🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Độc tố trong thức ăn chăn nuôi Ebooks Nhóm Zalo Đ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM GS. TS TỪ QUANG HIỂN (Chủ biên) GS. TS ĐẬU NGỌC HÀO TS. LÊ THỊ NGỌC DIỆP TS. TỪ TRUNG KIÊN ĐỘC TỐ TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI (Tài liệu sử dụng cho đào tạo bậc tiến sĩ) NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI 2012 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM GS. TS TỪ QUANG HIỂN (chủ biên) GS.TS ĐẬU NGỌC HÀO - TS LÊ THỊ NGỌC DIỆP - TS TỪ TRUNG KIÊN ĐỘC TỐ TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI (Tài liệu sử dụng cho đào tạo bậc tiến sĩ) NHÀ XUẤT BẢN NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2012 1 2 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU 5 Chương I. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ CỦA NẤM MỐC 7 1.1. Những thông tin cơ bản về nấm mốc và độc tố của nấm mốc 7 1.2. Tác hại của nấm mốc đối với vật nuôi và thức ăn chăn nuôi 13 1.3. Các phương pháp phòng chống nấm mốc 15 Chương II. ĐỘC TỐ AFLATOXIN 25 2.1. Giới thiệu về độc tố aflatoxin 25 2.2. Bệnh nhiễm độc aflatoxin ở vật nuôi (Aflatoxicosis) 26 2.3. Điều kiện để A.flavus phát triển và sản sinh aflatoxin ở ngô hạt 34 2.4. Phương pháp phân tích aflatoxin 37 2.5. Các phương pháp phân hủy aflatoxin 45 2.6. Sử dụng thức ăn chăn nuôi bị nhiễm aflatoxin 52 2.7. Một số chế phẩm chống aflatoxin 56 Chương III. ĐỘC TỐ HCN TRONG SẢN PHẨM SẮN 61 3.1. Giới thiệu về độc tố HCN trong cây sắn 61 3.2. Phương pháp hạn chế và loại bỏ HCN trong sản phẩm sắn 64 3.3. Nghiên cứu, sử dụng sắn trong chăn nuôi 67 Chương IV. ĐỘC TỐ MIMOSIN TRONG KEO GIẬU 73 4.1. Chất độc mimosin trong keo giậu 73 4.2. Mimosin trong cây keo giậu 76 4.3. Phương pháp hạn chế và loại bỏ mimosin trong thức ăn 77 4.4. Các nghiên cứu về sử dụng keo giậu trong chăn nuôi 80 3 Chương V. ĐỘC TỐ TRONG ĐẬU ĐỖ, KHOAI TÂY VÀ MỘT SỐ CHẤT CÓ THỂ GÂY ĐỘC 85 5.1. Độc tố trong đậu đỗ 85 5.2. Độc tố solanin trong khoai tây 96 5.3. Tác động độc của khoáng 98 5.4. Một số chất gây độc khác 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 4 LỜI NÓI ĐẦU Theo quy định của Bộ Giáo dục - Đào tạo, từ năm 2012 trở đi, đào tạo trình độ tiến sĩ sẽ thực hiện theo chương trình đào tạo mới. Đó là, nghiên cứu sinh sẽ học một số môn học chuyên sâu của chuyên ngành đào tạo trước khi thực hiện đề tài khoa học. Để đáp ứng yêu cầu này, chúng tôi đã biên soạn giáo trình “Độc chất trong thức ăn chăn nuôi”, mã số TIF 821 thuộc chuyên ngành Dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi, mã số 62 62 45 01. Giáo trình cung cấp cho nghiên cứu sinh những thông tin cơ bản nhất về cấu tạo hóa học, cơ chế gây độc và biện pháp phòng ngừa, loại bỏ, phân hủy các độc tố trong các loại thức ăn đang được sử dụng rộng rãi tại Việt Nam và trên thế giới. Giáo trình gồm có 5 chương: Chương I: Viết về nấm mốc và độc tố của nấm mốc trong các loại thức ăn chăn nuôi. Nấm mốc sinh sản phát triển trên tất cả các loại thức ăn và gây tổn hại tới gần 10% tổng số ngũ cốc và thực phẩm trên toàn cầu. Chương II: Trình bày sâu hơn về một loại độc tố thường gặp nhất và nguy hại nhất trong số các độc tố của nấm mốc, đó là aflatoxin. Chương III: Cung cấp một số thông tin về độc tố HCN trong sản phẩm sắn, một loại thức ăn được sử dụng rộng rãi thuộc hàng thứ hai sau ngũ cốc trên toàn thế giới. Chương IV: Giới thiệu về độc tố mimosin trong keo giậu, một loại cây thức ăn xanh giàu protein, caroten, các chất sắc tố và được sử dụng sản xuất thành bột lá thực vật với sản lượng lớn trên thế giới. Chương V: Viết về các độc tố trong đậu tương, khoai tây và một số chất có thể gây độc. Tập thể tác giả xin trân trọng giới thiệu với các thầy cô giáo, sinh viên đại học, học viên cao học, nghiên cứu sinh và độc giả cuốn giáo trình này. Kính mong được sự quan tâm góp ý của các đồng nghiệp, sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh và độc giả. Các tác giả 5 6 Chương I NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ CỦA NẤM MỐC 1.1. Những thông tin cơ bản về nấm mốc và độc tố của nấm mốc 1.1.1. Giới thiệu về nấm mốc Nấm mốc là một trong năm hình thái tạo nên sự sống của Trái Đất (thực vật, động vật, nguyên bào, vi khuẩn và nấm mốc). Nó là vi sinh vật có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt là chất hữu cơ. Người ta đã phát hiện khoảng 200.000 loài nấm mốc khác nhau, trong đó có khoảng 50 loài có hại (gây bệnh và gây ngộ độc cho người và động vật). Có nhiều loài nấm mốc có lợi cho con người nhưng trong phạm vi cuốn sách này, chúng tôi chỉ trình bày về nấm mốc gây độc hại trong thức ăn chăn nuôi. 1.1.2. Sinh sản và phát triển Nấm có mặt trên khắp thế giới không kể là khu vực nhiệt đới, ôn đới, khí hậu nóng hay lạnh. Chúng có thể phát triển quanh năm, mùa hè, mùa thu, mùa đông hay mùa xuân. Đối tượng để nấm mốc ký sinh hay hoại sinh gồm hầu hết mọi thứ vật chất: trên cơ thể động, thực vật, đất, nước, phân, cây mục, đồ dùng, lương thực, thực phẩm, hoa quả, thậm chí trên một số loại vật chất hầu như không có chất dinh dưỡng như dụng cụ quang học, kim loại và các chất dẻo vv... Sự sinh sản của nấm mốc rất da dạng, gần gũi với thực vật hơn là vi sinh vật, có hai con đường sinh sản và phát triển sau đây: * Sinh sản vô tính Sinh sản vô tính là hình thức phổ biến nhất đối với các loại nấm mốc có mặt trên lương thực và thực phẩm cũng như thức ăn chăn nuôi. Phương thức đơn giản là hình thức bào tử, có hai dạng bào tử là bào tử trần và bào tử kín. Bào tử kín sau giai đoạn chín sẽ vỡ vỏ bọc và giải phóng các bào tử ra ngoài. Bào tử trần được hình thành đơn giản, từ sợi nhánh phát sinh trên sợi mẹ, đầu sợi phình to gọi là bọng, trên bọng hình thành các thể bình, trên các thể bình hình thành các bào tử trần, xếp thành từng chuỗi. Bào tử trần còn được hình thành trực tiếp trên các sợi nấm phân hóa và được gọi là các tiền bào tử. Các bào tử có dạng nang có thể đơn độc (chồi) hoặc thành chồi bào tử già ở gốc, bào tử non ở ngọn, vì bào tử vừa được hình thành lại có khả năng tạo ra các bào tử mới. Bào tử kín thường ở dạng bọc hay nang bào tử. Trong bọc hay nang có chứa nhiều bào tử khác nhau. Bào tử kín cũng được hình thành từ sợi nấm, đầu nút của sợi được phình lên gọi là trụ và hình thành bào tử trong nang, các bào tử kín sau khi chín được giải phóng ra ngoài. Bào tử nói chung có màng hay gọi là vỏ dầy có thể chịu được điều kiện không thuận lợi của môi trường bên ngoài, khi gặp môi trường thuận lợi có thể nảy mầm và phát triển thành khuẩn lạc và lại tiếp tục chu kỳ phát triển. 7 * Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính là do hai đầu sợi nấm tiếp hợp với nhau mà tạo thành các bào tử tiếp hợp, thường thấy trong các loài Mucor. Bào tử nang được hình thành theo một phương thức phức tạp, từ một sợi nấm sinh sản tạo thành các nang, trong các nang có chứa bào tử, nhiều nang bào tử được bọc trong các túi hình tròn. Khi các nang chín vỡ ra, bào tử được giải phóng ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi phát triển thành khuẩn lạc nấm mốc. 1.1.3. Điều kiện môi trường cho sự sinh sản và phát triển của nấm mốc Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tốt hoặc xấu đến sự sinh sản và phát triển của nấm mốc, trong đó có năm yếu tố chính dưới đây: (1) nước trong cơ chất, (2) nhiệt độ môi trường, (3) ẩm độ môi trường, (4) độ pH môi trường, (5) chất dinh dưỡng trong cơ chất. * Nước trong cơ chất. Hàm lượng nước trong cơ chất (ngô, đậu tương, rau, quả...) được gọi là độ ẩm tương đối của cơ chất (ký hiệu là RH), nó biểu thị sự so sánh khối lượng nước trong cơ chất với khối lượng của cơ chất, đơn vị là phần trăm (%). Ví dụ: tỷ lệ nước (ẩm độ tương đối) của rau muống là 87%, của lá keo giậu là 83%, của ngô hạt là 14%.... Hàm lượng nước trong cơ chất bao gồm hai phần: nước liên kết và nước tự do. Nước liên kết gần như là ổn định trong quá trình phơi hoặc sấy ở nhiệt độ thấp. Nước tự do thì bị thay đổi trong quá trình phơi, sấy; nó bị giảm đi khi phơi hoặc sấy kéo dài ở nhiệt độ thấp và có thể không còn tồn tại (bằng 0) khi sấy ở nhiệt độ cao. Lá cây phơi nắng bị héo, cá phơi nắng bị teo đi, vì nước tự do trong chúng bị bốc hơi vào không khí. Lượng nước tự do trong cơ chất được ký hiệu là aw. Lượng nước tự do là một khái niệm về hóa học, nó có mối quan hệ tỷ lệ thuận với sự phát triển của nấm mốc. Lượng nước tự do trong cơ chất càng lớn thì khả năng sinh sản và phát triển của nấm mốc càng cao. Khi phơi, sấy, hàm lượng nước tự do trong cơ chất giảm xuống thấp; khi càng thấp thì nó càng gắn kết chặt với cơ chất. Vì vậy nấm mốc cũng khó xâm nhập và phát triển trên cơ chất. Đây là lí do tại sao muốn bảo quản nông sản phẩm thì phải phơi, sấy khô. Việc xác định lượng nước tự do (aw) trong cơ chất chỉ áp dụng trong nghiên cứu, còn trong thực tế người ta quan tâm đến độ ẩm tương đối của cơ chất hơn. Vì vậy, việc phòng chống nấm mốc tập trung vào khống chế độ ẩm tương đối của cơ chất là chính. * Nhiệt độ môi trường Nhiệt độ môi trường được đánh giá là nhân tố quan trọng thứ hai đối với sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nấm mốc có thể phát triển được trong phạm vi nhiệt độ rất rộng, từ 0-60oC, có thể chia ra một số nhóm như sau: Nhóm chịu nhiệt (Thermophile): Nhóm này phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ môi trường khá cao. Trung bình nhiệt độ phát triển là 30-40oC, tối đa là 50oC. Cũng có một vài loài có thể phát triển được ở nhiệt độ 55-60oC (Mucor pusillus). 8 Nhóm ưa nhiệt (Mesophile): Đây là nhóm phát triển tốt trong phạm vi nhiệt độ từ 10-40oC. Thích hợp nhất là 25oC. Phần lớn nhóm này thuộc hai loài là Aspergillus và Penicillium. Điển hình nhất là A. versicolor và P. chrylogenum. Nhóm chịu lạnh (Psychrophile): Có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ từ 7-10oC. Phần lớn nhóm nấm này thuộc loài Fusarium, có mặt ở các lục địa có nhiệt độ thấp như châu Âu, phát triển trên mì, mạch qua mùa đông. Một số loài điển hình là F. conglutinan, A. versicolor, P. cyclopium. * Ẩm độ môi trường Nấm mốc có thể phát triển được trong điều kiện ẩm độ môi trường rất thấp hoặc rất cao. Căn cứ vào sự thích ứng của chúng với ẩm độ môi trường người ta chia thành hai nhóm sau: Loài nấm ưa khô (Xerophile): phát triển được trong phạm vi độ ẩm môi trường 75% - 85%. Phần lớn nấm ưa khô thuộc loài Aspergillus và một số thuộc Penicillium. Người ta còn gọi là nấm trong bảo quản, điển hình là Alternaria tenulis, Cladosporium cladosporides, Trichothercium roseum v. v... Loài ưa ẩm cao: Phát triển được ở phạm vi độ ẩm từ 90-100%. Đại diện như Epicocum nigrum, Mucor circinelloides, Trichothercium roseum. Bảng 1.1: Phạm vi nhiệt độ thích hợp đối với một số loài nấm mốc Tên nấm mốc Tối thiểu (oC) Thích hợp nhất (oC) Tối đa (oC) Absidia corymbifera Alternaria alternate Aspergillus candidus A. flavus A. niger A. parasiticus Aureobasidium pullulans Byssochlamys fulva Cladosporium herbrum Fusarium avenaceum F. sporotrichioides Mucor hiemalis Penicillum expansum Rhizopus microsporus Scopulariopsis brevicaulis Thalmidium roseum Trichothecium roseum Wallemia sebi - -2 - 5 3 - 4 6 - 8 6 - 8 10 - 13 2 10 -5 - (-7) -3 2,5 - 2,7 4 -3 12 5 -7 15 5 35 - 37 20 - 25 20 - 24 35 - 37 35 - 37 37 25 30 - 35 24 - 25 25 23 - 30 36 25 - 26 30 - 35 24 - 30 27 25 24 - 30 45 31 - 32 40 - 42 42 - 45 46 - 48 - 35 45 30 - 32 31 35 44 33 - 35 42 37 - 35 37 - 40 Nguồn: Dẫn theo Đậu Ngọc Hào (2003). 9 * Độ pH của môi trường Khác với một số vi khuẩn, nấm mốc có thể phát triển được ở phạm vi pH khá rộng, từ 2 - 8. Độ pH thích hợp nhất là từ 4,5 - 6,5, sự phát sinh và phát triển của nấm mốc không quá phụ thuộc vào độ pH của môi trường. Tuy nhiên sự hình thành độc tố lại rất phụ thuộc vào độ pH. Bảng 1.2. Độ pH thích hợp nhất cho sự phát triển của một số loài nấm mốc Loài nấm Tối thiểu Tối ưu Tối đa Alternaria altenata Aspergillus candidus A. niger Cladosporium herbrum Fusarium oxysporum Mucor plumbeus Neurospora sitophila Penicillium cyclopium Rhizopus stolonifer Scopalariopsis brevicaulis Trichoderma konogi Aspergillus fumigatus A. flavus A. ochraceus < 2,7 2,1 1,5 3,1 2,0 - > 3,0 2,0 - - 2,5 3,0 2,5 3,0 5,4 - - - - 7,0 5 - 6 - - 9 - 10 - 6 - 7 7,5 6 - 7,5 > 8,0 7,7 9,8 7,7 9,0 - > 8,0 10,0 < 6,8 - 9,5 8,0 > 10,5 > 8,0 Nguồn: Dẫn theo Đậu Ngọc Hào (2003) * Chất dinh dưỡng trong cơ chất Cơ chất giàu protein và hydratcacbon (tinh bột, đường) sẽ thuận lợi cho nấm mốc sinh sản, phát triển. Các nguyên liệu thức ăn chăn nuôi thường giàu các chất dinh dưỡng nói trên. Vì vậy, nguyên liệu thức ăn và thức ăn hỗn hợp là cơ chất lý tưởng cho nấm mốc sinh sản, phát triển. Ngoài các yếu tố trên thì thành phần không khí (chủ yếu là O2 và CO2), một số yếu tố khác như trạng thái vật chất (lỏng, rắn), điều kiện bảo quản (bao gói kín hay để trần), cũng có ảnh hưởng đến sự sinh sản và phát triển của nấm mốc. Từ các điều kiện trên cho thấy: Việc chế biến và bảo quản thức ăn chăn nuôi có ý nghĩa quyết định đến việc khống chế hay tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Chế biến và bảo quản sao cho ẩm độ của cơ chất ở mức cho phép, bảo đảm kho cất giữ thoáng mát, không để nguyên liệu thức ăn (cơ chất) tiếp xúc tự do với không khí thì nấm mốc sẽ khó sinh sản, phát triển. 10 1.1.4. Các nấm mốc thường gặp trong thức ăn chăn nuôi - Trong ngô và sản phẩm của ngô: Alesidia, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus, Cephalosporium sp., Fusarium sp., Mucor sp., Penicillium sp., Rhizopus sp., Aspergillus glaucus - groupe, A. fumigatus, A. niger, A. ochraceus. - Trong lúa mỳ và các sản phẩm của lúa mỳ: Penicillium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp. (A. flavus, A. niger, A. ochraceus, A. glaucus), Absidia, Fusarium, Rhizopus, Scopuslariopsis, Trichodema. - Trong gạo và cám gạo: Alesidia, Corymleifera, Aspergillus candidus, A. flavus, A. fumigatus, A. sidowi, A. vericolor, Penicillium islaudium. - Trong sản phẩm sắn củ (sắn lát, bột sắn...): Aspergillus sp., Penicillium sp., Alecidia mucor sp., Rhizopus sp. - Trong thức ăn hỗn hợp của gia súc, gia cầm: Aspergillus sp., Absidia sp., Mucor sp., Rhizopus sp., Penicillium sp. - Trong lạc, khô dầu lạc: Acremonium sp., Aspergillus ficuum, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, A. oryzae, A. parasiticus, Fusarium sp., Paecilomyces sp., Penicillium sp. (P. decumbens, P. corylophylum, P. crustosum, P. expansum, P. funiculosum...). - Trong đậu tương và khô dầu đậu tương, bao gồm: Altemaria sp., Aspergillus caudidus, A. flavus, A. glaucus, A. melleus, A. ochraceus, A. versicolor, Cladosporium sp., Penicillium chrysogenum, P. cyclopium, P. expansum, P. urticae, P. viridicatum. - Trong bột cá: Aspergillus sp. (A. glaucus, A. niger, A. fumigatus, A. ocharaceus, A. flavus), Penicillium sp., Alecidia sp., Mucor sp., Rhizopus sp. 1.1.5. Các độc tố nấm mốc Các nhà khoa học đã phát hiện được khoảng 300 chất độc do nấm mốc tiết ra, nhưng chỉ có khoảng 20 chất có tính độc cao đối với người và vật nuôi. Các chất đó là: ∙ Aflatoxin B1 Độc tố do nấm mốc Aspergilus Flavus và F. parasiticus tiết ra, công thức hóa học là C17H12O6, trọng lượng phân tử: 312, điểm nóng chảy 268 - 269°C, độc tố tan trong rượu, axeton, chloroform, dung môi hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 223, 265 và 362. ∙ Aflatoxin B2 Độc tố do nấm mốc A. flavus và A. parasiticus tiết ra, công thức hóa học là C17H14O6, trọng lượng phân tử: 314, điểm nóng chảy: 287°C, tan trong rượu, axeton, Cloroform, dung môi hấp thụ là methanol, bước sóng hấp thụ là 220, 265 và 363. ∙ Aflatoxin G1 Độc tố do nấm mốc A. flavus và A. Parasiticus tiết ra, công thức hóa học: C17,H12O7, trọng lượng phân tử: 330, điểm nóng chảy 244- 246°C, tan trong rượu, axeton và cloroform, dung môi hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 243, 257, 264, 362. 