumarin, tanin, alcaloid, tinh dầu và chất béo). 3. Nguồn gốc, phân bô' và đặc điểm thực vật của những dược liệu quan trọng thông dụng. 4. Thành phần hoá học chính và các phương pháp kiểm nghiệm dược liệu bằng vi học và hoá học của các dược liệu quan trọng thông dụng. 5. Tác dụng sinh học và công dụng của những dược liệu quan trọng thông dụng. Đại cương về dược liệu học CHƯƠNG 1 ĐẠI CƯƠNG VÊ DƯỢC LIỆU ĐỊNH NGHĨA MÔN HỌC Dược liệu học là môn học chuyên môn trong chương trình đào tạo dược sĩ đại học. Thuật ngữ “Dược liệu học” trong tiếng Anh là “Pharmacognosy” có nghĩa là các hiểu biết về thuốc do Seydler đưa ra vào năm 1815, được ghép từ 2 từ Latin (gốc Hy Lạp) là pharmakon (nghĩa là thuốc) và gnosis (nghĩa là hiểu biết). Ngày nay, môn Dược liệu học thường được quan niệm là khoa học về các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc sinh học1. Đây là môn học nghiên cứu về sinh học và hoá học những nguyên liệu dừng làm thuốc có nguồn gốc sinh vật mà trong đó các cây thuốc là đối tượng chính. Nội dung môn học sẽ cưng cấp cho sinh viên những kiến thức bao gồm nguồn gốc, thành phần hoá học, kiểm nghiệm, tác dụng và công dụng của dược liệu. Yêu cầu chủ yếu là xác định đưdc sự thật giả, đánh giá được chất lượng và hướng dẫn sử dụng dược liệu. Trưóc đây, nguồn nguyên liệu tự nhiên làm thuốc tập trung chù yếu vào các nguyên liệu trên cạn. Ngày nay, các dược liệu từ nguồn tài nguyên biển cũng rất được chú ý. Các nguồn nguyên liệu tự nhiên Cung cấp các chất nội tiết 1 Chương trình dược liệu hiện đại thường không còn đề cập tới các dược liệu có nguồn gốc khoáng vật. Đại cương về dược liệu học (động vật), các kháng sinh (vi sinh vật) và các cây độc, nấm độc, các cây cỏ gây dị ứng, các cây diệt côn trùng cũng được đề cập trong một sô' chương trình giảng dạy môn dược liệu ở một số nước. Đối tượng nghiên cứu của dược liệu học hiện nay còn là các sinh vật sử dụng trong hương liệu và mỹ phẩm. Dược liệu học ngày nay tập trung vào nghiên cứu bôn Enh vực chính: - Tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc, - Kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hoá dược liệu, - Chiết xuất dược liệu, - Nghiên cứu thuốc mổi từ dược liệu. Dược liệu có thể là tất cả các bộ phận của cây hoặc con thuốc hoặc chỉ là một hay vài bộ phận của chúng. Những chất tiết ra hay được tách chiết ra từ cây cỏ hoặc động vật như gôm, nhựa, sáp, tinh dầu, dầu m3 cũng thuộc phạm vi dược liệu. Theo quan niệm hiện nay thì môn dược liệu không chỉ nghiên cứu nguyên liệu thô mà cả những tinh chất chiết ra từ dược liệu ví dụ hoa Hòe và rutin, lá dương Địa hoàng và digitalin, rễ Ba gạc và reserpin, Dừa cạn và vinblastin. Không có một ranh giới rõ ràng giữa cây con làm thuốc với các loại cây khác như cây lương thực, cây công nghiệp, cây cảnh, cây gia vị... Ví dụ như Cà phê, Trà, Gừng, Quế... là các dược liệu nhưng cũng đồng thòi là nguyên liệu dùng trong thực phẩm. Là một trong những môn học chuyên môn, môn dược liệu có liên quan đến những môn học khác như thực vật, hoá hữu cơ, hoá phân tích và dược lý. Do đó sinh viên cần liên hệ kiến thức của các môn học trên khi học môn dược liệu. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN MÔN DƯỢC LIỆU Kiến thức về dược liệu học có lẽ đã được quan tâm tìm hiểu ngay cả từ thòi các bộ tộc nguyên thủy. Trong quá trình con người tìm kiếm thức ăn, họ tìm hiểu về cây cỏ xung quanh để nhận biết các cây dùng được làm thức ăn và những cây có độc đối với con người. Kinh nghiệm về sử đụng cây cỏ của người tiển sử ban đầu có lẽ được phát hiện một cách tình cờ khi con ngưòi tìm cách làm dịu những vết thương, những bệnh tật của cơ thể, Dần dần, trong tiến trình phát triển của lịch sử loài người, những kinh nghiệm thu được một cách ngẫu nhiên ấy được thay bằng những điều được rút ra và tích lũy lại trong quá trình thử - sai, các kinh nghiệm sử dụng thuốc ban đầu được truyền khẩu từ thế hệ này sang thế hệ khác rồi tới các thực nghiệm khoa học như ngày nay. Còn rất ít những dấu vết về việc sử dụng dược liệu của loài người thời tiền sử. Tuy nhiên, ngưòi ta vẫn có thể tìm thấy những bằng chứng sử dụng được liệu của COĨ1 người. Ví dụ đã tìm thấy dấu vết của các hạt phấn hoa tại nơi chôn cất của ngưòi Neandertan (60.000 năm trưốc công nguyên - ten.). Những vị Đại cương về dược liệu học thuốc cổ nhất còn tìm thấy được ngày nay là của những dân cư vùng hồ ở Thụy Sĩ có niên đại khoảng 5000 - 6000 năm ten. Trong số các dược liệu này có khoảng 200 loài định danh được và một số loài hiện nay vẫn còn được sử dụng ỉàm thuốc. Khi chữ viết ra đời các kinh nghiệm này đươc ghi vào vản tự. Các văn bản cổ xưa nhất ghi lại việc sử đụng cây thuốc.còn được biết đến ngày nay là các bản đất nung của ngưồi Assyri (2700 ten), các cuộn giấy papữus của người Ai Cập (1700 ten). Sự ra đòi của kỹ thuật in â'n, đặc biệt của các phương tiện lưu trữ hiện đại ngày nay làm cho việc ghi nhận và lưu trữ thông tin trở nên dễ đàng và an toàn hơn. Mỗi dân tộc, mỗi quốc gia đều kế thừa và phát triển các kinh nghiệm của tổ tiên mình cũng như học hỏi, vay mượn các kiến thức y học của các dân tộc, các quốc gia khác. Các cuộc chiến tranh thôn tính xưa kia, sự giao thương và giao lưu văn hóa giữa các dân tộc, các quốc gia, giữa Đông và Tây dần dần làm cho kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của loài người thêm phong phú. Từ xa xưa, nghệ thuật chữa bệnh bao gồm cả Y và Dược. Các “thầy lang’’ hành nghề cả y ìẫn được. Theo thời gian, hiểu biết của con người càng ngày càng được tích lũy, nghề nghiệp của con người ngày càng được chuyên môn hóa và đi vào những lĩnh vực hẹp hơn, hai ngành Y và Dược dần dần được tách riêng. Rồi ngay cả ngành Dược chung nhất thủa ban đầu vối các hiểu biết về thuốc cũng dần dần được phân chia thành những chuyên ngành hẹp và sâu hơn theo đà phát triển của khoa học. Dược liệu học trước kìa với các hiểú biết về thuốc trở thành môn khoa học về các nguyên liệu làm thuốc như hiện nay. I. MỘT SỐ NỂN Y DƯỢC HỌC THỜI c ổ ĐẠI 1.1. Y học Ấn Độ Ấn Độ cổ đại có một nền y dược phát triển và có ảnh hưởng tổi nhiều nưác trong khu vực. Các kiến thức về y học và sử dụng cây thuốc của ngưồi Ãn Độ được đề cập sóm nhất trong kinh Vệ đà (Ayurveda = Khoa học của đời sống) xuất hiện khoảng 4000 - 1000 năm trước công nguyên (ten). Những dược liệu hay dùng là trong y học An Độ là: Ba gạc, Tỏi, Tiêu, Gừng, Thầu dầu, Me, Đậu khấu, Phụ tử, Ngưu hoàng, Rắn lục v.v... Y học Trung Hoa, Ai Cập, Hy Lạp cũng vay mượn nhiều dược liệu của Ấn Độ. Y học An Độ về sau suy tàn dần bởi sự xâm chiếm của người Hồi giáo vào khoảng 1000 năm ten. Hai thầy thưõc nổi tiếng của Ấn Độ sống vào đẩu công nguyên là Charaka (thế kỷ thứ 2) và Susruta (thế kỷ thứ tư) đã ghi nhận lại một sô' kinh nghiệm của nền y học này trong các tác phẩm của họ. Charaka kể đến 500 phương thuốc, ông nói nhiều tối các sản phẩm có nguồn gốc khoáng vật và động vật. Susruta cũng đã mô tả 760 loại dược liệu trong đó có Gai dầu (Cannabis), Phụ tử, Ba đậu, Quýt, Rau muổì, Lựu, Thầu đầu, stibi, borat, đồng, thủy ngân, natri carbonat, bạc, vàng. Susruta đã sử dụng gai dầu và Hyoscyamus làm thuốc gây tê. Đại cương về dược liệu học 1.2. Y học Assyri và Babilon Tại vùng Lưâng hà thuộc lưu vực của 2 con sông Tigris và Euphrates thuộc miển Tây Á một thời đã có một nền y học phát triển. Những hiểu biết hiện nay về y học Assyri và Babilon là từ các văn bản viết trên đất sét thuộc thư viện của Assur-banipal, vua Assyri giữa thế kỷ thứ 7 ten, ngưòi đã ra lệnh thu thập các văn bản cổ của người Sumer, Akkadia và Babilon cho thư viện của mình. Trong sô' cằc văn bản còn lại ngày nay, có khoảng 800 bản là các tư liệu y học. Nội dung ghi trong các văn bản này được cho là có niên đại niên đại vào khoảng 3000 - 2000 ten hay sám hơn. Chúng ghi nhận. khoảng 250 loài thực vật, 120 loại khoáng vật, trong đó có những loài hiện nay vẫn còn sử dụng như: A ngùy, Kỳ nham (Hyoscyamus niger), Mandagora, Chamomile, Thìa là, dầu Hạnh nhân, Cam thảo, Nghệ, Lựu, Anh túc, v.v... Các dạng thuốc và đưòng cho thuốc của người Babilon cũng khá gần vói hiện đại. Thuốc đắp là một trong những dạng thuốc được sử dụng sởm nhất, thuốc thụt và thuốc ucíng cũng được sử dụng. Các dịch ngâm dược liệu với rượu vang và các chất lỏng khác, địch ép dược liệu phôi hợp với rượu vang là những dạng thuốc được sử dụng. Thế kỷ 18 ten, yua Hammurabi1 của Babylon đã khuyến khích dân chúng trồng cây thuốc và đặt ra ỉuật lệ hành nghề y dược. 1.3. Y học Trung Hoa Y học Trung Hoa có lịch sử lâu đòi, có lý luận chặt chẽ và gắn liền với triết học và tôn giáo. Trong suốt quá trình phát triển, ngoài những kiến thức y học của người Hán và các dân tộc sông trên đất nưốc Trung Hoa cổ đại, y học Trung Hoa còn chịu ảnh hưỏng của các nền y học lớn khác như y học Ấn Độ, Ai Cập, A Rập và y học phương tây. Y học Trung Hoá cũng hấp thụ những kinh nghiệm chữa bệnh, cách sử dụng và dược liệu của các dân tộc, các nước láng giềng như Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Tây Tạng v.v... Có rất nhiều dược liệu được người Trung Hoa vay mượn của các dân tộc khác mà ngày nay đã nghiễm nhiên trở thành một bộ phận của y học Trung Hoa. Hoàng đế (2637 ten) đã có sách nói về các phương pháp ohữa bệnh theo y lý Đông phương đó là cuốn "Nội Kinh" hay còn được gọi là “Hoàng đế Nội kinh". Có rất nhiều nhà y học Trung Hoa góp phần vào việc xây dựng nển y học cổ truyển Trung Hoa. về lĩnh vực các cây thuốc, bộ sách quan trọng và đầy đủ nhất về các dược liệu và công dụng của chúng là cuốh "Bản thảo cương mục1' do Lý Thòi Trân (1518-1593)2 biên soạn “Bản thảo cương mục” đề cập tới 12.000 bài thuốc và phương thuốc trong đó có 1892 vị thuốc vối 1094 vị dược liệu, 444 vị thuốc động vật và 354 vị thuốc khoáng vật. 1.4. Y học Ai Cập Y học của nền văn minh Ai Cập cổ đại tồn tại ở lưu vực sông Nile cách đây hơn 5000 năm. Ngày nay, những hiểu biết về nền y học này chủ yếu là qua các bản papyrus3 có 'Hammurabi, vua xứ Babilon (khoảng 1792 - 1750 ten) đƯỢc coi là nguôi đạt ra các luật lệ để cai trị Babilon. 2 Có tài liệu cho rằng “Bản thào cương mục' được biên soạn vào nhũng năm 1595 - 1597 { Lẻ Qùy Ngưu, Danh từ Dược học Đông y - nxb. Thuận Hóa, 1992. trg.7; Modem Phamacognosy, 1952], 3 Papyrus (Cói Ai Cập - Cyperus papyrus, Cyperaceae), cây thảo cao 1 - 3 m. Được người dân Ai cập dùng chủ yếu để làm giấy gọi là papyrus, ngoài ra còn được dùng làm vật dụng hay để trang trí. Đại cương về dược liệu học niên đại vào khoảng năm 1700 ten do G.M. Ebers1 và E. Smith2 và một số nhà nghiên cứư khác tìm được, vể lĩnh vực dược, quan trọng nhất là papyrus do Ebers tìm được. Papyrus này liệt kê 700 phương thuốc đưọc người Ai Cập cổ đại sử dụng. Những được liệu quan ựọng có thể kể là Hyoscyamus niger, Mandagora officinarum, Thuốc phiện, Rễ lựu, dầu Thầu dầu, aloe, Hành, nhiều loại tinh dầu, mật súc vật v.v... Người Ai Cập sử dụng nhiều dạng thuổc khác nhav^từ thuốc nước, thuốc hoàn, thuốc mỡ, thuốc bột và cả toạ dược. Các dạng thuỗc nưởc có thể đùng dung môi là nước, bia, rượu. Nền Y học Ai Cập cực thịnh vào khoảng 1600 ten sau đó dần dần tan rã và đi vào phù thủy và ma thuật. Ngưòi nổi tiếng nhất trong y học Ai Cập cổ đại là Imhotep. 1.5. Y học Hy Lạp Y học Hy Lạp đã thừa hưởng rất nhiều từ y học Ai Cập cổ đại. Tới thế kỷ thứ 6 - 5 ten Y học Hy Lạp đạt tới thời kỳ vàng son vđi những tên tuổi lớn. Một trong những nhân vật đáng được nhắc tỏi trưốc tiên là Aslepius - vua của xứ Thessaly. Asclepius rất giòi về thuật chữa bệnh. Hippocrates3 (460 - 377 ? ten) được xem như là người thầy thuốc giòi nhất thời cổ đại. Ngoài những công trình về giải phẫu, sinh lý, ông còn đưa vào sử đụng hđu 200 cáy thuốc. Ông được suy tôn là tổ sư ngành y học hiện đại phương Tây. 1.6. Y học La Mã Văn minh La Mã thừa hưởng rất nhiều những thành tựu của văn minh Hy Lạp cả về tư tưông, văn hóa lẫn con người. Những nhân vật nổi tiếng trong y học của văn minh La Mã có thể kể là: Celsus* sống vào thế kỷ thứ nhâ't sau thiên chúa giáng sinh. Ổng viết bộ sách “De Medicina” vào khoảng năm 25 - 35. Đây là một bộ sách về y khoa râ't có gía trị của nền y học La Mã. Dioscoriđes5 (khoảng năm 40 - 90), nhà nghiên cứu về dược liệu đã viêt tập sách ''De Materia medica” {Dược liệu học) vào năm 78 ten. ôn g đã mô tả trên 600 loài cầy có tác dụng chữa bệnh. Nhiều cây trong số’ đó vẫn đang được sử dụng trong y học hiện đại. Các khoáng vật cũng được ghi nhận, Galen6(129 - 199) một thầy thuốc Hy Lạp sông tại La Mã. ông nghiên cứu cả y lẫn dược. Đặc biệt, ông viết nhiều sách mô tả các phương pháp bào chế thuốc có nguồn gốc động vật và thực vật. Ngày nay, ngành dược phương tây coi ông là bậc tiền bôi của ngành. 1 Ebers, G.M (1837 -1898), Nhà Ai Cập học người Đức, ngưòi đã phát hiện lại và đă hiệu đính tài liệu này năm 1874. Papyrus Ebers hiện đang được giữ tại thư viện Đại học Leipzig. 2 Smith E., nhà Ai Cập học đã mua tài liệu vào năm 1862. Tài liệu này được GS. J. H. Breasted dịch năm 1920 và đừợc Đại học Chicago xuất bản năm 1930. 3 Hippocrates nhấn mạnh vai trò không chi của dinh dưỡng mà còn của lối sống tdi sức khoẻ. Hypocrates tin rằng bệnh là do tác động từ môi trường chứ không phải do các thế lực siêu nhiên. 4 Celsus A. c. ngưỏi viết 8 cuốn sách vể y khoa dựa trên các ý tuởng của Hippocrates. 5 Dioscorides p. - Thầy thuốc Hy Lạp. ông nghiên cứu nhiểu về cây cỏ và các đặc tính trị bệnh cùa chúng. 6 Galenus c. (129-199 ?), được xem như là người thầy thuốc giòi nhất thời cổ đại sau Hippocrates. Có tài liệu cho rằng Galen sinh vao khoảng năm 131 và mất vào khoảng năm 200 - 210 [Doyle PẠ. Reading in Pharmacy, J. Wiley and son, 1962, p. 130]. Đại cương về dược liệu học Các kiến thức của Hyppocrates, Celsus, Dioscorides và Galen có ảnh hưởng rất lốn và lâu dài trong y học phương tây, cho đến tận thế kỷ thứ 15. I.7. Các nển y học khác Các nển văn hoá khác như của các bộ tộc Châu Mỹ, mặc dù chưa được biết đến nhiều và đã bị mai một cũng đã cũng cấp nhiều cây thuốc quí'cho y học. Người Aztec ò Mexico đã biết phân biệt và sừ dụng 1200 cây thuồc. Người Inca ỏ Peru, người Maya cũng có những kinh nghiệm rất đáng kể về việc sử dụng cây thuốc vào thòi quân Tây Ban Nha xâm lược. Những nền văn minh này đã đóng góp rất nhiều dược liệu quý cho y học hiện đại: Canh kina, Ipecac, Curare, Cacao, Thuốc lá, Côca v.v... Bên cạnh những nền y học cổ, kinh nghiệm dần gian trong điểu trị bệnh của rất nhiều các dân tộc khác dù lớn hay nhỏ, từ châu Á, Phi, Nam Mỹ tới Châu Đại dương cũng đã từng đồng hành vói con người trong suốt tiến trình lịch sử cũng đã và đang đóng góp vào kho tàng kiến thức y học hiện đại. II. Sự HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIEN c ủ a d ư ợ c h ọ c p h ư ơ n g t â y Ngành dược phương Tây phát triển dựa trên nền tảng kiến thức và kinh nghiệm của y dược học Hy Lạp và La Mã. 2.1. Thời Trung cổ Sau Thòi cổ đại, châu Âu bưốc vào Thòi trung cổ (575 - 1300) vối sự ảnh hưỏng rất lón của giáo hội Thiên chúa giáo. Trong suốt thời Trung cổ, Dược liệu học cũng như các môn khoa học nói chung không thể phát triển. Các tài liệu của Hippocrates, Celsus, Dioscorides, Galen trồ thành kinh thánh trong y học. Điểm đáng ghi nhận trong thòi kỳ này là sự xâm nhập của y học A Rập vào châu Âu. Ngưòi Saracen (một tộc người ở Bắc A Rập) đã đưa các hiệu thuôc vào Châu Âu ỏ thế kỷ thứ VII • VIII. Thời kỳ này có Avicen (980 - 1037) thầy thuôc A rập rất nổi tiếng ỏ phương Tây. Vào thế kỷ - XIII - XIV có sự ra đời của các phường hội về Dược ỏ Pháp. 2.2. Thời Phục hưng Trong rất nhiếu thế kỷ, việc sử dụng cây thuốc chủ yếu là dựa trên sách vỏ của Dioscorides, Galen v.v... Dược liệu học chỉ dừng lại ở mức độ mô tả các đặc điểm hình thái và sử dụng các dạng chế phẩm đơn giản như cao thuốc, rượu thuốc, dấm thuốc.... Đến thời Phục hưng (1300 - 1650), Paracelsus (1490? * 1541)1 - một y sĩ người Thụy Sĩ đã đưa ra khái niệm về hoạt chất của dược liệu. ông cũng là người đẩy mạnh việc sử đụng các khoáng vật làm thuốc tại Châu Au. Ong kêu gọi việc sử dụng các đơn thuốc độc vị thay cho các bài thuốc gồm nhiều vị. Paracelsus cũng cho rằng các hoạt chất phải được chế tạo từ đá, các chát tinh tuý của cây thuốc cần phải được chiết xuất. Những ý tưởng đó. sau này được áp dụng rộng rãi trong y dược học hiện đại Phương Tây. 1 Paracelsus, tên thật là Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim (1493Ỹ-1541), y sĩ người Thuỵ Sĩ có rất nhiều ý tưởng mới trong điều trị. Người được coi là ông tổ của sinh hoá học. Đại cương về dược liệu học 2.3. Thời cận đại Sau thời Phục hưng là Kỷ ánh sáng (1650 - 1750) của Thòi cận đại, ngành dược bắt đầu chấp nhận các lý thuyết của Paracelsus nhưng không loại bỏ những kinh nghiệm cũ. Các vuờn cây thuốc, vườn thực vật xuất hiện và đóng vai trò rất quan trọng. Những tiến bộ của điều trị được đánh dấu bởi Dale với cuốn Pharmacologia (1700) nhấn mạnh mục tiêu của y học là phải dựa trên nền tảng trị liệu. Đó được coi là thời điểm dược tách ra khỏi y trong y học Phương Tây. Sự phát triển của sinh vật học, hóa học làm cho hiểu biết về ngành dược tăng lên, Dược liệu học chuyển dần từ môn khoa học mô tả thành khoa học thực nghiệm. Hóa học ra đòi, con người bắt đầu có những khái niệm về các hợp chất trong cây cỏ và động vật. Những cột mốc đáng chú ý trong sự phát triển của ngành Dược liệu học (và ngành Dược) trong thòi cận đại có thể kể ra là: - c. Linnaeus (1707 - 1778) đặt ra hệ thống danh pháp cho động vật và thực vật. - K.W. Scheele đã chiết được các acid thực vật và những chất khác vào cuối thế kỷ 18. Khởi đầu cho việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây thuốc. - F. Sertílrner chiết được morphin từ thuốc phiện. Sự kiện này chứng minh khái niệm chất “tinh túy" của Paracelsus. - Chất gây mê đầu tiên được tổng hợp (1842), khởi đầu sự hình thành của hoá dược học, tách đần ra khỏi dược liệu. - Schleiden năm 1857 khám phá ra rằng có thể phân biệt được các dược liệu bằng cách quan sát chúng dưới kính hiển vi và tầm quan trọng của khảo sát mô học trong chống nhầm lẫn và giả mạo các vị thuốc. - Eijkman đưa ra khái niệm vitamin (1896). - J. Abel đã chiết được epinephrin từ động vật (1897), chứng minh rằng có thể sản xuất các chất có tác dụng sinh lý đặc hiệu từ các tuyến nội tiết của động vật... 2.4. Sự phát triển của dược liệu học thế kỷ XX Thòi hiện đại, sự phát triển của các môn khoa học cơ bản, đặc biệt là hóa học và các phương pháp phân tích hóa ]ý, quang phổ đã tạo ra những công cụ mới hết sức hữu hiệu cho nghiên cứu dược liệu. Sự ra đời của kỹ thuật sắc ký (Tsvets, 1903) làm cho việc phân tích, phân lập các chất trỏ nên đơn giản và hiệu quả hớn. Các phương pháp sắc ký điều chế đã giúp cho việc chiết tách các chất có hàm lượng thấp trong hỗn hợp phức tạp. Các phương pháp phân tích dụng cụ, đặc biệt các thiết bị sắc ký ghép nốì với các thiết bị quang phổ đã giúp cho việc nhận định và xác định hàm lượng các chất trong những hỗn hợp phức tạp với độ nhạy rất cao. Các thiết bị quang phổ đã giứp cho việc xác định cấu trúc các chất trỏ nên dễ dàng hơn, nhanh và tốn ít mẫu hơn. Vào cuối thế kỷ 20, việc nghiên cứu các cây thuốc có định hưóng bằng sự kết hợp của các thử nghiệm tác dụng sinh học với các nghiên cứu thành phần hóa học đã giúp cho việc tìm ra các chất trong cây cò có hoạt tính trị liệu trở nên nhanh chóng, ít tốn kém hơn và vối cơ may thành công lởn hơn. Sự phát triển của sinh học đặc biệt của sinh học phân tử đã giúp cho việc chọn lọc, nhân giông tạo ra nguồn nguyên liệu có chất lượng cao với các kỹ thuật gây đột biến, - nuôi cấy mô, chuyển gen v.v... Đại cương về dược liệu học III. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA Dược HỌC VIỆT NAM Nền y dược học của dân tộc ta cũng đã có một lịch sử lâu đời. Vào khoảng 4000 năm ten Thần Nống1 đã dạy cho người dân sử dụng các loại ngũ cốc, thực phẩm và biết phân biệt cây cỏ có tác dụng chữa bệnh. Vào thòi Hồng-Bàng (2879 ten) tổ tiên ta đã biết kết hợp một số dược liệu (vỏ Lựu, Ngũ bội tử, Cánh kiến) để nhuộm răng, đã có tục nhai trầu (trầu, cau, vôi) để bảo vệ ràng và da dẻ hồng hào, biết uống chè vối cho dễ tiêu; dùng gừng, hành, tỏi để làm gia vị và để phòng bệnh. Từ thời Hùng Vương, người dân đã biết ủ và cất rượu dùng để uống và làm thuốíc. Thời Thục An Dương Vương (257 - 179 ten) đã biết chế tên độc bắn địch [Lê Trần Đức - Lược sử thuốc nam và y dược học dân tộc, Y học, 1990, 8]. Theo sử ghi chép, dưới thời Nam Việt - Giao Chỉ, nhiều vị thuốc đã được phát hiện: Cau, Ý dĩ, Long nhãn, vải, Gừng gió, Quế, Trầm hương, quả Giun (sử quân tử), Hương bài, Cánh kiến (An tức hương), Mật ong, sừng Tê giáo V.V: Dưới thòi Bắc thuộc (207 ten - 905 sen), người Trung Hoa đô hộ nước ta đà lấy nhiều cây thuốc của Việt Nam về trồng như Ý dĩ, vải, Nhãn, Sử quân tử, Nhục đậu khâu, hay thu các công vật như Trầm hương, Cánh kiến trắng, Sừng tê giác, các loại hương liệu v.v... Cũng trong thời kỳ đó, nển y dược của ta giao lưu vối y dược học Trung Hoa. Y học cổ truyền Việt nam chịu nhiều ảnh hưởng của y học cổ truyền Trung hoa, nhưng cũng có nhiều kiến thức y học Việt Nam được người Trung Hoa vay mượn và nhập vào nền y học Trung Hoa. Dưới các triều Ngô - Đinh - Lê - Lý trong nước ta đã có nhiều thầy thuốc chuyên nghiệp chữa bệnh cho dân. Trong triều đình đã có Ty Thái y cổ nhiệm vụ chăm lo sức khoẻ cho hoàng gia. Các vị danh y có tiếng vào đời nhà Lý là các nhà sư Từ Đạo Hạnh, Nguyễn Minh Không. Đến thế kỷ thứ 14 dưới đời nhằ Trần (1225 - 1399) nền y dược học nưóc ta mới phát triển mạnh. Thời này đã có Viện Thái Y với nhiệm vụ chữa bệnh cho vua quan trong triều và trông nom cả việc cứu tế và y tế cho nhân dân, có mở khoa thi tuyển lựa lương y. Viện Thái y có tổ chức đi thu thập cây thuốc và tổ chức nhân dân trồng cậy thuốc. Dưói đây là những vị danh y có nhiều cống hiến cho sự nghiệp bảo vệ sức khoẻ nhân dân và xây dựng nền y dược học nước ta. Phạm Công Bân, còn gọi là Phạm Bân, quê ở xã Tứ Minh, huyện cẩm Giàng, tỉnh Hải Dương (nay thuộc thành phô" Hải Dương) là một danh y thòi 1 Vị Thần nông (Thần nông nghiệp) của người Việt cổ dạy dãn trồng lúa nưốc. Theo truyền thuyết, Thần Nông là tổ tiên của vua Hùng. Đế Minh là cháu 3 đời của Thần Nông, Đế Minh sinh ra Kinh Dương Vương, Kinh Dương Vương sinh ra Lạc long Quân, Lạc long Quân sinh ra vua Hùng. Một số học giả vãn học dân gian Trung quốc và Mỹ cũng đã chứng minh “Thần nông là vị thẩn của nền vân minh lúa nước của cư dân phương Nam, ngoài nưòc Trung hoa cổ đạ” . [Từđiển Bách khoa Nông nghiệp, TT. QG Biên soạn TĐBK, 1991, 387]. Đại cương về dược liệu học vua Trần Anh Tông và là bô" vợ Hồ Quý Ly. Với tài trị bệnh, ông được vua Trần Anh Tông (1293 - 1313) mời giữ chức Thái y lệnh chuyên chăm lo sức khoẻ cho nhà vua. Ngoài nhiệm vụ Viện Thái y, ông còn chữa bệnh chỡ dân. Chu Văn An, (1292-1370) là một danh nho nổi tiếng đồng thòi là danh y. Quê ông ở làng Văn thôn, xã Quang Liệt, huyện, Thanh Đàm (Thanh Trì) nav thuộc phường Hoàng Liệt, quận Hoàng Mai, Hà Nội. Thời vua Trần Minh Tông (1314-1329), vua mời ông ra làm Tu nghiệp Quốc Tử Giám, dạy cho Hoàng thái tử Trần Vượng, sau này là vua Trần Hiến Tông (1329-1341). Đến thời Trần Dụ Tông (1341-1369), thấy quyền thần làm nhiều đều vô đạo, ông đã dâng Thất trảm só xin chém 7 gian thần nhưng không được vua nghe nên cáo lão từ quan về núi Phượng Hoàng (Chí Linh, Hải Dương) dạy học, làm thuốc và viết sách cho tới khi mất. Tuệ Tĩnh, chính tên là Nguyễn Bá Tĩnh (đi tu lấy pháp danh là Tuệ Tĩnh) quê làng Nghĩa Phú, tổng Văn Thai, huyện cẩm Giàng, phủ Thượng Hồng, tỉnh Hải Dương (nay là xã cẩm Vũ, huyện cẩm Giàng, tĩnh Hải Đương), v ề năm sinh hiện chưa có tài liệu lịch sử chính xác. Theo Trương Xuân Nam [Lịch sử ngành Dược Việt Nam, Nxb. Y học] thì ông sinh vào năm 1330, mồ côi cha mẹ lúc 6 tuổi được các nhà sư chùa Hải Triều trong tổng nuôi ăn học. Nâm 22 tuổi ông thi đậu Thái học (Tiến sĩ) dưới triều Trần Dụ Tông (1341-1369), nhưng không ra làm quan. Ông ở chùa đi tu nhưng có mục đích làm từ thiện và chữa bệnh giúp dân. Tuệ Tĩnh đã nghiên cứu cây cỏ Việt Nam, đã sưu tầm những bài thuốc giản dị thường dùng trong dân gian kết hợp kinh nghiệm trị bệnh của y học Trung Hoa để xây dựng một nền y học có tính chất dân tộc, đại chúng và sáng tạo trong thời kỳ mà thuốc Bắc rất thịnh hành. Các tác phẩm của Tuệ Tĩnh còn lại 2 tác phẩm có giá trị là "Hồng Nghĩa giác tự y thư"1 và "Nam dược thần hiệu". Bộ Hồng Nghĩa giác tự y thư (2 quyển) được biên soạn bằng thơ nôm để truyền bá rộng rãi y dược học dân tộc và y lý biện-chứng trị liệu. Bộ sách “Nam dược thần hiệu” gồm 11 quyển, quyển đầu nói về dược tính của 499 vị thuốc nam, mười quyển sau, mỗi quyển nói về một khoa trị bệnh. Tư tưởng chỉ đạo của Tuệ Tĩnh về đường hưóng y học là "Nam dược trị Nam nhân": “Tôi tiên sư, Kính đạo tiên sư Thuốc Nam Việt chữa người Nam Việt”2 Năm 55 tuổi (1385) ông bị bắt đi sứ sang nhà Minh, ở Trung Quốc. Tuệ Tĩnh chữa cho Tông vương phi (vợ vua Minh) khỏi bệnh sản hậu nên được phong là "Đại y thiền sư*'. Ông mất ở Trung Quốc không rõ năm nào. 1 Biệt hiệu Hồng nghĩa là do Tuệ Tĩnh sinh ỏ làng Nghĩa Phú, phủ ThuỢng Hổng. 2 Nguyễn Bá Tĩnh - Nam dược quốc ngữ phú (trong Tuệ Tĩnh toàn tập, Nxb. y học, Hà Nội, 1998), tr. 377. Đại cương về dược liệu học Dưối thồi nhà Minh đô hộ (1400 - 1427), người Hán có chủ trương đồng hoá dân tộc ta và thủ tiêu văn hoá của ta nên trong thời kỳ này không có trưốc tác y học. Những thế kỷ tiếp theo lại có nhiều danh y xuất hiện: - Thế kỷ 16 có Hoàng Đôn Hoà, một lương y nổi tiếng dưới triều Lê (Lê Thánh Tông, Lê Thế Tông), ông đã giúp triều đình cứu chữa cho bệnh binh trong quân đội nhà Lê trong thòi gian giao tranh với nhà Mạc. Ông đã chữa khỏi bệnh cho nhiều người trong vùng, trong đó có công chúa Phương Dung con vua Lê Thế Tông và được làm phò mã. Ông để lại tác phẩm “Hoạt nhăn toát yếu” (Phép cốt yếu cứu người) gồm nhiều phương thuốc chữa bệnh. Các đòi vua về sau đều có sắc phong ghi nhớ công lao của ông. Nhà nước ta cũng đã xếp hạng Di tích lịch sử miếu thò ông tại làng Đa Sĩ (hay Đan Sĩ), Hà Đông (nay thuộc Hà Nội). - Hải Thượng Lãn ông (1720 - 1791) chính tên là Lê Hữu Trác, nguyên quán thôn Văn Xá, làng Liêu Xá, phủ Thượng Hồng, tỉnh Hải Dương. Lê Hữu Trác hồi nhỏ theo cha đi học ở kinh thành Thảng Long (Hà Nội) nổi tiếng là người thông minh, học rộng, văn thơ lỗi lạc. Tuy nhiên sống dưới thòi rối ren cực độ của chính quyền nhà Trịnh, ông chán ghét chiến tranh, viện cố về Hương Sơn nuôi mẹ. Nhân thời gian nằm chữa bệnh ở nhà lương y Trần Độc ông mượn sách thuốc để đọc. Vốn là người thông minh, học rộng, càng đọc sách thuốc ông càng thấy thú vị say mê. Lại thấy làm nghề y thiết thực ích lợi cho mình, vừa có điều kiện giúp đỡ mọi ngưòi nên ông quyết chí học thuốc. Sau mấy chục năm đúc kết kinh nghiệm thực tiễn, nghiên cứu sâu rộng kinh điển y học Trung Hoa kết hợp với y học dân tộc cô truyền, ông biên soạn trong 26 năm bộ sách thuốc "Hải Thượng y tông tâm lĩnh" gồm 28 tập, 66 quyển. Trước tác của ông chẳng những được dùng đê giảng dạy y học mà còn phục vụ trị bệnh cho nhân dân đương thời. Đặc biệt, Hải thượng Lãn ông đã phát huy chủ trương ''Dùng thuốc Nam chữa bệnh cho người Nam" của Tuệ Tĩnh. Ông đã SƯU tầm hơn 300 vị thuốc mói, phát hiện và nghiên cứu trên lâm sàng, tổng hớp thêm nhiều phương thuốc gia truyền công hiệu và phổ biến cho nhân dài! để mọi ngươi tự chữa các bệnh thông thường với cây nhà lá vưòn sẵn có. Ông viết: " Thuốc thang sẵn có khắp nơi Trong vườn ngoài ruộng trên đồi dưới sông Hàng ngàn thảo mộc thú trùng, Thiếu gì thuốc bô thuốc công quanh mình". Lãn ông là một nhà y học nổi tiếng cùa dân tộc ta đã nêu cao đạo đức của ngưòi thầy thuốc, soi sáng cho y học nước nhà. Với những quan điểm nhân đạo và thực tế, về sau được nhân dân ta coi là một “Đại y tôn” của Việt Nam. Dưới thời Tây Sơn (1788 - 1802) vì chiến tranh liên tiếp, tình hình y được học không có gì đổi mới. Danh y thời bấy giờ có tiến sĩ Nguyễn Gia Phan đã có Đại cương về dược liệu học công dập tắt được nhiều vụ dịch, cứu sống nhiều người, ông đã biên soạn cuốh "Liệu dịch phương pháp toàn tập". Danh y Nguyễn Quang Tuân biên soạn cuốn "La Khê phương dược" gồm 13 cuốn và «uôn "Kim ngọc quyển' viết bằng chữ nôm ghi nhiều phương thuốc gia truyền. Dưới thời triều Nguyễn có Trần Nguyệt Phựơng viết cuốn "Nam Bang thảo mộc" trong đó viết nhiều cây thuốc theo kinh nghiệm. Dưới thài Pháp thuộc (1885 - 1945), thực dân Pháp tổ chức nền y tế theo lối tây y, hạn chế đông y. Tuy thế trong thòi kỳ này cũng có nhiều tập sách có giá trị: - Đinh Nho Chân và Phạm Văn Thái biên soạn "Trung Việt Dược tính Hợp biên" gồm 16 cuốn viết công dụng, cách chế biến 1655 vị thuốc bắc và nam. - Nguyễn An Nhân vối tập 'Y học Từng thư" gồm 16 cuốn bằng tiếng Việt. - Phó Đức Thành với tập "Việt Nam Dược học" gồm 5 cuốn bằng tiếng Việt. Ngoài các tác già ngưòi Việt, các tác giả ngưòi Pháp cũng có biên soạn một số sách viết về cây thuốc ở Đông Dương: - Ch. Crevost và A. Petelot - Danh mục các sản phẩm Đông Dương - Các dược phẩm (Catalogue des produits de 1’Indochine * Produits médicinaux). - A. Petelot - Những cây thuốc của Campuchia, Lào và Việt Nam (Les pỉantes médicinales du Cambodge du Laos et du Vietnam). Từ ngày cách mạng tháng 8 - 1945 cho đến nay, nhà nước ta rất quan tâm đến việc kết hợp y học cổ truyền với y học hiện đại. Trong thời kháng chiến chống Pháp và Mỹ, quân dân ta đã tận dụng nguồn dược liệu địa phương để bào chế ra thuốc men, tự túc được*một phần quan trọng trong nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh. Nhiều cơ sở và tổ chức y được học cổ truyền đã được thành lập như Viện Nghiên cứu Đông y, Viện Y dược học Dân tộc, Viện Dược liệu, Hội Đông y... Nhiều tài liệu về cây thuốc được biên soạn, đặc biệt cuốn "Những Cây thuốc và VỊ thuốc Việt Nam" do GS.TS. Đỗ Tất Lợi biên soạn, đã được tái bản nhiều lần. Cuốn sách này được đánh giá cao không chỉ ở trong nưổc mà còn cả ỏ nước ngoài. Thứ trưởng Bộ Y tế Vũ Công Thuyết dã viết trong lồi giới thiệu bộ sâch lần xuất bẳn đầu tiên1 như sau: "... bộ sách đã thể hiện một công trình sưu tầm, nghiên cứu rất công phu, một khôi lượng lao động râ't lân trong nhiều nảm của tác giả. Nhiều công trình nghiên cứu trong nưốc, nhiều tài liệu nước ngoài đã được khảo sát, chọn lọc cộng vởi hơn 20 nảm trong nghề của tác giả, một cán bộ đã có nhiều nhiệt tình và cống hiến trong việc nghiên cứu thuốc nam”. Giáo sư về Dược liệu, A. p. Gammerman của Đại học Dược Leningrad đã đánh giá rất cao về bộ sách và nhận xét rằng công trình vừa có nội dung khoa học hiện đại, vừa có giá trị về y học cổ truyền phương đông. Tại 1 Sách được nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội xuất bản lần đầu nãm 1962-1965 gổm 6 cuốn. Đại cương về dược liệu học Hội chợ sách quốc tế tại Matxcơva năm 1983, bộ sách được đánh giá là một trong bảy đầu sách quý của triển lãm. Năm 2007, bộ sách được giải thưởng đặc biệt của Hiệp hội xuất bản châu Á - Thái Bình Dương. Giáo sư Đỗ Tất Lợi là nhà khoa học lỗi lạc, chủ nhiệm đầu tiên của Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Hà Nội giai đoạn sau 1945, là người đầu tiên tìm hiểu đông y và cây cỏ Việt Nam bằng ánh sáng của y học hiện đại để đưa vào giảng dạy trong chương trình đại học. Do có công đóng góp lổn cho ngành y tế Giáo sư Đỗ Tất Lợi đã đừợc vinh dự được nhà nước trao tặng giải thưỏng lớn - “Giải thưởng Hồ Chí M inh” đợt 1 về khoa học công nghệ năm 1997. Giáo sư Đỗ Tất Lợi sinh ngày 01 tháng 02 năm 1919 tại Phù Xá, Kim Anh, Phúc Yên (nay là Phú Minh, Sóc Sơn, Hà Nội), tạ thế ngày 03 tháng 02 năm 2008. Từ những năm 1958, Nhà nưóc, Bộ Y tế đã có nhiều chỉ thị, nghị quyết nói về phương châm kết hợp y học hiện đại với y học cổ truyền, khai thác phát triển cây thuốc và động vật làm thuốc, nghiên cứu và sử dụng thuốc Nam. Các văn kiện quan Irọug liên quan đến phát triển dược liệu hao gồm: - Chỉ thị 210/TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 06-12-1966. Chỉ thị nêu rõ tầm quan trọng của dược liệu Việt nam trong điều trị cả trong y học cổ truyền và y học hiện đại; là nguồn lợi cho việc sản xuất trong nước và cho xuâ"t khẩu. - Nghị quyết 200 CP ngày 21-08-1978 của Hội đồng chính phủ về việc phát triển dược liệu trong nước. - Quyết định 108/2002/QĐ-TTG ngày 15 tháng 8 năm 2002 của Thủ tướng chính phủ về việc phê duyệt chiến lược phát triển ngành dược trong đó chú trọng đầu tư, phát triển tiềm năng dược liệu, sản xuất nguyên liệu làm thuốc có thế mạnh, đặc biệt là từ dược liệu. VỊ TRÍ CỦA DƯỢC LIỆU TRONG NGÀNH Y TẾ VÀ TRONG NỀN KINH TẾ QUỐC DÂN Thuốc phòng bệnh và chữa bệnh được điều chế từ 2 nguồn: dược liệu và hoá chất tổng hợp. Riêng dược thảo, thông kê chưa đầy đủ của Tổ chức Y tế thế giới cho thấy có hơn 21.000 loài cây cỏ được các dân tộc trên thế giới sử dụng làm thuốc. Không chỉ các nước Á Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Thống kê cho thấy rằng ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì 1/4 số’ thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ thảo mộc. Chỉ tính riêng thị trường các nước phát triển năm 1998, doanh thu từ thuốc có nguồn gốc thảo mộc (các phytomedicine, không tính các chất tinh khiết lấy từ được liệu) là 10 tỉ USD ở Châu Âu và 4 tỉ USD ở Mỹ. Tổng doanh thu của thuốc có nguồn gốc thảo mộc trên thế giới ước tính vào khoảng 30 tỉ USD vào năm 2000. Đại cương về dược liệu học Nếu tính cả các loại thực phẩm chức năng, dược liệu thô thì con số này còn cao hơn nhiều. Chỉ riêng’ thị trường Mỹ năm 1998, con số’ này là 13,6 tỉ USD. Tốc độ tăng trưởng của thuôc có nguồn gốc tự nhiên, tuỳ theo vùng, tăng từ 5 - 15% mỗi năm [International Trade Forum - 3/2001]. Doanh sô" eủa dược liệu và các sản phẩm từ được liệu hiện nay trên toàn cầu ước tính vào khoảng 82 tỉ USD [Purohit, s.s. et al. Medicinal Plant Cultivation: A Scientific Approach, Laurier Books, 2007] và dự đoán của Tổ chức Y tế thế giới có thể lên tới 5.000 tỉ vào năm 2050 JThe Financial Express, Mar 03, 2004). Nhiều biệt dược đông dược của Trung Quô"c được tiêu thụ mạnh ỗ các nước châu Âu. Gần đây Việt Nam cũng có một sô" mặt hàng đông được xuất khẩu có tín nhiệm trên thị trường nước ngoài. Nhiều hoạt chất quan trọng như quinin, morphin, ajmalicin, vincaleucoblastin, digitalin, digoxin... đều phải chiết ra từ được liệu mà chưa có thể đi bằng con đường tổng hợp. Dược liệu cũng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho việc bán tổng hợp một sô" thuốc. Chỉ riêng nhu cầu để bán tổng hợp các thuốc steroid, hàng năm thế giới cần khoảng 100.000 tấn củ mài có chứa diosgenin. Dược liệu còn cung cấp các khung cơ bản để tổng hợp các thuốc mối, mở đường cho hoá dược phát triển. Ví dụ ephedrin là hoạt chất có trong cây Ma hoàng, một đã được sử dụng cách dây 4000 năm, y học hiện đại mới biết cách đây vài thế kỷ. Bắt chước thiên nhiên, hoá dược đi bằng con đường tổng hợp bằng cách ngưng tụ L-1-phenyl-1-acetyl carbinol với methylamin để có ephedrin và sau đó là các chất có cấu trúc tương tự. Dựa vào cấu trúc của quinin trong canh ki na người ta tổng hợp nhiều dẫn chất trị sốt rét khác. Dựa vào artemisinin được phân lập từ cây Thanh cao hoa vàng, các dẫn chất arteether, artemether, artesunat được bán tổng hợp cũng để điều trị bệnh sốt rét. Hiện nay, người ta vẫn có xu hướng nghiên cứu các hoạt chất có cấu trúc mới từ dược liệu rồi từ đó bán tổng hợp các dẫn chất có hiệu quả hơn. Từ năm 1950 đến 1980 sau khi thử tác dụng chống ung thư của 40.000 loài thảo mộc, người ta đã phân lập được một sô' hoạt chất có tác dụng chữa được ung thư, trong đó có chất paclitaxel (taxol®) được phân lập từ cây Taxus brevifolia Nutt, họ Taxaceae có tác đụng chữa được ung thư, đặc biệt là ung thư buồng trứng ở thòi kỳ tiến triển. Năm 1992 ở Mỹ, Canada và Pháp đã sử dụng taxol trên lâm sàng. Hiện nay, ngưòi ta nghiên cứu bán tổng hợp taxol và các dẫn châ't (như docetaxen với biệt dược taxotere®) từ 10-desacetyl baccatin III, một chất có khung taxan có trong thông đỏ. Đốì-với Việt Nam, dược liệu có một vị trí quan trọng. Nưốc ta nằm trong vùng nhiệt đới, chịu ảnh hưởng của gió mùa, nhiệt độ trung bình hàng năm là 25°c, độ ẩm khá cao tạo điều kiện thuận lợi cho cây cối phát triển. Diện tích rừng chiếm 2/3 diện tích đất nước. Hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, cả nưốc hiện đã biết có 12.000 loài thực vật có mạch. Trong đó có trên 4.000 loài cây thuốc. Nưốc ta có bờ biển trên 3.200 km chạy dài từ Bắc chí Nam nên có nhiều hải sản quỵ dùng làm thuốc. Nưóc ta ỉại có một sô' vùng có độ cao trên Đại cương về dược liệu học 1000m như Sapa, Đà Lạt thuận lợi cho việc di nhập một số cây thuốc vùng ôn đới như Actisô, Dương địa hoàng, Dương cam cúc, Cúc gai... Nếu biết cách khai thác và nghiên cứu nuôi trồng hợp lý thì các nguồn tài nguyên này sẽ có nhiều đóng góp cho ngành dược nước ta. Dân tộc ta cũng như Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và một sô" nước Đông Nam Á khác lại có truyền thông chữa bệnh theo lối y học cổ truyển từ lâu đời, đòi hỏi cung cấp một số lượng rất lớn về dược liệu. Trong những năm gần đây lượng thuốc Bắc ta nhập của Trung Quốc khá nhiều, nếu có kế hoạch đẩy mạnh việc trồng trọt và di thực thêm các cây thuốc thì sẽ hạn chế được sự lệ thuộc. Về mặt kinh tế, nhà nước ta đã xếp cây thuốc vào loại cây công nghiệp cao cấp cần được phát triển như những cây công nghiệp khác. Hàng năm các công ty kinh doanh dược liệu đã biết khai thác nhiều mặt hàng dược liệu để xuất khẩu như hoa Hoè, Quế, Sa nhân. Dừa cạn. các loại tinh dầu Hồi, Quế, Tràm... THU HÁI - CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN DƯỢC LIỆU I. THU HÁI DƯỢC LIỆU Chất lượng một dược liệu tốt hay xấu chủ yếu là do hàm lượng hoạt chất chứa trong dược liệu nhiều hay ít. Hoạt chất của dược liệu thay đổi bởi nhiều yếu tô": di truyền, điều kiện địa lý khí hậu, trồng trọt, thu hái, phơi sấy; bảo quản, ở đây, chúng ta xem xét vấn để thu hái. Nếu thu hái dúng nguyên tắc thì hàm lượng hoạt chất ta mong muốn có trong dược liệu sẽ đạt được tối đa. Cũng cần biết rằng mỗi dược liệu có thể có nhiều hoạt chất khác nhau, hàm lượng của mỗi hoạt chất có thể thay đổi tuỳ theo mùa, tuỳ theo chu kỳ phát triển của cây. Nếu thu hoạch đúng thời gian (có thể thay đổi tuỳ theo khí hậu, địa dư của mỗi vùng hay xê dịch chút ít theo thời tiết trong năm) dược liệu thu được sẽ có hoạt chất tối đa. Ví dụ: - Bạc hà có hàm lượng tinh dầu cũng như menthol trong tinh dầu đạt tối đa ỉúc cây bắt đầu ra hoa. Tinh dầu ỏ cây còn non chủ yếu là menthon. - Canh ki na có hàm lượng alcaloid trong vỏ cây tăng nhanh theo sự phát triển của cây và đạt tối đa vào năm thứ 7. - Hoa hòe hái lúc còn nụ thì hàm lượng rutin cao, khi hoa nở hàm lượng ru tin thấp. - Thành phần hoạt chất cũng có thể thay đổi theo thời gian, ví dụ cây Duboisia myoporoỉdes ồ Queensland khi thu hoạch vào tháng 10 thì chứa 3% hyoscyamin nhưng khi thu hoạch vào thấng 4 thì chứa scopolamin với hàm lượng như trên. Đại cương về dược liệu học Nhìn chung, nên thu hái dược liệu lúc trời nắng ráo giúp cho việc phơi sây và bảo quản dược liệu. Các cây có tinh dầu nên thu hái vào buổi sớm trưóc lúc mặt tròi mọc. Sau đây là nguyên tắc chung định thòi kỳ thu hoạch cho từng bộ phận của cây: 1. Rễ và thân rễ nên thu hoạch vào cuôì thồi kỳ sinh dưỡng, thưòng là vào thời kỳ thu đông. Tuy nhiên có trưòng hợp đặc biệt như rễ Bồ công anh cần hái vào giữa mùa hè vì khi ấy chứa nhiều hoạt chất. Có thể đào lúc ẩm ướt vì sau đó vẫn phải rửa sạch đất cát trước khi phơi sấy hoặc chế biến. ĐỐI với cây sông nhiều năm, người ta thưòng thu hái vào những năm sau để rể, củ có khối lượng lớn và hàm lượng hoạt châ't cao. Nhưng cũng không nên quá lâu vì rễ hay củ sẽ hoá gỗ hoặc phải cân nhắc giữa việc tăng hàm lượng hoạt chất và thời gian bị mất. Hàm lượng hoạt chất giữa các phần của củ có thể không giông nhau. Trong Đại hoàng và Bạch chỉ hàm lượng hoạt chất tăng dần từ phần gần mặt đất xuống phần chót của củ. 2. Vỏ cây (vỏ thân, cành và vỏ rễ) thường thu hoạch vào mùa xuân là thời kỳ nhựa cây hoạt động mạnh hay cuối mùa thư, đầu mùa đông khi cây phát triển chậm lại. Việc thu hái vỏ cây phải chú ý tới việc bảo vệ cây. Thu hái vỏ rễ đồng nghĩa vổi làm chết cây. vỏ cây quá già hoặc quá non thường có chất lương thấp hơn. 3. Lá và ngọn cây có hoa phải hái vào thòi kỳ quang tổng hợp mạnh nhất thường ỉà lá bánh tẻ vào thời kỳ cây bắt đầu ra hoa, không nên hái khi quả và hạt đã chín. Tuy nhièn với lá Trà, người ta hái búp và lá non còn với lá Bạch đàn người ta thường hái những lá già. Với những cây thảo, người ta có thể thu hái toàn cây cả rễ hay loại bỏ rễ. 4. Hoa phải hái lúc trời nắng ráo, khi còn là nụ hay trước hoặc đúng vào thòi kỳ hoa nở. Hái trước khi hoa nở như nụ Hòe, Đinh hương, Kim ngân. Hái khi hoa nở như Hồng hoa, Cà độc dược. 5. Quả được thu hái vào những thời gian khác nhau, tuỳ theo dược liệu nhưng thường là khi quả đã già hoặc chín. Quả thu hái ngay trước khi chín như mơ, hồ tiêu, chỉ xác hay khi quả chín như quả dâu, nhãn. Các loại quả nang, quả hạch, quả dĩnh thường thu hái khi đã già như Tiểu hồi, Sà sàng, Đại liồi. Một số loại quả có thể hái khi quả còn non như chỉ thực, quả cây Conium manỉciilatum L. 6. H ạt thưòng được thu hái khi quả đã già, bắt đầu khô như Sen, Ý dĩ. Dù thu hái bộ phận nào của cây cũng nên giữ cho dược liệu được sạch sẽ, tránh các cầy lạ, đất cát, rác v.v... Nếu là củ nên giũ hoặc rửa sạch đất trưốc khi phơi sấy. Các bộ phận to, cứng hay nhiều nước như củ, quả, thân v.v... thường được cắt nhỏ trước khi phơi sây. Đại cương về dược liệu học Trên đây là một sô' nguyên tắc chung, tuy nhiên, đối vói từng dược liệu cụ thể cần chú ý theo dõi sự thay đổi hàm lượng của hoạt chất để định thời gian thu hoạch để đạt đưctc kết quả tốt nhất. II. ỔN ĐỊNH DƯỢC LIỆU Dược liệu nguồn gốc thảo mộc thường chứa nhiều enzym như enzym thuỷ phân cắt các dây nối osid, enzym cắt dây nốì ester, enzym đồng phân hoá, enzym oxy hoá, enzym trùng hợp hóa... Người ta đã phân lập được hàng tràm enzym khác nhau. Bản chất enzym là protein hoặc có phần cơ bản là protein, tuy nhiên cấu trúc của chúng chưa được biết một cách đầy đủ. Enzym là những chất xúc tác hữu cơ của các phản ứng xảy ra trong các tế bào của thực vật và động vật. Enzym tồn tại trong dược thảo sau khi thu hái sẽ hoạt động mạnh ở nhiệt độ 25°c đến 50°c với độ ẩm thích hợp. Chúng tác động lên các hoạt chất để chuyển thành các sản phẩm thứ cấp. Ví dụ, trong cây dương địa hoàng tía, enzym digipurpidase cắt bồ một đơn vị glucose trong mạch đưòng của purpurea glycosid A và B để biến hai chất này thành glycosid thứ cấp là digitoxosid và gitoxosid tương ứng. Trong cây Hành biển, enzym scillarenase cắt bớt một glucose của scillaren A để cho proscillarin A. Các alcaloid có dây nối ester như hyoscyamin có trong lá cây belladon, Cà độc dược có thể bị enzym cắt dây nối ester để cho tropanol và acid tropic. Các glycerid thì bị enzym lipase cắt thành glycerol và acid béo. Acid ascorbic thường gặp trong thực vật thì bị enzym ascorbinodehydrogenase oxy hóa. Chất ranunculin có trong một số cây thuộc họ Mao lương, dưói tác dụng của enzym có sẵn trong cây cũng bị thuỷ phân thành protoanemonin rồi chất này lại bị dimer hoá để tạo thành chất anemonin mà người ta chỉ thấy ở cây khô. Còn nhiều ví dụ để dẫn chứng sự tác động của enzym làm biến đổi hoạt chất. Với phương pháp làm khô sẽ trình bày ở mục sau hoặc làm lạnh hoặc nghiền dược liệu tươi với một vài hoá chất như ammonisulfat, natrichlorid thường chỉ ức chế enzym. Chúng sẽ hoạt động trỏ lại khi có điều kiện thích hợp. Để phá huỷ enzym làm cho chúng không hoạt động trở lại người ta đề ra các phương pháp gọi là phương pháp "ổn định". 