11 ∙ Aflatoxin G2 Độc tố do nấm mốc Aspergillus flavus và A. parasticur tiết ra, công thức hóa học C17H14O7, trọng lượng phân tử 330, điểm nóng chảy 230°C, tan trong rượu, axeton, cloroform, dung môi hấp thụ: Methanol, bước sóng hấp thụ: 217, 245, 365. ∙ Aflatoxin M1 Độc tố do nấm mốc A. flavus và A. Parasticus tiết ra, công thức hóa học: C17H12O7, trọng lượng phân tử: 328, điểm nóng chảy: 229°C, tan trong rượu, axeton, cloroform, dung môi hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 226, 265 và 357, ∙ Ochratoxin A Độc tố do nấm mốc A. ochraceus, A. alliaceus, Penicillium viridicatum, P. ostianus tiết ra, công thức hóa học: C20H18O6HN, trọng lượng phân tử: 403, điểm nóng chảy: 169°C, tan trong rượu, nước, dung môi hấp thụ: Methanol, bước sóng hấp thụ: 215 và 333. ∙ Citrinin Độc tố do nấm mốc A. candidus, A. terus, Pencillin citrinum, P. expansum tiết ra, công thức hóa học: C13H14O5, trọng lượng phân tử: 205, điểm nóng chảy: 175°C, dung môi hòa tan: chưa xác định, dung môi hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 222, 253 và 319. ∙ Sterigmatocystin Độc tố do nấm mốc A. nidunaus, A. ustus, A. versicoloz tiết ra, công thức hóa học: C18H1206, trọng lượng phân tử: 324, điểm nóng chảy: 246°C, dung môi hòa tan: cloroformpyridin, dung môi hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 208, 235 và 329. ∙ Palrelin Độc tố có công thức hóa học: C7H6O4, trọng lượng phân tử: 154, điểm nóng chảy: 110-111°C, tan trong rượu, cloroform, axeton và nước, dung môi hấp thụ: Methanol, Ethanol, bước sóng hấp thụ: 275, 276. ∙ Zearalenol Độc tố do các nấm mốc Fusarium roseum, F. equiseti, F. inivale, F. gilebosum, F. moniliforme sản sinh ra, công thức hóa học C18H22O5, phân tử lượng: 318, điểm nóng chảy: 164 -165°C, tan trong benzene, ete, chloroform, dung môi hấp thụ: chưa xác định, bước sóng hấp thụ: 236, 274 và 316 ∙ T - 2 Toxin Độc tố do các nấm mốc Fusarium tricintum, F. solani, F. equiseti, F. gramminarum, công thức hóa học: C24H26O9, phân tử lượng: 446, điểm nóng chảy: 151 - 152°C, tan trong clofarform, rượu, dung môi và bước sóng hấp thụ: chưa có thông tin. ∙ Diacetoxyscirpenol Độc tố do các nấm mốc Fusarium tricintum, F. solani, F. equiseti, F. gramminarium tiết ra, công thức hóa học: C19H26O7, phân tử lượng: 366, điểm nóng 12 chảy 162 - 164°C, tan trong chloroform, rượu, dung môi và bước sóng hấp thụ: chưa có thông tin. ∙ Deoxynivalenol Độc tố có công thức hóa học là C15H20O6, phân tử lượng: 296, điểm nóng chảy: 151 - 153°C, tan trong rượu, cồn, dung dịch hấp thụ: Ethanol, bước sóng hấp thụ: 218. Ngoài các độc tố nêu trên còn có các độc tố sau: Patulin (do các nấm mốc Aspergillus clavatus, A. terrus, Penicillium patulum tiết ra), moniliformin (do các chủng thuộc Fusarium tiết ra), alternarial (do Alternarial alternatol tiết ra), sporidesmin (do Phytomifces chortorum tiết ra), fumatoxin (do các nấm Asperggillus nidulons, A. ustus, A. versicolor tiết ra), nivalenol (do Fusarium nivale tiết ra), vomitoxin (do Fusarium graminearum, F. roseum tiết ra), islantoxin (do Penicillium isladium tiết ra). Các độc tố của nấm mốc thường có điểm nóng chảy cao, trong điều kiện xử lí nhiệt đối với nguyên liệu thức ăn gia súc (phơi, sấy, nấu chín...) chúng hầu như không bị phá hủy. Bởi vậy, khi nguyên liệu thức ăn đã nhiễm nấm mốc thì khó có thể phá hủy được chất độc của nấm bằng xử lý nhiệt ở nhiệt độ thấp. 1.2. Tác hại của nấm mốc đối với vật nuôi và thức ăn chăn nuôi 1.2.1. Phân nhóm tác động của độc tố nấm mốc với vật nuôi Căn cứ vào tác động của độc tố nấm mốc đến các cơ quan, bộ phận của cơ thể động vật, người ta chia ra thành các nhóm sau: - Nhóm độc tố gây ung thư gan bao gồm: Aflatoxin, patulin, sterigmatocystin, luteoskyrin (islantoxin), penicillin axit. - Nhóm độc tố gây độc đối với gan bao gồm: Aflatoxin, ochratoxin, rubratoxin, luteoskayrin. - Nhóm độc tố gây độc đối với thận bao gồm: Ochratoxin, citrinin. - Nhóm tác động có hại đến cơ quan sinh dục bao gồm: Zearalenol và một số chất độc của Fusarium trichothecenes. - Nhóm độc tố gây độc hại đối với thần kinh bao gồm: Esgotamin, citrioviridin. - Nhóm độc tố gây độc đối với da và niêm mạc bao gồm: T-2 toxin, diacetocyscirpenol, nivalenol, sporidesmin, deoxynivanenol. 1.2.2. Tác động của một số độc tố đối với vật nuôi * T-2 toxin và diacetocyscipenol (DAS) T-2 toxin và DAS là đại diện chính của nhóm độc tố trichothecenes. - Đối với lợn: T-2 toxin và DAS gây dị ứng da, hủy hoại da, giảm bạch cầu, viêm dạ dày, ruột, yếu cơ tim, giảm khả năng tái tạo máu, giảm ăn, bỏ ăn, đi ỉa chảy, nôn mửa giảm tăng trọng. 13 - Đối với gia cầm T-2 toxin gây tổn thương (mọc mụn nước) ở da, đùi, chân, gây tổn thương gan, thận và viêm loét niêm mạc miệng ở gà thịt. T-2 toxin và DAS gây giảm sản lượng trứng, gây tổn thương gan, thận và gây loét niêm mạc miệng, gây viêm loét và thoái hóa đường tiêu hóa làm giảm tiêu thụ thức ăn, giảm tiêu hóa hấp thụ thức ăn dẫn đến giảm khả năng sản xuất hoặc bị chết. * Zearalenon(F-2 toxin) - Đối với lợn Zearalenon gây ra các triệu chứng bệnh lý khác nhau tùy thuộc vào liều lượng độc tố, thời gian tác động của độc tố, tuổi, tính biệt của lợn. Các triệu chứng bệnh lý thường thấy khi nhiễm độc là viêm đường sinh dục, phù âm hộ, âm đạo, mất động dục, sảy thai. Lợn mẹ nhiễm độc thì dẫn tới lợn con chậm lớn, còi cọc, bị bệnh lý cơ quan sinh dục (phình to cơ quan sinh dục bên ngoài và tử cung bên trong), lợn đực phát triển tính dục chậm. Lợn thịt trưởng thành ít chịu tác động của zearalenon. - Đối với gà đẻ Zearalenon gây giảm tỷ lệ đẻ, giảm tỷ lệ ấp nở của trứng, tồn dư lòng đỏ trong ống dẫn trứng, viêm mãn tính ống dẫn trứng dẫn đến casein hóa, trứng rơi vào xoang bụng, làm giảm bạch cầu, chủ yếu là lympho. * Ochratoxin Ochratoxin là độc tố đối với thận. Tùy theo liều lượng và thời gian nhiễm độc tố mà có các biểu hiện về triệu chứng, bệnh tích khác nhau ở gia súc, gia cầm. - Đối với lợn Lợn bị nhiễm độc nhẹ thì có biểu hiện khát nước, chuyển hóa thức ăn giảm, giảm trọng lượng. Lợn bị nhiễm độc nặng thì thận bị tổn thương. Các triệu chứng thường thấy khi lợn bị nhiễm độc là ỉa chảy, bỏ ăn, thận cứng và xám lại, khi xét nghiệm cơ thể thấy tăng ure máu, protein huyết thanh, men chuyển hóa amin, glacyl và protein niệu. - Đối với gia cầm Độc tố cũng làm cho gia cầm giảm chuyển hóa thức ăn, giảm tăng trưởng, rối loạn trao đổi sắc tố. Gà sinh sản sẽ chậm thành thục về tính, năng suất trứng giảm, giảm tỷ lệ ấp nở do phôi thai bị chết ngay trong tuần đầu. Gà nhiễm độc ochratoxin thì thường thấy hiện tượng ỉa chảy, vỏ trứng có phủ một lớp phấn màu vàng. Gà bị nhiễm độc cấp tính sẽ bị tổn thương gan, tụy, thận. Thận bị sưng to, trong niệu quản, thận, tim, cơ tim, gan, lách có chứa các chất urat màu trắng. 14 * Esgotin Esgotin do nấm mốc Claviceps purprea sản sinh ra, nấm mốc này sinh sản và phát triển chủ yếu trên hạt ngũ cốc và nó có các hạch nấm gọi là seletiria esgotin. Trong các hạch nấm có 3 độc tố chính là esgotamin và esgometin, esgotoxin. Khi bị nhiễm độc esgotin gia súc sẽ giảm ăn hoặc bỏ ăn, nhiễm độc nặng thì gia súc sẽ thở nhanh, mạch nhanh, hôn mê và có thể bị liệt. Lợn nái khi nhiễm độc esgotin có thể bị giảm về số lượng con sinh ra, khối lượng sơ sinh và tỷ lệ nuôi sống, lợn mẹ có thể giảm sản lượng sữa hoặc mất sữa do esgotin ngăn cản quá trình hình thành prolactin trong giai đoạn chửa cuối. Sản lượng sữa giảm dẫn đến lợn con chậm lớn, còi cọc. 1.2.3. Tác hại của nấm mốc đối với thức ăn chăn nuôi Khi thức ăn chăn nuôi bị nhiễm nấm mốc thì các tác hại chính do nấm mốc gây ra là: Làm giảm hàm lượng protein trong thức ăn do protein bị phân hủy, làm giảm hàm lượng lipit của thức ăn do nấm mốc sản sinh ra men lipaza phân giải lipit, gián tiếp làm tăng tỷ lệ xơ trong thức ăn từ đó dẫn đến tỷ lệ tiêu hóa, hấp thu giảm và làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Nếu ngô bị nhiễm mốc nặng thì có thể giảm tới 25% giá trị dinh dưỡng. Theo Tindall, 1983 (trích theo Đậu Xuân Hào, 2003) thì ngô bị nhiễm mốc đã giảm tỷ lệ protein từ 8,9% xuống 8,3%, lipit từ 4,0% xuống 1,3%, năng lượng trao đổi từ 3410 Kcal xuống 3252 Kcal/ Kg. Các nấm mốc đã sản sinh ra các men phân giải protein, lipit, bột đường như: lipaza, proteaza, amilaza. Các men này phân giải thức ăn làm biến đổi màu sắc và mùi vị thức ăn. Sự biến đổi này đã làm giảm tính ngon miệng của thức ăn, giảm khối lượng thức ăn gia súc ăn được, cuối cùng dẫn đến sinh trưởng chậm, tăng tiêu tốn, chi phí thức ăn cho một đơn vị sản phẩm. - Nấm mốc trong quá trình sinh sản và phát triển đã sản sinh ra các chất độc. Các chất độc này không chỉ gây ảnh hưởng đến sức khỏe của gia súc, mà còn ảnh hưởng cả đến sức khỏe của con người. - Theo thống kê của tổ chức Nông - Lương của Liên hiệp quốc thì hàng năm nấm mốc gây thiệt hại tới gần 10% tổng số ngũ cốc và thực phẩm trên toàn cầu. 1.3. Các phương pháp phòng chống nấm mốc Phòng chống sự phát triển của nấm mốc nói chung và nấm mốc sinh aflatoxin nói riêng là biện pháp quan trọng nhất, nhằm ngăn chặn sự giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn, đồng thời ngăn chặn sự phát triển của độc tố. 15 Có nhiều phương pháp phòng chống nấm mốc 1. Phương pháp phơi sấy để làm khô. 2. Phương pháp dùng hóa chất để ức chế sự phát triển của nấm mốc. 3. Phương pháp sinh học. 1.3.1. Phương pháp làm khô tự nhiên Đây là phương pháp được áp dụng lâu đời trong quá trình bảo quản hạt. Hạt ngũ cốc sau khi thu hoạch thường có độ ẩm rất cao, ví dụ ngô có thể từ 35 - 45%. Do đó phải tìm cách giảm độ ẩm của hạt xuống mức tối thiểu để cất giữ. Con đường đơn giản nhất là phơi khô, lợi dụng năng lượng ánh sáng mặt trời. Nếu ngô hạt đạt được độ ẩm < 13% trước khi bảo quản sẽ là lý tưởng, vì ở độ ẩm đó, nấm mốc không có điều kiện phù hợp để phát triển. Ở nhiều nơi do điều kiện thu hoạch không thuận lợi cho việc sử dụng năng lượng mặt trời, người ta dùng phương pháp sấy nhân tạo. Tuy nhiên cả phương pháp sấy nhân tạo và sử dụng nguồn năng lượng mặt trời đều tồn tại những nhược điểm sau: - Phơi nắng gặp khó khăn khi trời nắng yếu hoặc mưa kéo dài. - Sấy nhân tạo chỉ phù hợp với số lượng lớn hay sản xuất tập trung, không hoặc ít phù hợp với sản xuất nhỏ cá thể. 1.3.2. Phương pháp sử dụng hóa chất Người ta sử dụng hóa chất ít độc hại hoặc vô độc để ức chế sự phát triển của nấm mốc. Các loại axit và muối của chúng như sorbat, propionat và benzoat từ lâu đã được sử dụng trong thương mại. Ngoài ra, đã sử dụng một số chất tách từ thảo mộc, các kháng sinh tổng hợp như natamycin có thể ức chế phát triển của nấm mốc ở các nồng độ thấp. Hiện nay trên thị trường có bán nhiều loại chế phẩm chống mốc cho hạt, đặc biệt cho các nguyên liệu làm thức ăn của gia súc: Myco-bloc của hãng BIAKON.N.V/Belgium. Mold-NilTM- Dry của hãng Nutri-ad International BVBA. Mold-Zap của Alltech, inc. Các chế phẩm này được phối chế có các axit hữu cơ trong thành phần của chúng, chủ yếu là canxi propionat, sorbat và axit citric. Một số loại hương liệu và gia vị cũng được sử dụng để bảo quản chống mốc như cây đinh hương, quế, mù tạc, hạt tiêu, tỏi, tinh dầu cam, chanh, chất chống oxy hóa... 1.3.2.1. Axit sorbic Axit sorbic và muối sorbat đã được phép sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm chống nấm mốc. Axit sorbic có sẵn trong cây Askberries, cũng có thể được tổng 16 hợp hóa học. Nhược điểm của axit sorbic là tính hòa tan kém, vì vậy dạng muối kali được sử dụng nhiều hơn do hòa tan tốt. Axit sorbic chỉ hòa tan được 0,15% trong nước, còn kali sorbat hòa tan với 58,2%. Nhưng tác dụng chống nấm mốc của các muối sorbat kém hơn axit sorbic. Vì vậy, thông thường axit sorbic và muối kali sorbat được phối hợp với những tỷ lệ thích hợp để chống nấm mốc trong bảo quản. Bandelin (1958) đã nghiên cứu khả năng ức chế nấm mốc của axit sorbic và nhận thấy nồng độ tối thiểu ức chế là 0,02% đối với Alternaria solani và nồng độ 0,08% đối với Penicillium citrinum và Aspergillus niger. Nồng độ này thấp hơn nhiều so với axit sorbic và axit propionat (bảng 1.3). Bảng 1.3. Nồng độ axit tối thiểu ức chế một số nấm mốc Hợp chất Nồng độ ức chế tối thiểu của các loại nấm (%) Alternaria solani Penicillium citrinum Aspergillus niger Axit benzoic Axit propionic Axit sorbic 0,15 0,06 0,02 0,20 0,08 0,08 0,20 0,08 0,08 Nguồn: Bandelin, 1958. Người ta đã thí nghiệm khả năng của các axit sorbic và muối sorbat chống nấm mốc, đặc biệt là các loại nấm sản sinh độc tố như Aspergillus penicillium v.v... Udagawa và cộng sự (1977) nghiên cứu tác dụng chống nấm mốc của kali sorbat trên 5 mức khác nhau được nhiễm 3 loại nấm là: Penicillium expansum, Aspergillus niger và Rhizopus stolonifer. Lượng kali sorbat được đưa vào thí nghiệm là 0,01; 0,025 và 0,05%. Kết quả là 4 trong 5 loại đã không có nấm mọc trong suốt thời gian thí nghiệm ở nồng độ 0,01-0,025%. Thử nghiệm với Aspergillus flavus (loài nấm sản sinh aflatoxin) cho thấy, kali sorbat ở nồng độ 0,05% chỉ ức chế được 2% sự phát triển của nấm và 10% khả năng sản sinh aflatoxin, hàm lượng 0,25% ức chế được 10% nấm phát triển và giảm khả năng sinh sản aflatoxin tới 46%. Cũng ở nồng độ này (0,25%), ức chế tới 20% Penicillium cyclopium. Masimango (1979) đã nghiên cứu tác động của một số loại hóa chất chống nấm Aspergillus flavus và nhận thấy axit sorbic và kali sorbat nồng độ 1% đã ức chế được hơn 50%, còn hàm lượng 0,1% chỉ làm giảm chút ít sự sản sinh aflatoxin (bảng 1.4). Bullesman (1979) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của potasium sorbat đối với nấm Aspergillus parasiticus, Penicillium commune và P. patulum trong môi trường lỏng. Lượng muối sorbat sử dụng là 0,05; 0,1; 0,15%. Kết quả cho thấy A. parasiticus bị ức chế phát triển mạnh hơn 2 loài nấm kia. Nồng độ 0,05% sorbat đã kéo dài thời gian ức chế A.parasiticus gấp đôi so với đối chứng. 17 Bảng 1.4. Ảnh hưởng của một số hóa chất chống mốc, ngăn cản sự phát triển và sinh sản của aflatoxin Hóa chất Nồng độ sử dụng và khả năng ức chế (%) 1% 0,5% 0,1% Kali sorbat Axit sorbic Canxi propionat Canxi propionat Natri benzoat Axit benzoic 96,5 97,1 33,1 52,3 23,2 23,6 58,5 57,8 - 49,2 - - 6,5 10,2 - - - - Nguồn: Masimango và cs., 1979. Ở nồng độ 0,1% thời gian ức chế kéo dài gấp 3 lần so với đối chứng. Ở nồng độ 0,15% ức chế hoàn toàn sự phát triển của A. parasiticus. Cũng theo thông báo của Bullerman, cả 3 loại nấm mốc được thử nghiệm trên đã không có khả năng sản sinh độc tố trong môi trường nuôi cấy. 1.3.2.2. Axit propionic Axit propionic cũng được sử dụng rất rộng rãi trong bảo quản thực phẩm và thức ăn gia súc để chống mốc. Thường dùng dạng muối như: natri propionat hay canxi propionat. Axit propionic là một chất giống như dầu, có vị chua hơi cay và có mùi khó chịu, có thể hòa tan trong nước và các dung môi hữu cơ như rượu, ete, cloroform. Tác dụng chống mốc của axit propionic và các muối của nó đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy dạng natri propionat và axit propionic có tác dụng tốt hơn canxi propionat. Canxi propionat ở hàm lượng 0,5% và 1% chỉ bảo vệ được mẫu khỏi mốc trong phạm vi 1 tuần, trong khi đó natri propionat và axit propionic nếu cùng nồng độ có thể bảo vệ mẫu khỏi mốc trong 17 tuần. Bandelin (1958) nhận thấy ở nồng độ 0,06% và 0,08%, trong môi trường nấm mốc có pH=5,0 axit propionic có tác dụng ức chế nhiều loài nấm mốc bao gồm nhóm Aspergillus. Axit propionic ở nồng độ 0,3% giữ được hạt mạch có hàm lượng nước 18% và 23% khỏi bị hư hỏng trong thời gian 5 tháng. Hàm lượng axit propionic 0,1% có thể kìm hãm sự nảy mầm của bào tử nấm mốc. Nhưng nghiên cứu khác lại cho thấy, nếu sử dụng axit propionic ở nồng độ 0,8% có thể chống mốc cho hạt có hàm lượng nước tới 20%. Trong các mẫu thí nghiệm với các hàm lượng trên đây đã không thấy Aspergillus flavus và độc tố aflatoxin. Sử dụng axit propionic 1% để bảo quản ngô bị nhiễm Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, Penicillium viridicatum và nhận thấy đã ức chế hoàn toàn 4 loại nấm trên và sự sản sinh độc tố của chúng trong thời gian 29 tuần. Trong khi đó ở mẫu đối chứng, A. ochraceus và A. parasiticus phát triển rất mạnh. 18 Theo Stewart (1977), axit propionic ở nồng độ 3 - 4% đã ức chế sự phát triển của nấm và sự sinh sản bào tử trong môi trường lỏng (bảng 1.5). Tuy nhiên ở nồng độ 3%, bào tử nấm mốc vẫn còn có thể phát triển được. Masimango nghiên cứu ảnh hưởng của canxi propionat đến khả năng sinh sản aflatoxin của A. parasiticus. Họ nhận thấy, axit propionic 0,5% và 1% đã làm giảm 52,3% và 49,2% aflatoxin, nồng độ 0,1% không ức chế được sự sản sinh độc tố trong môi trường nuôi cấy. Canxi propionat 1% chỉ hạn chế được 33,1% lượng aflatoxin sản sinh ra, còn hàm lượng 0,5% và 0,1 % không có tác dụng. Bảng 1.5. Ảnh hưởng của axit propionic đến sự phát triển và sản sinh aflatoxin của Aspergillus parasiticus NRRL 2999 trong môi trường lỏng ở 280C và pH=4,5. Axit propionic (%) Trọng lượng khô của hệ sợi nấm (mg) 0 ngày 2 ngày 6 ngày 10 ngày 0 1 2 3 4 0 0 0 0 0 776 336 0 0 0 1573 1562 1341 0 0 1007 1005 1337 0 0 Nguồn: Stewart, 1977 Mặc dù axit propionic và các muối của nó có tác dụng rất tốt để phòng chống sự phát triển của nấm mốc và sự sản sinh các độc tố, nhưng trong công nghiệp thực phẩm cũng ít được sử dụng, chỉ chủ yếu sử dụng trong công nghiệp sản xuất bánh mì. Ngày nay, các chất này được dùng nhiều trong bảo quản thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là các loại hạt, dưới dạng kết hợp giữa các muối của axit propionic và các muối của axit sorbic, axit citric... 1.3.2.3. Axit benzoic Axit benzoic là chất thông dụng trong công nghiệp thực phẩm để phòng chống nấm mốc, tồn tại dưới dạng tự do và dạng kết hợp, như muối natri benzoat. Tác dụng kháng nấm của axit benzoic chủ yếu trong môi trường axit, ít có tác dụng trong môi trường trung tính. Nồng độ muối benzoat cần thiết để ngăn chặn nấm mốc phát triển là 0,15% với Alternaria solani, 0,2% với Penicillium citrinum và Aspergillus niger. Khả năng sản sinh của Aspergillus flavus bị giảm xuống đáng kể khi có mặt của axit benzoic và natri benzoat. Sự giảm hàm lượng aflatoxin tương ứng với sự có mặt của hàm lượng benzoat. Ở nồng độ 0,8%, axit benzoic và natri benzoat không ngăn cản được sự sinh sản. Các tác giả cũng đều ghi nhận sự giảm và làm chậm quá trình hình thành bảo tử của Aspergillus flavus với sự có mặt của axit benzoic và natri benzoat. 19 Ảnh hưởng axit benzoic và natri benzoat đối với sự hình thành aflatoxin trong môi trường nuôi cấy Aspergillus flavus. Các nhà khoa học đã nghiên cứu tác dụng của axit benzoic với khả năng hình thành aflatoxin và nhận thấy, axit benzoic và natri benzoat nồng độ 1% đã ức chế được 23,6% nấm mốc và 23,2% sự sản sinh aflatoxin. Ở hàm lượng 0,5% và 0,1% không có sự ức chế nấm mốc sản sinh độc tố. Chipley và Uraih (1980) đã tìm hiểu ảnh hưởng của một số hàm lượng axit benzoic đến sự sinh sản aflatoxin của 2 loài nấm Aspergillus flavus và A. parasiticus. Họ cho biết, hàm lượng 0,01% của o-nitrobenzoat hoặc p-aminobenzoat đã thúc đẩy sự phát triển của Aspergillus flavus nhưng làm giảm sự hình thành aflatoxin. Cũng ở nồng độ như vậy thì ethyl aminobenzoat hạn chế sự phát triển của Aspergillus flavus nhưng lại thúc đẩy sinh tổng hợp aflatoxin. Ethyl benzoat ở nồng độ 0,02% đã làm giảm sự phát triển của A. flavus và ngăn cản hoàn toàn sự sản sinh aflatoxin. 1.3.2.4. Một số kháng sinh Natamycin - (pimavicin) Natamycin có tác dụng ức chế nấm mốc, không có tác dụng đối với vi khuẩn. natamycin không được phép dùng chống nấm mốc trong thực phẩm ở Mỹ song lại được các nước ở Châu Âu sử dụng. Thuốc có thể ức chế nhiều loại nấm mốc ở hàm lượng rất thấp. Shahani thông báo, ở nồng độ 0,05% bảo quản chống nấm mốc cho hạt được từ 1 đến 5 ngày. Ở nồng độ thấp 1 ppm natamycin có thể ức chế nhiều loại Penicillium. Tuy nhiên, phải tới nồng độ 100ppm mới ngăn chặn được sự phát triển của Aspergillus flavus. Thí nghiệm của Shahani (1973) cho thấy ở hàm lượng natamycin thấp hơn đã ức chế được sự phát triển và sản sinh độc tố của Aspergillus flavus và A. ochraceus (bảng 1.6). Bảng 1.6. Tác dụng ức chế sự phát triển và sản sinh độc tố của natamycin đối với Aspergillus flavus NRRL 3000 và A. ochraceus NRRL 3174. Hàm lượng Natamycin Aspergillus flavus (% ức chế) A. ochraceus (% ức chế) Phát hiện Sinh độc tố Phát hiện Sinh độc tố 0 1 10 50 0 0,3 37,8 71,4 0 25,0 62,0 99,0 0 16,0 46,0 52,2 0 93,2 100,0 100,0 Nguồn: Shahani, 1973, Shahani và Goldberg, 1972 20 Nghiên cứu của nhiều tác giả khác cũng cho thấy natamycin có thể ngăn cản sự hình thành các độc tố của nấm Penicillium trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Tác dụng ức chế sự sản sinh độc tố của thuốc mạnh hơn so với ức chế phát triển của nấm mốc. Về ảnh hưởng của natamycin đối với nấm mốc mọc trên nhiều loại pho mát khác nhau, Shahani cho biết nồng độ 0,05-5ppm làm giảm sự hình thành bào tử của Aspergillus parasiticus và Penicillium patulum. Khi pho mát được nhúng vào dung dịch 0,1%-0,2% natamycin, nhiều loài nấm mốc đã không phát triển được. Aflatoxin không được sản sinh ra hoặc ở hàm lượng rất thấp không đủ để phát hiện. Một số loại kháng sinh khác như: Bongkrekie axit và nisin cũng có tác dụng chống nấm mốc. Bongkrekie axit được tách từ môi trường nuôi cấy Pseudomonas coccovenus. Nisin ở hàm lượng 5 và 125ppm đã ức chế sự phát triển của A. parasiticus. 1.3.2.5. Thảo mộc và gia vị Rất nhiều loại thảo mộc có tác dụng chống nấm mốc. Theo công bố của Buchaman, cây quế (cinamon) có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm mốc Alternaria, Penicillium và Aspergillus. Hạt tiêu, hành và đinh hương cũng có tính kháng nấm mốc nhưng yếu hơn. Bullerman (1979) phát hiện thấy sự sản sinh aflatoxin của nấm Aspergillus parasiticus trong nhiều loại bánh mì khác nhau như bánh mì đen, trắng. Tuy nhiên đã tìm thấy rất ít hoặc hầu như không có trong bánh mì màu nho. Ở hàm lượng quế 0,02% đã gây ức chế phát triển của nấm mốc tới 31% và sự sản sinh aflatoxin giảm từ 25-97% trên môi trường nhân tạo. Methyloxynamaldehyde của cây quế với hàm lượng 100 mg/ml có tác dụng ức chế hoàn toàn sự phát triển của A. Parasiticus và A. flavus. Liều 200mg/ml hoạt chất trên ức chế sự phát triển của A.ochraceus và A.versicolor, nếu sử dụng liều 624mg/ml có thể ức chế tới 90% aflatoxin B1 được sản sinh ra (bảng 1.7). Bảng 1.7. Ảnh hưởng của quế đến sự phát triển và sản sinh aflatoxin của Parasiticus NRRL, 2999 trong môi trường yeast sau 10 ngày ở 250C Hàm lượng quế (%) Tỷ lệ ức chế (%) Sự phát triển Sự sản sinh aflatoxin 0 0,02 0,2 2 20 0 16 23 31 100 0 25 57 97 100 Nguồn: Dẫn Đậu Ngọc Hào, 2003 21 Khi nghiên cứu ảnh hưởng của 13 loại hợp chất từ thảo mộc và 7 đồ gia vị khô được bán trên thị trường hạn chế sự phát triển và sinh độc tố của nhiều loại nấm Aspergillus thì quế có tác dụng nhất. Tỏi, đinh hương, hạt tiêu Giamaica ức chế hoàn toàn sự phát triển của nhiều loại nấm mốc, nhưng nhiều loại gia vị và thảo mộc khác chỉ ức chế được sản sinh aflatoxin. Thymol được chiết tách từ cỏ xạ hương, engome từ đinh hương ở nồng độ < 0,4 mg/ml có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của Aspergillus flavus và A.versicolor. Liều 2mg/ml methanol chiết tách từ hạt anit cũng có tác dụng như vậy đối với các chủng nấm mới thử nghiệm. Buchaman cũng công bố ở hàm lượng 500mg/ml thymol ức chế hoàn toàn sự phát triển của A. Parasiticus. Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy cây gia vị thường có tác dụng nhiều đến ức chế sự hình thành aflatoxin hơn là ức chế sự phát triển của hệ sợi. Nồng độ ≥ 5% đinh hương đã ức chế hoàn toàn sự phát triển và sinh sản aflatoxin. Nồng độ ≥ 5% bạc hà, thìa là Ai Cập và 10% của hạt tiêu bắc đen đã ngăn chặn được sự sản sinh aflatoxin. 1.3.2.6. Tinh dầu Một số loại tinh dầu có tính kháng nấm. Nồng độ 0,2% tinh dầu cam có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của A. flavus. Tinh dầu chanh ở hàm lượng 0,3-0,35% đã làm cho nấm A. flavus chậm phát triển và giảm sản sinh aflatoxin. Các tinh dầu khác như mentha arvenis và mentha piperita cũng có tác dụng chống nấm mốc rất tốt, đặc biệt là nấm sản sinh độc tố. 1.3.2.7. Các hóa chất bảo vệ thực vật Dichlorvos là thuốc bảo vệ thực vật nhóm photpho hữu cơ. Ở hàm lượng rất thấp dichlorvos đã có tác dụng ức chế nấm mốc. Thuốc tác động mạnh đến khả năng tạo độc tố của nấm A. flavus và A. parasiticus, nếu sử dụng 200ppm đã ức chế tới 98% độc tố sinh ra ở môi trường lỏng, nhưng chỉ hạn chế được 5,6% nấm mốc phát triển. Ở hàm lượng thấp hơn (10ppm) ức chế được 2,4% nấm mốc, nhưng giảm được 96% aflatoxin. Dichlorvos cũng ảnh hưởng đến sự hình thành độc tố từ các nấm khác như Penicillium, Fusarium. Ở hàm lượng 20ppm, dichlorvos ức chế được nấm Fusarium roseum và F. Graminearum sản sinh zearalenon. Để có thể tác động đến nấm A. ochraceus thì cần lượng dichlorvos lớn hơn. Ở hàm lượng 100-300ppm dichlorvos làm giảm 11-18% nấm phát triển và giảm sinh tổng hợp 50-74% ochratoxin. Dichlorvos còn ức chế sự hình thành patulin và cotrin, hàm lượng 100ppm hạn chế 50% sự phát triển của Penicillium và giảm sự hình thành patulin tới 89%. Hàm lượng thấp dichlorvos (1ppm) không hạn chế được nấm nhưng lại giảm sự hình thành patulin tới 36,2%. * Naled Naled cũng là đồng phân của dichlorvos. Khi sử dụng naled ở nồng độ 0,01% đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của Fusarium graminearum và sự hình thành zearalenon. Ngoài ra còn được dùng để chống nấm mốc và sự hình thành độc tố trong ngô hạt. 22 * Methyl bromide Methyl bromide (CH3Br) là một chất chống nấm mốc và côn trùng ở thức ăn hạt. Người ta đã nghiên cứu tác dụng của methyl bromide đối với nhiều loài nấm mốc như A. parasiticus và P. ruben ở gạo. Ở hàm lượng 30 - 40 mg, methyl bromide có thể tiêu diệt 104- 105bào tử nấm trong 1g ngô. Các loài nấm sinh độc tố như A. flavus, A. ochraceus, P. citrinum cũng hoàn toàn bị tiêu diệt bởi methyl bromide. Một số công trình cho thấy nếu dùng chất này liều 120 mg/lít (0,012%) thì trong 4 giờ đầu 100% các bào tử nấm bị diệt. * Methyl xanthine Các methyl xanthine tự nhiên có trong các loại hạt cũng có tác dụng chống nấm mốc. Nhiều nghiên cứu cho thấy cafein ở hàm lượng 0,1% có tác dụng ức chế có tính chọn lọc các loài nấm mốc. Cafein cũng ức chế sự phát triển của A. flavus và sản sinh aflatoxin. Ở nồng độ 0,05%; 0,07% và 0,2% cafein làm giảm sự phát triển của nấm mốc tương ứng là: 18; 84 và 83%. Cũng ở nồng độ trên, sự sản sinh aflatoxin đã bị giảm thấp đáng kể. Hạt cà phê còn xanh được làm mất hoạt chất cafein vẫn có tác dụng hạn chế nấm A. flavus sản sinh độc tố. Các methyl xanthine được tìm thấy trong coca cũng có tác dụng kháng nấm và sản sinh độc tố. Theophylin với hàm lượng 0,8% trong môi trường nuôi cấy tổng hợp ức chế được 54% aflatoxin do A. parasiticus sản sinh. Theobromin cũng đã được thử nghiệm nhưng không thấy có các tác dụng trên. 1.3.2.8. Ảnh hưởng của ẩm độ, nhiệt độ, oxy và CO2 đến sự phát triển của nấm Hệ nấm mốc có sự phát triển khác nhau tùy theo độ ẩm và nhiệt độ. Ở độ ẩm 80% và nhiệt độ 25°C thì Penicllium phát triển, 30oC thích hợp với Aspergillus, Euroticus ở 35oC và Mucor ở 45oC. Nấm mốc giảm phát triển với nồng độ oxy là 0,1% và 21% là CO2 nhưng không ngăn cản được sự phát triển. Nhiều thí nghiệm cấy A. flavus và F. moniliforma ở ngô sau thu hoạch có độ ẩm cao (29,4%) và ngô làm ướt 19,6%, được đưa vào điều kiện bảo quản N2 (99,7%) cho thấy ức chế sự phát triển của nấm. Wall và Uota (1970) cho thấy Alternaria alternata, Boytritis cinerea, Rhizopus stolonifer và Cladosporin herbarum phát triển kém dần theo nồng độ CO2 từ 10, 20, 30 và 45% với 21% O2. Có tới một nửa nấm mốc đã được nghiên cứu bị ức chế khi trong không khí có 20,9% CO2. Nấm mốc Fusarium roseum phát triển khi có 10% CO2 và bị ức chế phát triển khi trong không khí có 45% CO2 (hình 1.1). 23 Hình 1.1: Ảnh hưởng của bảo quản ngô hạt ở các điều kiện có các thành phần không khí khác nhau, Willson và cs., 1975 24 Chương II ĐỘC TỐ AFLATOXIN 2.1. Giới thiệu về độc tố aflatoxin 2.1.1. Nguồn gốc Độc tố aflatoxin do các nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh ra. Các nấm này thường thấy ở các loại hạt có dầu, hạt ngũ cốc, đặc biệt là hạt lạc, hạt ngô. Độc tố aflatoxin được phát hiện bởi các nhà khoa học Anh, Nga từ năm 1920, khi họ thấy trường hợp ngộ độc alcaloit ở người và gà. Đến năm 1960, tại Anh, hàng ngàn con gà tây đã bị chết do ăn phải thức ăn có lạc thối mốc. Các nhà khoa học nghiên cứu và phát hiện thấy chất độc aflatoxin ở lạc bị nhiễm nấm mốc này. Sau đó họ đã nghiên cứu ảnh hưởng của aflatoxin trên chuột và trên nhiều loại động vật khác nhau. Từ kết quả nghiên cứu, các nhà khoa học đã cảnh báo về mối nguy hại của thức ăn bị nhiễm nấm mốc và khả năng gây “bệnh dịch” của aflatoxin. 2.1.2. Cấu tạo và tính chất lý, hóa học Các afatoxin B1, B2 và G1, G2 đã được nhiều viện nghiên cứu xác định cấu trúc hóa học. Thoạt đầu các nhà hóa học đã xác định được có hai aflatoxin có công thức C17H12O6 và Cl7H12O7 với trọng lượng phân tử tương ứng 312 và 328. Hiện nay hai độc tố này được biết là aflatoxin B1, và G1. Trong cấu trúc phân tử có các nhóm lacton và metoxyl, không có nhóm hydroxyl tự do. Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời (blue), aflatoxin G1 - xanh lá cây (green). Aflatoxin G1 có chứa 2 vòng lacton, aflatoxin B1 - 1 vòng lacton. Sau đó hai aflatoxin B2 và G2 cũng được phát hiện. Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống với aflatoxin B1, và G1 chỉ khác là nối đôi trong vòng hydrofuran đã bị khử. Năm 1966, các nhà khoa học phát hiện thấy trong môi trường nuôi cấy hai dẫn chất hydroxi-2 của aflatoxin B2 và aflatoxin G2 là aflatoxin B2a và aflatoxin G2a, trong sữa và thịt bò cũng có các dẫn chất của aflatoxin B1 và B2, được đặt tên là aflatoxin M1 và M2 (Milk). Cả hai chất này đều bắt màu huỳnh quang màu xanh tím. Ở gan, thận và nước tiểu của cừu cũng tìm được hợp chất như vậy, trong nước tiểu của khỉ có aflatoxin P1 dẫn chất của aflatoxin B1. Một afatoxin khác cũng được phát hiện gọi là afatoxin 3B hay parasiticol. 25 O O O O O OCH3 O O O O O OCH3 Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 O O O O O OCH3 O O O O O O OCH3 O Aflatoxin G1 Aflatoxin G2 OH O O O O O OCH3 Aflatoxin M1 Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của aflatoxin (Jones, 1977) Bảng 2.1: Tính chất lý hóa của các aflatoxin Aflatoxin Công thức Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy Huỳnh quang Hấp thụ tia UV trong EtOH Độ quay cực quang học CHCI3[a]D B1 B2 G1 G2 M1 M2 C17H1206 C17H1406 C17H1207 C17H3407 Cl7H1207 C17H1407 312 314 328 330 328 330 268-269 286-289 244-246 229-231 299 293 Xanh lam Xanh lam Xanh lục Xanh lục Xanh tím Xanh tím 223,265 và 362 222,265 và 362 243,264 và 362 221,265 và 357 226,265 và 357 221,264 và 357 -558° -492° -556° -473° -280° - Nguồn: Twonsend, Stubblefield và Beljeanns (Dẫn theo Đậu Ngọc Hào, 2003) 2.2. Bệnh nhiễm độc aflatoxin ở vật nuôi (Aflatoxicosis) Bệnh nhiễm độc aflatoxin ở vật nuôi rất phổ biến, đặc biệt ở các nước nhiệt đới, do thức ăn chăn nuôi chứa aflatoxin đã không được phân tích xác định trước. Các trường hợp ngộ độc quan sát được cho thấy, tất cả loài vật nuôi như gà, vịt, gà tây, lợn, bò v.v... đều bị ảnh hưởng bởi aflatoxin. Trong các cơ sở chăn nuôi tập trung, các giống gia súc và gia cầm ngoại nhập có năng suất cao thường xuất hiện ổ dịch liên quan tới aflatoxin. Nguyên nhân chính là do thức ăn dự trữ nhiều dễ bị nhiễm nấm và độc tố của chúng. Trong những năm gần đây, khi công nghiệp chăn nuôi tập trung phát triển, nhiều vụ gây chết vật nuôi đã không tìm được nguyên nhân bởi các chẩn đoán chỉ tập trung vào 26 các nguyên nhân bệnh truyền nhiễm. Tới những năm 60 của thế kỷ này khi hàng trăm nghìn gà tây ở Anh bị chết thì tình cờ người ta phát hiện aflatoxin. Như vậy dấu hiệu đặc trưng của nhiễm độc độc tố nấm mốc nói chung và nhiễm độc aflatoxin là không có những dấu hiệu đặc biệt. Chính vì thế các thú y viên không phải là người đầu tiên phát hiện được nguyên nhân gây chết vật nuôi do chất độc nấm mốc mà là các nhà hóa học. Trong trường hợp nhiễm độc không gây chết ở vật nuôi, các biểu hiện triệu chứng lâm sàng thường thấy là kém phát triển, giảm sức sản xuất trứng, sữa, giảm tăng trọng và chuyển hóa thức ăn, mà các dấu hiệu đó thường không chỉ đặc trưng cho nhiễm độc tố. Chỉ sau khi phát hiện bệnh nhiễm độc aflatoxin ở gà tây, người ta mới tổng kết xây dựng một vài dấu hiệu phân biệt bệnh này với các bệnh truyền nhiễm và trúng độc khác (bảng 2.2). Tuy nhiên các dấu hiệu nhận biết lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó phải kể đến hàm lượng của chất độc ăn phải và thời gian kéo dài. Như thế sự chẩn đoán phân biệt có thể khác nhau từ trường hợp này đến trường hợp khác. Bảng 2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin có trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi Loại gia súc Lượng aflatoxin (mg/kg thức ăn) Thời kỳ nuôi dưỡng (tuần) Tổn thương gan Ảnh hưởng tới phát triển và hiệu quả thức ăn Lợn (20-70kg) 0,14 0,28 0,41 12 12 12 Trung bình Nhẹ Nhẹ Bình thường Giảm sút Giảm sút Lợn (40-100kg) 0,28 và 0,41 20 Nhẹ Giảm sút Lợn (70-100kg) 0,69 7 Trung bình Bình thường Lợn nái (có chửa) 0,3-0,55 4 Rõ Suy giảm và một số con chết Gà Tây (1 ngày tuổi) 0,25 4 Rõ Chậm phát triển và giảm trọng lượng Gà thịt (broiler) (1 ngày tuổi) 0,2 0,42 0,5 7 7 7 Nhẹ Nhẹ Nặng Giảm trọng lượng trong 3 tuần Vịt (7 ngày tuổi) 0,03 4 Đặc tính điển hình nhiễm độc aflatoxin (1) Giảm trọng lượng, chết 50% Bê (4 ngày tuổi) 0,2 16 Trung bình Giảm trọng lượng từ 0 đến 3 tháng Bê vỗ béo (6 tháng tuổi) 0,66 20 Trung bình Bình thường Bò sữa 1,5 4 Trung bình Giảm lượng sữa; aflatoxin M, có trong sữa Nguồn: Allcroff,1969 Ghi chú: Số liệu được tổng hợp từ những thí nghiệm khác nhau nên kết quả có thể có sự khác nhau. (1) xem tại điểm a) mục 2.2.1 27 Cho đến nay, phần lớn các tư liệu về nhiễm độc aflatoxin tập trung chủ yếu vào chăn nuôi gia cầm. Lý do có thể không phải gia cầm mẫn cảm với aflatoxin hơn là các loài vật nuôi khác trừ vịt con. Song ở gà công nghiệp người ta thấy có những dấu hiệu bệnh lý liên quan tới nhiễm độc aflatoxin, mặc dù chúng vẫn khỏe mạnh. Đó là hội chứng xanh tím và chảy máu khiến cho chất lượng thực phẩm bị giảm sút và đặc biệt người tiêu dùng không có cảm tình với loại thực phẩm này. Hơn nữa trong chăn nuôi gà, màu vàng trên da và trong lòng đỏ trứng rất hấp dẫn người tiêu dùng, thì màu sắc này lại bị tác động làm giảm đi đáng kể bởi sự có mặt của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng trên là do aflatoxin đã làm tăng tính dễ vỡ của lớp mao quản, cũng như làm mất chức năng là lớp đệm lót cho mạch quản khi có những tác động cơ giới. Mặt khác aflatoxin cũng gây ra sự ức chế quá trình đông máu, làm tăng hoạt tính của prothrombin, do đó, sự chảy máu trở nên liên tục không dừng. Hơn thế nữa aflatoxin can thiệp vào quá trình hấp thụ, chuyển hóa và đào thải caroten, một chất màu có trong thức ăn góp phần tạo màu vàng của da và lòng đỏ trứng. Quá trình giảm hấp thụ caroten cũng là nguyên nhân gây hội chứng xanh tím trong mô bào của gia cầm. Bên cạnh đó sự suy giảm hàm lượng lipit được hấp thụ từ thức ăn do ảnh hưởng của aflatoxin cũng dẫn đến giảm chất lượng thịt. Người ta thấy hàm lượng lipit trong phân của vật nuôi bị nhiễm độc aflatoxin cao hơn gấp 10 lần hàm lượng lipit trong phân của vật nuôi được ăn thức ăn không có aflatoxin. Lý do aflatoxin đã ảnh hưởng đến men lipaza của tuyến tụy, làm giảm hàm lượng men này. Aflatoxin còn tác động tới số lượng và chất lượng mật - một nhân tố quan trọng trong quá trình tiêu hóa mỡ. Trong chăn nuôi lợn, aflatoxin ảnh hưởng đến sự phát dục và đặc biệt có thể gây sẩy thai ở lợn. Lợn con theo mẹ có thể nhiễm aflatoxin qua sữa mẹ và có thể dẫn tới chết hay chậm lớn. Ở bò sữa, aflatoxin có thể bị phân giải và đào thải qua sữa dưới dạng đồng phân là aflatoxin M1, là chất độc nguy hiểm cho trẻ em. Đối với gia cầm sinh sản, aflatoxin ảnh hưởng đến năng suất trứng và tỷ lệ trứng có phôi và