1. Phương pháp phá huỷ enzym bằng cồn sôi Phương pháp này cho một cồn thuốc ổn định, cách làm như sau: cắt nhỏ dược liệu tươi, thả từng ít một (để cồn vẫn tiếp tục sôi) vào cồn 95 % đang đun sôi. Lượng cồn dùng thường gấp 5 lần lượng dược liệu. Sau khi đã cho hết dược liệu, lắp ông sinh hàn đứng và giữ cho cồn sôi trong 30 - 40 phút. Đê’ nguội, gạn lấy cồn. Dược liệu đem giã nhỏ và chiết kiệt lần hai. Như vậy ta có một dung dịch cồn hoặc cao sau khi bốc hơi cồn chứa các hoạt chất của cây tươi. Đại cương về dược liệu học 2. Phương pháp dùng nhiệt ẩm Hơi cồn Dùng nổi hấp, cho vào một ít cồn 95 %, xếp dược liệu trên các vỉ chồng lên nhau. Vỉ dưới cùng nằm trên mặt cồn. Vỉ trên cùng được đậy bằng một nón kim loại để tránh cồn khi đọng lại nhỏ trên dược liệu. Đậy nồi, vòi thoát để ngỏ. Đun nhanh và dẫn hơi cồn ra xa lửa bằng một ống dẫn. Sau khi đã xả hết không khí, đóng vòi lại, làm tăng áp suất và giữ vài phút ở 1,25 atmosphe. Để nguội, mỏ nồi lấy dược liệu ra rồi làm khô. Phương pháp này cho ta dược liệu có màu sắc đẹp, thành phần hoá học giông như dược liệu tươi. Hơi nước Cách tiến hành như trên nhưng thay cồn bằng nước và giữ ở nhiệt độ 105 - 110°c trong vài phút. Phương pháp này hay dùng đốì với các bộ phận dày, cứng như rễ, vỏ, gỗ, hạt nhưng có nhược điểm: tinh bột biến thành hồ, protein bị đông lại, do đó sau khi làm khô, dược liệu có trạng thái sừng làm cho việc chiết xuất hoạt chất không thuận lợi. 3. Phương pháp dùng nhiệt khô Phương pháp này đã được sử dụng từ lâu để chế biến chè xanh bằng cách sao để phá huỷ enzym, ngược lại vối việc chế chè đen bằng cách để cho enzym hoạt động. Ớ quy mô công nghiệp, ngưòi ta ổn đinh bằng cách thổi một luồng gió nóng 80 - 110°c có khi còn nâng nhiệt độ lên 300°c hoặc hơn trong một thời gian rất ngắn đi qua dược liệu. Phương pháp này không được hoàn hảo vì trong môi trường khô enzym khó bị phân' huỷ. Ngoài ra, vì làm nóng nhanh nên tạo xung quanh dược liệu một lổp mỏng khô bao phía ngoài làm cho việc làm khô tiếp theo bị khó khăn. Hơn nữa, một vài chất trong dược liệu cũng bị biến đổi như protein bị vón, tinh dầu bị bay hơi, đưòng bị chuyển thành caramen. Trên đây là một số phương pháp chính để phá huỷ enzym, đảm bảo cho hoạt chất trong dược liệu sau khi làm khô được giữ nguyên vẹn như khi còn tươi. Tuy nhiên, cũng có trường hợp ngưòi ta để cho enzym hoạt động để tăng hàm lượng hoạt chất mong muôn, ví dụ muôn tăng hàm lượng diosgenín trong nguyên liệu, người ta ủ nguyên liệu tươi với nưởc. Muôn chiết digitoxin trong lá Dương địa hoàng thì cứ để cho enzym hoạt động. III. LÀM KHÔ DƯỢC LIỆU Làm khô dược liệu mục đích để bảo quản dược liệu khỏi bị nhiễm mốc, vi khuẩn, bị tác động bỏi enzym và hạn chế các biến đổi hoá học có thể xảy ra trong dược liệu như bị thuỷ phân, oxy hoá, đồng phân hoá, trùng hợp hoá. Dược liệu khô thì dễ xay nghiền và vận chuyển thuận lợi. Việc làm khô liên quan đến 2 yếu tố là nhiệt độ và thông hơi. Tuỳ theo yêu cầu của mỗi dược liệu mà nhiệt độ và thời gian phơi sấy được khống chế. Đại cương về dược liệu học 1. Phơi Có 2 cách phơi là phơi dưối ánh nắng mặt trời và phơi trong râm. Phơi dưới ánh nắng mặt trời: thông thường dược liệu được trải trên các tấm liếp đặt cao khỏi mặt đất vừa để tránh lẫn đất cát vừa để thoáng khí ở cả mặt dưới lốp dược liệu. Trong quá trình phơi thường xuyên xới đảo. Thời gian phơi có thể kéo dài từ vài giò đến vài ngày tuỳ theo lượng nước chứa trong được liệu và thời tiết. Cách phơi này đơn giản ít tốn kém nhưng có một sô" nhược điểm như bị động bởi thời tiết, nhiễm bụi, thu hút ruồi nhặng đối với dược liệu có đường, một sô' hoạt chất trong dược liệu có thể bị biến đổi bỏi tia tử ngoại. Phơi trong râm: dược liệu được trải mỏng trên các liếp hoặc buộc thành bó nhỏ rồi treo hoặc vắt theo kiểu chữa X trên các sợi dây thép. Việc làm khô được tiến hành trong các lều chung quanh không có vách. Phơi trong râm thường được áp dụng vối các dược liệu là hoa để bảo vệ màu sắc hoặc các dược liệu chứa tinh dầu. 2. Sấy Sấy là biện p h á p Quạt hút tuy tốn kém nhưng có f—w| I ____ lợi ở chỗ không bị Ị—/ ^ ■■■■■— động bỏi thòi tiết, rút 1 U Q Q Q Ư ' o o ngắn thời gian làm Qyạt ngắn thời gian làm khô, bảo vệ được một số dược liệu khỏi bị biến đổi bởi tia u v và làm khô nhanh nên XXX. Q Q Lò sấy n làm giảm tác động của enzym. Khác với phới, sấy phải được thực Lối váo của toa xe mang nguyên 6êu đến sấy Lối ra của nguyên liệu đă sáy hiện trong buồng kin “ sáv kil“ hểm hiện trong buồng kín nhưng có lỗ thông hơi. Nhiệt độ của lò cung cấp nhiệt có thể điều chỉnh để nhiệt độ sây có thể thay đổi từ 30 - 80°c. Lúc khỏi đầu không nên để nhiệt độ cao quá vì sẽ tạo ra một lớp mỏng khô bao ngoài dược liệu làm ngăn cản sự bốc hơi nước của các lốp bên trong. Điều kiện thông hơi (thường dùng quạt hút) cũng phải theo dõi để vừa đủ đẩy hết không khí bão hoà hơi nước khỏi buồng sấy. Đối với các loại củ, rễ hoặc thân rễ thưòng được thái mỏng hoặc đập Hập để dễ khô. Hiện nay, đối vối cây thuốc người ta hay thiết kế buồng sấy kiểu hầm thông. Thiết bị cung cấp nhiệt được đặt ồ một đầu buồng sấy và ở dưới thấp, quạt gió hút ỏ đầu đốỉ diện và ỏ phía trên cao. Trong hầm thông có các đường ray để các xe mang các khay sấy chứa dược liệu di chuyển dễ dàng. Khay sấy thường có chiều dài 1,5 m và rộng 0,80 m được làm bằng lưới kim loại hoặc bằng vải. Các khay được xếp chồng lên nhau, cách nhau vừa đủ để không khí lưu thông dễ dàng. Lúc bắt đầu sấy, người ta đặt một xe đầu tiên ỏ lối vào đối diện với nguồn cung cấp nhiệt. Sau đó đẩy xe thứ nhất ìên và đặt xe thứ hai rồi cứ Đại cương về dược liệu học tiếp tục tiến hành như vậy. Điều chỉnh nhiệt độ và thời gian để khi mỗi xe tới gần lò nhiệt thì dược liệu đã khô và cho ra khỏi lò sấy. 3. Làm khô trong tủ sây ở áp suâ't giảm Dược liệu được đặt vào tủ sấy có của đóng thật kín, có nhiệt kế để theo dõi nhiệt độ và đồng hồ đo áp suất. Tủ được nối với máy hút chân khồng. Nhò sấy ở điều kiện áp suất giảm nên thời gian sây nhanh và có thể sấy ở nhiệt độ thấp (25 - 40°C). Tuy nhiên, phương pháp này không áp dụng được với khôi lượng dược liệu lớn, thường chỉ dùng để làm khô một sô' cao thuốc hoặc một sô' dược liệu quý mà hoạt chất dễ bị hỏng bởi nhiệt độ. 4. Đông khô Đây là phương pháp làm khô bằng cách cho tinh thể nưdc đá thăng hoa. Muôn vậy, nguyên liệu được làm lạnh thật nhanh ở nhiệt độ rất thấp (-80°C) để nưốc chứa bên trong nguyên liệu kết t.inh nhanh ở dạng tinh thể nhỏ. Nguyên liệu được giữ ỏ nhiệt độ thấp trong quá trình đông khô và được đặt ỏ trong buồng thật kín có nối vối máy hút chân không. Nước ỏ thể rắn trong nguyên liệu bị thăng hoa dưới áp suất giảm (10-5 mmHg). Vói phương pháp đông khô, nguyên liệu có thể được làm khô tuyệt đối, các hoạt chất không bay hơi cũng được bảo vệ nguyên vẹn, các enzym bị ức chế nhưng có thể hoạt động trỏ lại ỏ điều kiện bình thường, cấu trúc của các mô cũng không bị biến đổi. Phướng pháp đông khô thưòng chỉ dùng để làm khô một sô' dược liệu quý như nọc rắn, sữa ong chúa hoặc trong nghiên cứu các dược liệu chứa những hoạt chất rất dễ bị biến đổi. IV. ĐÓNG GÓI VÀ BẢO QUẢN DƯỢC LIỆU 1. Chọn lựa Việc chọn lựa mặc dầu đã được thực hiện một phần trong quá trình thu hái, tuy nhiên sau khi sấy khô nhất thiết phải chọn lựa lại trước khi đóng gói đưa ra thị trường để đảm bảo dược liệu đạt tiêu chuẩn quy định. Một sô" qui định thường được đề ra về: - Tạp chất, bao gồm các tạp chất hữu cơ (rơm rạ, vật lạ khác) hoặc vô cơ (đất, cát...). - Các bộ phận khác với bộ phận quy định được dùng (cành lẫn với lá, rễ lẫn với thân...)- - Màu sắc, mùi vị. - Tỉ lệ của dược liệu bị vụn nát. - Dược liệu bị nhiễm mốc mọt. Đại cương về dược liệu học Công việc chọn lựa chủ yếu tiến hành bằng tay, có thể dùng dụng cụ hoặc máy móc đơn giản như rây có kích thưốc mắt khác nhau, quạt gió ... 2. Đóng gói Mục đích của việc đóng gói là để bảo vệ dược Ịiệu về mọi mặt trong thời gian vận chuyển hay bảo quản. Khi đóng gói cần phải theo đúng tiêu chuẩn về loại bao bì, kích thước, khối lượng, hình dáng. Phải có nhãn ghi rõ: Tên dược liệu, khối lượng nguyên, khối lượng cả bì, nơi sản xuất, số kiểm soát. Nếu đóng gói nhỏ có thể dùng ngay thì trên nhãn phải ghi cả công dụng, cách dùng, liều dùng, hạn dùng. 3. Bảo quản Bảo quản dược liệu là biện pháp nhằm giữ phẩm chất và hình thức của dược liệu không bị giảm sút trưốc khi chúng được sử dụng. Trong thời gian bảo quản, dược liệu chịu ảnh hưỏng của nhiều yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, sâu mọt và nấm mốc dẫn tới biến đổi màu sắc mùi vị, giảm hàm lượng hoạt chất, bị nhiễm nấm mốc, sâu mọt sinh ra các chất độc hại khác. Độ ẩm trong không khí cao là nguyên nhân chính làm giảm chất lượng dược liệu. Nếu dược liệu dễ hút ẩm thì phải đựng trong bao bì bằng nhựa tổng hợp hoặc bằng sắt và dưới đáy có để chất hút ẩm. Nấm mốc thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penỉcillium, Mucor, Rhizopus. Sâu mọt trên dược liệu hay gặp các loại: mọt gạo (Sìtophyỉlus oryzae), mọt thóc đỏ (Tribolium ferrugineum), mọt cà phê (Araecerus fasciculatus), mọt thuốc (|Stegobium paniceum)... Muôn bảo vệ dược liệu tốt thì phải xây dựng kho chứa đúng quy cách. Kho thường được xây dựng bằng các nguyên liệu chông cháy. Kho phải mát, thoáng gió, khô ráo. Giữa các giá phải có lối đi lại. Các dược liệu phải được xếp đặt theo từng khu vực để dễ tìm, <ỉễ kiểm soát. Các dược liệu độc như Cà độc được, Ô đầu, Mã tiền... và các dược liệu có tinh dầu như Hồi, Đinh hương, Quế, Bạc hà... phải để riêng. Định kỳ phải theo dõi nấm mốc, sâu bọ. Khi dược liệu bị nấm mốíc thì phải xử lý như rửa, lau nưóc hoặc cồn rồi phơi sấy lại, nếu nhiễm nặng thì phải loại bỏ. Nếu dược liệu bị sâu mọt phương pháp đơn giản nhất là sấy ỏ 65°c. Có thể phòng chông nấm mốc, sâu mọt bằng cách sử dụng bức xạ y Co80 chiếu từ 0,25 KGy đến 1 Kgy. Quy định cho việc sử dụng này tưỳ thuộc vào từng quốc gia. Dược liệu vói số lượng ít và rất dễ sâu mọt thường được đựng trong những hộp hoặc thùng sắt kín và nhỏ xuống đáy thùng một vài giọt chloroform. Đại cương về dược liệu học CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ Dược LIỆU Đánh giá một dược liệu nghĩa là xác định dược liệu đó có đạt tiêu chuẩn quy định hay không. Khi đánh giá, có thể dựa vào tiêu chuẩn nhà nước được ghi trong Dược điển hoặc theo tiêu chuẩn cơ sở. Các chỉ tiêu của một tiêu chuẩn được đề ra để đảm bảo chất lượng của dược liệu và có căn cứ để giao dịch trên thị trường Tiêu chuẩn của một dược liệu thường bao gồm: - Đặc điểm hình thái gồm các đặc điểm cảm quan, đặc điểm vi học của dược liệu. - Thử tinh khiết: độ ẩm, độ tro, tạp chất hay các hằng số vật lý. - Định tính thành phần chính trong dược liệu. - Đinh lượng thành phần chính hoặc hàm lượng cao chiết được của dược liệu. I. CẢM QUAN Phương pháp cảm quan nghĩa là dùng các giác quan của chúng ta để đánh giá, phân biệt các dược liệu. Dùng mắt để quan sát hình dáng bên ngoài, kích thước, màu sắc của dược liệu; đối vói một vài dược liệu thì cần phải bẻ ra đê quan sát bên trong. Dùng tay để cảm nhận thể chất, mức độ nặng nhẹ, xốp chắc, trơn hay dính của dược liệu. Mùi là đặc điểm của nhiều dược liệu chứa tinh dầu, nhựa. Vị của dược liệu có thể ngọt như cam thảo, cỏ ngọt; chua đối với dược liệu chứa acid hữu cơ; đắng như đối với các dược liệu chứa alcaloid, glycosid; cay như ớt, gừng... II. PHƯƠNG PHÁP SOI KÍNH HIÊN VI Phương pháp đánh giá dựa vào kính hiển vi bao gồm soi vi phẫu và soi bột. Đây là phương pháp hay dùng nhất để kiểm nghiệm dược liệu là các bộ phận của cây thuốc. Trong một vài trường hợp phương pháp này lại có ưu thế hơn phương pháp hoá học. Ví dụ, để phân biệt các loại tinh bột người ta không thể dựa vào phương pháp hoá học mà phải nhò vào các đặc điểm hiển vi. Một vài mảnh lá trúc đào trong dạ dày tử thi được xác định dễ đàng bằng soi vi phẫu hơn là làm phản ứng tìm oleandrosid. Dùng kính hiển vi không chỉ để xác định sự giả mạo mà còn có thể ưốc lượng tỵ lệ chất giả mạo căn oứ vào số lượng một đặc điểm nào đó của mẫu kiểm nghiệm so sáọh vói mẫu đối chứng. III. PHƯƠNG PHÁP DựA VÀO CÁC TÍNH CHAT VẬT LÝ Vối các dược liệu là các bộ phận của cầy cỏ, nhiều trường hợp có thể phát hiện bị pha lẫn hay giả mạo bằng cách soi mặt cắt dược liệu hay bột dược liệu dưới ánh đèn phân tích tử ngoại. Có khi, trước khi soi ngưòi ta nhỏ thêm trên bột dược liệu một vài loại thuốc thử (kiềm, acid...). Một sô' cao dược liệu cũng cho màu sắc khác nhau, các hoạt chất cũng vậy. Ví đụ, aconitin (lơ sáng), Đại cương về dược liệu học berberin (vàng), emetin (đỏ cam). Quinin cho màu xanh lơ trong dung dịch oxy acid ngay dưới ánh sáng thường và rất rõ dưói ánh đèn tử ngoại. Việc ứng dụng các.hằng số' vật lý để đánh giá thưòng hay tiến hành đối với các dược liệu không phải là các bộ phận của cây cỏ như tinh dầu, dầu béo và các hoạt chất. r Mỗi được liệu có các hằng số’ vật lý nằm trong 1 giái hạn nhất định. Khi kết quả nằm ngoài giới hạn này, dược liệu có thể kém chất lượng hay bị giả mạo, pha trộn bồi các chất khác. Độ hòa ta n : độ hoà tan của các chất thường được biểu thị bằng sô" mỉ dung môi tốì thiểu cần để hoà tan lg chất đó. Tỷ trọng: áp dụng cho các nguyên liệu là chất lỏng, đặc biệt đối với tinh dầu và dầu béo. Ví dụ, tỷ trọng ở 20°c của tinh dầu bạc hà: 0,890 - 0,922; của mật ong không dưới 1,38. Góc quay cực riêng: Đối với chất lỏng như tinh dầu, dầu béo, có thể đo trực tiếp năng suất quay cưc của chất lỏng. Khi đó [a] Is = —. Đổi với hoat chất rắn thì có thể pha loãng ỉd trong dung môi thích hơp. Khi đó [aìn = a xl0° . Góc quay cưc và tỉ trong đươc đo / X c ò cùng một nhiệt độ (ở đây là 25°C). (vói 1 (có thể tới 20 hay hơn) do vậy vẫn có thể được phân tích trong thiết bị phổ vối m /z 1000 - 2000. APCI tạo ra các ion dương được proton hoá hay ion âm do loại bỏ proton khỏi phân tử. Dung dịch mẫu được hoá hơi bởi nhiệt độ dưới dạng phun mù và đi vào vùng plasma của các ion dung môi tạo bởi hồ quang ở áp suất khí quyển. Sự cho nhận proton xảy ra giữa mẫu và dung môi tạo nên các ion của mẫu thử. Trong TSP, dung dịch mẫu được bơm dưói áp suất tương đối cao qua 1 mao quản được nung nóng bằng nhiệt điện. Khi ra khỏi ông mao quản, dung môi được hoá hơi hỗ trợ cho việc phun dung dịch thành các hạt mù rồi thành các ion đẩy vào bộ phận phân tích khối. TSP có thể áp dụng cho những hệ thông có tốc độ dòng cao (HPLC). Tuy nhiên, ngày nay kỹ thuật này phần lốn được thay thế bằng ESI. Ngoài những phương pháp ion hoá trên được sử dụng nhiều trong phân tích các hợp chất phân tử nhỏ còn có nhiều kỹ thuật ion hoá khác sử dụng cho các đại phân tử. Ví dụ, kỹ thuật bắn phá nhanh bằng nguyên tử {fast atom bombardment, FAB), các kỹ thuật giải hấp trường (field desorption, FD), giải hấp laser (laser desorption, LD) và một trong các kỹ thuật đang được sử dụng nhiều là kỷ thật giải hấp laser hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). Vối MALDI, mẫu được trộn vói dung dịch chất nền và được làm khô dung môi trên phiến kim loại rồi đưa vào buồng íon hoố của máy phổ khôi chứ không kết nối trực tiếp được với hệ thông sắc ký. 3.3. Bộ p h ậ n p h á n tích khối Mhiệm vụ của bộ phận phân tích khôi là phân tách hỗn hợp các ion sinh ra bởi bộ phận ion hoá thành từng loại ion riêng biệt theo m Ịz để đưa các ion này tới detector để ghi nhận phổ. Có nhiều cơ chế để tách riêng các ion như sử dụng từ trường, điện trường và vận tốc của các ion... Các bộ phân tích khối đang được sử dụng trong phổ khối gồm có các loại sau: cung từ (magnetic sector), tứ cực (quadrupole), bẫy ion (ion trap), thời gian bay (time of flight) và cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổi Fourier (.Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR). Kinh điển nhất trong các bộ phân tích khôi là thiết bị sử dụng từ trường. Dưới một từ trường mạnh, quỹ đạo các ion sẽ thay đổi và khác nhau phụ thuộc vào điện tích và Đại cương về dược liệu học khối lượng ion. Thay đổi từ trường sẽ thay đổi quỹ đạo các ion, lần lượt đưa chúng đi vào detector. Đây cũng là 1 trong 2 loại phân tích ion mạnh và có độ chính xác cao nhất được dùng trong các máy khôi phổ phần giải cao (HR-MS). Bộ phân tích tứ cực gồm 4 thanh kim loại có tiết diện tròn hay hyperbol đặt song song với nhau dài khoảng 100 - 200 mm. Một điện thế một chiều không đổi được điều biến bởi điện thế tần scf radio được áp lên tứ cực tạo nên một điện trường trong tứ cực. Dưới tác động của điện trường, chỉ có những ion nhâ't định bay dọc theo tứ cực đi tối detector. Các ion khác quỹ đạo bị lệch và va vào các thanh tứ cực hoặc bay ra ngoài. Thay đổi đòng điện tần sô" radio trên tứ cực sẽ lần lượt cho phép các ion khác nhau bay vào detector và được ghi nhận thành phổ. Bẫy ion có cấu tạo gồm một điện cực vòng với mặt trong có dạng hyperbol và hai điện cực chỏm nằm ở hai đầu trống của điện cực vòng cũng có dạng hyperbol. Bằng cách thay đổi điện thế các điện cực, người ta có thể điều khiển được quỹ đạo của các ion trong bẫy. Tuy nhiên, khác với tứ cực, các ion khi đi vào bẫy ion sẽ bị giữ tại đó bởi điện trường nếu điện thế của điện cực vòng và 2 điện cực chỏm không khác nhau. Thay đổi điện thế và tần số của điện cực vòng sẽ lần lượt quét các ion ra khỏi bẫy đi tới detector để ghi nhận thành phổ. Thay đổi thế của hai điện cực chỏm sẽ giữ lại một hay một vài ion nhất định trong bẫy (trong chế độ chọn ỉọc ion) hay gia tốc cấc ion (trong chế độ MS nhiều lần). Tứ cực và bẫy ion cho phép phân tích các chất có m /z tởi 5000. Độ chính xác khối của tứ cực và bẫy ion không cao (0,1 đơn vị khối) nhưng nhỏ gọn, đdn giản, dễ sử dụng và rẻ tiền hơn nên được áp đụng nhiều trong các hệ LC-MS. Một cách khác để tách các ion ra khỏi hỗn hợp là dựa vào vận tốc của các ion. ở cùng một mức năng lượng, vận tốc của ion phụ thuộc vào khối lượng của ion. Phân tử càng nhẹ vận tốc càng lốn. Đo lường thời gian để ion từ điểm xuất phát bay tới detector sẽ tính ra được khối lượng của ion. Do vậy, kỹ thuật này được gọi là xạc định thời gian bay của ion (TOF). TOF có độ phân giải tương đối cao (tối 20.000), với số khối chính xác hơn (tới 0,0001). Khoảng phân tích khối của TOF là không giới hạn, rất hũư dụng cho việc phân tích các đại phân tử. Một kỹ thuật mới để phân tích khối là cộng hưởng bằng gia tốc ion - biến đổi Fourier (FT-ICR). Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường mạnh ở bên và một điện trưồng theo hướng trục. Giồng như trong cộng hưởng từ hạt nhân, tất cả các ion trong buồng được kích thích bối một xung tần số’ radio băng rộng (10 KHz - 1MHz). Các ion sẽ hấp thu năng lượng phù hợp để cộng hưồng. Các ion cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng) chuyển động đồng nhất tạo ra một tần số nhất định phụ thuộc vào m ịz. Tất cả các tần số của các ion tạo ra sẽ được ghi nhận dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian và sau đó được biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống. FT-ICR có độ phân giải và độ chính xác khối rất cao (tới 1 ppm), khoảng phân tích khối rộng (hiện nay là m /z tới 10.000). Độ nhạy của FT-ICR cũng rất cao, giới hạn phát hiện có thể đạt tối mức attomole. Khi phối hợp với ESI, FT-ICR có thể phân tích các protein tới 15.000 đơn vị khối. Ngoài các kỹ thuật phân tích khối đã nêu trên, còn có các loại khác đã hoặc đang được phát triển như bẫy quỹ đạo (iorbital trap) hay dựa trên tính linh động cùa ion (ion mobility) và các kỹ thuật lai hay kết hợp giữa các loại trên. Đại cương về dược liệu học 3.4. D etector Là nơi tiếp nhận các ion và biến thành các tín hiệu điện để được ghi nhận thành các tín hiệu phổ khôi. Có nhiểu loại detector khác nhau nhưng thường là các loại ông nhân điện, ống nhân quang... các tín hiệu điện thu được từ detector sẽ được sốhoá và lưu trữ dưới dạng các tập tin kỹ thuật số. r Trong phân tích phổ khối, việc xác định chính xác một ion (M+ hay các phân mảnh) rất quan trọng cho việc xác đinh chất được phân tích. Một hợp chất xác định, trong những điều kiện xác định sẽ cho các ion xác định trên phổ khối. Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ khối lại có thể xuất phát từ nhiều chất khác nhau. Trong phân tích một hỗn hợp bằng sắc ký - khối phổ, nếu điều kiện sắc ký không đảm bảo, các chất tách ra không hoàn toàn dẫn tối phổ khối thu được sẽ có các ion của các phân tử khác làm ảnh hưởng tới việc nhận định kết quả. Trong các trường hợp này, việc xác định MS thông thường (một lần) không cho được kết quả chính xác. Để khắc phục, ngưòi ta sử dụng các kỹ thuật phổ khối n lần vổi n thường là 2 hay đôi khi hơn. Kỹ thuật này được gọi ià MS/MS hay MSn. Nguyên tắc của kỹ thuật này là lựa chọn một ion xác định (thường là M+ nhưng cũng có thể là các ion con) trong các ion của lần ion hoá thứ nhất và loại bỏ tất cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các ion này sau đó được cho tiếp xúc với 1 lượng nhỏ các khí (thường là argon). Vói vận tốc cao, các ion này sẽ va đập vào các phân tử khí và phân thành các mảnh nhỏ hơn. Các ion sinh ra trong lần phân mảnh thứ 2 này sẽ được phần tích và ghi nhận phổ MS. Vì phổ khối ghi nhận được chỉ từ 1 loại ion duy nhất nên không còn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu nữa. Việc nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khi hàm lưđng chất phân tích thấp và nằm trong hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị để thực hiện MS/MS có 2 loại chính là: loại phổ khối nối tiếp và bẫy ion. Loại cổ điển nhất của phổ khối nối tiếp gồm 3 tứ cực ghép nối tiếp với nhau. Tứ cực thứ nhất làm nhiệm vụ chọn lọc ion. Các ion được chọn sẽ bay vào tứ cực thứ 2 và va đập vối khí argon để phân mảnh ion lần 2. Tất cả các ion tạo ra sẽ bay vào tứ cực thứ 3 và được quét lần lượt bởi điện trường để đi tới detector và ghi nhận thành phổ. Do cấu tạo bởi 3 tứ cực nên loại này thường được gọi là triplequad (triple quadrupoles). Với bẫy ion, cả 3 giai đoạn trên đều xảy ra trong bẫy theo trình tự thời gian. Vì các ion được giữ lại trong bẫy nên việc phân mảnh có thể được thực hiện thêm nhiều lần nữa (MSn). Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật này ở các lần sau giảm đi nhanh chóng do SỐ’ ion giảm. Trên thực tế, người ta thường chỉ sử dụng MS2. Ngoài hai thiết kế cơ bản trên, còn có các loại lai khác như: Q-Trap (kết hợp giữa tứ cực và bẫy ion), Q-Tof (kết hợp giữa tứ cực và TOF), IT-Tof (kết hợp giữa bẫy ion và TOF)... Các loại thiết bị này kết nối vối GC, HPLC... hiện có mặt trên thị trường. Một phương tiện rất hữu hiệu trong phân tích các chất, đặc biệt là trong phân tích các chất có nguồn gốc tự nhiên. Phổ khôi cho nhiều thông tin về cấu trúc để xác định cấu trúc một chất mới hay định danh một chất đã biết. Phổ khôi có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính động học rộng rất thích hợp cho phân tích định lượng, đặc biệt là trong phân tích vết. Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, Đại cương về dược liệu học phổ khối có thể sử dụng như một detector phổ thông, phát hiện hầu hết các chất nhưng vối chế độ chọn lọc ion Ỉ1Ó lại là detector chọn lọc cho những chất xác định rất có ích trong việc định lượng các chết trong một hỗn hợp phức tạp. Các thiết bị phổ khôi ngày càng nhạy và tin cậy hơn; giói hạn phân tích khối ngày càng mở rộng; việc sử dụng ngày càng dễ dàng và giá thành ngày càng hạ. Điểu này làm cho thiết bị phể khối dần trỏ thành các pnương tiện phân tích thường quy trong phân tíoh dược liệu. 4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cùng vối phổ khôi và nhiễu xạ đơn tinh thể tia X hiện là những công cụ mạnh và thường được sử dụng nhất hiện nay trong xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Khi đặt một chất có hạt nhân có sô' spin (7) lẻ OH, 13c...) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tối trạng thái cần bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu đùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngxíỢc chiều với từ trường). Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trỏ vể trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tổ’ trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưỏng từ hạt nhân của các chất đó. Có 2 cách xác định năng lượng cộng hưỏng này. Cách thứ nhất là xác định tần sô" cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số’ cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hường từ hạt nhân quét. Cách thứ 2 là ghi nhận đồng thời mọi tần số’ cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần sô' cộng hường của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (.Fourier transform - NMR, FT - NMK) và là kỹ thuật sử đụng chủ yếu hiện nay. Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tẩn số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong sô' liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần sô" cộng hưỏng của hạt nhân so vối một chất chuẩn (thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số’ cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu) nên người ta dùng pprn để thể hiện giá trị cộng hưỏng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0 - 14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0 - 240 ppm. Như-đã trình bày ở trên, tần số’ cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số đùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton. Có nhiều kỹ thuật xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau được áp dụng. Mỗi kỹ thuật dùng để xác định những đặc tính cộng hưỏng từ nhất Đại cương về dược liệu học định của hạt nhân. Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ngưòi ta có thể đo 1 hay nhiểu loại phổ khác nhau. Người ta có thể xác định phổ của cùng một loại hạt nhân (*H hay 13C) như trong các phổ một chiều OH-NMR, 13C-NMR, DEPT), hay các mối tương quan giữa các loại hạt nhân trong các phổ 2 chiều (COSY, HETCOR, Long-range HETCOR, NOẺSYí..). 4.1. P h ổ cộng hưởng từ h ạ t nhân một chiều Phổ proton (JH-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hoá học của proton trong phân tử. Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có chuyển địch hoá học khác nhau. Ví dụ, các proton của liên kết vối carbon thơm hay liên hợp thường chuyển dịch trong vùng 6 * 8 ppm\ các proton trong alkan thường chuyển dịch trong vùng 0 - 2 ppm... Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hoá học (như 3 proton của nhóm CH3) thể hiện trên phổ có thể là 1 đình. Đĩnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba... tới 7 đỉnh thành phần (đỉnh 7). Diện tích của mỗi đỉnh tì lệ vói số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích đình có thể biết số proton củ9. đĩnVi íỉó Một. t.hônÉT số quan trọng khác của phổ proton là hằng số ghép (J) tính bằng Hz, cho biết tương tác của proton với các proton kế cận. Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hoá học của carbon. Carbon lai hoá sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng ũ - 60 ppm. Carbon liên kết đơn vối oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45 - 85 ppm. Carbon lai hoá sp2 chuyển dịch trong khoảng 100 - 150 ppm\ nếu có liên kết (đôi) vối oxy có thể chuyển dịch tởi 240 ppm. Vái kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng vối một carbon (hơn 1 carbon nếu chúng có chung môi trường hoá học) của phân tử. Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết sô' lượng proton liên kết trên mỗi carbon. Nói cách khác, nó cho biết carbon đó là c, CH, CH2 hay CH3, gián tiếp cho biết sô" c và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường được sử dụng hiện nay là DEPT (detortionless enhancement by polarization transfer). Trong phổ DEPT-135, carbon bậc IV không xuất hiện, carbon bậc II là các đỉnh âm, c bậc III và bậc I là các đỉnh dương, ở phổ DEPT-90, chỉ còn các c bậc III là các đỉnh dương trong phổ. 4.2. P h ổ cộng hưởng từ hạt n hân hai chiều Ngoài các kỹ thuật pho một chiều, các kỹ thuật phổ hai chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa c và H gắn trực tiếp trên nó (thưòng dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giũa proton và các carbon kế cận (thường dùng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-range HETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC); hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY); hay giữa các carbon kế cận nhau (incredible natural abundance double quantum transfer experiment, NADEQƯATE). Vai trò của các phổ thu được từ các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân khác nhau trong xác định cấu trúc có thể tóm tắt như sau: Đại cương về dược liệu học Vói các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được môi liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác người ta có thể xây đựng được cấu trúc phân tử của hợp chất. Trong khá nhiều trường hợp, chỉ bằng NMR ngưòi ta cũng có thể xác định được cấu trúc và cấu hình lập thể của chất cần phân tích. Do có rất nhiều thông tin đặc trưng về cấu trúc phân tử, việc so sánh phổ proton hay carbon một chiểu của một chất với một chất đã biết cho phép xác định một chất một cách tin cậy. Ngày nay, chỉ cần lượng mẫu ỏ mửc mg hay thấp hơn đã có thể xác định câu trúc của một chất. Khả nảng này giúp ích rất nhiều trong nghiên cứu các tự nhiên, khi mà các chất rất khó phân lập và thường chỉ thu được vói một lượng nhỏ. Ngoài việc xác định cấu trúc, phổ cộng hưỏng từ họt nhân còn được dùng trong định lượng các chất trong phân tích định lượng như các phương pháp phổ khác. Tuy nhiên, do thiết bị đắt tiền nên cách thức này ít được sử dụng. Việc kết nối cộng hưởng từ hạt nhân với các thiết bị sắc ký lỏng có nhiều khó khàn. Tuy vậy, hiện đã có những hệ thống ghép nối HPLC-NMR để phân tích và xác định các chất chiết từ được liệu. Ngoài các phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân dùng trong phân tích cấu trúc, kỷ thuật xác định hình ảnh cộng hưởng từ hat nhân [(nuclear) Magnetic Resonance Image, MRI] cũng đươc sử dụng trong chẩn đoán y khoa. 5. Các loại phổ khác Ngoài các loại phổ trên, phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X {single cristal X ray diffraction), phổ tán sắc quay quang (optical rotatory dispersion, ORD) và phô lưỡng cực vòng (cừcular dichroism, CD) cũng được dùng trong xác đinh câu trúc các chất. . Khi chiếu xạ một chùm tia X vào một lát cắt mòng của tinh thể, các nguyên tự của phân tử các chất nằm trên các điểm nút của mạng tinh thể sẽ gây ra sự nhiễu xạ của chùm tia X tạo nên các vân giao thoa. Giải các kết quả này bằng thuật toán thích hợp sẽ thu được các số liệu về chiều dài và góc liên kết của từng nguyên tử trong phân tử. Từ đó có thể dựng lại cấu trúc không gian của phân tử. Vâi phổ nhiễu xạ đơn tinh thể tia X, người ta có thể biết được cấu trúc lập thể của các chất. Đại cương về dược liệu học Với phổ CD và ORĐ, người ta có thể xác định cấu dạng của các trung tâm bất đối (a hay P; R hay S) của các chất quang hoạt. Việc xác định cấu hình phân tử là quan trọng vì các chất tự nhiên có hoạt tính sinh học thưởng chỉ là một dạng đối quang (thưồng là quay trái), đối quang còn lại có tác dụng yếu hay không có tác dụng. VII. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Sắc ký là một phương pháp phân tách lý — hoá trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn hợp dựa trên sự “phân bố’ liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) và một pha chuyển động (pha động) dịch chuyển qua pha tĩnh theo một phương xác định. Trong các phương pháp phân tách hiện nay, sắc ký là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng trong hỗn hợp như dịch chiết các hợp chất từ cây cỏ. Từ khi phương pháp sắc ký ra đời (1903) cho tói nay rất nhiều kỹ Ihuật sắc ký cõng như các cải tiến về pha tĩnh, thiết bị và phương pháp phất hiện đã được phát triển và áp dụng trong thực tế để phân tích định tính, định lượng và chiết tách các chất, đặc biệt là thành phần hoá học của cây cỏ. Theo như định nghĩa, các yếu tô' quan trọng nhất trong hệ thông sắc ký quyết định đến khả năng tách một hỗn hợp mẫu xác định nào đó là pha tĩnh và pha động. Với pha tĩnh, cơ chế phân tách ìà một trong những yếu tô' quan trọng nhất. Các pha tĩnh đang sử dụng trong sắc ký hiện nay dựa trên các cơ chế phân tách khác nhau: phân bố, hấp phụ, rây phân tử, trao đôi ion, điện di, ái lực... Trong đó, cơ chế phân bô" và hấp phụ là 2 cơ chế được sử dụng chủ yếu hiện nay. Khả năng phần tách của pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ tiếp xúc của pha tĩnh với mẫu thử và pha động. Yếu tô" này liên quan nhiều tới diện tích bề mặt riêng và mật độ của pha tĩnh. Diện tích bề mặt riêng càng lớn (kích thưốc tiểu phân của pha tĩnh càng nhỏ) thì khả .năng phân tách của pha tĩnh càng lớn. Mật độ của pha tĩnh cao, khả nàng tạo cân bằng pha càng lốn, hệ càng phân tách tốt. Pha tĩnh thông dụng nhất dùng trong sắc ký hấp phụ hiện nay là Silica gel. Nhôm oxyd và các chất hấp phụ khác cũng được dùng nhưng ỏ mức độ thấp hơn rất nhiều. Sắc ký pha thuận thường dùng trong sắc ký lốp mỏng và trong các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển hay cải tiến. Với cơ chế phân bô', pha tĩnh có thể là (a) các chất lỏng thực sự, hay (b) 1 lớp chất lỏng tẩm hay phủ trên bề mặt của một giá mang rắn, hoặc (c) được gắn vào giá mang rắn bằng liên kết hoá học (pha liên kết - bonded phase), (a) thường là pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng; (b) thường gặp trong pha tĩnh sắc ký khí và sắc ký giấy và (c) là loại phổ biến nhất hiện nay, thường dùng trong sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng quá tối hạn. Chất lỏng được sử dụng làm pha tĩnh có thể là chất phân cực (phần bô' pha thuận) hay không phân cực (phân bố pha đảo). Phần lớn các phân tích HPLC hiện nay sử dụng pha đảo RP-18 vối pha tĩnh là mạch hydrocarbon có 18 carbon gắn vào giá mang là Silica gel. Đại cương về dược liệu học Vói pha động, bản chất của pha động có ảnh hưởng quan trọng nhất tói quá trình phân tách của hệ sác ký. Pha động thường là một hệ dung môi gồm có hai (hay nhiều hơn) dung môi phôi hợp với nhau theo những tĩ lệ thích hợp. Một pha động tốt là pha động có khả nàng phân tách -tốt các chất nhưng không quá phức tạp vể thành phần hay tĩ lệ, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện với môi trưòng. Thành phần và tỉ lệ của dung môi trong pha động có thể không đổi trong suốt quá trình phân tích sắc ký (như trong sắc ký lốp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký lỏng cao áp đẳng dung môi - ỉsòcratic) hay thay đổi theo hướng tăng đần độ mạnh cùa hệ đung môi (rửa giải theo gradient như trong sắc ký cột các loại). Một yếu tố quan trọng khác là tốc độ của dòng pha động. Tốc độ dòng phải được tối ưu hoá để đạt được cân bằng pha với sô' đĩa lý thuyết của hệ thống là lớn nhất nhưng không làm tăng hiện tượng giãn rộng các băng các chất được tách ra khỏi hỗn hợp. Với sắc ký giây, sắc ký lốp mòng hay sắc ký cột cổ điển, chỉ cần lực mao dẫn hay áp suất thuỷ tĩnh là đủ tạo nên dòng dung môi cho phân tích, trong khi sắc ký lỏng áp suất trung bình và đặc biệt là sác ký lỏng cao áp cần có 1 áp lực cao nhất định mối có thể có được tốc độ dòng tõì ưu. Để phát hiện các chất tách ra trong hệ thông sắc ký người ta có thê quan sát các vết tách ra dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại hay sử dụng các thuốc thử hiện màu (như trong sắc ký lóp mỏng, sắc ký giấy) hay phát hiện các chất bằng các đặc tính vật ỉý của chúng (chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, dẫn nhiệt, phổ u v - Vis, IR, MS, NMR...) bằng các thiết bị phát hiện 0detector) như trong các phương pháp sắc ký cột, sắc ký khí, sấc ký lỏng cao áp... Độ nhạy của phương pháp phát hiện (các detector) cũng được cải tiến để có thể phát hiện các chất có hàm lượng ngày càng thấp hơn (ng, pg , fg). Vối các thiết bị hiện đại, khả năng tách và độ nhạy của phương pháp sắc ký ngày càng cao, lượng mẫu cần để phân tích ngày càng nhỏ trong khi kích thước các tiểu phân pha tĩnh và kích thưốc cột ngày càng nhỏ và áp suất của dòng pha động ngày càng cao. Có nhiều cách phân loại và gọi tên các phương pháp sắc ký. Ví dụ: - Theo cơ chế của quá trình phần tách, ta có: sốc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cổ (rây phân tử, lọc gel hay thấm gel), sắc ký ái lực và điện di. - Theo pha động, người ta phân thành: sắc ký lòng (ỈUỊUid chromatography, LC), sắc ký khí (gas chromatography, GC), sắc ký lỏng quá tói hạn (super-critical fluid chromatography, SFC). - Theo hình dạng của pha tĩnh người ta xếp các phương pháp sắc ký vào 2 nhóm chính là sắc ký trên mặt phẳng (planar chromatography, PC) trong đó có các kỹ thuật sác ký giấy, sắc ký lớp mỏng... và sắc ký cột (column chromatography, CC) trong đó có các kỹ thuật sấc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí... - Theo áp lực đẩy dòng dung môi đi qua pha tĩnh, ta có: sắc ký lỏng áp suất thấp (low pressure liquid chromatography, LPLC) bao gồm các sác ký cột cổ điển hay cải tiến, sắc ký lỏng áp suất trung bình (medium pressure liquid chromatography, MPLC) và sắc ký lỏng áp suất cao (high pressure liquid chromatography, HPLC, sắc ký lỏng cao áp)... - Theo phương pháp khai triển sắc ký, người ta phân ra phương pháp phân tích tuyến, phương pháp thế chỗ và phân tích rửa giải. - Trên thực tế, người ta thường gọi tên các phương pháp sác ký theo thói quen chứ không gọi theo một cách thống nhất. Đại cương về dược liệu học Trong nghiên cứu dược liệu, sắc ký thường được sử dụng cho các công việc sau: Định tính Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của- phương pháp sắc ký trong dược liệu học là định tính thành phần các chất trong dược liệu, trong dịch chiết dược liệu hay phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hay các thành phẩm từ dược liệu. Khi sử dụng các phổ kế làm detector, chúng cung cấp một phương tiện rất hiệu quả cho định tính các chất trong một hỗn hợp. Có thể sử dụng phương pháp sắc ký để phát hiện các thành phần trong hỗn hợp vôi sô' lượng, Rf hay Rt, màu sắc hay đặc điểm phổ của các chất. Khi sử dụng các chất chuẩn sắc ký trong cùng điều kiện, người ta có thể xác nhận sự có mặt của một chất nào đó trong dược liệu mà không cần phải phân lập chất đó. Điều