ấp nở. Do aflatoxin có thể kết hợp với ADN trong phôi, đã làm cho nhiều phôi bị chết ở ngày thứ 7 sau khi ấp. Trứng gà thương phẩm không chỉ nhạt màu, mà còn nhỏ hơn bình thường và dễ vỡ do lớp vỏ bị mỏng đi. Số lượng tinh dịch và tinh trùng của gà trống giảm sút rõ rệt, đặc biệt ở gà Leghorn. Nét đặc trưng nữa trong nhiễm độc aflatoxin ở vật nuôi là sự suy giảm tính đề kháng của cơ thể với mầm bệnh. Người ta đã chứng minh rằng nếu vật nuôi bị nhiễm độc aflatoxin thì tính kháng bệnh giảm sút rất lớn, đặc biệt bệnh cầu trùng (Coccidiosis), bệnh đơn bào (protozoa), Salmonellosis cũng như các bệnh truyền nhiễm do siêu vi trùng như bệnh Gumboro, bệnh Newcastle; bệnh do sán lá gan, bệnh do nấm men 28 Candida. Nguyên nhân là aflatoxin gây ức chế quá trình miễn dịch tiếp thu, do đó làm giảm hiệu lực của các vacxin phòng bệnh, tác động này như thế nào sẽ được nghiên cứu trên các đối tượng vật nuôi. 2.2.1. Nhiễm độc aflatoxin ở gia cầm a) Bệnh nhiễm độc aflatoxin ở vịt Vịt là vật nuôi mẫn cảm nhất với aflatoxin có trong thức ăn. Liều gây chết 50% động vật (LD50) ở vịt là 0,3 mg/kg. Nhiều vụ dịch gây chết vịt đã được thông báo. Ở Anh, 2 ổ dịch gây chết vịt là do trong thức ăn có chứa bột khô dầu lạc nhập từ Braxin. Bệnh cũng được phát hiện thấy ở các đàn vịt nuôi ở Kênia, ăn thức ăn được bổ sung bột khô dầu lạc từ Đông Phi và từ bang Kerala Ấn Độ. Nhiễm độc aflatoxin của vịt cũng được phát hiện ở Việt Nam (Dẫn theo Đậu Ngọc Hào và cs., 2003). Vịt bị nhiễm độc thường bỏ ăn, chậm phát triển, tiếng kêu không bình thường, da chân và da đùi biến thành màu tím, rối loạn vận động, co giật, ưỡn lưng, có thể dẫn đến chết. Các biến đổi cơ quan nội tạng cho thấy: Cơ thể bị phù nhẹ, gan xuất huyết, sưng to, rắn, mật sưng, thận sưng và xuất huyết, tá tràng sưng và chứa dịch rỉ viêm. Trong trường hợp cấp tính: Gan sưng to, màu vàng nhạt, vàng đất thó hay màu xám nhạt. Trong trường hợp mãn tính: Gan co lại, rắn chắc và xuất hiện các hạt, túi mật sưng to, chảy máu ở lách, thận và dưới da. Các biến đổi vi thể điển hình là thoái hóa nguyên sinh chất dạng không bào, nhân tế bào bị phá hủy, ống mật dãn ra, xuất hiện các sợi viêm, chảy máu lan tràn thành từng đám. Biểu mô ống thận cũng bị tổn thương, thoái hóa tế bào ống lượn, cầu thận teo, làm mất khả năng bài tiết. b) Bệnh nhiễm độc aflatoxin ở gà Về lịch sử phát triển của bệnh do aflatoxin, người ta nói đến vụ dịch gây chết 100.000 gà tây (Turkey Disease) ở Anh vào năm 1960. Gà bị nhiễm bệnh bỏ ăn và chết trong thời gian 7 ngày. Nhiều nguyên nhân đã được tìm kiếm như: Vi trùng, siêu vi trùng hay các chất độc kim loại nhưng đều không thuyết phục. Cuối cùng đã chiết tách được trong khô dầu lạc nhập từ Braxin về làm thức ăn bổ sung cho gà tây những chất có màu huỳnh quang xanh da trời (blue) dưới ánh sáng tia tử ngoại 365nm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC). Từ đó, bệnh nhiễm độc aflatoxin trong vật nuôi liên tiếp được công bố trên phạm vi thế giới như ở Tây Ban Nha, Úc, Hungary và Ấn Độ. Ở Việt Nam, bệnh cũng được phát hiện ở các trại chăn nuôi gia cầm giống nhập ngoại (Dẫn theo Đậu Ngọc Hào và cs., 2003). * Triệu chứng của bệnh Gà bỏ ăn, giảm tăng trọng, hiệu quả chuyển hóa thức ăn thấp, giảm sản lượng trứng, sự phát dục của gà mái và gà trống chậm. Tỷ lệ chết thường cao, đặc biệt phụ thuộc vào 29 các yếu tố "Stress" như nóng, ẩm, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng kém và các bệnh truyền nhiễm cộng phát. Mức độ nhiễm độc aflatoxin ở gà phụ thuộc vào loài, giống và lứa tuổi. Gà Tây mẫn cảm nhất, sau đó là gà Lôi, gà Nhật, gà công nghiệp nhập ngoại và các giống gà nội. Dấu hiệu quan sát thấy ở các đàn gà nhiễm độc aflatoxin không đặc trưng cho bệnh, vì nhiều loại bệnh khác nhau cũng có những biểu hiện tương tự. Để chẩn đoán đúng bệnh, cần kết hợp các yếu tố triệu chứng, mổ khám và đặc biệt là phân tích aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi. * Bệnh tích đại thể và vi thể Ngộ độc aflatoxin ở gà cũng giống như ở vịt về bệnh tích đại thể và vi thể. Ở thể cấp tính, bệnh tích chủ yếu là gan vàng và sưng. Trong các trường hợp mãn tính, gan biến thành màu xám hay vàng xám và trở nên xơ cứng. Những xét nghiệm vi thể ở gan cho thấy các thùy gan bị tổn thương lan tràn kèm theo chảy máu, tế bào gan thoái hóa không bào, thoái hóa hạt và thoái hóa mỡ tùy theo hàm lượng aflatoxin (bảng 2.3). Bảng 2.3. Tổn thương gan ở gia súc, gia cầm được ăn thức ăn có chứa aflatoxin Tình trạng tổn thương Bò Bê Lợn Cừu Vịt con Vịt Gà Giãn ống mật Tế bào gan sưng to Hoại tử cấp tính và chảy máu Viêm sợi huyết mãn tính + + - - + + - + + + + + - - - - + + + ± + + - + + - - - Nguồn: Wogan, 1966 Ghi chú: (+) là có gây tổn thương, (-) không gây tổn thương, (±) có thể có hoặc không Trong nhiễm độc mãn tính, tế bào gan trương to, nhân sưng, xuất hiện nhiều dạng phân bào gián phân, giãn ống mật. Liều aflatoxin bán cấp tính cũng gây ở gà dò các bệnh tích chung về tổn thương gan như: Gan biến thành màu vàng xám, chảy máu cục bộ, phát sinh các điểm hoại tử trắng và tăng lượng mỡ gan. Tế bào gan thoái hóa mỡ, thoái hóa không bào, nhân lồi lên, giãn ống mật và hình thành sợi huyết. Sự tăng sinh tế bào gan và tế bào ống mật nhằm khắc phục chức năng gan trong các trường hợp mãn tính, tế bào bắt màu kiềm. Trong quá trình viêm xuất hiện các bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính. Ở gà tây, nhiễm độc aflatoxin á cấp tính xuất hiện sự suy giảm các tiểu quản trong các bè gan. Sự tăng sinh tái tạo các tiểu quản xuất hiện nhiều ở các rãnh ngang, và có xu hướng lan toàn tiểu thùy. Phát sinh các hạt nhỏ trong các tế bào ái toan. * Suy giảm miễn dịch Nhiễm độc aflatoxin đã có mối quan hệ chặt chẽ với sự tăng tính mẫn cảm lên với các bệnh truyền nhiễm khác ở gà, do có sự mẫn cảm với bệnh cầu trùng. Tỷ lệ gà nhiễm 30 Salmonella cao hơn khi gà bị nhiễm độc aflatoxin hoặc tăng mẫn cảm nhiễm bệnh viêm túi fabricius do virut (siêu vi trùng). Ở gà tây được dùng vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng (Pasteurella multocida) đã không có miễn dịch khi thử thách với chủng gây bệnh và tăng tính mẫn cảm với bệnh cầu trùng gây ra bởi Eimeria adenolides. Sự suy giảm miễn dịch trong trường hợp nhiễm độc aflatoxin được giải thích bằng nguyên nhân làm teo túi fabricius, tuyến thymus và lách. Sự hấp thụ và giải trừ sắt bị giảm ở gà dò dẫn đến thiếu máu, tổng số bạch cầu tăng lên. * Thải trừ và tồn dư Trong cơ thể gia cầm chỉ tồn dư một lượng nhỏ, nhưng nhanh chóng được thải hồi, nếu như trong khẩu phần không có thêm aflatoxin tiếp tục. Ở gà dò, chất thải trừ có nồng độ cao nhất ở mề, gan, thận. aflatoxin B1 được chuyển hóa thành aflatoxin B2a và M1 trong gan. - Men gan NADP - nicotinamid dinucleotit photphat - có thể phân giải aflatoxin B1 và B2 thành cytopentenol và aflatoxintoxicol. Aflatoxin B1 bị đào thải qua mật và nước tiểu cũng như phân theo tỷ lệ 70:15:15 theo các đồng phân B1, B2, B2a, M1. Aflatoxin B1, M1 và aflatoxintoxicol là những chất thải chính ở gà tây với nồng độ cao nhất ở gan, thận, mề và phân. Phần lớn các chất thải trừ khỏi biểu mô khi không còn nguồn aflatoxin tiếp tục. Chất selen có thể làm giảm độc tố aflatoxin do chúng thúc đẩy làm tăng tỷ lệ aflatoxin dạng liên kết. Ở vịt có sự thay đổi công thức bạch cầu do sự biến đổi nhân của tế bào bạch cầu, sự suy giảm chức năng của các thực bào (phagocyts) và hệ võng mạc nội mô. Hoạt lực của cơ thể giảm sút ở gà dò, sự đáp ứng miễn dịch tế bào giảm cả ở gà ta và gà tây. Mặc dù có sự suy thoái miễn dịch do aflatoxin, nhưng những bằng chứng xác minh vẫn còn nhiều tranh cãi trên cả hai khía cạnh giải phẫu tổ chức các cơ quan có liên quan đến bạch cầu và sự đáp ứng miễn dịch chức năng sản sinh. 2.2.2. Nhiễm độc aflatoxin ở lợn Lợn rất mẫn cảm với aflatoxin. Trong những năm 1970-1980, tại Sông Bôi, Mường Hồng, Tô Hiệu (Sơn La) đã bùng phát ra một số ổ dịch lợn bị ngộ độc aflatoxin trong thức ăn, gây tổn thất rất lớn cho các cơ sở chăn nuôi. Nguyên nhân là do ngô bị nhiễm aflatoxin B với hàm lượng >1000ppb. Trong các ổ dịch này, lợn con và lợn nái mẫn cảm nhất và tỷ lệ chết rất cao. LD50 ở lợn là 0,62mg/kg trọng lượng cơ thể. Trong thức ăn, aflatoxin hàm lượng từ 2-4ppm có thể gây bệnh cấp tính. Liều 260ppb cho ăn trong nhiều tuần lễ gây chậm lớn, giảm tăng trọng và hiệu quả chuyển hóa thức ăn. Liều 400ppb cho ăn trong nhiều tuần gây những biến đổi bệnh lý ở gan. * Triệu chứng bệnh lý Dấu hiệu điển hình trong nhiễm độc aflatoxin ở lợn rất khó phân biệt với một số bệnh truyền nhiễm khác, đặc biệt là bệnh Leptospira và hướng điều trị chủ yếu là dùng 31 kháng sinh như streptomycin. Dấu hiệu quan sát được là sự suy giảm trọng lượng, bỏ ăn hay ăn ít, tiêu tốn thức ăn nhiều. Nét đặc trưng là da vàng, đặc biệt vùng niêm mạc như mắt, mũi, sau tai, da đùi, bẹn v.v... là những nơi dễ quan sát thay đổi màu sắc của da. Nguyên nhân do gan bị tổn thương, bilirubin tràn vào máu làm xuất hiện sắc tố vàng ở da. Nước tiểu ít, màu vàng và có mùi rất khét rất giống với mùi nước tiểu trong bệnh Leptospira. Nguyên nhân còn do tổn thương thận và lượng bilirubin trong nước tiểu tăng. Đôi khi cũng quan sát thấy các dấu hiệu ở phân như: Phân màu xám, xám nhạt do bilirubin không được chuyển qua mật vào ruột giúp tiêu hóa, phân có khi lẫn máu. Tổn thương đại thể phát hiện thấy chủ yếu ở gan, thận. Gan bị biến màu, trở nên xám nhạt, có trường hợp màu vàng nhạt hay màu vàng đất thó. Trong trường hợp mãn tính, gan bị teo hay cứng lại, sần sùi do tổ chức xơ phát triển. Ở giai đoạn tiếp theo thường xuất hiện các u hạt nổi lên trên bề mặt của gan. Thận sưng to ở giai đoạn đầu, có màu vàng đất hay màu xám nhạt, sau đó trở nên xơ cứng, teo. Chức năng bài tiết bị ảnh hưởng nghiêm trọng. Bệnh lý vi thể ở gan cho thấy các dạng thoái hóa và hủy hoại tổ chức, chảy máu ở trung tâm tiểu thùy rất điển hình. * Biến đổi tổ chức và chức năng sinh lý, sinh hóa Cũng như ở gia cầm, nét đặc trưng của nhiễm độc giai đoạn đầu là gan thoái hóa mỡ. Trong tổ chức tế bào nhiễm nhiều hạt mỡ, tạo màu sắc vàng nhạt và rất dễ vỡ. Thoái hóa rất phổ biến ở các vùng trung tâm. Nhiễm độc thể mãn tính, thường xuất hiện các tế bào gan khổng lồ, nhân tế bào đột biến, phát triển dạng sợi trong nội ống và tăng sinh mô ống mật. Các biến đổi sinh hóa trong bệnh nhiễm độc aflatoxin cũng đã được nghiên cứu. Sự sản sinh nhiều prothrombin làm giảm thời gian đông máu. Hoạt độ các men sGOT và sGPT tăng lên do các tế bào gan bị hủy hoại. Protein tổng số giảm do quá trình sinh tổng hợp protein bị ảnh hưởng. Ngoài ra, các thành phần khác như tổng số sắt liên kết, albumin, globulin, cholesterol, ure máu cũng bị giảm. Chẩn đoán nhiễm độc aflatoxin không thể chỉ dựa vào triệu chứng quan sát. Cần phải tìm kiếm sự có mặt của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Nếu trong khẩu phần ăn có từ 500 đến 700ppb aflatoxin, lợn con theo mẹ sẽ chậm lớn do bú sữa mẹ có aflatoxin M1. Ở lợn mẹ thường xuất hiện vàng da, lông xơ. Cả lợn mẹ, lợn choai và lợn con đều rất dễ cảm nhiễm. 2.2.3. Nhiễm độc aflatoxin ở các loài vật khác a) Ở trâu bò Nhiễm độc aflatoxin ở đại gia súc thường ít gặp hơn ở gia cầm và lợn. Bò sữa do được ăn thức ăn giàu protein như khô dầu lạc, khô dầu bông v.v... lượng aflatoxin không đủ để có thể gây độc cấp tính. Tuy nhiên, đối với bò sữa thì mức độ nguy hiểm 32 của thức ăn có chứa aflatoxin là do sự đào thải độc tố qua sữa. Aflatoxin cũng có thể bị phân hủy một phần ở dạ cỏ do hệ vi sinh vật trong dạ cỏ rất phong phú. Vào những năm 1960 những bê non được ăn khẩu phần có chứa 15% bột khô dầu lạc nhập từ Braxin đã có những biểu hiện của nhiễm độc aflatoxin, gan xơ và giãn ống mật. Năm 1962 một vụ nhiễm độc tương tự gây chết 4/16 bê. Triệu chứng và bệnh tích cũng giống như trường hợp trên, chủ yếu là sự phá hủy tế bào gan và tăng sinh ống mật. Một bê già hơn được ăn khẩu phần có chứa 2000ppb afllatoxin B1, đã bị chết sau đó. Năm 1981, 12/90 bê đã bị chết do ăn phải thức ăn có khô lạc khi phân tích chứa tới 2230ppb aflatoxin B1. Một vụ nhiễm độc ở bê do aflatoxin có trong thức ăn đã được phát hiện ở Tây Ban Nha, 448 bê trong số 2532 bê vỗ béo đã bị chết. Nguyên nhân do bê ăn ngô bị nhiễm nấm có chứa aflatoxin B1. Bột ngô đem cho vịt ăn đã gây chết 100% vịt thử nghiệm. Khi mổ khám các bê bị chết, người ta đã quan sát thấy bệnh tích điển hình của nhiễm độc aflatoxin: Chảy máu ở túi mật, dạ dày, ruột non, ruột già, tim và gan. Các nhà nghiên cứu đã thực nghiệm bằng cách bổ sung các hàm lượng aflatoxin thích hợp vào khẩu phần ăn của bò để xác định sự mẫn cảm của chúng đối với aflatoxin và khả năng gây chết cấp tính. 50 bê non được chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 10 con và được ăn khẩu phần có chứa 1000, 700, 300, 100 và 0ppb aflatoxin B1. Kết quả cho thấy ở nhóm ăn thức ăn có chứa 1000ppb đã có 2 trong l0 bê bị chết. Sau 59 và 137 ngày, gan của 3 trong 8 bê còn lại bị tổn thương, giảm chuyển hóa thức ăn. Hàm lượng aflatoxin 700ppb không gây chết bê trong thời gian nuôi 133 ngày nhưng gây tổn thương gan 2 trong số l0 bê và giảm chuyển hóa thức ăn. Ở các nhóm thí nghiệm còn lại, gan bê không bị tổn thương nhưng có biểu hiện biếng ăn. Không phát hiện thấy độc tố tồn dư trong gan thậm chí ở hàm lượng 1000ppb. Như vậy bê non cũng là động vật mẫn cảm với aflatoxin nhưng ở mức độ trung bình và có thể chịu đựng được đến hàm lượng 300ppb. Bò sữa là loại gia súc cần được bảo vệ khỏi bị nhiễm độc aflatoxin có trong thức ăn, bởi vì aflatoxin B1, sẽ được đào thải qua sữa dạng đồng phân aflatoxin M1. Các tổ chức quốc tế và nhiều quốc gia đã đề ra những hạn chế về hàm lượng độc tố trong thức ăn của bò sữa nhằm tránh được mối nguy hiểm của aflatoxin M1 cho con người. Cộng đồng Châu Âu (EEC) chỉ cho phép giới hạn tối đa của aflatoxin B1 trong thức ăn cho bò sữa là l0ppb. Nghiên cứu khả năng thải qua sữa của aflatoxin B1 cho thấy có tới 3,3% aflatoxin B1 được thải qua đường này ở dạng aflatoxin M1. Bò sữa cũng mẫn cảm với aflatoxin, nếu trong khẩu phần ăn có 500ppb aflatoxin B1, đã gây chậm phát triển và giảm chuyển hóa thức ăn. 33 b) Ở cừu Chưa thấy có công bố về nhiễm độc aflatoxin ở cừu. Lý do có thể do cừu chỉ được ăn cỏ nên ít có cơ hội bị nhiễm aflatoxin vì độc tố này không có trên đồng cỏ, trừ những trường hợp cừu được ăn thêm khẩu phần vỗ béo có chứa bột vào mùa đông. c) Ở thỏ Thỏ là loài vật rất mẫn cảm với aflatoxin, LD50 là khoảng 0,3mg/kg thể trọng, tương đương với liều gây chết vịt. Nếu trong khẩu phần ăn của thỏ chứa 330ppb aflatoxin B1 thì thỏ đã bị chết, sau 3 tuần thí nghiệm tỷ lệ chết lên tới 30%. Mổ khám bệnh tích đã xác nhận sự hủy hoại tế bào gan. d) Ở cá Bệnh aflatoxin chỉ quan sát thấy ở cá chăn nuôi tại các trại cá thương phẩm. Cá hồi mẫn cảm nhất đối với aflatoxin. Thí nghiệm cho thấy liều LD50 ở cá hồi cũng tương đương với vịt và thỏ. Người ta cũng gây các u ung thư thực nghiệm ở cá hồi. Lượng độc tố 0,5ppb trong khẩu phần thức ăn đã làm tăng một cách có ý nghĩa các trường hợp u ung thư ở loài Mt. Mhastra. Hàm lượng 20ppb aflatoxin B1 trong thức ăn hàng ngày có thể gây chết, 36% trường hợp có u ung thư gan sau 12 tháng. Aflatoxin G1 cùng hàm lượng trên chỉ có thể gây cho loài này 17% trường hợp u ung thư gan sau 16 tháng thử nghiệm. Tuy nhiên, các loài cá hồi khác nhau cũng mẫn cảm khác nhau với aflatoxin B1. Riêng loài cá hồi Salmo aguabonita là hoàn toàn kháng lại với aflatoxin B1. Đã có nhiều vụ nhiễm độc aflatoxin "trong nước". Nhiều trường hợp nhiễm độc ở cá được phát hiện tại Mỹ, bệnh nhiễm độc kiểu này là do thức ăn của cá chứa bột hạt bông bị nhiễm aflatoxin. Những vụ chết cá tương tự đã được nói đến trong các tư liệu từ những năm 1936. Vì vậy, để tránh thiệt hại có thể nuôi những giống kháng với aflatoxin hoặc cần chú ý tới khẩu phần ăn của chúng. 2.3. Điều kiện để A.flavus phát triển và sản sinh aflatoxin ở ngô hạt 2.3.1. Điều kiện môi trường Các nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển A. flavus trong ngô bảo quản sau thu hoạch là nhiệt độ, độ ẩm của môi trường và cơ chất. Ngược lại với nhân tố nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố aflatoxin trước thu hoạch thì độ ẩm lại đóng vai trò quan trọng sau thu hoạch. Độ ẩm môi trường tối thiểu để nấm mốc phát triển sau thu hoạch là 85%. Các bào tử nấm mốc có thể nảy mầm được trong điều kiện có độ ẩm môi trường từ 81-82%. Tuy nhiên các nghiên cứu khác cho thấy phải cần độ ẩm môi trường đạt 85%. Nếu cơ chất là ngô và gạo thì cả hai loại ngũ cốc này có thể cần độ ẩm thấp nhất để nấm A. flavus phát triển và sản sinh độc tố aflatoxin so với các cơ chất khác. Khi độ ẩm môi trường tăng lên trên 85% - điều đó cũng có nghĩa là sự phát triển của A. flavus cũng tăng lên một cách đáng kể. Như vậy nếu độ ẩm môi trường ở giới hạn này 34 tăng lên một chút thì nguy cơ sự có mặt của aflatoxin tăng lên. Hầu như chưa có giới hạn trên nào của độ ẩm môi trường được xác định có tác dụng ngăn cản sự phát triển của nấm mốc và sản sinh aflatoxin trong môi trường nuôi cấy nhân tạo cung cấp khí đầy đủ, trừ khi dưới những điều kiện không bình thường. Tuy nhiên trong điều kiện tự nhiên, nếu độ ẩm môi trường quá cao sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của A. flavus do sự phát triển mạnh mẽ của các vi sinh vật khác, ở hàm lượng độ ẩm của môi trường và cơ chất cao thì các loại nấm khác, nấm men và vi khuẩn sẽ phát triển lấn át A. flavus hoặc các vi sinh vật này tạo ra môi trường thiếu không khí sẽ hạn chế sự phát triển của A. flavus và sự sản sinh aflatoxin. Độ ẩm cơ chất trong quá trình bảo quản sau thu hoạch là nhân tố rất quan trọng. Nếu độ ẩm của hạt đạt 16%, nấm A. flavus khó có thể phát triển nhưng nếu độ ẩm lớn hơn 17%, nấm mốc đã bắt đầu phát triển tốt, ở hàm lượng độ ẩm từ 18-19%, A. flavus phát triển rất nhanh. Nhiều nghiên cứu chứng minh độ ẩm cơ chất cao là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Aflatoxin sản sinh ra ở lúa mạch có độ ẩm là 24-26%, nhưng không sản sinh ở độ ẩm 20%. Aflatoxin có thể sản sinh ra ở ngô sau khi thu hoạch có độ ẩm từ 20-28%, đặc biệt khi nhiệt độ môi trường từ 20-30°C (bảng 2.4). Ở nhiệt độ môi trường thấp tới 80C, A. flavus vẫn có thể phát triển và người ta thấy chúng có thể vẫn sản sinh ra aflatoxin. Nhiệt độ 11°C ở gạo và 14°C ở lạc có thể sản sinh được aflatoxin do nấm A. flavus phát triển và phát sinh. Tuy nhiên ở nhiệt độ tối thiểu này A. flavus chỉ có thể sản sinh được aflatoxin nếu như các yếu tố khác là tối ưu. Nhiệt độ từ 20-35°C là thích hợp nhất cho sự hình thành aflatoxin. Ở nhiệt độ 37-43°C có thể là giới hạn tối đa để nấm A. flavus sản sinh được aflatoxin, đặc biệt mới có nấm A. flavus phát triển được ở nhiệt độ từ 44-46°C. Bảng 2.4. Khả năng sản sinh aflatoxin trên ngô có độ ẩm khác nhau Độ ẩm trung bình của ngô (%) Độ ẩm tương đối môi trường (%) Lượng aflatoxin B1 (µg/g) 14 ngày 28 ngày Giống ngô 1 Giống ngô 2 Giống ngô 1 Giống ngô 2 16,5 16,7 17,3 17,6 18,0 84,2 85,1 86,0 86,9 87,7 ND ND 10 25 140 ND ND 30 750 500 ND ND 45 150 600 ND 25 1100 1675 3375 Ghi chú: ND: Không tìm thấy aflatoxin. Nguồn: Sauer và Burraoughs, 1980 Nếu cả độ ẩm môi trường, nhiệt độ và hàm lượng nước cơ chất tối ưu, thì sự hình thành aflatoxin chỉ sau 48 giờ. Người ta thí nghiệm trên ngô có độ ẩm 21% được bảo quản trong chum ở 30°C, nếu dùng không khí lạnh bơm vào ngay thì nấm A.flavus ít 35 phát triển và không hình thành aflatoxin. Nhưng nếu bơm khí lạnh từ từ trong vòng 20 tới 40 giờ thì nấm A.flavus có thể phát triển và sản sinh ra aflatoxin. Thành phần khí quyển trong quá trình bảo quản cũng là những nhân tố làm giới hạn sự phát sinh và phát triển của nấm mốc. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh khi CO2 ở nồng độ cao hay khi O2 ở nồng độ thấp đều có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc. Tác dụng này sinh học tới sự hình thành aflatoxin mạnh hơn là sự ức chế phát triển nấm mốc. 2.3.2. Thu hoạch và làm khô Quá trình thu hoạch và làm khô hạt bảo quản có thể gây ra sự hư hại mang tính chất cơ giới đối với hạt và đó là nguyên nhân gây ra sự phát triển của nấm mốc trong đó có A.flavus. Dưới điều kiện môi trường thuận lợi, sự phát triển của A.flavus ở các hạt bị tổn thương này nhanh hơn nhiều lần so với hạt bình thường. Sự hư hại hạt như gẫy vỡ là do quá trình thu hoạch, tách hạt, phơi sấy gây ra và có thể còn do sâu mọt phá hủy hạt. Người ta nhận thấy, nếu quá trình hư hại hạt xảy ra ở khu vực mầm hạt thì nấm mốc phát triển nhanh hơn là ở hạt. Vì vậy trong quá trình thu hạt làm khô và bảo quản cần phải lưu ý những tổn hại này. Nhiệt độ làm khô hạt cao có tác động tới sự phát triển A.flavus bởi vì nó sẽ có xu hướng làm giảm thấp hàm lượng nước trong cơ chất ở dưới mức tối thiểu. Nhiệt độ sấy khô cao cũng có thể làm hạt bị chết, như vậy sẽ làm tăng tính mẫn cảm của hạt đối với nấm mốc khi điều kiện ngoại cảnh bên ngoài không thuận lợi. Sự sấy khô ở nhiệt độ cao cũng có thể gây ra sự dễ vỡ của hạt so với làm khô trong tự nhiên. Một số nấm mốc và bào tử nấm mốc có mặt trên hạt sẽ bị diệt trong quá trình sấy khô ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên nếu như các loài nấm mốc bị tiêu diệt thì sau đó sự tái nhiễm lại thuận lợi hơn đối với A.flavus vì thiếu sự cạnh tranh sinh vật và vì bản thân A.flavus là loài ưa nhiệt hơn (Thermotolerant). Nhưng sau khi bị tiêu diệt, cần phải có thời gian lâu dài hệ nấm mốc mới có thể được tái lập. Làm khô ở điều kiện tự nhiên, nhiệt độ thấp có ưu điểm hơn là tiết kiệm được nhiên liệu và tránh được sự hư hại hạt trong quá trình sấy khô ở nhiệt độ cao. Phơi khô ở nhiệt độ thấp, cần phải tiêu tốn thời gian nhiều ngày mới có thể dẫn đến lượng độ ẩm của hạt an toàn tránh sự xâm nhập của nấm mốc, nhưng trong quá trình đó lại nâng cao khả năng nấm mốc có thể xâm nhập và sản sinh aflatoxin. Nếu nhiệt độ đó thấp hơn 20°C thì khả năng sản sinh aflatoxin cũng rất hạn chế vì nấm A. flavus cũng không phát triển mạnh mẽ ở khu vực nhiệt độ này. Ở nhiệt độ cao hơn, mối nguy hiểm do nhiễm aflatoxin tiềm tàng hơn. Một số thí nghiệm cũng đã chứng minh rằng nếu làm khô ở nhiệt độ thấp thì sẽ tránh được sự nhiễm aflatoxin. Một cách khác để làm giảm sự xâm nhập của nấm mốc vào hạt ngô, ở lớp trên của kho bảo quản người ta bố trí hệ thống trộn để bảo đảm tránh sự tập trung độ ẩm của hạt ở lớp trên. Người ta cũng còn có nhiều con đường khác để chống sự xâm nhập của nấm mốc vào hạt bảo quản, như dùng các hóa chất và các biện pháp sinh học sẽ đề cập ở phần sau. 36 2.4. Phương pháp phân tích aflatoxin Có hai phương pháp được sử dụng để phân tích aflatoxin: Phương pháp vật lý hóa học và phương pháp hóa sinh học. 2.4.1. Phương pháp vật lý hóa học Phương pháp này dựa trên nguyên lý các aflatoxin dễ dàng tách ra khỏi mẫu phân tích bằng các dung môi hữu cơ phân cực mạnh như cloroform, methanol, ethanol, axeton, benzen. Các aflatoxin cũng có tính không hòa tan trong các dung môi hexan, ete petrol, ete etylic. Từ năm 1961, các nhà khoa học đã chiết xuất aflatoxin trong khô lạc bằng methanol. Đây là phương pháp đơn giản đầu tiên, aflatoxin được hòa tan trong methanol và được loại mỡ bằng ete petrol. Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng để tách aflatoxin và được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (UV) ở bước sóng 360nm. Chiết xuất aflatoxin bằng cloroform có thể tách hoàn toàn aflatoxin ra khỏi cơ chất, được làm sạch mỡ qua cột hexan và ete etylic, thu hồi lại bằng cloroform, bốc hơi cloroform và sử dụng cho phân tích tiếp theo. 2.4.1.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography - TLC) Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi để xác định lượng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Các bản được tráng bởi silica gel được sử dụng để phân tích. Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là (chloroform: methanal) và (chloroform: axeton). Việc thêm nước vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. Hệ dung môi gồm: (nước: axeton: chloroform) tỷ lệ: (1,5:12:88 v/v) được đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng sau khi đi qua các dung môi, được đưa vào chiếu bởi đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 365nm. Các vết mẫu phân tích có mầu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây và có độ dài Rf được so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phương pháp này có thể xác định được lượng từ 3-4.10-4µg (0,3-0,4ng). Nhược điểm của phương pháp này là phụ thuộc vào trình độ kỹ thuật của người phân tích. Khi so sánh giữa mẫu nghiên cứu và mẫu của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả tới 20-30%. * Phương pháp đo mật độ huỳnh quang trên máy fluorodensitometer Fluorodensitometer có nhiều tiến bộ hơn, chính xác hơn so với nhìn bằng mắt thường. Tuy nhiên, ở nhiều phòng thí nghiệm hiện đại vẫn sử dụng phương pháp nhìn so sánh trực tiếp các vết trên bản mỏng vì dễ hơn nhiều khi phải qua máy densitometre. Hội hóa học phân tích (A.O.A.C - 1980) đã lưu ý tới phương pháp phân tích định lượng sử dụng TLC. Phương pháp này mở rộng thành chương trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency for Research on Cancer) 37 (Friesen, 1980, 1982). Các kết quả của chương trình phân tích trên đã chứng minh sự thiếu chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao (từ 30-122%). Hiện có 4 phương pháp phân tích bằng TLC, phổ biến nhất là CB (Contaminnation Branch), BF (The Best Foods), EEC (The European Economic Community) và Pon‟s (Pons Methods). Phương pháp CB tỏ ra ưu điểm hơn cả và thường xuyên được sử dụng. Tuy nhiên phương pháp CB đắt, sử dụng quá nhiều dung môi phân tích. Phương pháp BF có tính thực tế hơn nhiều, dễ làm và tiêu thụ ít dung môi; dung môi sử dụng là nước và methanol ít độc hơn chloroform. Phương pháp của Pons có nhiều ưu điểm, sử dụng hệ dung môi là axeton và nước, dung môi này không hòa tan mỡ. Cả 4 phương pháp trên đều sử dụng hệ dung môi chạy là chloroform và axeton. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin: Một số chất được tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phương pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên các bản sắc ký. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang có cùng một đồng phân. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích được phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) (Dẫn theo Đậu Ngọc Hào, 2003) và được hội phân tích hóa học Hoa Kỳ (A.O.A.C) công nhận. Aflatoxin B2b nhờ axit trifloaxetic (TFA) phun trực tiếp trên các bản mỏng. Axit sunfuric 50% được sử dụng để phun trực tiếp lên các bản mỏng trước khi chạy trong môi trường chạy. Axit sunfuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng. 2.4.1.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer chromatography - HPTLC) Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc ký lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: (1) Đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động; (2) Cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ; (3) Chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó, các vết được định đúng vị trí và đo cường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometers. Thể tích mẫu được dùng trong HPTLC có thể = 1µl so với 5-10 µl mẫu trong phương pháp TLC, như vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể chỉ cần 5pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30pg (0,03µg) aflatoxin B1 ở lạc (Coker,19). Sử dụng kỹ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TLC để định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất. 38 2.4.1.3. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High performance liquid chromatography - HPLC) Hệ thống phân tích aflatoxin tự động HPLC là hệ thống phân tích đắt tiền, dùng xác định định lượng aflatoxin. Phương pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thường và pha phản. Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia UV và xác định cường độ huỳnh quang. Trong pha bình thường, pha tĩnh là rắn, phân cực hơn pha động. Trong pha phản, pha bình thường là pha phản pha, pha tĩnh là lỏng và ít phân cực hơn pha động. Trong HPLC, pha phản được sử dụng để tách aflatoxin nhiều hơn pha bình thường. Mẫu phân tích được tách bằng hỗn hợp chloroform với nước. Ly tâm chất tách và làm sạch qua Silica gel. Pha bình thường sử dụng cột nhồi Silica gel 5µm và pha động sử dụng: (benzen: axetonitril: axit formic). Giới hạn xác định là 0.5µg/kg. Các nhà khoa học đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định được các aflatoxin trong lạc. Sử dụng pha phản với sự hình thành các đồng phân có thể xác định được các aflatoxin B1, B2, G1 và G2 ở nồng độ 5pg. Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân Iod của aflatoxin B1. Kết quả dẫn đến việc phát triển phương pháp đồng phân cột. 2.4.1.4. Phương pháp cột mini (Minicolumn methods) Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, nhưng chỉ xác định định tính. Kỹ thuật cột mini là cột sắc ký bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3 - 6 mm chiều rộng và 20cm chiều dài. Dung dịch chiết tách được làm sạch bằng dung môi/dung môi và hòa tan trong một lượng nhỏ benzen hay chloroform. Cột được nhồi silica gel như một chất hấp thụ và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại (UV) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin. Các nhà khoa học đã cải tiến phương pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu. Phương pháp cột mini đã được A.O.A.C (Association of Offical Analytical Chemists) (1980) công nhận. Aflatoxin được tách bằng axeton và nước (85:15), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin được tách ra bằng một pha nước với chloroform. Chloroform tách được đưa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silica gel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khô ở cả trên và dưới. Cột được chạy trong chloroform và axeton (9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp florisil. Ở đó, aflatoxin có thể được xác định bởi màu huỳnh quang xanh dưới đèn tử ngoại. 2.4.2. Phương pháp hóa sinh miễn dịch (Immunochemical methods) Phương pháp hóa sinh miễn dịch mang tính đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Hai phương pháp hiện dùng là: Aflatoxin đánh dấu phóng xạ (radio-labeled aflatoxin) và aflatoxin gắn men. Do sự tiến bộ của kỹ 39 thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau để xác định aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng (monoclonal và polyclonal). Phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal) tỏ ra đặc hiệu với aflatoxin B1 và aflatoxin B2 (100 - 125%), với aflatoxin G1 tới 30%. Trong khi đó kháng thể đơn dòng tỏ ra đặc hiệu với aflatoxin B1 và không phản ứng chéo với aflatoxin G1. Tuy nhiên, cũng có ý kiến cho rằng kháng thể đơn dòng có phản ứng chéo với aflatoxin B2, G1, G2. Theo ý kiến một số tác giả ở nhiều nước, việc xác định 4 loại afatoxin B1, B2 và G1, G2 có mặt trong tự nhiên mang tính thực tiễn hơn là chỉ xác định aflatoxin B1. Do vậy dùng kháng thể đa dòng hay đơn dòng để xác định aflatoxin không trở nên cần thiết. 2.4.2.1. Phương pháp ELISA (enzyme - linked immunoabsorbant assay) Phương pháp ELISA gồm ELISA trực tiếp (direct) và ELISA gián tiếp (indirect). ELISA trực tiếp sử dụng aflatoxin gắn men (aflatoxin - enzyme conjugate), ELISA gián tiếp - aflatoxin gắn protein (aflatoxin - enzyme conjugate) và một kháng thể thứ hai (secondary antibody) như IgG kháng thể (anti rabit IgG). Cả hai phương pháp trực tiếp hay gián tiếp đều sử dụng men peroxidaza (HRP) và men photphataza kiềm để gắn. ELISA trực tiếp (direct competitive ELISA) Phương pháp ELISA trực tiếp dựa trên nguyên lý kháng thể đặc hiệu được phủ trên các đĩa chuẩn độ (microtites). Dung dịch tách từ mẫu hay aflatoxin chuẩn được ủ cùng nhau hay tách thành 2 bước. Sau đó rửa bằng dung dịch thích hợp. Lượng men gắn vào đĩa được xác định bằng dung dịch đặc biệt. Phản ứng màu được đo bằng quang phổ hoặc so sánh bằng mắt thường với các đĩa tiêu chuẩn. Phương pháp ELISA này nhiều khi cũng chiếm thời gian và sai số lớn trong cùng một mẫu phân tích do sự xâm nhập của các chất ngoại lai có trong mẫu tách. Chu và cộng sự (1978) đã phát triển một phương pháp đơn giản hơn, chỉ cần một giờ là có thể phát hiện được aflatoxin B1 trong lạc và ngô, dựa trên nguyên lý chiết mẫu bằng methanol và nước có chứa dimethyl formamid. Bằng phương pháp này có thể phát hiện tới 95,4% aflatoxin B1 trong bơ. Có thể làm tăng độ chính xác của phương pháp ELISA qua các bước làm sạch mẫu. Vì vậy, người ta đề nghị cần làm sạch mỡ trước khi đưa vào phản ứng ELISA. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Trong phương pháp này aflatoxin gắn vào protein được phủ các đĩa chuẩn độ (microtiter). Mẫu tách hay aflatoxin chuẩn được đưa vào đĩa, tiếp theo là kháng thể thứ cấp (anti aflatoxin antibody). Lượng kháng thể gắn vào đĩa được xác định do thêm IgG kháng thể (anti rabit IgG) gắn với photphataza kiềm (ALP) và phản ứng màu xảy ra với P - nitrophenyl photphat. Lượng độc tố được xác định bằng cách so sánh với đường chuẩn (Standard Curve). Toàn bộ quá trình chiếm khoảng 5 giờ. Kawamura (1988) đã cải tiến phương pháp và xác định aflatoxin trong thời gian 3,5 giờ, độ nhạy phản ứng là 1ppb. So sánh với phương pháp ELISA trực tiếp, phương pháp ELISA gián tiếp trải qua 40 nhiều bước hơn và cần một kháng thể thứ cấp, vì vậy khả năng sai số cao và mất nhiều thời gian. 2.4.2.2. Phương pháp kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) trong phân tích ELISA Do sự không đặc hiệu của phân tích ELISA trong quá trình sản xuất thể đa dòng (polyclonal antibody) trên thỏ, người ta đã sản xuất kháng thể đơn dòng nhằm mục đích loại bỏ sự thiếu chính xác do phản ứng chéo (crossreaction) giữa các aflatoxin với nhau, đặc biệt là aflatoxin B1 và G1. Nguyên lý của sản xuất kháng thể đơn dòng: Đây là phương pháp phức tạp. Kháng thể đơn dòng (McAb) được sản xuất sau khi pha trộn tế bào myeloma của chuột nhắt trắng với tế bào lách phân lập từ tế bào lai F1, được miễn dịch bằng aflatoxin B1 (oxime - conjugate). Dòng tế bào lai hybridoma sản sinh kháng thể đặc hiệu chống aflatoxin B1 mọc trên môi trường nuôi cấy tế bào. Dịch nuôi cấy thu được có hàm lượng chuẩn độ cao (1:800.000) bằng phương pháp phân tích enzym miễn dịch và được gắn men peroxidaza conjugate theo 2 bước với glutaraldehyd. Conjugate được sử dụng cho phân tích ELISA trực tiếp với aflatoxin B1. Độ nhạy cảm của phương pháp đạt 0,2 ng/ml. Tính đặc hiệu của phương pháp đã được ghi nhận là không có phản ứng ngưng kết chéo với bất kỳ đồng phân nào. Phương pháp này cũng được ứng dụng để xác định aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và thực phẩm. Bảng 2.5. Phản ứng ngưng kết chéo giữa các aflatoxin và đồng phân trong monoclonal antibody ELISA Đồng phân Aflatoxin Tỷ lệ % phản ứng chéo Aflatoxin B1 Aflatoxin G1 Aflatoxin B2 Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 Aflatoxin G2 Aflatoxin G2a Aflatoxin G2b 100 14,3 12,5 7,3 4,4 1,8 0,08 0,03 Nguồn: Cauddish, 1985 2.4.2.3. Kit ELISA thương phẩm Một số các hãng của Anh, Pháp, Nhật Bản và Mỹ đã sản xuất ra các kit ELISA để phân tích aflatoxin. Trừ “Biokit” là ELISA gián tiếp, còn lại các kit khác đều là trực tiếp (bảng 2.6). 