này giúp cho việc xác nhận dược liệu, tránh nhầm lẫn vì mỗi dược ỉiệu có những thành phần hoá học nhất định, đặc trưng cho nó. Ví dụ, hoa Hòe có rutin, Trúc đào có neriolin, Mã tiền có strychnin v.v... Các phương pháp sắc ký còn được sử dựng trong định tính điểm chỉ (dấu vân tay) các dược liệu. Vởi định tính điểm chỉ, thay cho chất chuẩn, người ta sử ■* dụng một dược liệu chuẩn và tiến hành chiết xuất, sắc ký trong cùng một điều kiện với dược liệu cần kiểm nghiệm. Sự khác biệt giữa sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử cho phép đánh giá chất lượng dược liệu. Các thành phần lạ trên mẫu thử không có ở mẫu chuẩn có thể là dấu hiệu cho thấy dược liệu không đúng, bị pha tạp hay kém chất lượng. Về nguyên tắc, hai mẫu dược liệu của cùng một loài phải có sắc ký đồ đồng nhất. Từ đó, có thể xác nhận được mẫu kiểm nghiệm có đúng hay không, có bị giả mạo hay pha tạp không. Trên thực tế, thành phần các chất trong các mẫu có thể có những sai biệt nhất định do các điều kiện di truyền (các chủng, dạng, thứ hay loài phụ, các loài lai, loài trồng trọt...) hay điều kiện phát triển (thổ nhưỡng, khí hậu), điều kiện thu hái (tuổi, mùa thu hái) v.v... Tuỳ thuộc vào từng loài, và yêu cầu sử dụng mà có thể chấp nhận những sự khác biệt vê' thành phần đến một mức độ nào đó. Nếu sự khác biệt quá lớn, đặc biệt là trên những thành phần chính, thường là do các biến thể dưới loài hay cây mọc ở các vùng có điều kiện rất cách biệt nhau thì có thể phải coi là những dược liệu riêng biệt. Định tính điểm chỉ hiện đang được sử dụng nhiều trong thực tế để kiểm nghiệm dược liệu và các thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phát hiện giả mạo hay bị pha trộn các dược liệu khác. Nhiều chuyên luận của Dược điển Việt Nam IV có quy định sử dụng định tính điểm chỉ. Định lượng Các phương pháp sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại. Khác với các phép định lượng hoá học, các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng Đại cương về dược liệu học từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, với điều kiện là phải có chất chuẩn tương ứng. Ngưòi ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thòi nhiều chất trong 1 lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp. sắc ký lỏng cao áp, sấc ký khí, điện di mao quản là những phương pháp thông dụng nhất vì khả năng phân tách cao, độ nhạy và độ lặp lại cao. sắc ký ldp mỏng kết hợp vói mật độ quang kế hiện chỉ còn được coi là phương pháp bần định lượng. Theo dôi thành phần các chất Các phương pháp sắc ký là có thể dùng như là phương pháp theo dõi, đánh giá sự thay đổi thành phần (và hàm lượng) các châ't trong cây thuốc trong trồng trọt, trong dược liệu trong quá trình bảo quản hay trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất và phân tách các chất. Phân lâp các chất Một ứng dụng khác nữa của các phương pháp sắc ký là phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu. Các chất tinh khiết phân lập được có thể được dùng trong xác định cấu trúc, châ't chuẩn cho định tính, định lượng, nghiên cứu các đặc tính dược lý hay độc tính và sử dụng làm thuốc (khi chiết xuất, phân lập ở quy mô lớn). Các phương pháp sắc ký phân lập các chất được trình bày phần chiết xuất và phân lập các chất. Dưới đây là một vài phương pháp sắc ký thông dụng nhất áp dụng cho phân tích các chất từ dược liệu. 1. Sắc ký giấy Cơ chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường là nước) được thấm trên một tò giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Nhờ các xoang rỗng trong sợi cellulose của tò giây sắc ký, nước được giữ lại trên đó làm thành pha tĩnh. Có nhiều loại giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung môi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tuỳ thuộc vào hãng sản xuất. Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp. Có 2 phương pháp triển khai sắc ký phẳng là sắc ký đi lên và sắc ký đi xuống tuỳ thuộc vào chiều đi của pha động. Tỷ lệ giữa khoảng cách đường đi của chất phân tích với đưồng đi của pha động tính từ điểm đặt chất phân tích gọi là Rf. Tỉ lệ giữa đưòng đi của chất phin tích với đường đi của một chất đổi chiếu được gọi là Rr. 80 vói Rf, giá trị Rr ổn định hơn nên dễ so sánh hơn. Các trị số’ Rf và Rr của nhiều hoạt chất quen thuộc trong dược liệu kèm theo hệ dung môi triển khai thường được ghi sẵn trong các tài liệu để tra cứu đối chiếu. Két quả sắc ký thư được với các vết của các chất phân tích được phân bô" trên giấy sắc ký được gọi là sắc đồ. Các chất được tách ra trên sắc đồ được phát hiện và đánh giá bằng màu sắc, kích thước, hình dạng các vết hiện ra khi quan sát ỏ ánh sáng thường hoặc ánh sáng đèn tử ngoại trước và/hoặc sau khi phun các thuôc thử hiện màu. Để có kêt luận một chất nào đó khi đối chiếu chất phân tích với chất chuẩn thường phải tiến hành trên 3 hệ dung môi khác biệt. Đại cương về dược liệu học Trong nhiều trường hợp, để kết quả píiân tách tốt hơn, người ta cần phải tiến hành sắc ký hai chiểu. Muôn vậy, trên một tờ giấy vuông (60 X 60cm hoặc 40 X 40cm) ngưòi ta chấm dung dịch cần phân tích ở góc cách mép tò giấy 4 - 6cm. Sau khi triển khai lần thứ nhất với một hệ dung môi thì chuyển tờ giấy đó sang một buồng sắc ký thứ hai, quay giấy một góc 90° và triển khai lần hai với đung môi thứ hai. Sau khi hiện màu, các vết sẽ phân bố trên mặt phẳng chứ không phải tặrên một đưòng thẳng. Sắc ký giấy là 1 phương pháp sắc ký phân bô' pha thuận, áp dụng tốt cho các chất phân cực từ trung bình tới mạnh như các glycosid, các hợp chất polyphenol, các acid hữu cơ phân tử nhỏ, acid amin, các monosaccharid và oligosaccharid... Ngoài việc phân tích thành phần của hỗn hợp, sắc ký giây cũng có thể dùng để điểu chế một lượng nhỏ các chất bằng cách chấm mẫu thử thành các băng. Sau khi triển khai, cắt các băng chất được tách ra rồi phản hấp phụ bằng dung môi thích hợp. Lặp lại nhiều lần thì có thể thu được lượng chất tinh khiết cần thiết. Do khả năng phân tách hạn chế, việc thực hiện tốn nhiều thòi gian nên hiện nay phương pháp này có ứng dụng hạn chế và được thay thế bằng sắc ký lóp mỏng, sắc ký lớp mỏng pha đảo hay sắc ký lỏng cao áp. 2. Sắc ký lớp mỏng Trong sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh được trải trên 1 mặt phẳng với 1 độ dày thích hợp từ 0,1 mm đến 0,2 mm và đung môi dịch chuyển qua pha tĩnh chủ yếu bằng lực mao dẫn. Pha tĩnh thông dụng nhất trong sắc ký lổp mỏng là Silica gel với cơ chế phân tách chính là hấp phụ. Tuy nhiên, cơ chế phân tách trong sắc ký lốp mỏng cũng có thể là sắc ký phân bô" hoặc kết hợp cả hai, hoặc các cơ chế khác, tuỳ thuộc vào pha tĩnh và dung môi sử dụng. Các chất khác sử dụng làm pha tĩnh có thể là nhôm oxyd, Kieselguhr, cellulose, polyamiđ hay các loai'Silica gel pha đảo. Để chuẩn bị bản sắc ký phân tích, người ta trải một lớp mỏng có chiều đày 0,2 - 0,3 mm thật đều bằng tay hay bàng dụng cụ tráng sắc ký trên một tấm kính. Vâi bản sắc ký chế hoá, bề dày lớp tráng có thể tới 2 mm. Các chất dùng để tráng có thể ỉà bột mịn Silica gel hoặc nhôm oxyd, Kieselguhr... Bột có thể không có thêm chất dính (dùng để tráng khô) hoậc có thể thêm chất dính (ví dụ, silicagel có trộn thêm CaS04) và thêm nước để tạo thành hỗn dịch (tráng ưôt). Sau khi tráng ướt, bản mỏng được để ráo và sấy hoạt hoá trưốc khi sử dụng. Hiện nay, có nhiều hẵng sản xuất các bản sắc ký tráng sẵn trên tấm kính, nhôm hoặc nhựa, ví dụ hãng Merck của Đức, hãng Eastman. Tíodak của Mỹ. Kích thưỏc bản sắc ký có thể thay đổi tuỳ mục đích sử dụng, nhưng không quá 20 X 20 cm. Ngoài việc nâng cao chất lượng pha tĩnh, các hãng sản xuất có thể có những cải tiến nhất định các bản tráng sẵn để cải thiện việc phân tách như bản sắc ký vùng đậm đặc để cải thiện việc đưa mẫu lên bản mỏng. Với sắc ký lóp mỏng, đặc biệt là sắc ký hấp phụ, có thể sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau. Có thể sử dụng các dung môi với độ phân cực tăng dần (xem bảng). Muôn có dung môi với trị giá trung gian không có trong bảng trên, ta dùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tỉ lệ thích hợp. Có nhiều phương thức khai triển sắc ký lớp mỏng khác nhau (như dưói lên, trên xuống, nằm ngang) trong các kiểu bình sắc ký khác nhau như trong bình đứng thông Đại cương về dược liệu học thường (bình N), bình nằm ngang hay ‘bình’ hẹp đặc biệt (bình S). Tuy nhiên, thông đụng nhất vẫn là triển khai dung môi từ dưới lên trong bình sắc ký thông thường bởi tính đơn giản và dễ sử dạng của nó. Cũng như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng hai chiều (trên bản có kích fehước tối đa 20 X 20 cm) cũng được sử dạng. Hằng số điện môi của một số dung môi sắc ký ịhông dụng Dung môl £° Dung mồi 8° Ether dầu 0,01 Dichlor ethan 0,49 Hexan 0,01 Aceton 0,56 Heptan 0,01 Dioxan 0,56 Cyclo hexan 0,04 Butanol 0,56 Carbon tetrachlorid 0,18 Ethyl acetat 0,58 Ether isopropylic 028 Acetonitril 0,65 Toluen 0,29 Pyridin 0,71 Benzen 0,32 Dimethylsulfoxid 0,75. Ethèr ethylic 0,38 Alcol isopropylic 0,82 Chloroform 0,40 Alcol ethylic 0,88 Methylen chlorid 0,42 Alcol methylic 0,95 So với sắc ký giấy, thời gian triển khai đối với sắc ký lớp mỏng nhanh hơn, lượng mẫu phân tích cần ít hơn, khả năng phân tách cũng tốt hơn. Ngoài ra, có thể sử dụng các thuốc thử mạnh như acid sulfuric, nitric đậm đặc... để phát hiện các vết. Vì thế, sắc ký lớp mỏng là phương pháp được sử dụng chủ yếu hiện nay để phát hiện, theo dõi các chất trong hỗn hợp khi yêu cầu phân tích không đòi hỏi các phương pháp hiện đại hơn. Một trong những cải tiến của sắc ký lớp mòng là người ta giảm kích thước của hạt silica gel đê tảng diện tích bê' mặt riêng làm hiệu năng phân tách của pha tĩnh. Kích thước hạt Silica gel trung bình là 6 |im so với sắc ký lớp mỏng thông thường là 15 um. Khi đó quãng đường và thời gian sắc ký có thể rút ngắn còn 1/2 so vái sắc ký lóp mòng thông thường mà vẫn có kết quả tách tưởng tự hay thậm chí tốt hơn. Các bản sắc ký như vậy được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance TLC, HPTLC). Kích thước bản HPTLC thường là 5 hay 10 cm. Đối với sắc ký lốp mỏng, diện tích và mật độ của một vết tách ra trên sắc đồ trong các điều kiện xác định thì tỷ lệ với lượng chất có trong vết đó. Vì thế, ngưòi ta có thể định lượng các chất trong hỗn hởp bằng phép đo mật độ quang so sánh với giai mẫu chuẩn được triển khai trên cùng bản sắc ký. Ngưài ta cũng có thể cạo vùng pha tĩnh ứng vói từng vết rồi giải hấp hoạt chất chúa trong đó bằng dung môi thích hợp, sau đó định lượng bằng các phương pháp thích hợp như đo huỳnh quang, đo màu hay đo độ hấp thư tử ngoại. Để tách các hạt chất từ một hỗn hợp, ngưòi ta có thể dùng phương pháp sắc ký lớp mồng điều chế (chế hoá) hay còn gọi là sắc ký lổp dày. Để có thể đưa nhiều mẫu hơn lên bản mỏng, bể dày lớp chất hấp phụ có thề là 0,5 - 1 mm, có thể tối 2 mm. Mẫu được đưa lên bản mỏng dưới dạng vệt dài (báng). Sau khi triển khai, định vị các băng chất tách ra bằng cách thích hợp và cạo lấy băng chất cần lấy. Đại cương về dược liệu học Phản hấp phụ bằng dung môi để thu lấy chất tinh khiết. Lặp lại trên vài bản sắc ký thì có thể thu được lượng mẫu cần thiết cho việc xác định cấu trúc. Trong phân tích dược liệu, sắc ký lốp mỏng là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất bỏi khả năng phân tách tốt, linh động, dễ thực hiện và kinh tế của nó. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong phân tích thạnh phần của các dược liệu, định tính các chất trong dược liệu, cao chiết bằng cách so sánh với chất chuẩn, định tính được liệu bằng điểm chỉ, theo dõi quá trình chiết xuất, thăm dò các điều kiện phân tích cho sắc ký cột... Khả năng phân tích của sắc ký lớp mỏng cũng rất đa dạng, từ những chất kém phân cực tới các chất phân cực trung bình tới mạnh. Rất nhiều các nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị trong trị liệu có thể phân tích bằng sắc ký lớp mỏng. Tuy khả năng phân tách không cao và không nhạy bằng HPLC hay GC nhưng sắc ký lốp mỏng hiện vẫn là phương pháp rất phổ biến và hữu ích trong phân tích dược liệu. Dược điển nhiều nưóc (Anh, Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quỗo, Việt Nam.,,) vẫn sủ dụng rộng rãi phương pháp sắc ký lốp mỏng trong kiểm nghiệm dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu. Có nhiều bài báo và tài liệu xuất bản vê' sắc ký lớp mỏng áp dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, đặc biệt là để định tính điểm chỉ dược liệu. Trong đó, cuốn Plant Drug Analysis - A Thin Layer Chromatography Atlas” của Wagner H. và Blađt s. (Bản tiếng Anh do nhà xuất bản Springer Verlag ấn hành năm 1996 được xem là có giá trị nhất hiện nay. 3. Sắc ký lỏng cao áp Trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC), để tăng hiệu năng tách của cột sắc ký, người ta sử đụng chất nhồi cột với kích thưóc rất nhỏ, thường dưới 10 |im với đường kính của các xoang xốp bên trong các hạt từ 80 - 120 Ả cho phân tích các phân tử nhỏ và 300 Ả dùng cho phân tích các đại phân tử. Do kích thước hạt rất nhỏ, để dung môi có thê chảy qua vối tốc độ dòng tối ưu (khoảng 1 ml/phút với cột có đưòng kính trong 4,6 mm được nhồi pha tĩnh có kích thước 3,7 Ịxm), người ta phải dùng bơm nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng đung môi qua cột. Vì thế nên phường pháp được gọi là sắc ký lỏng cao áp. sắc đổ Computer Sơ đồ một máy sắc ký lỏng cao áp Các loại cột HPLC phân tích thông dụng hiện nay sử dụng các hạt nhồi có kích thưốc 3,7 Ị.im. Gần đây, các hạt nhồi có kích thước hạt 1,7 Jim đã được sử dụng. Đại cương về dược liệu học Cột sắc ký loại này có hiệu năng táclj cao hơn so vối loại cột chứa hạt nhồi 3,7 |im nhưng cũng phải dùng áp suất cao hơn rất nhiều (tới 1000 atm) để bơm dung môi. Các máy sắc ký sử dụng áp suất cao này được gọi là sắc ký lỏng siêư cao áp (ultra high pressure liquid chromatography, UHPLC, hay còn được gọi là sắc ký lỏng siêu hiệu nẳng, Ultra (high) performance liquid chroatography, U(H)PLC)1. Khi áp lực bơm tăng lên cao sẽ ảnh hưởng tới cấu trúc pha tĩnh cũng như các vân dề về thiết bị. Ngưdi ta cũng cải tiến hình dạng và bể mặt pha tĩnh để giảm bớt áp suất bơm dung môi. Một số cột có các pha tĩnh như vậy cũng đã có trên thị trường như cột đơn khối (monolithic) hay các hạt có cấu trúc, xốp ở bề mặt nhưng đặc tâm... hoặc được .tăng cường thêm lực chịu nén của các hạt pha tĩnh. Các loại cột dùng cho sắc ký điều chế các chất có thể sử dụng các hạt nhồi có kích thưốc hạt tương tự như cột phân tích, nhưng thường được nhồi với các hạt có kích thước hơi lớn hơn (5 um) để làm giảm áp suất bơm dung môi. Kích thước cột sắc ký phân tích cũng thay đổi theo hiệu năng tách và nhu cầu phân tích. Đường kính trong của cột phân tích thay đổi từ 0,05 * 5 mm, thông dụng hiện nay là 4,6 mm; 3,0 mm hay 2,1 mm. Các cột dùng với mục đích điều chế có đường kính trong lớn hơn. từ 7 mm vối cột bán điều chế tối 100 mm hay hơn. Chiều dài cột thay đổi từ 30 mm - 300 mm. Pha tĩnh sử dụng trong HPLC rất phong phú và đa dạng. Các cơ chế tách như phân bố, hấp phụ, rây phân tử, trao đổi ion... đều được sử dụng. Tuy nhiên, các pha tĩnh thông dạng nhất là pha tĩnh phân bố" (pha đảo hay pha thuận). Các hạt nhồi của loại pha tĩnh này thường có một nhân (giá mang) là Silica gel vối các nhóm OH silanol trên bề mặt được liên kết với một chất khác.đóng vai trò là pha tĩnh thực sự. Loại hạt nhồi này thường được gọi là pha liên kết (bonded phase). Thông dụng nhất là các loại pha tĩnh RP-18, RP-8 với pha tĩnh tương ứng là một mạch hydrocarbon có 18 hay 8 carbon. Các pha tĩnh khác ít được sử dụng hơn. Dung môi (pha động) dùng trong HPLC (pha đảo) thông dụng nhất lả hỗn hợp nước - methanol hoặc nước - acetonitril với các tỉ lệ khác nhau. Để tăng khả năng phân giải các chất có khả năng phân ly, các dung dịch đệm vối pH khác nhau hay các acid (acid trifluoroacetic, acetic, formic) hay các chất kiềm hữu cơ có thể được thêm vào pha động. Vối các pha tĩnh sắc ký khác, đặc biệt là sắc ký hấp phụ, có thể sử dụng nhiều hệ dung môi khác nhau. Detector Có khá nhiều loại detector được sử dụng trong việc phát hiện các chất tách ra khỏi cột sắc ký lỏng cao áp. Các detector phát hiện sự thay đổi các đặc tính của dung dịch rửa giải như detector chỉ số khúc xạ (reflective index, RI), detector điện hoá (electrochemical detector), detector tán xạ bay hơi (evaporating light scattering detector, ELSD), detector UV-Vis đon bước sóng (UV detector) hay detector .huỳnh quang (fluorescence detector) cho biết có các chất ra khỏi cột vào những thời điểm nhất định. Các detector quang phổ như detector dãy diod quang {photodiode array, PDA), khôi phổ (MS) hay cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ngoài việc cho biết các chất ra khỏi 1 UPLC là tên bảo hộ của hệ thống sắc ký lòng siêu hiệu năng của hãng Waters. Để chỉ chung kỹ thuật này, người ta có xu hướng dùng thuật ngữ UHPLC {ultra high pressure liquid chromatography). Các hãng sàn xuất máy sắc ký khác sử dụng các tên gọi khác như UFLC {ultra fast liquid chromatography) để chì các hệ thống HPLC phân tích nhanh, hiệu quà cao vái nhũhg cải tiến về pha tĩnh và/hoặc tăng áp suất bơm đẩy dung môi. Đại cương về dược liệu học cột theo thòi gian trên sắc ký đồ truyền thống còn cho biết thêm nhưng thông tin quan trọng khác về chất được tách ra, đó là phổ của các chất. Các thông tin này rất có ích và tăng độ tin cậy của việc nhận định các chất, so sánh vối chất chuẩn. Phần lớn các detector sử dụng trong HPLC không phá huỷ các chất (ngoại trừ MS). Các hệ thổng sắc ký hiện đại có thể ghép nối tiếp hay song song nhiều detector với nhau để có thêm thông tin xác định các chất. Ưng dụng trong phân tích dược liệu Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng. Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp châ't khác nhau. Tuy hiệu năng tách của sắc ký lỏng cao áp không cao bằng sắc ký khí nhưng khả năng phân tích của nó rộng hơn rất nhiều. Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hrtn các phương pháp khác nhò các cđ chế tách, pha tĩnh và pha động đa dạng, phong phú, Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất. Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêiig lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh vói chất chuẩn trong cùng điểu kiện phân tích. Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, sắc ký lỏng cao áp ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt. Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp. Với sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguồn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài tương cận, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu... So với sắc ký lóp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu năng tách cao hơn nên cho các kết quả điểm chỉ chi tiết và nhiều giá trị hơn. Khi kết hợp với các thiết bị quang phổ hiện đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị trong việc xác định các chất. Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các thiết bị ghép nối LC—MS-NMR-CD để phân tích thành phần các dịch chiết và xác định cấu trúc các chất trong hỗn hợp mà không cần tách riêng các chất. Một ứng dụng khác của sắc ký lỏng cao áp là phân lập các chất tinh khiết (HPLC điều chể). Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ mọi nguyên lý của HPLC phân tích. Điểm khác biệt duy nhất là hệ thông sử dụng cột sắc ký lốn hơn, vối lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có được các chất tinh khiết. Theo truyền thống, các cột có đường kính trong lón hơn 4,7 mm có thể được xem là cột bán điều chế. Các cột điểu chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ 1 cm - 10 cm. Trong quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế Đại cương về dược liệu học có thể có đưòng kính trong tới 100 cm. So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường hợp không tách được bằng các phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC. 4. Sắc ký khí Sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động lồng được thay bằng một dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh. Các chất được tách ra khỏi hỗn hợp bối tương tác khác nhau của chúng vói pha tĩnh. Do khả năng hoà tan rất kém của chất khí, dòng khí này không đóng vai trò của một pha động thực sự trong hệ thông sắc ký. Nó chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn, các chất trong pha hơi chạy dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác với pha tĩnh. Vì thế, dòng khí chạy trong cột sắc ký khí chỉ được gọi là khí mang. Đóng vai trò đẩy các chất ra khỏi pha tĩnh trong sắc ký khí chính ỉà nhiệt độ. Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ hay bị lôi cuốn bồi dòng khí mang khác nhau. Từ đó các chất tách ra khỏi nhau. Do phải được hoá hơi để có thể được lôi cuốn đi bởi dòng khí mang, chỉ những chất bay hơi mới có thê được phân tách. Vì vậy, sắc ký khí chỉ áp dụng được cho các chất có khả năng bay hơi ở nhiệt độ tiến hành sắc ký. Cấu tạo của một hệ thông sắc ký khí hiện đại bao gồm những thành phần chính sau: (a) Khí mang và hệ thông điều chỉnh khí, (b) cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẫu, (c) cột sắc ký, (d) buồng cột, (e) detector và (0 máy tính dùng để điều khiển thiết bị, ghi nhận và lưu trữ kết quả. 4.1. Khí m ang và hê thống diều chỉnh khí Các khí mang thông dụng nhất là nitơ và heli. Nitơ rẻ tiền và sẵn có hơn so với heli. Heli cho hiệu quả tách thường cao hơn. Khí mang phải không được có các khí lạ khác ảnh hưỏng tới phân tích như tương tác vói các chất phân tích, với pha tĩnh hay tạo nên các peak lạ trong sắc ký đồ. Độ tinh khiết của các khí thông thưòng phải cao hơn 99,95%. Các chất không được phép có trong khí mang là oxy, khí carbonic, hơi nưdc và các halogen. Chúng phải được lọc trước khi đưa vào hệ thống sắc ký bởi hệ thống lọc. Để có được tốc độ dòng tốì ưu, một hệ thông đo và điều chỉnh áp suất, lưu lượng khí được sử dụng. Hệ thông này cho phép điểu chỉnh lưu lượng/áp suất dòng khí vào cột một cách chính xác theo yêu cầu phân tích. 4.2. Cổng bơm mẫu và thiết bị bơm mẩu Là nơi mẫu dưới dạng lỏng được bơm vào hệ thống, cổng bơm mẫu được gia nhiệt để cho tất cả các thành phần trong mẫu lỏng được hoá hơi và đi vào hệ thống. Với sắc ký khí mao quản, lượng mẫu thưòng không vượt quá 10 Ịil. Với sắc ký khí cột nhồi, lượng mẫu bơm có thể lốn hơn. Toàn bộ lượng mẫu bơm vào sau khi được hoá hơi có thể đi vào cột sắc ký (bơm mẫu không chia dòng) hay chỉ một lượng nhất định hơi đi vào cột phân tích, phần còn lại được đẩy ra ngoài (bơm mẫu chia dòng). Có thể bơm mẫu vào cổng bdm mẫu bằng tay với một xy lanh. Người ta cũng có thể tự động hoá bằng một bộ phận bơm mẫu tự động. Trong kỹ thuật head space, mẫu được hoá hơi trong một chai đựng mẫu kín rồi được bớm vào hệ thống sắc ký dưới dạng khí. Đại cương về dược liệu học 4.3. Cột sắc ký Dạng cổ điển nhất của cột sắc ký khí là cột nhồi vói một cột thuỷ tinh hay thép không ri hở hai đầu có đưòng kính trong 2 - 4 mm, dài 1 • 4 m, bên trong nhồi đầy pha tĩnh. Tuy nhiên, ngày nay phần lớn (trên 90 %) các cột sắc ký kí là cột mao quản. Cột mao quản thường được làm bằng silica nung chảy có đường kính trong từ 0,1 - 0,53 mm với chiểu dài 10 - 100 m hay hơn. Các cột thông thường có đường kính trong 0,2 mm, 0,25 mm hay 0,32 mm với chiều dài 25 - 60 m. Thành trong của cột mao quản có thể tráng lên một lóp pha tĩnh lỏng với bề dày 0,2 • 5 fim (wall coated open tubular, WCOT) hay được phủ một lốp hạt có một lóp pha tĩnh lỏng bao quanh (suport coated open tubular, SCOT) hoặc một lớp pha tĩnh xốp của chất hấp phụ hay rây phân tử (porous layer open tubular, PLOT)... loại cột mao quản thông dụng nhất hiện nay là WCOT. So với cột nhồi, cột mao quản có hiệu năng tách cao hơn rất nhiều. Một cột mao quản 60 m có thể có 180.000 - 300.000 đĩa lý thuyết so vối 4000 đĩa lý thuyết của cột nhồi (2m). Loại cột nhồi có đường kính nhỏ hơn (microbore] 0,75 mm) được xem như là dạng trung gian giữa cột nhồi và cột mao quản. Pha tĩnh trong sắc ký khí cũng khá đa dạng. Các pha tĩnh rắn với cơ chế hấp phụ (silica gel, nhôm oxyd), rầy phân tử hay gặp trong cột nhồi. Tuy nhiên, pha tĩnh phổ biến nhất là phạ tĩnh lỏng theo cơ chế phản bố. Pha tĩnh lỏng có thể được phủ lên một giá mang trong cột nhồi hay tráng lên thành trong của cột mao quản. Lượng pha tĩnh trong cột càng lón, khả năng tách và lượng mẫu có thể phân tích của cột càng cao. Trong cột nhồi, lượng pha tĩnh có thế chiếm tối 25 % khối lượng của vật liệu nhồi cột. Các chất lỏng sử dụng làm pha tĩnh cũng khá đa dạng về nguồn gốc và độ phân cực. Hai loại pha tĩnh thông đụng nhất là dẫn chất của polysiloxan và polyethylen glycon. Các dẫn chất polysiloxan (methyl polyloxan, các hỗn hợp của methyl polysiloxan, phenyl polysiloxan và cyano polysiloxan) có độ phân cực từ kếm tới trung bình. Các polyethylen gìycon là pha tĩnh phân cực. Tên gọi của pha tĩnh khác nhau theo hãng sản xuất như o v , SE hay DB... cho các loại dẫn chất polysiloxan, Carbowax, CP-wax hay DB-wax... cho polyethylen glycon với các chữ số đứng sau để chỉ loại polysiloxan hay polyethylen glycon sử dụng. Các pha tĩnh khác như dầu apiezon, squalen, các alcol có độ sôi cao và những ester của chúng... cũng được sử đụng. Mỗi pha tĩnh đều có những nhiệt độ giới hạn của chúng, vượt quá nhiệt độ này sẽ làm pha tĩnh mau hư hỏng. Các dẫn chất polysiloxan, nhiệt độ thường không được quá 340 - 360°c, còn với polyethylen glycon, nhiệt độ thường không được quá 250°c. 4.4. Buồng côt Nhiệt độ là một yếu tố có ý nghĩa quan trọng trong việc tách các chất của quá trình sắc ký khí. Trong suốt quá trình phân tích, nhiệt độ của cột phải đồng đều trên toàn bộ cột. Nhiệt độ cột phải Ổn định, chính xác và thay đổi được theo yêu cầu phân tích. Phân tích sắc ký khí có thể được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt (isothermal) hay nhiệt độ tăng dần theo chương trình nhiệt {gradient), Để đạt được điều này, toàn bộ cột sắc ký được -đặt trong một khoang kín được gọi ỉà buồng cột. Buồng cột được cách nhiêt và có các thiết bi gia nhiêt, theo dõi nhiệt đô và phân phối nhiêt, giữ cho ■ nhiệt độ cột phân tích đồng đều, ổn định và tuân theo yêu cầu phân tích. Đại cương về dược liệu bọc 4.5. Detector Có nhiều loại detector khác nhau sử dụng trong sắc ký khí. Detector phổ biến nhất hiện nay là detector ion hoá ngọn lửa (flame ionization detector, FID), đây là loại detector phổ thông, phát hiện được hầu hết các chất phân tích, nhạy và có khoảng tuyến tính động học khá rộng, thích hợp cho việc định lượng. Loại này có thiết kế đơn giản và cũng tương đối rẻ tiến. Detector MS với nhiều kỹ tHuật đo khác nhau ngày càng trỗ nên phổ biết hơn vì tính hiộu dụng của nó. Nó phát hiện được rết nhiều chất nhưng cũng là một detector rất chọn lọc khi sử dụng kỹ thuật phát hiện chọn lọc ion. Phổ khối có độ nhạy cao và khoảng tuyến tính động học lốn thích hợp cho việc định lượng. Detector MS còn cung cấp những thông tin hữu ích về khối lượng phân tử và các phần mảnh để xác định câu trúc các chất. Ngoài ra, còn có các detector phổ thông hay đặc hiệu khác thích hợp cho từng nhóm hợp chất. Tuy nhiên, các detector này ít phổ biến. Để xác định một chất nào đó, ngoài thòi gian lưu (tr), ngưồi ta còn sử dụng chỉ sốlưu Kovats (hay còn được gọi là chỉ sô'Kovats hay chỉ sô'lưu). So với tr, chỉ số’ lưu Kovats ổn định hơn do bù trừ được những sai lệch do thiết bị và điều kiện phân tích. Để xác định chỉ số lưu Kovats cùa một chất, người ta tiến hành sác kỷ chất đổ vổi 2 chất chuẩn là hydrocarbon được chọn sao cho một chất được rửa giải trước và chất còn lại được rửa giải ra sau chất cần xác định. Chỉ số Kovats được tính dựa trên mốì liên hệ (logarit) của thể tích lưu (thời gian lưu) hiệu chỉnh của chất đó với 2 chất chuẩn. Sắc ký khí là phương pháp có hiệu năng tách rất cao, cao hơn nhiều so với HPLC. Nó có thể phân' tích những hỗn hợp rất phức tạp mà HPLC không phân tích nổi. Tuy nhiên, nhược điểm của sắc ký khí là phương pháp này chỉ có thể sử dụng cho phân tích các chất bay hơi. Các chất không bay hđi ở nhiệt độ phân tích (thường không quá 300°C) muốn phân tích được cần phải biến đổi thành dẫn chất bay hơi bằng cách ether hoá (methyl hoá, tolyl hoá, silyl hoá). Điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng của sắc ký khí.1 Mặc dù vẫn có thể sử dụng trong sắc ký điều chế nhưng trên thực tế, sắc ký khí gần như chỉ dùng trong phân tích định tính và định lượng. Trong phân tích được liệu, sắc ký khí rất thích hợp cho phân tích tinh dầu và các chất bay hơi. Đặc biệt, khi kết hợp với phổ khối kế và thư viện phổ, hệ thông GC-MS có thể phân tích và cho biết thành phần của tinh dầu và các chất bay hơi rất nhanh và hiệu quả. Các kết quả phân tích khối phổ trên, hệ thông sẽ được so sánh với một cơ sở dữ liệu về khối phổ ESI-MS (được gọi là thư viện phổ) để xác định các chất phân tích. 1 Sắc ký lòng quá tới hạn {super-critical fluid chromatography, SFC) được xem như là trung gian giữa GC và HPLC. SFC sử dụng chất lỏng quá tới hạn (thưởng là C02) làm pha động và sử dụng cột sắc ký với pha tĩnh tương tự HPLC. Nó sắc ký được các chất không bay hơi và khả năng phân giải cao hơn HPLC. Tuy nhiên, SFC cũng có những hạn chế. Việc duy trì nhiệt độ và áp suất ổn định trong 1 hệ giữa các lần phân tích và so sánh giữa các kết quà phân Ưch trên các máy khác nhau có những khó khăn. Đại cương về dược liệu học Có nhiều thư viện phổ khác nhau nhưng lón và thường được sử dụng nhất là thư viện phổ NIST. Hiện nay là phiên bản NIST-08 của Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia, Mỹ (National Institute of Standards & Technology). Thư viện có 220.460 phổ khôi EI-MS của 192.108 hđp chất thuộc các nhóm: (a) Thuốc, chất chuyển hoá và chất độc (b) Thuốc trừ sâu và trừ nấm, (c) các chất hữu cơ trong đất, nưâc và không khí, (d) aminoacid, di- và tri-peptiđ, (e) các tạp chất thông thường và (f) các dẫn chất phân tích của các nhổm trên. Thư viện còn cỏ 14.802 phổ MS/MS của 5.308 ion (3.898 cation và 1.410 anion) và 224.038 chỉ sô' lưu Kovats của 21.847 chất trên cả cột không phân cực và phân cực.' Một ứng dụng khác hiện nay cũng được quan tâm là phân tích dư lượng các chất bảo vệ thực vật còn lại trên dược liệu, dioxin và các chất độc hại trong thực phẩm, lượng dung môi tồn dư trong thuốc, các chất ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khoẻ con người (các hợp chất thơm đa vòng...). Các chất này thường tồn tại vối một lượng rất nhỏ trong hỗn hợp phức tạp, rất khó để phát hiện, định danh cũng như định lượng chúng bằng các phương pháp sắc ký khác. 5. Điện di mao quản Điện di là một phương pháp phân tích dựa trên sự khác nhau về độ linh động điện di (linh độ điện di, electrophoretic mobility, n) của hai hay nhiều chất hay tiểu phân tĩnh điện trong điện trưòng. Khi một dung dịch các chất được đặt trong một điện trường, các chất phân ly thành ion hay có khả năng tạo các tiểu phân tĩnh điện sẽ dịch chữyển về phía điện cực trái dấu vối nó. Tốc độ dịch chuyển của các ion trong hệ thông phụ thuộc vào độ lón của điện trường, bản chất của chất phân tích và một số yếu tô" khác của môi trường phân tích. Trong cùng một hệ, tốc độ dịch chuyển của các chất phụ thuộc vào độ linh động điện di của chất đó. Các chất có điện tích và /hoặc hình dạng và kích thước phân tử khác nhau sẽ dịch chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trưòng và tách khỏi nhau trong hệ điện di. Có 2 phương thức điện di chính là điện di trên mặt phẳng và điện đi mao quản. Điện di trên mặt phăng là phương pháp điện di được áp dụng sớm nhất. Bản điện di là một mặt phẳng được tráng bỏi 1 lốp gel (tinh bột, agar, agarose hay polyacrilamiđ), một lớp giấy lọc hay 1 bản mòng trải sìlicagel, cellulose, cellulose acetat, nitrocellulose. Tất cả được tẩm dung dịch đệm. Lóp gel, giấy hay silica gel... chỉ làm nhiệm vụ giá mang để giữ dung dịch đệm là môi trưồng để cho các ion dịch chuyển. Mẫu thử được đưa lên lớp gel. Hai cực của một điện trường mạnh tạo bỏi dòng điện một chiểu được áp trên 2 đầu đối diện của lớp gel làm các chất dịch chuyển về cực trái dấu tạo nên các băng trên bản điện di. Các băng này có thể được phát hiện bằng màu sác trong ánh sáng thường, trong ánh sáng tử ngoại hay dùng các thuốc thử tạo màu hay tạo thành các chất phát huỳnh quang. Do hiệu ứng sinh nhiệt Joule, điện thế áp dụng trong điện di trên mặt phẳng thường chỉ trong khoàng 15-40 v/cm để tránh sự tăng nhiệt quá mức làm khô dung dịch đệm trên bản điện di. Có nhiều kỹ thuật khác nhau được sử dụng trong điện di trên mặt phẳng. Đại cương về dược liệu học Trong điện di mao quản (Electrophoresis, CE), các chất được phân tách trong một mao quản silica nung chảy được chứa đầy dưng dịch điện giải. Đường kính trong của mao quản thường từ 20 - 100 um, chiều dài mao quản thay đổi thường là 20 - 30 cm kể từ đều vào đến detector. Chiều dài tối đa của mao quản là 100 cm. Hai đầu ống mao quản được nhúng vào 2 cốc đựng dung dịch điện giải. 0 gần một đầu của mao quản được gắn với detector. Hai đầu mao quản được nốì vối hai cực của nguồn điện một chiều (có thể thay đổi điện thế được) có điện thế thường vào khoảng 5-30 KV (có thể tới 800 v/cm). Điện thế càng lổn các chất dịch chuyển, càng nhanh nhưng có thể không kịp tách ra khỏi nhau. Thay đổi điện thế có thể đạt được việc phần tách tốt trong thòi gian ngăn nhất. Trong CE, tất cả các ion đều dịch chuyển về phía cực âm (cathod) mặc dù lực điện di làm các ion dương và âm dịch chuyển ngược chiều nhau. Hiện tượng này là do dòng điện thẩm (electroosmotic flow, EOF) sinh ra trong dung dịch đệm trong lòng mao quản, silica nung chảy. Dòng điện thẩm này dịch chuyển về cathod với tốc độ có thể tới 2 mm/s và phụ thuộc vào pH, độ nhớt của môi trường... và thường lớn hơn tốc độ dịch chuyển của các ion theo linh độ điện di. Như vậy, các ion dương sẽ dịch chuyển nhanh hơn tốc độ điện di vốn có của nó, các chất trung tích sẽ dịch chuyển vối tốc độ của dòng điện thẩm còn các ion âm sẽ dịch chuyển chậm hơn và ngược chiều vỗi chiểu điện di. Các chất khác nhau sẽ tách ra khỏi nhau và địch chuyển qua detector để được phát hiện và ghi lại thành điện di đồ. Các dctector sử dụng trong điện di cũng rất phong phú và có độ nhạy cao. Detector thông dụng nhất vẫn là detector tử ngoại. Detector có thể gắn trực tiếp trên mao quản, dùng mao quản như tế bào đo hay dùng các tế bào đo riêng biệt. Nhược điểm của phương pháp đo trực tiếp trên mao quản là độ nhạy thấp do quãng đưòng ngắn. Các detector huỳnh quang, laser, điện hoá hay dẫn điện... cũng được sử dụng. Việc kết nối máy điện di mao quản với khối phổ kế có những khó khăn nhất định về giao diện. Tuy nhiên các thiết bị CE-MS hiện, đã có mặt trên thị trường, tăng khả năng ứng dụng của điện di mao quản. Kỹ thuật ion hoá trong CE-MS chủ yếu là kỹ thuật phun điện {electro spray ionization, ESI). Đại cương về dược liệu học Trong điện di mao quàn, các kỹ thuật điện di sau được sử dụng: - Điện d i vùng (;zone electrophoresis) là kỹ thuật đơn giản và được áp dụng rộng rãi nhất hiện nay trong cả điện di trên mặt phẳng và mao quản. Trên mao quản, kỹ thuật này được gọi là điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE). Việc thêm vào dung dịch đệm một sô' chất sẽ cho các kỹ thật điện di mối như MECK, CIEF.CSE. - Sắc ký điện động micell {micellar electrokỉnetic chromatography, MEKC)1 là một phương pháp điện đi trong đó mẫu thử được tách ra bỏi sự phân bô" khác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm (pha động). Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn. Trong phần lỗn trường hợp, MEKC được tiến hành trong môi trường kiềm. Natri đođecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề mặt thưòng sử dụng nhất. - Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemuỉsion electrokinetic chromatography, MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC. MEEKC sử dụng các vi nhũ tương (thường là dầu7nước) làm pha tĩnh giả. MEEKG linh động và hiệu quả hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ỉy và trung tính nay Irong phân tích quang hoạt. MEEKC được đùng nhiều trong phân tích dược phẩm. - Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): là một kỹ thuật mổi được phát triển gần đây sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rủa giải đi qua pha tĩnh của cột nhồi HPLC có dung môi. CEC sử dụng thiết bị điện di thông thường nhưng có thêm ưu điểm là việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng hdn so vối điện di mao quản thông thường. Các chất trung tính cũng có thể phân tách vối hiệu quả rất cao trong kỹ thuật này. - Điện di rây mao quản {capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di rây mao quản, dung dịch đệm được thêm vào những chất có tác dụng cản trỏ vât lý sự đi chuyển của các phân tử như polyethylen oxyd hay dextran. Các phân tử lớn như protein sẽ di chuyển chậm hơn do ma sát hay cản trỏ bởi các chất này. Mứe độ bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động của phân tử. Nếu thêm váo môi trường điện di các chất có cấu trúc mạng 3 chiều tương tự như sắc ký lọc gel ta có Điện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE). Tuy nhiên, trong điện di mao quản, CSE cho kết quả lặp lại và tin cậy hơn, dễ thay thế sau khi điện di nên được sử dụng rộng rãi hơn trong phân tích protein. [Guttman A. J Chromatogr Sci 2003-41:449- 59.] - Ngoài các kỷ thuật trên, một số’ kỹ thật điện di mao quản khác cũng được sỏ dụng, Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng tốc (isotachophoresis, ITP)... Điện di mao quản có hiệu lực phân tách rất cao. Một trong những yếu tố quan trọng là các chất được di chuyển đồng đều trong mao quản tạo nên các băng dịch chuyển chứ không phải các vùng dịch chuyển dạng parabol như trong sắc ký lỏng cao áp. Điều này hạn chế sự dãn rộng các bảng phân tách, tạo nên các đỉnh hẹp trên điện di đồ làm cho dung lượng peak của điện di cao hơn, đồng nghĩa với độ phân giải cao hơn. Khi chọn được các điều kiện điện di thích hợp, độ phân giải của phương pháp có thể đạt được rất cao. Số đĩa lý thuyết trong một hệ điện di mao quản có thể đạt tới hàng trảm ngàn (thường là 100.000 — 250.000 đĩa lý thuyết), thậm chí hàng triệu (có thể tới 1 Còn được gọi !à sắc ký mao quản diện động micell (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC) Đại cương về dược liệu học 30.000.000 đĩa ỉý thuyết trong CGE các oligonucleotid). Do các đỉnh của các chất tách ra hẹp hơn nên chúng có cường độ lón hơn, góp phần làm tăng độ nhạy của phưđng pháp. Phương pháp điện di nguyên thuỷ (điện di vùng) vốn chì áp dụng cho các chất ion hoá. Vì thế, trong một hỗn hợp phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly đi chuyển làm cho điện đi đồ trỏ nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lượng. Thiết bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém vể vật tư tiêu hao hơn các phương pháp sắc ký khác. Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc ký khác. Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly. Mặc dù các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hoá nhưng việc phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn tương đối hạn chế. So vói sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch đệm, điện thể) cũng hạn chế và ít linh động hơn so vói lựa chọn dung môi và pha tĩnh sắc kỷ. Kỹ thuật điện di đã được áp dụng vào phân tích các hợp chất tự nhiên, (alkaloid, acid amin...) từ khá sớm (giữa những nảm 1950) với điện di trên mặt phang. Tuy nhiên, do không thuận tiện bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC phát triển sau đó (1970) nên ít được sử dụng. Kỳ thuật này hiện nay chủ yếu được sử dụng trong phân tích các đại phân tử (protein, polysacchariđ, vật liệu di truyền...) trong sinh hoá, lâm sàng và các lĩnh vực liên quan. Từ khi các thiết bị điện di mao quản được thương mại hoá vào năm 1987, với các ưu điểm trong phân tích các phân tử nhỏ, điện di mao quản đã thu hút sự quan tâm của các nhà phân tích hoá hợp chất tự nhiên. Trong các hỢp chất tự nhiên, các hợp chất phenol, alcaloid, các acid, acid amin rất thích hợp với phần tích điện di mao quản cả về định tính và định lượng. Các kỹ thuật điện di thương sử dụng trong phân tích dược liệu là CZE, MEKC và CEC. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU I. CHIẾT XUẤT Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất tan hoà tan trong đung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thòi xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hoà tan của chất tan vào dung môi. - Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. - Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu ...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất. Đại cương về dược liệu học Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểnv tra về mặt thực vật xem có đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không, cần ghi rõ nơi thu hái thòi gian thu hái. Tùy theo trường hợp'inà đặt vấn đề thòi vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Dược liệu sau đó có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý đểfdiệt enzym (xem phần ổn định dược liệu). Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tô' quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết. Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết vói các thiết bị như soxhlet, kumagawa... tùy yêu cầu, điều kiện mà lựa chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Các phương pháp chiết gồm có ngâm và ngấm kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng t.hừa dung môi trone một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hoà tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mối được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tói khi bão hoà ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tối cuối khối được liệu. Dung môi mâi tiếp xúc vối dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn. Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp. về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosid, các muối của alcaloid, các hơp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Đe chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cục. Trên thực tế, cồn vói các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng, cồn có thể hoà tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hoà tan hoạt chất. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưối áp suất cao v.v... đẳ được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất. Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm vói tần sô" trên 20 KHz thưòng được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hoà tan của chất tan vào dung môi và tảng quá trình khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cưòng độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết. Đại cương về dược liệu học Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng trong chuẩn bị mẫu phần tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Sohxlet cổ điển. Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào trong 1 bể siêu âm có chứa ỊXƯỐC, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyển qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn. Trong chiết xU(ất ở quy mô lốn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Do khả năng xuyên sâu kém nên việc sử dụng thưòng ở quy mô phòng thí nghiệm. Chiết với sự hỗ trơ của vỉ sóng Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vùng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác đụng của điện trưòng. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất ỉàm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hoà tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá huỷ cấu trúc vách tế bào thực vật ỉàm các cha't tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hoà tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết nhiều tạp chất hơn. Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet) đo rut ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15 - 20 phút. Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ử quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ cùa vi.sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thòi gian tiếp xúc vối nhiệt ngắn. Cũng có những báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid... Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ đã chấp thuận sử dụng kỹ thuật vi sóng trong việc chuẩn bị mẫu cho phân tích các chất hữu cd trong phân tích môi trường (EPA Method 3546). Chiết bằng chất lỏng quá tới han Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn1 {super‘critical fluid extraction, SFE) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp châ't tự nhiên. Nguyên tắc của phương pháp này như sàu: trong điều kiện áp sua't bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hoá 1 Có tài liệu gọi là chất lỏng siêu tối hạn do chữ super- Đại cương về dược liệu học hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, ngưòi ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Điểm (ứng với nhiệt độ và áp suất) mà một chất chuyển từ trạng thái hơi sang trạng thái lỏng này được gọi là điểm tối hạn (critical point) của châ't đó. Điểm tối hạn của nưốc có nhiệt độ tới hạn (tj và áp suất tối hạn (pj tương ứng là 374,2°c và 220,5 bar; với carbon dioxid te = 31,l°c và pc = 73,8 bar, vối ethanol tc = 243,4°p và pc = 72 bar. Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tối hạn có khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhốt thấp và khả năng khuếch tán cao có thể dùng để hoà tan các chất và ứng dựng vào chiết xuất các chất trong dược liệu. Các đặc tính của chất lỏng quá tói hạn (khả năng hoà tan các chất, độ nhót..) phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính (độ phân cực, khả năng hoà tan) của chất lỏng quá tối hạn. Trong thực tế, người ta thực hiện chiết trong điều kiện cao hơn điểm tới hạn một ít. Chất lòng thòng đụng nhất hiện Iiay là CO., lổng quá tối hạn. CQ* có điểm tới bạn thấp, rẻ tiền, không độc hại và thân thiện vâi môi trưòng, có thể thu hồi, không làm tăng hiệu ứng nhà kính. Khi chiết xuất hoạt chất từ được liệu, C02 lỏng quá tói hạn có lợi hơn các dưng môi hữu cơ thông thưòng ỏ chỗ ít độc hại, nâng cao hiệu suất và không để lại dư lượng dung môi trong cao chiết. Ngoài ra quá trình chiết xuất có thể tiến hành ở nhiệt độ thấp nên không làm biến đổi những thành phần kém bền với nhiệt độ. Một trong những nhược điểm của SFE là tính phân cực của C 02 lỏng quá tới hạn. 0 các điều kiện chiết thông thường, c o , lỏng quá tối hạn là một dung môi kém phân cực, do đó chỉ có thể dùng đề chiết các chất kém phân cực. Để cải thiện khả năng hoà t.an cán chất phân cực hơn, trong quá trình chiết xuất, người ta tbêm vào C02 lỏng quá tới hạn một lượng nhất định một dung môi phân cực (như methanol) để thay đổi tính phân cực của dung môi để chiết các chất phân cực hơn. Chiết chất lỏng quá tới hạn hiện nay được ứng dụng trong nhiều ngành ở quy mô công nghiệp (từ những năm 1978), trong nghiên cứu và phân tích kiểm nghiệm. Trong phạm vi nghiên cứu cây thuốc, tác giả đầu tiên ứng dụng phương pháp này là Stahl và cộng sự [Planta Med. , 1980, 40, 12]. Các nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng quá tới hạn là tinh dầu, chất béo, carotenoiđ và các chất kém phân cực khác. Với tinh dầu, việc chiết bằng C 02 lỏng quá tới hạn cho hiệu xuất chiết cao, thời gian chiết ngắn và không làm hư hỏng các chất nhạy cầm với nhiệt độ. Tinh dầu thu được có hương thơm gần với tự nhiên nhất. Ngưòi ta dùng carbon dioxyd và nitrogen oxyd hoá lỏng để chiết xuất nhiều loại hoạt chất trong cây như alcaloid ví dụ loại cafein trong hạt Cà phê, chiết những thành phần của hoa cây Dương cam cúc - Matricaria chamomilla, hoa Cúc trừ sâu - Pyrethrum cinerariifolium... Bằng phuơng pháp chiết này hiệu suất pyrethrin được nâng lên đến 50% so với phương pháp chiết bằng ether dầu. Trong phòng thí nghiệm, SFE được dùng để chiết mẫu cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ độc hại trong môi trường... Đại cương về dược liệu học Chiết dưới áp suất cao Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết xuất hiện đại là chiết dưới áp xuất cao (pressurized liquid extraction1 * PLE). Khả năng hoà tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng Sơ đồ hệ thống chiết dưới á p suđt hoà tan các chất Bĩnh hứng tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thưòng, việc tăng nhiệt độ chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hoá hơi, dung môi không còn khả năng hoà tan các chất nữa. Đê khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất. Khi nhiệt độ tăng lên 10°c, khả năng hoà tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi. Trong chiết dưối áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tối hạn. Nhiệt dộ và áp suất cao làm tăng khả năng hoà tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ chiết có thể thay đổi từ 80 - 200°c và áp suất có thể tới 150 bar tuỳ theo loại dung môi và chất cần chiết. So vói SFE, PLE có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi do đó có thể chiết các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực. Các thiết bị cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như SFE nên dễ dàng áp dụng thực tế trên quy mô ỉổn hơn. PLE cũng đã được sử dụng chính thức trong các quy trình chuẩn bị mẫu phân tích các thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu và các hydrocarbon thơm đa vòng... của cơ quan bảo vệ môi trường (EPA Method 3454). Trong nghiên cứu và sản xuất dược liệu, PLE đã được sử dụng để chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay chiết các chất ỏ quy mô lớn. Ví dụ, chiết dioxin bằng toluen hoặc toluen + 5 % acid acetic (150°c, 150 bar), chiết chất béo trong các hạt có dầu bằng n-hexan (100°c, 100 bar), chiết hypericin trong Hypericum perforatum bằng acetonitril (100°c, 100 bar). 1 Còn được gọi là Accelerated Solvent Extraction - ASE, pressurized solvent extraction - PSE, pressurized fluid extraction - PFE Đại cương về dược liệu học Một biến thể của PLE cũng được áp dụng trong chiết xuất dược liệu là chiết bằng nước nóng dưâi áp suất {pressurized hot water extraction, PHWE). Do điểm tái hạn của nưốc khá cao nên trong PHWE ngưòi ta dùng ip suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 - 200°c. Đặc tính (độ phân cực) của nước thay đổi rất nhiều trong điều kiện này làm cho nước có thể chiết được các chất kém phân cực hơn. Trong PHWE, sự phân huỷ các chất có thể xảy ra. II. PHÂN LẬP CÁC HOẠT CHẤT Phân lập là tách riêng một chất dưới dạng tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp. Thành phần của một dược liệu thường rất phức tạp, trong nhiều trường hợp, chỉ một hoặc vài chất trong hỗn hợp toàn phần của dược liệu được sử dụng làm thuốc, ví dụ, strychnin trong hạt Mã tiền, vincristin và vinblastin trong Dừa cạn, paclitaxen trong Taxus, quinin và quinidin từ Canh kina... Để tách riêng hoạt chất hoặc trong nghiên cứu muôn tách riêng các chất để xác định câu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dược lý... người ta cần phải tiến hành phân lập từng chất dưới dạng tinh khiết. Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân lập các chất từ một hỗn hợp. Có các phương pháp kinh điển như các phương pháp kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn hay các kỹ thuật sắc ký hiện đại v.v... 1. Kết tin h phân đoạn Phương pháp dựa vào độ hoà tan khác nhau của từng chất khi hoà tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi. Trong quá trình để yên đê dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần tình thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch còn lại có thể để bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung môi dùng để hoà tan/kết tinh phân đòạn thường là một dung môi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hay 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh. Đối với một số nhóm chất đặc biệt, để phân lập người ta tạo ra các dẫn chất ít tan ví dụ tao muối picrat alcaloid, tạo osazon các đường để cấc chất dễ kết tinh hơn. 2. Tách phân đoạn Đối với một vài nhóm chất, người ta có thể tách riêng từng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào lý hoá tính khác nhau của các chất thành phần như độ hoà tan trong các dung môi, tính acid hay base và độ mạnh cùa tính acid hay base. Ví dụ, một hỗn hợp muối alcaloid trong nước, khi kiềm hoá từ từ thì alcaloid có tính kiềm yếu nhất sẽ được giải phóng ra dạng tự do trưốc, nếu kiềm hoá tiếp thì lần lượt các alcaloid có tính kiềm mạnh hơn sẽ được tiếp tục giải phóng. Nếu ta dùng dung môi hữu cơ để chiết sau từng giai đoạn thì sẽ thu đuợc các alcaloid khác nhau. Cũng như vậy đối với một hỗn hợp acid hữu cơ dưới dạng muối sẽ được giải phóng từng phân đoạn khi thêm từ từ acid vô cơ rồi chiết bằng dung môi hữu cơ. Đại cương về dược liệu học 3. T hăng hoa Một sô" chất hay nhóm hợp chất có thể thăng hoa được như các coumarin và anthranoid ở dạng tự do (aglycon); cafein, ephedrin, camphor, borneol... có thể được tách ra khỏi hỗn hợp hay được tinh chế bằng cách cho thăng hoa. Quá trình thăng hoa có thể được thực hiện ò áp suất thường hay áp suất giảm. Khi thăng hoa dưới áp suất giảm, nhiệt độ thăng hoa của các châ't giảm làm giảm bớt tác động phân huỷ của nhiệt độ lên các chất. Với các đụng cụ thăng hoa dưới áp suất giảm có theo dõi áp suất và nhiệt độ người ta có thể thăng hoa cả những chất khó hay không thực hiện được bằng cách thăng hoa ở áp suất thường. Với dụng cụ này người ta có thể phân lập, tinh chế một sô" alcaloid, flavonoid... 4. Chưng cất p h ân đoạn Chưng cất phân đoạn là một trong những phướng pháp kinh điển dùng để tách các chất bay hơi ra khỏi một hỗn hớp dựa vào sự khác biệt nhiệt độ sôi của các chất trong hỗn hợp. Quá trình chưng cất có thể thực hiện ỏ áp suất khí quyển hay áp suâ't giảm. Phương pháp chưng cất phân đoạn được thực hiện vối những bình cắt có lắp cột phân đoạn và thường được nốì với máy hút chân không để giảm nhiệt độ chưng cất, giảm ảnh hưởng tới các chất nhạy cảm với nhiệt độ. Nhiệt độ và áp suất được theo dõi trong quá trình chưng cất. Phương pháp này thường áp dụng để tách các chất thành phần của tinh dầu. 5. Các phương p h áp sắc ký Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Thành phần của các dịch chiết thực vật thường rất phức tạp, thường vài chục chất. Tính chất của các chất cần tách cũng rất thay đổi, từ các chất không hay rất kém phân cực tới các chất phản cực mạnh, từ các chất phân tử nhỏ tói các đại phân tử. Hàm lương các chất trong hỗn hợp cũng rất thay đổi, từ vài % tới phần %0 hay thậm chí thấp hớn trong một sô' trường hợp. Trong các trường hợp như vậy, các phương pháp phân lập cổ điển như kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn v.v... không thể đáp ứng được. Khi đó, các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lóp mỏng điều chế, sắc ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký lỏng cao áp điều chế và sắc ký phân bố ngược dòng sẽ là các kỹ thuật được lựa chọn sử dụng. Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, về mặt lý thuyết và thiết bị đã được để cập tói à phần các phương pháp đánh giá dược liệu. Dưới đây là một sô" kỹ thuật sắc ký khác, đặc trưng cho phân lập các châ't thường sử dụng trong nghiên cứu dược liệu. 5.1. Sắc ký cột Sắc ký cột là phương pháp sắc ký mà pha tĩnh đưđc nhồi trong một cột hình trụ hỏ 2 đầu hoặc được tráng trong lòng một mao quản có đưòng kính trong rất hẹp. Theo nghĩa rộng, sắc ký cột bao gồm cả sắc ký cột cổ điển dùng trong điều chê các chất và sắc ký cột hiện đại thưòng dùng trong phân tích như Đại cương về dược liệu học là HPLC, GC... ở đây chỉ trình bày các kỹ thuật sắc ký cột cổ điển. Với kích thước cột ỉớn, sắc ký cột cổ điển chủ yếu được dùng trong việc chiết tách và phân lập các chất. Trong sắc ký cột cổ điển, ngưòi ta thường dùng các cột thuỷ tinh đưòng kính 1 - 5 cm dài 30 - 100 cm để nhồi pha tĩnh. Chất nhồi cột có kích thước từ 15 - 300 um. Kích thước hạt càng lớn, dung môi qua cột càng dễ dàng nhưng hiệu năng tách kém. Vối vật liệu nhồi cột là Silica gel dùng cho sắc ký cột, người ta thường phân ra làm 3 loại là loại mịn (15 - 40 um), loại vừa (40 - 63 um) và loại thô (63 - 200 |im). Lượng mẫu nạp lên cột thay đổi tùy theo tính chất phức tạp của mẫu và khả nảng tách của hệ thông. Tỉ lệ mẫu / pha tĩnh thưòng là 1/30 - 1/100 hay hơn. Trong 1 vài kỹ thuật, tì lệ này có thể tăng tới 1/ 10. Cột sẽ được triển khai bằng dung môi thích hợp. Dung môi có các chất được tách ra sẽ đi ra khỏi cột và được hứng thành từng phân đoạn, bằng tay hay bằng bộ hứng phân đoạn. Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng và những phân đoạn giống nhau được gộp chung, loại dung môi để thu được chất tinh khiết. Trong trưòng hợp sắc ký cột khô hay cột ngược, các băng chất được tách ra không được rửa giải ra khỏi cột mà được cắt thành các “khoanh” và giải hẵp bằng dung mỏi đẻ’ thu các chất. Trong sắc ký cột cổ điển, áp lực đẩy dòng dung môi qua cột là áp suất thuỷ tĩnh. Vói cột dài và chất nhồi cột mịn, tốc độ dòng dung môi giảm có thể ảnh hưởng đến kết quả sắc ký do hiện tượng khuyếch tán. Thời gian khai triển cũng rất dài, có khi là nhiều ngày hay hơn. Để khắe phục phần nào nhược điểm này, một số kỹ thuật sấc ký cột cải tiến đã được sử dụng giúp giảm thòi gian phân tách. Tuy nhiên, hiệu lực tách của cột cũng có thể giảm. Khi ấy người ta thường thu các phân đoạn đơn giản để tiếp tục phân tách trên các cột sắc ký khác. Hai kỹ thuật hay sử dụng là sắc ký cột nhanh (flash chromatography, FC) và sắc ký cột chắn không (vacuum liquid chromatography, VLC). cả hai đều sử dụng cột ngắn và đường kính lớn để tăng tốc độ dòng và tăng lượng mẫu. FC sử đụng áp suất dương thấp trên đầu cột còn VLC sử dụng áp suất âm ở cuối cột. Trang bị cho sắc ký cột cổ điển rất đơn giản, không tôn kém nên hiện nay vẫn là phương tiện chủ yếu để tách các chất có trong thành phần hoá học của dược liệu. Hiện nay, sắc ký cột cổ điển và các kỹ thuật cải tiến của nó vẫn đóng vai trò chính trong việc chiết tách và phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu. 5.2. Sắc ký lỏng áp su ấ t tru n g bình Để cải thiện khả năng phân tách các chất của sắc ký cột trong phân lập các chất, người ta sử dụng sắc ký cột áp suất trung bình (MPLC). MPLC được phát triển vào những nàm 1980 sử dụng các cột chịu áp lực có kích thưổc tương tự như sắc ký cột cổ điển nhưng nhồi pha tĩnh loại hạt mịn (15-40 |im). Cột được nhồi dưối áp suất nên có mật độ pha tĩnh cao hơn làm cho khả năng tách tốt hơn. Để có tốc độ dòng tôi ưu, một áp suất không quá 40 bar, thường là 5-20 bar, tạo bởi một bơm nén được dùng để nén dồng dung môi chảy qua cột với tốc độ dòng có thê từ 3 ml/phút tới 160-200 mì/phút tuỳ theo kích thước cột. Lượng mẫu thử cho MPLC có thể thay đổi từ vài chục mg tới lOOg. Mẫu thử có thể được đưa trực tiếp lên đầu cột, sau đó nối vối hệ thống bơm đẩy dung môi để triển khai hay được bơm vào hệ thống qua hệ thông van bơm mẫu. Đại cương về dược liệu học Pha tĩnh dùng trong MPLC là các pha tĩnh dùng trong sắc ký cột cổ điển (thường là silica gel) hay các loại pha đảo (RP) với kích thưổc tiểu phân thích hợp. Cột nạp các pha tĩnh RP có thể sử dụng lại nhiều lần. Việc thàm do và lựa chọn hệ dung môi thích hợp cho MPLC có thể được tiến hành trên sắc ký lớp mỏng. Một hệ dung môi thích hợp cho MPLC là hệ dung môi có Rf các chất cần tách vào khoảng 0,3 trên sắc ký lớp mỏng. Với pha tĩnh RP, có thể sử dụng HPLC phân tích để thăm dò hệ dung môi. Trên thực tế, một máy MPLC hiện đại thường có một hệ thông phân phối dung môi gồm bơm có thể thay đổi tốc độ dòng và các phụ kiện (chặn xung, gradient...); một hệ thống bơm mẫu với vòng lặp và van chuyển; cột MPLC, một detector u v , một máy tính để điều khiển thiết bị và ghi nhận kết quả; và một bộ hứng phân đoạn. So với sắc ký cột cể điển, hiệu năng tách của MPLC cao hơn. Hiệư năng tách của MPLC là trung gian giữa sắc ký cột cổ điển và sắc ký lỏng cao áp điểu chế. So với HPLC điều chế, MPLC có thể sử dụng các cột lớn hơn nên có thể tách lượng mẫu nhiều hơn. Do các cột sắc ký là tự nhồi và chất nhồi cột là loại thông thường, dung môi không đòi hỏi chất lượng đặc biệt, thiết bị không quá phức tạp nên MPLC dễ áp dụng và kinh tế hơn so vối HPLC điều chế. 5.3. Sắc ký p h â n bố ngược dòng Trong sắc ký cột cổ điển và MPLC, pha tĩnh sử dụng thường là các chất hấp phụ pha thuận tương đối rẻ tiền và thưòng chỉ sử dụng một lần. Các pha tĩnh này thích hợp vối các chất từ kém phân cực tới phân cực trung bình. Trong những trường hợp phân tích các hỗn hợp phức tạp, các chất phân cực mạnh như các glycosid có mạch đường dài, các polyphenol, các alcol, acid phân tử nhỏ v.v... pha tĩnh hâp phụ thưỏng không cho kết quả tốt. Khi ấy, người ta thường sử dụng cđ chế phân bô' để tách các châ”! Các pha tĩnh phân bố sử dụng trong HPLC (thường ià pha đảo) rất thích hợp trong những trường hợp này. Tuy nhiên, các pha tĩnh này thường đắt tiền, chỉ sử dụng trong sử dụng trong sắc ký điều chế khi thật cần thiết. Để cải thiện khả năng phân tách các chất phân cực, ngưòi ta phầt triển phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng (Countercurrent chromatography, CCC). Sắc ký phân bố” ngược dòng là phương pháp sắc ký mà trong đó cả pha tĩnh và pha động đều ở trạng thái lỏng. Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bô" ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân huỷ mẫu. sắc ký phân bô' ngược dòng là phương pháp có khả nảng tảch các chất phân cực hiệu quả, hệ dung môi dùng cho cả pha tĩnh và pha động linh hoạt, rẻ tiền và có thể tiến hành trên phân tích lượng mẫu khá lốn trong thòi gian tương đối ngắn. Khác vối HPLC hay các kỹ thuật sắc ký cột trên pha tĩnh lỏng mà trong đó pha tĩnh thường được giữ trên một giá mang rắn, pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng là một chất lỏng theo đúng nghía. Hai chất lỏng hay hỗn hợp chất lỏng không đồng tan này ‘dịch chuyển’ ngTíỢc chiều và tiếp xúc liên tục với nhau. Trong quá trình dịch chuyển, các chất trong hỗn hợp mẫu cần phân tích sẽ được hoà tan một cách cạnh tranh vào pha tĩnh và pha động. Mức độ hoà tan của chất giữa 2 pha phụ thuộc vào Đại cương về dược liệu học hệ số phân bố1 của nó trong 2 pha. Các chất có hệ số phân bô' khác nhau sẽ phân bố vào pha động và pha tĩnh vối những tỉ lệ khác nhau và trong quá trình địch chuyển của pha động sẽ dần dần tách ra khỏi nhau. Trong quá trình phã động dịch chuyển, sự phân bố các chất giữa 2 pha diễn ra, các chất trong hỗn hợp mẫu (được đưa vào ở 1 đầu của pha tĩnh) sẽ dịch chuyển dần về cuối pha tĩnh và tách ra khỏi nhau. Các chất có hệ số’ phốn bô' trong pha động lớn sẽ tách ra trưóc trong pha động và đi ra khỏi hệ thông trước tiên. Chất có hệ số k càng lốn sẽ ra càng sớm. Các chất có hệ sô' phân bô' trong pha tĩnh lớn hơn cũng được tách ra khỏi nhau và địch chuyển trohg pha tĩnh vê' phía cuổì cột. Đến một thời điểm nào đó, khi các chất tan nhiều trong pha động đã được tách ra khỏi hệ thống, người ta ngừng không đưa pha động vào nữa mà dùng pha tĩnh để đẩy phần chất lỏng trong hệ thống ra. Các chất đã tách ra trong pha tĩnh cũng sẽ được hứng thành từng phân đoạn riêng biệt. Các chất tách trong hệ càng tốt khi “số' đĩa lý thuyết” của hệ càng lớn, tức là khi sự tiếp xúc giữa 2 dung môi và chiểu dài của “cột” (pha tĩnh) càng lân. Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký phần bố ngược dòng thường là hỗn hợp của 2 hay nhiều (thường không quá 4) dung môi có khả năng hoà tan hạn chê' vào nhau. Khi tỉ lệ các dung môi này vựợt. quá giới hạn hòa tan. chúne sẽ tách thành 2 pha với tỉ lệ của các dung môi trong mỗi pha hoàn toàn khác nhau. Hai pha này sẽ được sử dụng làm pha động và pha tĩnh trong sắc ký phân bố ngược dòng. Ví dụ, với hỗn hợp hai dung môi là n-butanol và nưóc ở 30°Cf khi tỉ lệ hai dung môi vượt quá khả năng hoà tan vào nhau sẽ tách thành hai lóp chất lỏng riêng biệt là n-butanol bão hoà nưốc (với lương nưác là 7% kl/kl) và nưốc bão hoà n-butanol (với lượng n-butanol ~ 21% kl/kl). Để một hỗn hợp chất lỏng có thể “đứng yên” làm pha tĩnh, ngưòi ta cần có những thiết bị đặc biệt. Thiết bị tách phân bô' đơn giản nhất được sử dụng tách các hỗn hợp chất là thiết bị Phân bố ngược dòng (Countercurrent distribution - CCD) được L. c. Craig thiết kế vào những năm 1940. Thiết bị gồm nhiều bộ phận là những ông bằng thuỷ tinh có thiết kế đặc biệt để chứa pha tĩnh và pha động, khi vận .hành có thể chuyển pha động từ ông nà}f sang ông khác. Mỗi ông chiết được xem như một đĩa lý thuyết. Nhược điểm của thiết bị này là sô" đĩa không nhiều nên khả năng tách tương đối hạn chế và thiết bị tương đối cồng kềnh. Ngày nay, có một sô" thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng với số đĩa lý thuyết lớn hơn, gọn và dễ sử dụng hơn đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm. Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ {Droplet countercurrent chromatography - DCCƠ) được Yoichiro Ito và cộng sự giới thiộu vào những năm 1970. DCCC sử dụng những ông nhò có đường kính trong 2 - 4 mm và chiều dài 40cm. Các Ống này (khoảng 300 ông) được xếp đứng song song vối nhau và nối vởi nhau qua hệ thống ông teflon vối đầu Ống này nối vào cuối ông kia. Pha động Sơ độ hệ thống DCCC với pha tĩnh màu sẫm trong các ống thuỷ tinh và pha động {nhẹ hơn) màu nhạt là những giọt nhỏ trong ống thuỷ tinh và trong các ống teflon 1 Hệ số phân bố k của một chất tan là tỉ số giữa nồng độ chất đó trong pha fĩnh/nổng độ của nó trong pha động. Hệ số k càng lớn khi chất tan tan nhiều trong pha tĩnh. Để sắc ký phân bố hiệu qúả, k nên gần bằng 1 . Đại cương về dược liệu học được dịch chuyển qua pha tĩnh dưới dạng những giọt nhỏ nểi lên hay chìm xuống trong pha tĩnh (tuỳ thuộc vào pha động nặng hơn hay nhẹ hơn pha tĩnh). Nhược điểm của DCCC là tốc độ chậm và hiệu quả tách chưa cao do sự tiếp xúc kém giữa 2 pha. Sắc ký phân bô' ly tâm (Centrifugal partition chromatography - CPC) hay còn gọi là Sắc ký ngược dòng giọt nhỏ ly tâm (Centrifugal droplet countercurrent chromatography - CDCCC) cũng tương tự như DCCC nhưọg dòng pha động có thể được bơm vào với tốc độ cao hdn (có thể tới 100 lần htín so với DCCC) nhừ tác động của lực ly tâm. Thiết bị gồm các ống polymer chịu dung môi (như teflon) nối vói nhau giống như DCCC nhưng được sắp xếp theo hướng từ tâm ra ngoài của 1 trục quay. Khi vận hành, các ống được quay qúanh trục và lực ly tâm sẽ giữ cho pha tĩnh trong ông. Pha tĩnh được bơm vào hệ thống theo hướng từ tâm ra ngoài với pha động nặng hơn hay ngược lại vói pha tĩnh nhẹ hơn. Do khả năng tiếp xúc giữa 2 dung môi tốt hơn nên CDCCC có số đĩa lý thuyết lốn hơn. Tốc độ phân tách của CPC cũng nhanh hơn so với DCCC. Hệ thông sắc ký phân bô' ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography - HSCCC) là hệ thông được Y. Ito phát triển vào những năm 1980 và được sử dụng nhiều hiện nay trong các thiết bị sắc ký phân bố ngược dòng do hiệu quả phân bố cao và tốc độ phân tách nhanh. Cũng giống như DCCC, HSCCC sử đựng lực ly tâm để giữ một chất lỏng trong hệ thống làm pha tĩnh và chất lỏng còn lại được bơm vào hệ thống làm pha động. Thiết bị HSCCC bao gồm 1 ống nhựa teflon vổi 1 đầu của ống được dùng làm đầu vào còn đầu kia là đầu ra của hệ thống. Đầu vào và ra của hệ thông có thể đảo ngược tùy theo pha động là nặng hay nhẹ hơn so với pha tĩnh. Ông này được cuộn xoắn, lại theo kiểu lò xo hay xoắn ốc, vừa có thể quay quanh trực cùa nó đồng thòi được sắp xếp để có thể quay quanh 1 trục chung theo kiểu chuyển động của hành tinh quanh mặt trời. Tuỳ theo thiết kế mà thiết bị có số’ lượng cuộn và cách sắp đặt các cuộn có khác nhau. Trong đó, ỉoại thiết bị có cách sắp xếp các cuộn xoắn theo ‘kiểu J’ phổ biến và được sử đụng nhiều nhất. Trong phân lập các chất trong dược liệu, để việc phân lập hiệu quả hơn, đặc biệt là vổi các hỗn hợp phức tạp và có cấu trúc gần giông nhau, ngưòi ta thường sử dụng phốỉ hợp các phương pháp sắc ký với các cơ chế tách khác nhau. Ví dụ, như phân tách cao chiết thành các phân đoạn đơn giản hơn bằng các phương pháp săc ký cột cải tiến (FC, VLC) sau đó tách bằng sắc ký cột cổ điển vối các loại pha tĩnh khác nhau, sắc ký rây phân tử, MPLC và HPLC điều chế. Việc áp dụng các phương pháp nên đi dần từ đơn giản tói phức tạp, từ các phương tiện, pha tĩnh rẻ tiền tối các loại có giá thành cao. Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat CHƯƠNG 2 CARBOHYDRAT VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA GARBOHYDRAT ■ ■ ĐẠI CƯƠNG VỀ CARBOHYDRAT ĩ. ĐỊNH NGHĨA Carbohydrat rất phổ biến trong giới sinh vật và là thành phần rất quan trọng của thực vật. Carbohydrat là nơi “tích trữ” năng lượng từ ánh sáng mặt trời thông qua quá trình quang hợp; tham gia vào cấu trúc tế bào cũng như biệt hóa tế bào. Carbohydrat cũng là nguồn carbon để tổng hợp các hợp chất khác và là nguồn thực phẩm quan trọng nuôi sông loài ngưòi và loài vật. Cấu tạo của carbohydrat gồm có c , H và o trong phân tử. Đầu tiên, khi nghiên cứu những hợp chất đơn giản của nhóm này người ta thấy tỉ lệ C:H;0 thường là 1:2:1 tương ứng với công thức Cn(H20)n nên gọi chúng là carbohydrat, ví dụ glucose C6H120 6 có thể viết C6(H20 )6. Sau này, ngưòi ta nhận thấy có ngoại lệ, một sô' đường không có dạng công thức chung là Cn(H20)n (ví dụ các methyl pentose CH3-(CHOH)4-CHO), các đưòng deoxy... hoặc có một so'cha't, tuy không phải thuộc carbohydrat nhưng vẫn có thể viết được theo công thức trên, ví dụ như acid lactic CHg-CHOH-COOH có thể viết thành C3(H20)3. Do đó, để có một tên gọi chính xác, hội nghị quốc tế về danh pháp đã để nghị gọi nhóm hợp chất này là glucid. Tuy nhiên, thuật ngữ carbohydrat vẫn còn thông dụng. Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat Có thể định nghĩa carbohydrat hay glucid là những nhóm hợp chất hữu cơ bao gồm các monosacchariđ, những dẫn chất và những sản phẩm ngưng tụ của chúng qua dây nối glycosid. Các carbohydrat có thê chia thành 3 nhóm chính: monosaccharid, oligosaccharid và poỉysaccharid. Monosaccharid (đưòng đơn) là những polyhydroxyaldehyd (aldose) và polyhydroxyceton (cetose) có mạch 3 hay nhiều hơn 3 carbon. Monosaccharid là những đường đơn không thể cho carbohydrat đơn giản hơn khi bị thủy phần. Chúng có thể tồn tại ở dạng mạch hở hay dạng mạch vòng bán acetal. Monosaccharid tồn tại trong tự nhiên có từ bôn carbon (tetrose) đến 9 carbon (nonose). Các dẫn xuất của chúng như khử hóa nhóm aldehyd thành alcol (các alditol) hay sự oxy hóa các nhóm thế tận cùng thành acid carboxylĩc (các aciđ uronic) hay thay thế 1 nhóm hydroxy bằng hydro (các đường deoxy), nhóm thiol hay amino (các glycosamin) cũng được xem như là các dẫn chất monosaccharid. Oligosaccharìd1 là những carbohydrat khi thủy phân cho từ 2 đến 9 đơn vị đường (các đường đơn). Trên thực tế, thường chỉ gặp các oligosaccharid có từ 2 - 6 đơn vị đường. Ví dụ, m altose (4-0-a-Z)-glucopyranosyl-D-glucose), gentibiose (ô-ỡ-yỡ-D-gluco-pyranosyl-D-glưcose), cellobiose (4-O-yỡ-ơ-gluco-pyranosyl-D glucose), lactose (4-0->9-D-ga]acto-pyranosyl-D-glucose). Oligosaccharid có nhiều đơn vị đưòng đơn thường hay gặp trong các mạch đường của các heteroẹid, đặc biệt trong các saponin. Ví dụ, mạch đường của clematosid B, một trong những saponin của cây Clematis mandshurica là glc 1—>4 glc 1—»4 xyl l-»2 arab ỉ-»2 arab l-> 4 rham. Polysaccharid (còn được gọi là glycan) có phân tử rất lớn gồm nhiều monosaccharid nối vói nhau bằng dây nối glycosid. Sô' lượng các đường đơn trong một polysaccharid rất lón từ 100 — 100.000 đơn vị với khối lượng phân tử từ 1,6 X 104 - 1,6 X 107 đơn vị khôi. Các polysaccharid thường được chia thành hai nhóm chính: Homopolysaccharid {homoglycan)\ là các polysaccharid mà các đớn phân chỉ gồm một loại đường duy nhất. Ví dụ: tinh bột, cellulose cấu tạo bởi n phân tử glucose; inulin cấu tạo bởi n phân tử fructose. Tên chung của các chất này thường được ghép bởi tên gốc của đường đơn + tiếp vĩ ngữ ~Ian. Ví dụ glucan2 là tên chung để chỉ các polymer của glucose như tinh bột và cellulose; fructan để chỉ các polymer của fructose như inulin. HeUropolysaccharid (heterogỉycan): là các polysacchariđ mà phân tử có hai hay nhiều loại đường đơn khác nhau. Nhóm này có cấư tạo phức tạp, tùy theo thành phần đường đơn mà người ta còn chia thành nhiểu nhóm nhỏ như 1 Oligo~ theo tiếng Hy Lạp có nghĩa !à một it so với mono~ (một) và poly- (nhiều). 2 Cẩn phân biệt giữa glycan và glycosid (từ chữ Hy Lạp glycos có nghĩa là ngọt để chỉ các đưởng nói chung) với glucan và glucosidđề chỉ các glycan và gtycosid của đường glucose. Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat pectin, gôm, chất nhầy v.v... Tên gọi chung của các chất có cùng loại đường cũng được gọi bằng tên gốc của đường + tiếp vĩ ngữ ~an. Tuy nhiên, do có hai loại đường trỏ lên nên tên chính sẽ là tên gốc của đưòng có tỉ lệ cao nhất còn tên gốc của các đưòng có tỉ lệ thấp hơn sẽ được đùng làm tiếp đầu ngữ. Tỉ lệ của đường nào trong phân tử càng thấp thì nằm càng xa phần têọ gốc (tức là phía đầu của tên). Ví dụ, hợp chất galactoglucomannan có tỉ lệ đường là manose > glucose > galactose. Khi tỉ lệ đường chưa được xác định người ta viết các đường theo thứ tự bảng chữ cái như là phần tiếp đầu ngữ còn tên chính sẽ là gỉycan. Ví dụ, arabinogalactomannoglycan. Oligosaccharid và polysaccharid còn được gọi chung ỉà các holosỉd1 để phân biệt vói các heterosid là những chất có cấu tạo bởi 1 phần đường và phần còn lại không phải là đưòng. Carbohydrat còn có thể kết hợp với các chất phân tử lón không phải là đường để tạo nên các peptidoglycan, proteoglycan và glycoprotein; các gỉycolipid và lipopolysaccharid và các glysaminoglycan. Phần dưói đây chỉ đề cập đến phần polysaccharid. II. TINH BỘT Tinh bột là sản phẩm quang hợp của cây xanh. Ớ trong tế bào thực vật, hạt lạp không màu là nơi tạo ra tinh bột, các glucid hòa tan đi đến hạt lạp không màu và được để dành dưói dạng tinh bột. Tinh bột được giữ lại trong các bộ phận của cây như củ, rễ, quả, hạt, thân vối hàm lượng từ 2-70%, trong lá thưòng không quá 1-2%. Tinh bột ở dưới dạng hạt kích thưốc và hình dáng khác I nhau, không tan trong nước, lạnh, đim với nước thì tinh bột dần dần bị hồ hóa i và độ nhớt của dung dịch cũng tăng lên. Trong quá trình hoạt động của cây, ị tinh bột dưối tác động của enzym có sẵn trong cây bị cắt nhỏ thành những ; đường đơn giản ở dạng hòa tan và được chuyển đến những bộ phận khác nhau I của cây. Ị 1. Câ'u trúc hóa học của tinh bột I Tinh bột được cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid được gọi là amylose và amylopectin. 1.1. Amylose Phân tử amylose là một chuỗi hiện nay được biết đến hàng nghìn đơn vị a-D glucose nối vối nhau theo dây nối (l-»4). ÒH ÓH ÒH Amylose và dây nối a-D-1->4 glucopyranosy! 1 Holo~ theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là toàn thể, còn heterơ- có nghĩa là khác. Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat Quan niệm trước đây cho rằng chi có từ 200-400 đơn vị vì do quá trình chiết xuất và phân tích, mạch đưòng bị đứt. Phân tử amylose là các chuỗi thẳng không phản nhánh. Công thức lập thể của các đơn vị glucose ở dạng ghế Cl nối vối nhau tạo thành những vòng xoắn, mỗi vòng có 6 đơn vị glucose. 1.2. Am ylopectỉn Amylopectin có phân tử lượng lớn hơn nhiều so với amylose, khoảng 106- 107 gồm 5000-50.000 đơn. vị glucose và phân nhánh nhiều. Các đơn vị a-D glucose trong mạch cũng nốì với nhau theo dây nốì (1 -» 4) còn chỗ phân nhánh thì theo dây nối (1-* 6). Cấu tạo của amylopectin Để đánh giá mức độ phân nhánh, ngưòi ta methyl hóa toàn bộ các nhóm OH của phân tử amylopectin rồi sau đó thủy phần và xác định tỉ lệ các đường thu được. Mức độ phân nhánh được suy ra từ lượng 2,3-dimethylglucose thu được. Lượng 2,3,4,6- tetramethy] glucose ứng với những đơn vị đường tận cùng của mạch; còn lượng 2,3,6- trimethylglucose ứng vúi những đơn vị glucose trong mạch. Ngoầi ra, còn có thể xác định lượng glucose đầu mạch dựa vào tính khử của amylopectin không methyl hoá. Cần nhớ rằng đây là glucose có OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, nhũng mạch bên ngoài có từ 10-18 đơn vị. (xem sơ đồ ỏ trang bên) Trong các loại tinh bột, tỉ lệ amylose trung bình là 15-30%, còn lại là amylopectin. Tỉ lệ này tuỳ thuộc vào loài thực vật. Tuy nhiên, người ta cũng tạo ra được những chủng thực vật có nhiều amylose, ví dụ ngô, có tinh bột chứa đến 75% amylose. Carbohydrat và dươc liêu chứa carbohydrat CH,OCR, CH,OCH CH,OCH. CH,OCH CH,0 — 0J CH.O CHjO CHj o H CHjOCHj o H L . h\ — OCH, H OCH, IX I, IV, V. ------ (Đơn vị cuối mạch) Ii.m .v i - (Đơn vị ỏ giữa) oCHj Jỵ -2,3,4,6-Telramethylglucose H H\ OH H ÓCH, CH,OCHj ,, 0 H H J ^ \ OCH, -2,3,6-T rimethylglucosc OH H OCH, CH,OH -o H H H\ VII, v n i — (Điểm phân nhánh) 2. Sinh tổng hợp tinh bột HO OCH, ) OH H OCH, -2,3-Dimethylglucose Amylose trong tinh bột được tạo thành có sự tham gia của các enzym gọi là “enzym vận chuyển glycosyl” để nối dài mạch đưòng. Trước tiên phải có một oligosaccharid có ít nhất 3 đơn vị glucose nốỉ với nhau theo dây nối a-1,4. Chất cung cấp glucose tiếp để nối dài là UDP-glucose và ADP-glucose trong các nucleotid. (Glucose)n + UDP-glucose -> (Glucose)n+1 + UDP (Glucose)n+1 + UDP-glucose (Glucose)n+2 + UDP v.v... Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat Amylopectin được tạo thành từ amylose có sự tham gia của một loại enzym vận chuyển gọi là Q-enzym. Bước đầu enzym này cắt một polysaccharid mà *• mạch có chứa ít nhất 40 đơn vị glucose làm thành hai đoạn. Một trong hai đoạn đó (đoạn mang đơn vị glucose có OH bán acetal tự do) liên kết vối enzym rồi ; được chuyển đến một điểm thích hợp của amylose để thiết lập nên mạch nhánh a-1,6. Khi được tổng hợp trong cây, các phân tử tinh bột được “cuộn” lại thành nhũng hạt tinh bột có cấu trúc bán tinh thể và có hình dạng và kích thưdc nhất định, phụ thuộc vào loài cây. 3. Tính chât của tỉnh bột 3.1. Hình dang tinh bột Tùy theo loài cây và mức độ trưởng thành của cây mà hình dáng và kích thước thay đổi. Đây là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dược liệu chứa tinh bột. Khi soi dưổi kính hiển vi, hạt tinh bột của các loài thực vật khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau, về hình dáng, hạt tinh bột có thể hình cầu, hình trứng, hình đa giác... 'Các hạt tinh bột có thể rời hay đôi khi dính lại thành những hạt tinh bột kép đôi hay kép ba hoặc có khi tụ thành đám. Kích thước hạt tinh bột có thể thay đổi từ 1-100 fim. Hạt tinh bột có cấu tạo bởi nhiều lốp đồng tâm sắp xếp chung quanh một điểm gọi là rôn hạt (hay còn gọi là tễ). Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lổn dần bằng cách tăng thêm các lớp ỏ phía ngoài. Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm lượng nước. Dưới kính hiển vi có thể thấy như những vân trên hạt. Các vân này có thể rõ hay mò. Sự khác nhau về cấu tạo mạng cấu trúc của hạt tinh bột làm nên sự khác biệt này. Các vân sáng của hạt tinh bột là vùng kết tinh cấu tạo bởi các dây nhánh glucose liên kết với nhau bằng dây nốĩ a-D l->4. các vân tối là vùng vô định hình vói các đ ây nối 1—>6 [Cui s. w. Food. Carbohydrates: Chemistry, Physical Properties, and Applications; Taylor & Francis, 2005, 325-7], Rốn có thể là một điểm, một vạch ngắn, hình hoa thị hay một vạch, dài, một vạch dài phân nhánh. Dưới kính hiển vi phân cực, hạt tinh bột có hiện tượng chữ thập đen. Tất cả các đặc điểm trên giúp cho việc xác định các hạt tinh bột, phân biệt tinh bột của các loài khác nhau và xác định các trường hợp giả mạo. Dưối đây là một số” loại hạt tinh bột hay gặp. Hạt tinh bột lúa mì Quan sát dưới kính hiển vi dưới ánh sáng thưòng (hình lỏn) và ánh sáng phàn cực (hinh nhò) Carbohydrat và dược liệu chứa carbohydrat 3.1.1. Hạt hình trứng và hình thận Tinh bột khoai tây chế từ củ cây Khoai tây — Solanum tuberosum L-, thuộc họ Cà-Solanaceae. Hạt tinh bột hình trứng, rốn hạt ỏ đầu hẹp, các vân đồng tâm đễ nhận, Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3. Kích thưốc trung bình 50 Ịim nhưng cũng có hạt lớn đến 80-100 |im. Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây Dong - Maranta arundinacea L., thuộc họ Dong-Marantaceae (đừng nhầm với các cây Hoàng tinh - Polygonatum spp.). Hạt hình trứng kích thước 30-60 um. Tinh bột Sắn (Khoai mì) chế từ cây sắn (Khoai mì) - Manihot esculenta Crantz; họ Thầu Dầu-Euphorbiaceae. Hạt hình cầu phần lớn một đầu bị lẹm và hơi lõm trông như cái chuông. Rốn hạt hình sao, kích thước 3-35 ỊAm. Tinh bột Hoài sơn, chế từ củ của cây Củ mài — Dioscorea persimilis Prain và Burkill, họ củ nâu-Dioscorcaceae. Hạt hình trứng Viay hình thận, kích thước trung bình 40 Jim, rốn hạt dài. Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseoỉus spp.; họ Đậu- I Fabaceae. Hạt hình trứng hay hình thận, kích thưốc trung bình 35 |im, rốn hạt I đài và phân nhánh. Tinh bột sen, chế từ hạt cây Sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen- ị Nelumbonaceae. Hạt tỉnh bột hình trứng hay hình thận, kích thưổc hạt từ 3-25 ; |im, rốn hạt hình vạch. 3.1.2. Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa mì — Triticum vulgare L., họ Lúa Poaceae, kích thưốc: hạt lớn 30 um, hạt bé 6-7 fim. Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình tròn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt. Rốn hạt' là 1 điểm ỏ giữa hạt, nhìn không được rõ. 3.1.3. Hạt hình đa giác Tinh bột gạo chế từ hạt cây Lúa - Oriza sativa L.; họ Lúa-Poaceae. Hạt đa giác, nhỏ, kích thưốc từ 4-6 |am, thường được kết thành đám. Rốn hạt không rõ. Tinh bột ngô (bắp), chế từ hạt cây Ngô - Zea mays L.; họ Lúa-Poaceae. Hạt đa giác, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thước 15-30 um.