41 Bảng 2.6. Các kit ELISA thương phẩm để phân tích aflatoxin Đặc tính Quntitor Aflasure (UK) Biokit (UK) Trasnia (France) Afla - Check (Japan) Đặc hiệu Bước sóng hấp thụ Giới hạn định lượng (ppb) Dung dịch chiết B1 450nm 2 - 30 (Methanol:nước) (55:45) B1, B2 450nm 2 - 200 (Axetonitril:nước) (60:40) B1, B2, G1, G2 414nm 2 - 200 (Axetonitril:nước) (50:50) B1, B2, G1, G2 410nm 1 - 30 (Methanol:nước) (80:20) B1 492nm 2 - 40 (Methanol:nước) (55:45) Nguồn: Dẫn theo Đậu Ngọc Hào, 2003 Các kit ELISA được sử dụng đơn giản, nhanh chóng và thích hợp ở lượng aflatoxin 20ppb. Một vài dịch chiết được nhỏ lên giấy trên bản plastic. Nhỏ tiếp aflatoxin đã gắn men, sau đó cho dung dịch chất hiện màu. Sự không xuất hiện màu cho thấy sự có mặt của aflatoxin trong các mẫu chiết tách. Màu xanh sáng là không có 1 aflatoxin. Phương pháp chỉ mang tính chất định tính, không có ý nghĩa định lượng. Hạn chế của phương pháp này là giá kít còn cao, chỉ phù hợp cho kiểm tra sản phẩm xuất nhập khẩu và các chương trình giám sát aflatoxin. Cần được hoàn chỉnh và giảm giá do tự chế tạo để phục vụ cho sản xuất. 2.4.3. Phương pháp phân tích nhanh hàm lượng aflatoxin trong ngô (phương pháp BGYF) Theo một trình tự phân tích trong phòng thí nghiệm đòi hỏi phải có thời gian và rất tốn kém tài chính. Vì vậy, người ta đã tìm ra nhưng phương pháp đơn giản hơn nhằm đáp ứng được đòi hỏi trong quá trình mua bán trên thị trường. Phương pháp sử dụng cột mini (mini column) cũng là một trong các phương pháp xác định nhanh aflatoxin trong ngô, tuy nhiên độ chính xác kém vì dung lượng mẫu sử dụng trong quá trình này quá ít nên phương pháp này không được sử dụng rộng rãi. 42 Hiện nay người ta sử dụng kỹ thuật BGYF (bright green yellow fluorescenes), kỹ thuật này dựa trên sự phát sáng của đèn huỳnh quang màu vàng xanh của các hạt bị nhiễm aflatoxin dưới ánh sáng đèn tử ngoại 365nm. Kỹ thuật này được gọi là phương pháp sàng lọc (screening) nhằm phát hiện nhanh lô hàng có hàm lượng aflatoxin thấp. Nếu kiểm tra khoảng 4,54kg mẫu mà không thấy có hạt màu vàng xanh, lô hàng được coi như có hàm lượng aflatoxin thấp. Nếu như có những hạt có màu huỳnh quang vàng xanh thì cần được đánh giá theo những thang mẫu quy định. Ở Mỹ người ta chấp nhận phương pháp BGYF để đánh giá tình trạng nhiễm aflatoxin trong lô hàng hóa có hàm lượng từ 20 - 100ppb. Phương pháp này cũng được áp dụng ở nhiều nước và quy định mức nhiễm aflatoxin từ 20ppb trở lên tùy theo mục đích sử dụng. Phương pháp BGYF cũng được áp dụng với ngô trắng và ngô đã qua bảo quản nhưng phương pháp này gặp khó khăn trong việc định lượng. 2.4.4. Các bước dẫn tới sai sót trong quá trình phân tích định lượng aflatoxin Do sự phân bố hàm lượng aflatoxin không đồng đều trong lô phân tích, đặc biệt đối với lô hàng ở dạng hạt như ngô, hạt bông, lạc... Các loại hạt này có thể bị mốc hoặc bị sâu mọt nên có chứa hàm lượng aflatoxin cao hơn so với các hạt khác. Số lượng hạt bị mốc hay sâu mọt có khi tập trung vào những khu vực nhất định như trên bề mặt, trong các khu vực bị rò rỉ... Vì vậy sẽ gây ra những chênh lệch về hàm lượng đôi khi rất lớn trong cùng một lô hàng phân tích. Bên cạnh đó khi lấy mẫu người ta vẫn có thể bị áp đặt tính chủ quan và vì vậy cũng là nguyên nhân dẫn đến sự sai lệch kết quả phân tích. Đã có những công trình nghiên cứu cho thấy sự biến động hàm lượng aflatoxin có thể từ 0 - 500ppb do sự có mặt hay không có mặt của hạt bị mốc. Như vậy, nếu muốn tăng cao tính chính xác của kết quả phân tích với hàm lượng có thực trong lô hàng thì quá trình lấy mẫu cần phải được thiết kế và nghiên cứu. Sự sai sót có thể bắt đầu lấy mẫu từ lô hàng cho tới khi mẫu đó chỉ được lấy với một lượng nhỏ hơn để đem nghiền ra và lại một lần nữa, từ một khối lượng nhỏ này lại chỉ lấy một lượng rất nhỏ để phân tích. Cuối cùng sai sót còn tồn tại trong quá trình xử lý, chiết tách mẫu và đánh giá, đo lường mẫu trong các phương pháp. Để khắc phục tình trạng trên, người ta đã thiết lập những chương trình phân tích mẫu để nghiên cứu nhằm giảm tối thiểu quá trình dẫn đến sai sót. Theo phương pháp phân tích và đánh giá của Hội phân tích hóa học Hoa kỳ (A.O.A.C) thì không thiết kế dung lượng mẫu bắt buộc, song bắt buộc mẫu phải được nghiền nhỏ tới kích thước quy định. Lần đầu tiên mẫu phải được nghiền để qua được rây số 20. Sau cùng 50g mẫu được sử dụng cho chiết tách và dùng cho phân tích. Quá trình dẫn đến sai sót trong phân tích có thể được thiết lập và biểu diễn như sau: 43 V = S + C + F + Q S = 3,9539 P/Ws C = 0,1196 P/Wc F = 0,0125 P/Wf Q = 0,0699 p2/Nq Trong đó: V: là biểu diễn tổng các sai sót có thể S: là sai sót trong quá trình lấy mẫu từ lô hàng C: là sai sót từ quá trình lấy mẫu từ mẫu ban đầu F: là lần lấy mẫu cuối cùng từ C Q: là sai sót trong các bước xử lý mẫu Ws: khối lượng mẫu lần đầu từ lô hàng (kg) Wc: khối lượng mẫu lấy ra để nghiền từ Ws (kg) Wf: khối lượng mẫu cuối cùng lấy từ Wc dùng để phân tích (kg) Nq: số lần aflatoxin phải thông qua các công đoạn chiết tách để sử dụng cho phân tích cuối cùng. P: là hàm lượng aflatoxin trong lô hàng phân tích bằngppb hay µg/kg. Kết quả của các công thức 2, 3, 4 là dựa trên những phân tích chi tiết trong phòng thí nghiệm với dung lượng mẫu cho cả 3 lần đã được tính toán và ước lượng cả những sai sót trong khi lấy mẫu để khắc phục tính chủ quan. Chỉ có thể có sự đồng nhất hàm lượng aflatoxin có trong hạt mới hy vọng khắc phục được sai sót do 2, 3 và 4. Nhưng điều đó không xảy ra trong thực tế. Công thức 5 phản ánh sự sai sót trong các bước phân tích. Thông thường qua các bước làm sạch mẫu, sử dụng các dung môi phân tích để chiết tách có thể dẫn tới làm sai sót hàm lượng aflatoxin trong mẫu. Sự đánh giá bằng mắt thường trên bản mỏng theo phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) cũng thường dẫn đến sự sai sót do tính chủ quan. Ngay cả nếu sử dụng máy đo mật độ quang học Spectro - photometer cũng vẫn tồn tại nhũng sai sót khi đánh giá kết quả trên bản mỏng. Chỉ có sử dụng các phương pháp hiện đại hơn như sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thì mới hy vọng làm giảm sai sót trong bước đánh giá cuối cùng. Như thế chỉ có thể giảm thiểu sự sai sót trong phân tích định lượng aflatoxin khi các yếu tố có thể gây sai sót trong toàn bộ quá trình lấy mẫu và phân tích mẫu được chú ý và được tính toán tối ưu. Mối quan hệ giữa dung lượng mẫu, số lượng hạt đại diện được dùng trong phân tích và độ mịn của mẫu cuối cùng được đưa vào chiết tách là rất quan trọng. Điều này sẽ quyết định mức độ tương quan giữa kết quả phân tích với hàm lượng có trong lô phân tích. Tuy nhiên nếu yêu cầu về mối tương quan càng cao thì chi phí cho quá trình phân tích càng lớn. Nói chung dung lượng mẫu càng cao, tỷ lệ hạt càng lớn trong quá trình 44 phân tích, đảm bảo mức chính xác và mối tương quan càng lớn, song chi phí quá cao sẽ cản trở công việc trên. Vì vậy các bước lấy mẫu phân tích cần được tính toán để đảm bảo sự phù hợp với khối lượng của lô hàng hóa phân tích. 2.5. Các phương pháp phân hủy aflatoxin 2.5.1. Phương pháp vật lý học a) Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng Phương pháp dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nghiên cứu và phương pháp này cũng đã đem lại kết quả đáng kể. Ở lạc hạt, nếu sức nóng 130°C trong vòng 5 phút có thể làm giảm lượng aflatoxin B, từ 2000ppb xuống 1000ppb. Lượng aflatoxin giảm còn liên quan đến sự có mặt của các aflatoxin khác như af. B2, af.G1 v.v... Kết quả một số thí nghiệm cho thấy aflatoxin B1 giảm 70% còn lượng aflatoxin B2 chỉ giảm từ 47-52%. Trong các thí nghiệm khác lại thấy aflatoxin B1, giảm được 69% và aflatoxin G1, chỉ giảm 67%. Trong nông nghiệp thường dùng phương pháp này để làm khô và giảm aflatoxin ở ngô hạt. Nếu nhiệt độ khí nóng là 100-145°C thì lượng aflatoxin B có thể giảm từ 877ppb còn 452ppb, từ 378 còn 213ppb, từ 133ppb còn 80ppb và từ 80ppb còn 35ppb (giảm khoảng từ 40% đến 60%). Nếu tăng nhiệt độ thổi lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm từ 66-77%. b) Phân hủy alfatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá vỡ nhanh chóng vòng lactam trong cấu trúc phân tử aflatoxin. Coomes (1966), Elkady (1981) và một số tác giả đã chứng minh lượng aflatoxin có thể giảm thiểu tới mức không thể phát hiện được bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Ở lạc có độ ẩm 10%, chứa 7000ppb aflatoxin B1; được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ, lượng aflatoxin B1 đã giảm còn 370ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5atm trong vòng 1 giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. Nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40-4000ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 tới 68%. c) Phân hủy aflatoxin bằng cách đun trực tiếp Aflatoxin bền vững với nhiệt độ. Điều này cũng phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của các aflatoxin B1, B2, G1, G2 và M lần lượt là 268, 386, 244, 230 và 299oC (Milczewski, 1981) Nhiều thí nghiệm khác được tiến hành bằng phương pháp đun nấu thông thường (nhiệt độ = 100°C), song kết quả cho thấy hoàn toàn không giảm được lượng aflatoxin có trong mẫu phân tích. Khi đun sôi nguyên liệu nấu bia ở 100°C vẫn tìm thấy 90% lượng aflatoxin so với lượng độc tố có mặt ban đầu. Người ta đã phát hiện thấy trong thức ăn nấu chín ở Thái Lan một lượng aflatoxin từ 748ppb tới 1299ppb. 45 Tuy nhiên, độ bền vững của aflatoxin trong quá trình đun sôi còn phụ thuộc vào hàm lượng nước chứa trong hạt. Nếu luộc gạo với nước theo tỷ lệ 1:4 trong vòng 30 phút đã làm giảm 50% lượng afatoxin. Nếu tỷ lệ đó là 1:8 giảm tới 67% lượng độc tố. Như vậy, trong quá trình đun sôi, nếu thêm nước vào sẽ thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy aflatoxin. Ranh giới nhiệt độ để phân hủy được aflatoxin cũng rất quan trọng. Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 100oC thì khả năng phân hủy độc tố hầu như không xảy ra. Người ta đã ngâm hạt bông có độ ẩm 20% trong 90 phút ở nhiệt độ 60oC nhưng lượng aflatoxin B1 không bị giảm đi, lượng aflatoxin B1 và G2 chỉ giảm được từ 1,7% và 2,8%. Sự giảm aflatoxin trong điều kiện đun nấu còn phụ thuộc vào pH của mẫu phân tích. Nếu ở pH = 1, nhiệt độ ngâm là 40°C thì aflatoxin B1 có thể chuyển thành aflatoxin B2a và aflatoxin G1 thành aflatoxin G2a. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy, sự giảm aflatoxin M trong sữa chịu ảnh hưởng của nhiệt độ tiệt trùng. Nếu sử dụng nhiệt độ 75°C trong 4 giây, 62°C trong 30 phút, 74°C trong 30 phút thì tỷ lệ độc tố tương ứng giảm được là 12%, 35% và 40%. Tuy nhiên, bản thân sự phân hủy này còn phụ thuộc vào aflatoxin B, con vật ăn phải được đào thải qua sữa, hay thí nghiệm bổ sung aflatoxin M vào sữa. Những nghiên cứu khác cũng cho thấy, nếu hấp ướt bột lạc ở 1,5 atm, sau đó sấy khô ở 80-105°C thì bột lạc gần như đạt giới hạn an toàn cho vật nuôi. Người ta đun nóng 500ppb aflatoxin trong dầu ở 160°C, sau 30 phút còn 400ppb độc tố. Tiếp tục đun 30 phút nữa aflatoxin vẫn không bị phá hủy. Dầu ngô và dầu lạc nhiễm aflatoxin được đun nóng tới 250°C mà độc tố vẫn tồn tại. Tuy nhiên sự giảm aflatoxin trong hạt lạc hay ngô bằng phương pháp sấy nóng có kết quả khả quan hơn. Nguyên do là bởi sự có mặt của nước trong các hạt. Nếu sấy lạc ở 160°C trong 30 phút thì lượng aflatoxin giảm từ 100ppb còn 5ppb, nếu ở 190°C trong 10 phút thì lượng độc tố còn lại là 20ppb. d) Làm giảm aflatoxin bằng phương pháp hấp phụ Aflatoxin có thể được hấp phụ bởi các chất hấp phụ như: vermicullit, montmorillonit, bentonit, sepiolit v.v... Nếu thử các chất hấp phụ trên ở hàm lượng l gam, thêm 50ml dung dịch đệm photphat (pH = 6), ủ trong 5 ngày thì khả năng hấp phụ aflatoxin có thể đạt 100%. Nghiên cứu sử dụng than gỗ hoạt tính để hấp phụ các mycotoxin trong đó có aflatoxin đã thu được kết quả tốt. Người ta đã tiến hành thí nghiệm trên 2 nhóm vật nuôi. Nhóm đối chứng ăn thức ăn nhiễm aflatoxin, thức ăn của nhóm thí nghiệm đã được hấp phụ qua than củi hoạt tính. Kết quả cho thấy nhóm vật nuôi đối chứng bị chết trong khi nhóm được ăn thức ăn qua hấp phụ vẫn khỏe mạnh. Bên cạnh đó một số các hợp chất như silicagel, polyme cao phân tử cũng được thử nghiệm khả năng hấp phụ toxin trong thức ăn chăn nuôi. Quá trình hấp phụ xảy ra trên bề mặt các cao phân tử, do sự gắn các toxin vào các nhóm hydro. Các nhà nghiên cứu nhận thấy khả năng hấp phụ độc tố trong in vitro thí nghiệm với các độc tố chuẩn như 46 aflatoxin B1, B2, G1 và G2 giảm tới 61, 37, 46 và 35%. Kết quả được chứng minh qua việc nuôi vịt thí nghiệm. Người ta thấy những biểu hiện bệnh lý ở gan qua giải phẫu đã giảm rõ rệt nhưng vẫn phát hiện được những dấu vết của aflatoxin trong gan. Kết quả cũng được quan sát thấy trên gà thí nghiệm, trên lợn và gà đẻ. Các vật nuôi thí nghiệm phát triển bình thường và tăng trọng hơn so với đối chứng. e) Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, đặc biệt là hạt lạc và hạt bông. Methanol được sử dụng như một dung môi thích hợp cho việc tách độc tố, ngoài ra còn có ethanol, axeton, cloroform, hỗn hợp axeton và nước, methanol và nước, hỗn hợp hexan - axeton - nước, v.v... Khả năng chiết xuất aflatoxin bằng các dung môi hữu cơ còn phụ thuộc vào nhiệt độ dung môi. Tuy nhiên mục đích chiết tách aflatoxin trong nguyên liệu còn cần được hạch toán kinh tế. Vì vậy chỉ dùng hỗn hợp methanol - nước là tương đối phù hợp về giá thành. Một thí nghiệm sử dụng methanol để tách aflatoxin ra khỏi ngô ở tỷ lệ 5: 1 đã cho kết quả rất khả quan. Gần như ngô đã trở nên vô độc đối với vịt, sau đó methanol thu hồi được lọc qua than hoạt tính và có thể tiếp tục sử dụng lại. Rửa các nguyên liệu chỉ chứa aflatoxin (như ngô) bằng dung dịch 1% clorua canxi (CaCl2) có thể làm giảm tới 80% lượng aflatoxin. Nếu sử dụng nước có 1% bicacbonat natri (NaHCO3), lượng độc sẽ giảm 100% (lượng ban đầu là 10 ppm). Tuy nhiên quá trình rửa cũng làm giảm hàm lượng protein tới 6%. Người ta có thể loại bỏ 80% aflatoxin trong dầu lạc bằng cách sử dụng nước muối 10% (NaCl) theo tỷ lệ 1:4 ở nhiệt độ 90°C trong 30 phút. f) Phân hủy aflatoxin bằng các tia xạ Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím (UV light). Nhiều tác giả đã nghiên cứu khả năng làm giảm aflatoxin bằng tia cực tím. Ở bước sóng 365nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Lượng aflatoxin ở ngô (150ppb và 250ppb) có thể giảm 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. Các nhà khoa học ở Ấn Độ cũng khẳng định, dưới tác động của ánh sáng mặt trời aflatoxin B1, trong bột lạc sẽ giảm từ 83% xuống 50%. Các tia xạ như tia γ đã được nghiên cứu để làm giảm aflatoxin trong hạt. Thí nghiệm được tiến hành ở liều 1; 5; l0 và 15 Mrad (Mega rad) để chiếu vào các dung dịch có chứa aflatoxin B1, B2, G1, G2. Chỉ ở liều 10 Mrad mới có thể làm giảm đáng kể hàm lượng aflatoxin. Tuy nhiên, việc chiếu tia xạ để làm giảm aflatoxin trong nguyên liệu đã không mang lại ý nghĩa kinh tế. Nếu sử dụng liều 3 Mrad để chiếu vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm các chất dinh dưỡng, đặc biệt là các axit amin và cũng không gây nguy hiểm cho động vật thí nghiệm nuôi bằng thức ăn được chiếu tia xạ. Nhưng ở liều lượng này, aflatoxin đã không bị phá hủy. Nếu sử dụng liều 10 Mrad sẽ gây ảnh hưởng xấu đến các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. 47 Từ các phương pháp vật lý nhằm phân hủy aflatoxin đã nêu trên, có thể nhận xét như sau: Việc loại bỏ hoặc làm giảm lượng aflatoxin bằng phương pháp cơ học và vật lý học có thể mang lại những kết quả khả quan. Người ta tách bằng thủ công hay bằng các máy tách hạt những hạt bị hư hỏng, biến màu ra khỏi khối lượng hàng hóa để có thể tránh được một phần khả năng nhiễm aflatoxin. Phương pháp phơi khô hay rửa bằng nước có chứa các dung môi hữu cơ không hoàn toàn loại bỏ được aflatoxin. Tuy nhiên, phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn vì đơn giản dễ làm, đặc biệt đối với các nước nhiệt đới có nhiều ánh sáng mặt trời, điều kiện phơi khô thuận lợi. Nhưng hoàn toàn không phù hợp với các nguyên liệu đã xay nghiền từ hạt thành dạng bột. Phương pháp chiết bằng các dung môi hữu cơ có thể lấy ra phần lớn lượng aflatoxin trong hàng hóa. Nó đã được áp dụng thành công ở nhiều nước và đặc biệt đối với bột lạc và dầu lạc. Phương pháp hấp phụ qua than hoạt tính đặc biệt có hiệu quả đối với aflatoxin, patulin và các mycotoxin khác. Phương pháp làm vô hoạt độc tố nấm bằng nhiệt còn phụ thuộc vào các yếu tố như lượng nước có trong cơ chất, áp suất, thời gian và nhiệt độ sấy v.v..., trong đó hấp ướt dưới áp suất cao có hiệu lực hơn cả. Sự phân hủy các mycotoxin có thể xảy ra ở 100°C, thấp nhất là 60°C. Citrinin là độc tố nấm mốc dễ bị phân hủy bởi nhiệt, các độc tố khác như ochratoxin, patulin, zearalenon... lại tương đối bền vững với nhiệt. Aflatoxin là độc tố bền vững nhất ở nhiệt độ cao. Aflatoxin có thể bị phân hủy bởi tia cực tím, thậm chí khi phơi nắng. Tia ion cũng có thể phân hủy được aflatoxin, tuy nhiên liều cần thiết là rất cao và do đó ảnh hưởng tới chất lượng của thực phẩm, thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi. 2.5.2. Phương pháp hoá học Phương pháp hóa học sử dụng nhằm vô hoạt hay giảm lượng aflatoxin trong thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi đã được nhiều tác giả nghiên cứu và được ứng dụng ở nhiều nơi. a) Phương pháp sử dụng các chất oxy hóa khử Các chất oxy hóa khử như natri hypochlorit (NaOCl), oxy già (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Natri hypochlorit được dùng làm sạch các dụng cụ phòng thí nghiệm. Người ta đã chứng minh khả năng làm vô hoạt aflatoxin B1, có thể chuyển thành dạng aflatoxin B1-2-3 dichlorid, là một chất rất nguy hiểm có thể gây ung thư và đột biến. Vì vậy, khi dùng NaOCl để khử aflatoxin B1, thường kết hợp với axeton hàm lượng 5%. Cũng có thể sử dụng hỗn hợp NaOCl và H2O2 để phân hủy aflatoxin. Người ta còn dùng hỗn hợp 16,5% NaCl và 1% NaOCl để xử lý mẫu. Thí nghiệm trên bột gạo được 48 xử lý bằng dung dịch trên trong 24 giờ đã tách được hoàn toàn aflatoxin ra khỏi mẫu thử. Khi mẫu được xử lý bằng dung dịch 3% H2O2 trong 1 giờ ở 65°C, lượng aflatoxin B1, trong ngô giảm từ 379ppb còn 20ppb. Nhiều tác giả khác cũng cho biết, có thể loại bỏ hoàn toàn aflatoxin B1 bằng hỗn hợp 2% NaOCl và 12% H2O2 ở điều kiện bình thường. Một số nghiên cứu khác sử dụng H2O2 trong 30 phút ở pH = 9,5 và 80°C cho kết quả rất khả quan, không những aflatoxin bị phân hủy hoàn toàn mà còn đảm bảo an toàn khi thí nghiệm lại trên vịt và trên phôi gà. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các axit amin. Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu đạt hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm, đặc biệt là protein. b) Phương pháp sử dụng các chất kiềm Hydroxit amon (NH4OH) và hydroxit natri (NaOH) là 2 chất kiềm được thử nghiệm làm vô hoạt aflatoxin. Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lactam trong cấu trúc phân tử aflatoxin. Tuy điều kiện thí nghiệm mà các sản phẩm phân hủy aflatoxin có những trọng lượng phân tử khác nhau. Người ta đã xác định được một số chất có trọng lượng phân tử 286 và 256. Aflatoxin D1, là sản phẩm phân hủy có trọng lượng phân tử bằng 286. Quá trình hình thành aflatoxin D1 dưới tác động của ion NH3 làm mở vòng lactam và làm mất cacbon của axit keto. Ở nồng độ nguyên của NH4OH, trong 100°C và 1 giờ tiếp xúc đã có 10% aflatoxin D1, hình thành từ aflatoxin B1. Schroeder (1968) đã lập mô hình thí nghiệm với aflatoxin đánh dấu nguyên tử hydro (3H-aflatoxin B1) trong một thời gian tiếp xúc là 4 giờ ở 100oC và 25% NH4OH thì có 31% aflatoxin B1, chuyển thành aflatoxin D1. Hợp chất được phân giải có trọng lượng phân tử bằng 206 được phát hiện bị mất đi vòng lactam và vòng zylopentan. Một chất khác là sản phẩm phân giải tiếp theo của phân tử aflatoxin D1, do bị mất nhóm methoxy có trọng lượng phân tử là 256. Trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, aflatoxin được tiếp xúc với NH4OH đậm đặc trong 18 ngày đã phát hiện được những thành phần không bị hòa tan trong axeton nhưng không xác định được sản phẩm phân giải loại gì. Chất được xác định tiếp theo trong những thí nghiệm khác là axit o-cumarirh. Tuy tác dụng của các kiềm chất phân giải aflatoxin đã được chứng minh bằng sự mất màu xanh huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại (UV), song trên động vật thí nghiệm thì không an toàn. Điều này đã được kiểm tra với Artamia salina và tính đột biến trong thí nghiệm trên Samonella (Ames-test). Như vậy, độc tính của aflatoxin không chỉ phụ thuộc vào vòng lactam, mà còn phụ thuộc vào vòng furan trong phân tử. Theo nghiên cứu của Vesonder (1975), nếu thời gian tiếp xúc của aflatoxin với NH4OH trong 18 ngày ở nhiệt độ 60°C, độc tố sẽ bị phân hủy hoàn toàn và không gây độc cho phôi trứng thử nghiệm. Nhưng theo Draughon (1982), dù tăng cường hàm lượng NaOH hay 49 NH4OH, vẫn còn từ 6-10% aflatoxin B1, tồn lại trong sản phẩm thử nghiệm. Do vậy theo tác giả, cần thận trọng khi sử dụng các sản phẩm phân hủy toxin bằng con đường này nếu như trong nguyên liệu có chứa nhiều aflatoxin. Ngoài ra, hydroxit canxi Ca(OH)2, natri cacbonat Na2C03 cũng đã được thử nghiệm và cho hiệu quả cao. Trong những thí nghiệm khác, người ta còn kết hợp giữa monomethyramin và natri cacbonat. c) Phương pháp sử dụng khí NH3 Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả hiển hiện của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Ngay trong thực tiễn ở nhiều nước, phương pháp này đã và đang được sử dụng. Thí nghiệm trên hạt bông được xử lý bằng khí NH3 cho thấy rất thành công, đặc biệt trong điều kiện nâng cao nhiệt độ và áp suất. Ở nhiệt độ 121oC và 1,5 atm chỉ trong 30 phút, hạt bông có chứa 317ppb và 545ppb aflatoxin B1 đã giảm xuống còn 1 và 3ppb. Để thuận tiện cho việc ứng dụng trong thực tiễn, những thí nghiệm trong điều kiện bình thường đã được áp dụng. Nếu hạt bông đựng trong các túi polyethylen kín chứa 2% khí NH3 ở 43oC, hàm lượng độc tố có thể giảm từ 800ppb còn 200ppb. Ở điều kiện bình thường và áp lực bình thường, tác dụng của NH3 phân hủy aflatoxin cần kéo dài tới 15 ngày. Nếu hàm lượng nước của vật liệu thấp (7,5%), tác dụng của NH3 sẽ kém, vì vậy cần nâng độ ẩm cơ chất lên 15; 17 hoặc 20% để đạt hiệu quả tốt hơn. Price (1982) đã xử lý 50 tấn hạt bông có độ ẩm bằng 17%, nhiễm 400-7000ppb aflatoxin B1, đựng trong các túi nhựa chứa 1,5% NH3 ở nhiệt độ và áp lực bình thường, thời gian xử lý kéo dài 21 ngày. Kết quả phân tích mẫu sau khi xử lý cho thấy chỉ còn 20ppb aflatoxin B1 được xác định. Các nghiên cứu trên lạc và ngô cũng cho kết quả rất tốt. Cheelkowski (1981) đã thử nghiệm trên lạc chứa lượng aflatoxin bằng 1842ppb được tiếp xúc với 2% khí NH3 ở nhiệt độ 43°C trong 5 tuần lễ, kết quả hầu như 100% aflatoxin bị phân hủy. Cũng theo tác giả trên, nếu nhiệt độ bên ngoài khoảng 30°C thì trong 11 tuần, lượng aflatoxin có trong lạc có thể giảm tới 95%. Xử lý ngô hạt bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5-1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuồng còn 10ppb. Tuy nhiên để có hiệu quả xử lý nhanh hơn và tiết kiệm hơn, phương pháp bơm khí luân chuyển (Recycle -Techniques) đã được sử dụng nhằm mục đích tăng tiếp xúc của khí NH3 với nguyên liệu xử lý. Kết quả thí nghiệm như sau: nếu trong 14 ngày tiếp xúc, độ ẩm ngô hạt là 17,5% và nhiệt độ môi trường 25°C, độc tố trong ngô bị phân giải còn 10ppb từ 1000ppb ban đầu. Nhiều tác giả khác cũng khẳng định, nếu ngô bị nhiễm aflatoxin, đựng trong các túi chất dẻo chứa từ 1-1,5% khí NH3 và để qua mùa đông chắc chắn sẽ có tác dụng tốt. 50 Việc áp dụng khí NH3 để xử lý khối lượng ngô lớn cũng đạt được những hiệu quả tốt. Brekke (1977) đã xử lý 29 tấn ngô bị nhiễm tới 750ppb aflatoxin bằng 1,5% NH3 theo phương pháp Recycling trong 13 ngày đã làm giảm lượng aflatoxin xuống còn 7ppb. Guthrie (1979) đã dùng phương pháp thổi khí NH3 qua các túi đựng 380 tấn ngô bị nhiễm aflatoxin hàm lượng 272ppb trong 48 giờ. Kết quả hàm lượng aflatoxin chỉ còn 29ppb. * Tính an toàn và ảnh hưởng của khí NH3 đến giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu được xử lý. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, xử lý nguyên liệu nhiễm aflatoxin bằng khí NH3 hoàn toàn không gây độc hại cho động vật thí nghiệm nuôi bằng thức ăn chế tạo từ nguyên liệu đó. Ngô nhiễm 1600ppb aflatoxin được xử lý bằng khí NH3 đã không gây chết vịt và phôi trứng gà. Nếu đem ngô cho lợn ăn, không phát hiện thấy sự biến đổi bệnh lý ở gan. Những thí nghiệm trên gà cũng không thấy hệ thống miễn dịch bị ảnh hưởng do ăn thức ăn nêu trên. Bằng chứng còn được ghi nhận ở chuột và hoạt độ men photphataza kiềm không thay đổi. Bằng phương pháp phóng xạ đánh dấu cacbon (C14) cũng nhận thấy rất ít sự kết hợp giữa aflatoxin B1 với phân tử ADN trong tế bào gan gà được ăn thức ăn qua xử lý này. Cũng như các thí nghiệm trên, kết quả là hàm lượng aflatoxin M1 trong sữa bò rất thấp. Kết quả nghiên cứu đặc tính của các chất phân giải từ aflatoxin B1 trong ngô cũng cho thấy chỉ những trường hợp hàm lượng độc tố ban đầu quá cao (hàng nghìnppb) mới gây nguy cho phôi trứng. Các hàm lượng toxin thấp (vài chụcppb) đã không thể hiện độc tính trên động vật thí nghiệm ăn thức ăn qua xử lý. Khí NH3 cũng làm thay đổi mùi vị và màu sắc của hạt, giảm hàm lượng cystin trong hạt. Nhưng vẫn có thể khắc phục bằng cách bổ sung thêm methionin vào khẩu phần thức ăn. d) Phương pháp sử dụng formaldehyd, bisunfit và axit Formaldehyd, bisufit và axit cũng có thể phân giải được aflatoxin. Hàm lượng aflatoxin trong bột lạc được tiếp xúc với 2% formaldehyd ở 100-200°C đã hoàn toàn giảm. Tác dụng phân giải độc tố của formaldehyd còn mạnh hơn nếu kết hợp với hydroxit canxi Ca(OH)2. Tuy nhiên, formaldehyd có tính độc hại đối với động vật nên người ta ít sử dụng. Doyle (1978) đã thí nghiệm loại bỏ aflatoxin trong mẫu phân tích bằng dung dịch sunphit kali (K2SO3) 0,05M (tương đương với 3000 mg/kg SO2) ở nhiệt độ 25°C và pH bằng 5,5. Kết quả 50% aflatoxin B1 bị phân hủy trong thời gian 127-163 giờ. Nếu nâng nhiệt độ lên thì khả năng phân giải độc tố sẽ mạnh hơn. Aflatoxin B1 trong ngô cũng bị phân hủy bởi NaHSO3, trong 24 giờ ở nhiệt độ 24oC. Ngoài ra, cũng có thể dùng bisunfit để xử lý aflatoxin trong sữa. Khả năng phân hủy aflatoxin B1 của bisunfit là do phá vỡ vòng lactam, còn ảnh hưởng của bisunfit và formaldehyd hạn chế độc hại aflatoxin đối với động vật thí nghiệm vẫn chưa được phát hiện. 51 Các axit có tác dụng biến đổi aflatoxin B1, và G1 thành aflatoxin B2a và G2a. Sự chuyển biến trên còn phụ thuộc vào độ pH và nhiệt độ dung dịch. Nếu pH bằng 3 và nhiệt độ dung dịch là 40°C thì quá trình trên xảy ra trong 214 giờ và làm biến đổi 95% aflatoxin B1. Người ta cũng chứng minh được aflatoxin B2a và G2a rất ít độc đối với các động vật thí nghiệm như vịt và phôi gà so với aflatoxin B1. 2.5.3. Phương pháp sinh học Các loài nấm men, mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn đã được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin. Ciegler (1996) nhận thấy Flavobacterium aurantiacum có thể phân hủy hoàn toàn aflatoxin có trong mẫu phân tích. Chủng này còn được sử dụng để loại bỏ aflatoxin M1, trong sữa, bơ, lạc, ngô. Các nguyên liệu này sử dụng làm thức ăn cho vịt đảm bảo an toàn. Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin G1. Rhizopus arrhizus có thể làm giảm chức năng ketone trong vòng cyclopentan của aflatoxin B1 tạo thành chất ít độc hơn và xác định bằng phương pháp đánh dấu nguyên tử (C14). Aspergillus parasiticus cũng có thể tác động lên aflatoxin qua hệ thống men của sợi nấm. Tuy nhiên, tác dụng này có sự phụ thuộc vào chủng loại nấm, nhiệt độ, độ pH và hàm lượng aflatoxin trong môi trường. Corynebacterium rubrum và Aspergillus niger chuyển hóa aflatoxin B1 thành aflatoxin Ro. Tetrahydema pyriformis làm giảm 58% aflatoxin B1 trong thời gian nuôi cấy 24 giờ và 67% trong 48 giờ. Hiện nay, đã chọn được một số dạng nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng hạn chế ảnh hưởng xấu của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Đã có một số chế phẩm được sản xuất từ chủng này như chế phẩm Yea-sac của hãng Agritech Sài Gòn (Bayer). Bộ môn Vệ sinh thú y - Viện Thú y quốc gia cũng sử dụng một số dạng nấm men dưới dạng bào tử sống bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, rất thuận tiện cho sử dụng. Các chế phẩm này không những hạn chế được tác dụng xấu của aflatoxin mà còn giúp tăng trọng và giảm bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi. Những chế phẩm sinh học rất đáng được quan tâm sử dụng vì giá thành rẻ, sử dụng thuận tiện, có lợi cho sản xuất, tạo ra thực phẩm sạch, bảo đảm sức khỏe và quyền lợi cho người tiêu dùng. 2.6. Sử dụng thức ăn chăn nuôi bị nhiễm aflatoxin 2.6.1. Hàm lượng aflatoxin tối đa trong thức ăn được sử dụng cho chăn nuôi Các tổ chức quốc tế như: Tổ chức Nông nghiệp và thực phẩm thế giới (FAO), Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khối thị trường chung châu Âu (EU), các nước trên phạm vi 52 thế giới đều đưa ra những giới hạn cho phép sự có mặt của aflatoxin trong lương thực, thực phẩm dùng cho người và gia súc. 2.6.1.1. Một số căn cứ và phương pháp để tạo lập hàm lượng giới hạn tối đa (hay giới hạn an toàn - MED) Người ta quan tâm đến nhiễm độc aflatoxin trong chăn nuôi không chỉ vì aflatoxin làm thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi đơn thuần mà còn do sự tồn dư của chất độc này trong sản phẩm vật nuôi, đặc biệt được chú ý đối với bò sữa. Nếu trong sữa có aflatoxin thì rất nguy hại cho trẻ em vì cơ thể chưa trưởng thành, kể cả gia súc non và trẻ em đều rất mẫn cảm với aflatoxin. Người ta nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng aflatoxin có trong thức ăn và hàm lượng aflatoxin trong sữa bò và lợn cho thấy, nếu trong thức ăn có 100ppb aflatoxin B1 thì trong sữa bò có 1,5ppb tồn dư; trong sữa lợn mẹ còn 8ppb. Qua nhiều thí nghiệm và các kết quả phân tích khác nhau, người ta đã đưa ra được tỷ lệ là 100:1 (1%) giữa hàm lượng aflatoxin trong thức ăn và trong sữa. Nhiều tác giả ở các nước khác nhau cũng đã nghiên cứu mối tương quan này trên các tổ chức như: gan, thận, thịt, trứng... của vật nuôi và đưa ra kết quả tỷ lệ: đó là 14.000:1 đối với thịt; 2200:1 đối với trứng; 1200:1 với gan gà; 800:1 với gan lợn và 300:1 với sữa bò. Tuy nhiên họ cũng kết luận rằng tỷ lệ trên không phải là một hằng số bởi vì sự hấp thu và thải trừ chất độc còn phụ thuộc vào cá thể con vật nuôi. Để đảm bảo được an toàn cho vật nuôi và sức khỏe người tiêu dùng, các nhà khoa học đã tìm cách xác định giới hạn an toàn hay liều an toàn tối thiểu viết tắt theo tiếng anh là: MED (Minimum Effective Dose). Nếu nghiên cứu liều này trên gà thì phải tới 2500ppb trong thức ăn mới gây chết ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Như vậy giới hạn an toàn phải nhỏ hơn 2500ppb. Điều này đã đặt ra những nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của aflatoxin tới các chức năng sinh lý và sinh hoá của vật nuôi. Ngay cả ở liều < 625ppb thì vẫn ảnh hưởng đến hội chứng xanh tím và chảy máu ở cơ, sự giảm hàm lượng men lipaza tuyến tụy, tăng thời gian đông máu, do đó việc thiết lập giới hạn cần phải được nghiên cứu ở mức thấp hơn. Sáu liều khác nhau dưới 625ppb aflatoxin B1 đã được lựa chọn và rút ra hai liều là 200 và 350ppb aflatoxin B1 để nghiên cứu đánh giá. Các nhà khoa học đã rút ra mối quan hệ giữa liều lượng có tác dụng và sự biến đổi sinh hóa sinh lý là tỷ lệ 10:1. Như vậy để đảm bảo an toàn về chức năng sinh lý sinh hóa thì hàm lượng đó thực chất là từ 20-35ppb. Tuy nhiên, nếu sử dụng thuật toán thống kê để nghiên cứu nhiều yếu tố cùng một lúc với hàm lượng aflatoxin ở các ngưỡng xác định thì thấy vẫn còn có yếu tố chưa phù hợp với sự xác định liều. Vì vậy trong mô hình nghiên cứu tiếp theo đã giảm hàm lượng từ 200-350ppb xuống còn 50-88ppb. Lý do còn là để không bị tách rời các yếu tố thống 53 kê đơn thuần khỏi yếu tố sinh học của cơ thể và ngoại cảnh của vật nuôi. Người ta phải mất tới 400 thí nghiệm để tính toán được sự giảm đi 1% năng suất thực sự của vật nuôi do tác dụng của aflatoxin. Nếu chỉ giảm đi 1% năng suất chăn nuôi do tác động của aflatoxin thì hàng năm nước Mỹ có thể thiệt hại tới hàng trăm triệu đôla trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm. Như vậy làm thế nào để tránh được thiệt hại trong chăn nuôi khi đề ra những hàm lượng cho phép aflatoxin có trong thức ăn, mà trong thực tế không thể loại bỏ hoàn toàn chất độc này. Thực sự nếu chỉ nghiên cứu trong phòng thí nghiệm hoàn toàn không đáp ứng được đòi hỏi của thực tế. Mẫu thí nghiệm đủ lớn mới phù hợp với thực tế sản xuất, khi đó phải có tới hàng nghìn gà cho một lô thí nghiệm. Và nếu có thực hiện được thì chắc chắn giới hạn đề ra phải nhỏ tới mức < 1ppb. Do đó, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hàng vạn gà ở tổ hợp chăn nuôi khác nhau nhưng có cùng điều kiện chuồng trại, công thức thức ăn, giống gà chỉ khác nhau về hàm lượng aflatoxin trong thức ăn. Họ rút ra kết luận là nếu như thức ăn có chứa 6ppb aflatoxin B1 và tần suất nhiễm 18% được coi như là giới hạn an toàn và thức ăn được đánh giá là tốt. Nếu hàm lượng đó là 15ppb và tần suất nhiễm là 31% thì xem như không an toàn, thức ăn kém. Kết hợp nhiều yếu tố trong nghiên cứu phòng thí nghiệm, các yếu tố sinh học cơ thể vật nuôi, người ta đi đến đề xuất một giới hạn MED là 10ppb aflatoxin B1, đối với thức ăn của gia cầm và cũng như vậy người ta đề xuất giới hạn chất độc này cho lợn, bò và một số vật nuôi khác. Tuy nhiên cũng không thể có giới hạn nào tuyệt đối an toàn vì còn phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố môi trường và các stress khác. 2.6.1.2. Quy định về hàm lượng aflatoxin tối đa trong thức ăn chăn nuôi * Quy định của một số nước trên thế giới. Quy định về hàm lượng aflatoxin tối đa có trong thức ăn chăn nuôi của Áo là 50ppb, của khối EEC bao gồm Bỉ, Đan Mạch, Đức, Ailen, Ý, Lucxămbua, Hà Lan, Anh, Hy Lạp là 50ppb trong thức ăn hỗn hợp cho bò thịt, lợn, gia cầm, 10ppb cho bò sữa, bê non, cừu non, trong thức ăn bổ sung cho bò sữa là 20ppb, của Ba Lan là từ 200ppb đối với tất cả các thức ăn chăn nuôi, tùy thuộc vào đối tượng vật nuôi. Hàm lượng aflatoxin tối đa trong lạc, khô dầu lạc dùng làm thức ăn chăn nuôi của Ấn Độ là 1000ppb, của Nhật Bản cũng là 1000ppb nhưng có lưu ý là không sử dụng trong thức ăn cho gà, bê, lợn, không dùng quá 2% trong thức ăn cho bò sữa và không quá 4% trong thức ăn cho các loại gia súc khác. Đối với thực phẩm cho người, các nước thường quy định hàm lượng tối đa aflatoxin là 10ppb cho tất cả các loại thực phẩm và 20ppb cho lạc và sản phẩm từ lạc. 54 * Quy định của Việt Nam Quy định tạm thời của Việt Nam về hàm lượng aflatoxin tối đa trong nguyên liệu thức ăn và thức ăn hỗn hợp dùng cho chăn nuôi xem tại bảng 2.5. Bảng 2.5. Quy định tạm thời về hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam Nguyên liệu Lượng aflatoxin B1 tối đa (ppb) Tổng số aflatoxin B1 + B2 + G1 + G2 (ppb) Khô dầu lạc nhân Khô dầu lạc cả vỏ Ngô hạt Sắn khô Khô đậu tương Đậu tương Cám gạo Bột cá, bột xương Thức ăn gà con (từ 1 - 21 ngày tuổi) Nhóm còn lại Thức ăn vịt con (từ 1 - 21 ngày tuổi) Nhóm còn lại Thức ăn lợn con (từ 1 - 60 ngày tuổi) Nhóm còn lại Bò nuôi lấy sữa 250 100 100 50 100 50 50 10 10 30 5 10 20 100 20 500 250 150 100 200 100 100 20 30 50 10 20 50 200 50 Nguồn tài liệu: Vụ KHKT và CLSP bộ nông nghiệp và PTNT 2.6.2. Những điều cần chú ý khi sử dụng thức ăn nhiễm aflatoxin Thức ăn chăn nuôi không chỉ có riêng độc tố aflatoxin của nấm mốc A. flavus tiết ra mà còn có các độc tố của các nấm mốc khác như A.ochraceus, Fusarium sp., penicillinum sp. Độc tố của các nấm mốc này cũng rất nguy hiểm đối với vật nuôi. Tuy nhiên, cũng không nên quá sợ hãi về độc tố nấm mốc mà không sử dụng các nguyên liệu thức ăn đã nhiễm nấm mốc. Để gia súc không bị độc và không giảm năng suất chăn nuôi, khi sử dụng nguyên liệu có chứa độc tố aflatoxin cần chú ý những điểm sau: 55 * Loại gia súc, gia cầm Các loại gia súc gia cầm khác nhau có sự mẫn cảm với aflatoxin khác nhau. Vì thế có thể sử dụng thức ăn cho các loại gia súc ít mẫn cảm với độc tố. Ví dụ: Vịt rất mẫn cảm với aflatoxin, nhưng gà thì ít mẫn cảm hơn. Có thể sử dụng thức ăn nhiễm độc aflatoxin cao cho trâu, bò thịt, cày kéo, nhưng không được sử dụng cho trâu, bò sữa. Aflatoxin sẽ chuyển hóa thành aflatoxin M trong sữa, độc tố này rất độc hại đối với trẻ em nói riêng, con người nói chung, cũng không dùng thức ăn nhiễm aflatoxin cao cho gà và lợn. * Tuổi của gia súc, gia cầm. Cùng một loại gia súc, gia cầm nhưng ở các giai đoạn tuổi khác nhau thì sẽ mẫn cảm với aflatoxin khác nhau. Ví dụ: Lợn ở giai đoạn vỗ béo ít chịu ảnh hưởng aflatoxin hơn là lợn con. * Hàm lượng aflatoxin trong thức ăn Các thức ăn nhiễm độc nhẹ aflatoxin có thể sử dụng cho gà, lợn, còn nhiễm độc cao có thể sự dụng cho trâu, bò vỗ béo, cày kéo. Vì thế, cần xác định hàm lượng độc tố trong thức ăn để sử dụng cho phù hợp với đối tượng vật nuôi. * Pha loãng nguyên liệu bị nhiễm aflatoxin cao Nguyên liệu nhiễm aflatoxin cao, thì nên đưa vào thức ăn hỗn hợp với tỷ lệ nhỏ hơn thông thường, như vậy thức ăn sau khi phối chế sẽ trở thành bị nhiễm aflatoxin với hàm lượng thấp. Thức ăn này sẽ được sử dụng cho đối tượng gia súc, gia cầm rộng hơn. Các nghiên cứu cho thấy: Sử dụng đúng, hợp lý thức ăn nhiễm aflatoxin vẫn đạt được hiệu quả kinh tế cao vì nó không làm ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi, đồng thời còn làm giảm chi phí thức ăn (vì thức ăn nhiễm aflatoxin có giá rẻ hơn thức ăn không bị nhiễm aflatoxin). 2.7. Một số chế phẩm chống aflatoxin 2.7.1. Một số chế phẩm trong thương mại Hiện tại trên thị trường Việt Nam, nhiều hãng sản xuất thuốc thú y và các chế phẩm sinh học đã giới thiệu và có bán các chế phẩm chống aflatoxin và mycotoxin khác nhau, có thể thấy một số chế phẩm như sau: * Biodone Biodone là sản phẩm của ISIA pacific Pte LTD. Theo giới thiệu của hãng sản xuất thì Biodone không hòa tan trong nước, dạng bột màu trắng; trọng lượng phân tử >1.000.000. 56 Cơ chế hấp phụ mycotoxin hay aflatoxin dựa vào khả năng gắn kết của aflatoxin lên bề mặt của các phân tử Biodone, bề mặt rất rộng giống như kiểu Kieselgur (hyflo supper eel) với tỷ lệ 20:80 mà hoạt lực gắn các mycotoxin. Mycotoxin đã được gắn vào Biodone sẽ được loại ra khỏi thức ăn qua phân. Liều sử dụng là 200 ppm (tức là 200g trên một tấn thức ăn). Có thể trực tiếp trộn vào thức ăn trước khi cho ăn, hoặc cho gia súc uống trực tiếp chế phẩm này. * Alvefix plus Alvefix plus của hãng Avetra GmbH (Hà Lan) là chế phẩm chống aflatoxin. Theo giới thiệu của hãng thì Alvefix plus bao gồm 3 thành phần: Vitamin E (10.000mg) Selenium (160mg dưới dạng Sodium selenite) Processed silicates (Silicat đã được xử lý) Alvefix plus được đưa vào thức ăn nhằm giảm tác hại của các độc tố nấm mốc. Do có hoạt tính gắn chặt với các độc tố như aflatoxin đã làm cho chúng không thể đi vào máu gây độc mà được đào thải ra ngoài theo phân. Sử dụng Alvefix plus ở hàm lượng 2kg/tấn thức ăn cho gà dò ở 4 tuần đầu, sau đó là 1kg/tấn thức ăn ở giai đoạn sau. Đối với gà đẻ trứng liều Alvefix plus là 1kg/tấn thức ăn. Đối với lợn con là 2kg/tấn thức ăn và sau đó là lkg/tấn thức ăn ở giai đoạn vỗ béo đã mang lại kết quả tốt. 2.7.2. Một số các chất vô cơ có khả năng làm giảm độc tính aflatoxin * Các chất khoáng sét (clay minerals) Các chất khoáng sét là các chất khoáng thứ cấp được hình thành do quá trình phong hóa của các loại silicat và đặc trưng bởi cấu trúc tầng lớp. Chất khoáng sét 3 lớp - montinorillonite có khả năng hấp phụ cao, có tính không đặc hiệu và phụ thuộc vào thể tích của màng hợp thủy. Các phân tử độc chất bị hút tới màng và bị cản lại. Liên kết này không phải là cố định hóa học, chỉ là một phức hợp sáng, dựa trên cầu nối H-O-H (lực hút Van-der-vaals) ở trong màng hợp thủy, nó có thể mở nếu môi trường thích hợp. Các chất khoáng sét là những chất hấp phụ rẻ tiền và có nhiều ưu điểm. Tuy nhiên chúng hút cả các vitamin và chất dinh dưỡng. * Các chất khoáng zeolit Zeolit là các chất khoáng thứ cấp có cấu trúc tinh thể. Có cả zeolit thiên nhiên và tổng hợp. Trên bề mặt của zeolit có một vật tích điện đặc biệt. Zeolit hút các phân tử 57 nước cũng như các phân tử khác. Khả năng hút độc tố aflatoxin của các zeolit phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Vì kích thước của các phân tử là một yếu tố quan trọng trong sự liên kết, loại zeolit hấp phụ aflatoxin cũng hấp phụ các phân tử dinh dưỡng có cùng kích thước. * Các chất trùng phân như polyvinylpolyrrolidone Polyvinylpolyrrolidone là một homopolymer của N-vinyl-2-pyrrolidon. Là chất bột trắng mịn, có trọng lượng phân tử cao, tan trong nước và các dung môi hữu cơ. Các chất trùng phân này có cơ chế tác dụng tương tự như khoáng clay (minerals). Các thành phần polymer hút các phân tử nước, các liên kết cầu nối hydro hình thành một màng hợp thủy. Nhờ có màng này, cùng với các phân tử nước, các thành phần phân cực khác cũng bị hấp phụ. Khả năng hấp phụ của các chất trùng phân tốt nhưng chúng có nhược điểm rất lớn là các phân tử phân cực có cùng kích thước như vitamin dễ bị hấp phụ. Những phân tử độc tố nấm không phân cực sẽ không bị hấp phụ. * Than hoạt tính Là chất bột màu đen, không mùi, không vị, không tan trong nước và nhiều dung môi khác. Than hoạt tính được đốt từ gỗ, xương động vật và các vật chất hữu cơ khác. Đặc tính quan trọng nhất của than hoạt tính là có khả năng hấp phụ rất cao. Khác với một số chất hấp phụ khác, than hoạt tính hấp phụ tất cả các phân tử mang điện tích dương và điện tích âm. Than hoạt tính có khả năng hấp phụ nhiều loại chất độc và aflatoxin. Cơ chế tác dụng của nó về bản chất là phủ một bề mặt tiểu phần và làm dễ quá trình đào thải chất độc qua phân. 2.7.3. Chế phẩm hóa sinh học Các chế phẩm hạn chế độc hại của aflatoxin trong cơ thể tác động theo con đường sinh hóa học thường ít gây hại cho người và động vật. Một trong các chế phẩm được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi thú y hiện nay là Mycofix plus. Chế phẩm hóa sinh học Mycofix plus do hãng Biomin (Austria) sản xuất được bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm. Theo giới thiệu của hãng sản xuất thì Mycofix plus có tác dụng làm vô hoạt các độc tố nấm mốc, trong đó có aflatoxin. Cơ chế tác dụng của Mycofix plus một mặt thông qua sự hấp phụ mycotoxin, mặt khác phá hủy cấu trúc hóa học của mycotoxin dựa trên các men có trong chế phẩm. Quá trình hấp phụ mycotoxin xảy ra trên màng hợp thủy do chất hấp phụ tạo ra. Các phân tử aflatoxin và một số mycotoxin phân cực khác bị hút tới màng, cố định trên bề mặt màng và trở nên hoàn toàn vô hoạt. Các khoảng xúc tác trên màng hợp thủy điều 58 chỉnh điện thế riêng của đa số các nhóm mycotoxin tạo nên cách hấp phụ đặc biệt của Mycofix plus. Quá trình này bắt đầu từ khoang miệng khi con vật tiết nước bọt (hoặc ngay trong thức ăn trước khi được tiêu hóa), tiếp tục ở dạ dày và ruột. Các độc tố bị cố định bởi Mycofix plus không hấp thu được vào máu. Hợp chất Mycofix plus và mycotoxin được hấp phụ cùng thải ra ngoài theo phân. Zearalenose Detoxified form Trichothecenes form Detoxified Hình 2.2 : Sự phân hủy các độc tố nấm mốc nhờ men Epoxydaza và Lactonaza Các mycotoxin không phân cực hoàn toàn bị các men có trong Mycofix plus phá hủy. Men epoxydaza phá cấu trúc của nhóm chức năng 12, 13 - epoxy (phần độc nhất của Trichothecenes). Robert Glavits (1992) đã thử tác dụng của Mycofix plus làm vô hoạt aflatoxin B1, với các liều lượng 400 và 1000ppb aflatoxin, 2kg Mycofix plus/1 tấn thức ăn bổ sung trong thức ăn của gà công nghiệp. Kết quả cho thấy: Các lô gà cho ăn các thức ăn có bổ sung aflatoxin B1, đều có hiện tượng giảm tăng trọng, tăng mức tiêu tốn thức ăn. Về biến đổi bệnh lý có các hiện tượng như: Gan nhợt màu, thoái hóa mỡ ở gan, tăng sinh ống mật và viêm túi mật. Tác dụng của Mycofix plus làm hạn chế hiện tượng này thể hiện ở các lô gà cho ăn thức ăn bổ sung đồng thời aflatoxin và Mycofix plus ở các liều lượng trên. Kiểm tra trong phòng thí nghiệm và trên đại trà cho thấy: Mycofix plus có tác dụng làm giảm ảnh hưởng xấu của aflatoxin đối với gà thịt cũng như gà đẻ, làm cho gia cầm không có dấu hiệu bệnh lý ở gan, thận và túi mật, gà khỏe hơn và tăng sức đề kháng với bệnh. Với hàm lượng < 2kg/tấn thức ăn, Mycofix plus chỉ có tác dụng tốt ở liều aflatoxin B1 thấp (200-400ppb). Nếu hàm lượng aflatoxin B1 < 100ppb thì lượng 59 Mycofix plus chỉ cần < 1kg/tấn thức ăn. Mycofix plus có thể được đưa vào sử dụng trong chăn nuôi nhằm phòng chống độc tố nấm mốc. Tác dụng của 1,2 - dithiole - 3 - thione (DTT), một chất cảm ứng của enzym đơn chức năng đến quá trình hình thành các liên kết aflatoxin - ADN trong gan chuột được Egner P.A. và cộng sự nghiên cứu năm 1990. Các liên kết ADN chính như aflatoxin B - N7 Guanin thải theo nước tiểu chuột được cho uống DTT giảm đi rất đáng kể. Từ đó rút ra kết luật DTT là chất có thể chống lại ung thư do aflatoxin gây ra. Trong nhân y, chế phẩm Oltipraz được coi như một loại thuốc chống ung thư do aflatoxin gây ra. Kết quả nghiên cứu của Firozi P.F. và cộng sự (1996) về tác dụng của chế phẩm Curcumin đến hệ thống men Cytochrom P450 tham gia xúc tác quá trình hoạt hóa aflatoxin B1, cho thấy: Curcumin ức chế 50% sự hình thành các mối liên kết aflatoxin B1 - ADN. Nó có thể hạn chế quá trình ung thư do các chất hóa học thông qua việc điều chỉnh chức năng của cytochrom P450. Phạm Khắc Hiến, Lê Thị Ngọc Diệp (1999) đã nghiên cứu tác dụng của việc hạn chế độc hại do aflatoxin trên gà và cho biết: Cao Actiso 10%, liều lượng 6 ml/lít nước uống của gà có tác dụng làm giảm rõ rệt tình trạng trúng độc do aflatoxin B1 hàm lượng 200 và 500ppb gây ra. Trong, thịt và gan gà nhiễm độc có tác động của Actiso đã không hoặc chỉ phát hiện thấy lượng aflatoxin B1, tồn dư nhỏ hơn rất nhiều so với mức cho phép trong thực phẩm. 60 Chương III ĐỘC TỐ HCN TRONG SẢN PHẨM SẮN Sắn được trồng nhiều nơi thuộc Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ; diện tích trồng hàng năm khoảng 3,9 triệu ha, sản lượng khoảng 160 triệu tấn. Sản phẩm sắn (củ, lá) được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm khá phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, kể cả một số nước không trồng sắn ở Châu Âu. Bột củ sắn được phối hợp vào thức ăn hỗn hợp với tỷ lệ khá cao, từ 20% đến 30% trong thức ăn cho bò, 30% đến 50% trong thức ăn cho lợn và từ 20% đến 30% trong thức ăn cho gia cầm. Trong sắn có axit cyanhydric, đó là một chất gây độc đối với gia súc, gia cầm và nó là yếu tố hạn chế cho việc sử dụng sắn trong chăn nuôi. Chính vì vậy, sắn được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Các nghiên cứu tập trung vào cấu tạo hóa học của độc tố, cơ chế gây độc, phương pháp loại bỏ độc tố trong sản phẩm sắn và mức độ sử dụng sắn có hiệu quả trong thức ăn hỗn hợp của gia súc, gia cầm. 3.1. Giới thiệu về độc tố HCN trong cây sắn 3.1.1. Quá trình hình thành và cơ chế gây độc của axit cyanhydric Quá trình hình thành: Axit cyanhydric không tồn tại tự do trong cây sắn mà nó nằm trong Cyanogen Glucoside (Linamaroside và Lotostraloside); khi thủy phân Cyanogen glucoside sẽ được Linamaroside, chiếm khoảng trên dưới 90%, và Lotostraloside, chiếm khoảng trên dưới 10% (Gomez, 1991; Nartey, 1978). Trong cây, chất Linamaroside được tổng hợp từ Valin, còn chất Lotostraloside được tổng hợp từ Izoleusin (Nartey, 1978). Quá trình thủy phân Cyanogen Glucoside (Linamaroside và Lotostraloside) để tạo thành HCN trong cây sắn xảy ra theo hai bước (Fuller, 1987; Maner, 1987; Gome, 1983). Cụ thể là: Phân giải Cyanogen Glucoside thành glucose và bộ phận aglicon dưới tác dụng của enzim glucosidaza hoặc Linamariaza. R của linamarosid = CH3 (bộ phận aglicon) Hình 3.1. Quá trình phân giải Cyanogen glucosid 61 Phân giải Aglicon dưới tác dụng của enzim đặc hiệu hoặc nước thành axit cyanhydric và axeton (nếu phân giải Linamaroside thì cho axeton, còn Lotostraloside thì cho metiethixeton). Hình 3.2: Quá trình phân giải Aglicon Axit cyanhydric có cấu tạo tinh thể, hình kim, không màu, không hòa tan trong cồn, ête, tan ít trong axeton nhưng dễ bay hơi, dễ hòa tan trong nước (Đinh Văn Lữ, 1972; Silvestre và Arraudeau (tài liệu dịch 1990); Holleman và cs., 1989). * Cơ chế gây độc Cơ chế gây độc của axit cyanhydric đối với gia súc, gia cầm đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhưng kết luận về vấn đề này còn có nhiều ý kiến khác nhau. Tuy nhiên, cơ chế chính gây độc được nhiều ý kiến đồng thuận hơn cả. Đối với trường hợp ngộ độc cấp tính thì do gốc Cyanua (CN-) kết hợp với hemoglobin của hồng cầu để tạo thành phức chất Cyanohemoglobin. Chất này không có khả năng vận chuyển oxy trong máu làm cho mô bào và não bị thiếu oxy. Mặt khác, axit cyanhydric cũng có dạng kết hợp với ion Cu+2 được giải phóng do sự oxy hóa các tế bào crome, dạng kết hợp này lại đóng vai trò như một chất oxy hóa các enzim và làm ức chế vận chuyển các electron trong tế bào, gây ra sự thiếu hụt oxy trong toàn bộ các mô bào của cơ thể động vật. Những tác nhân trên đã gây suy nhược thần kinh ở các trung tâm tủy sống (medullar centers) từ đó dẫn đến tê liệt toàn bộ hệ thống thần kinh và làm cho động vật bị chết. Vì vậy, axit cyanhydric được xếp vào loại chất độc nguyên sinh chất (protoplasma poison) mạnh nhất đối với tất cả các dạng cơ thể sống (Oke, 1969; Nambisan, 1985; Maner và Pond, 1987). Khi động vật ăn liên tục trong thời gian dài thức ăn có chứa axit cyanhydric với hàm lượng nhỏ; thì axit cyanhydric không gây tử vong nhưng gây ảnh hưởng xấu đến hấp thu và sử dụng các chất lấy từ thức ăn như methionin, cystin, vitamin B12, sắt, đồng, iod... làm cho cơ thể thiếu hụt các chất này ngay cả khi khẩu phần ăn đầy đủ hoặc dư thừa các chất đó. Vì vậy, động vật sẽ sinh trưởng chậm, hiệu quả sử dụng thức ăn thấp, dễ mắc bệnh, lâu dài sẽ dẫn đến tử vong. Trường hợp này gọi là ngộ độc mãn tính (Oke, 1969; Maner và Pond, 1987). 3.1.2. Triệu chứng ngộ độc HCN và liều lượng HCN gây độc ở động vật Triệu chứng ngộ độc cấp tính axit cyanhydric ở động vật là: Phản xạ không bình thường (điên khùng) hoặc là mất dần phản xạ, giảm tính thèm ăn, gầy yếu, sinh trưởng, 62 sinh sản giảm, dễ mắc bệnh. Nhìn chung, các triệu chứng ngộ độc ở thể mãn tính HCN rất khó phân biệt với triệu chứng gia súc bị ngộ độc các chất khác hoặc bị mắc bệnh nếu như không biết rõ về việc gia súc được cho ăn các sản phẩm sắn kéo dài (Oke, 1969; Mener và Pond, 1987). Theo Silvestre và Arraudeau (tài liệu dịch, 1990) và Arraudeau, 1990; Gomez, 1991; Nartey, 1978 thì liều lượng HCN gây độc đối với động vật vào khoảng 2,5 mg/1kg thể trọng. Tuy nhiên, các loài động vật khác nhau, các giống khác nhau, các cá thể khác nhau và tuổi khác nhau sẽ có khả năng chống chịu với HCN khác nhau. Có những thí nghiệm trên gia súc cho thấy ở liều lượng 5 - 7 mg HCN, thậm chí trên 10 mg HCN/1kg thể trọng vẫn không thấy gia súc bị ngộ độc. Đối với người lớn, liều lượng gây độc là 20mg HCN/1kg thể trọng, liều lượng gây chết là 50mg HCN/1kg thể trọng. 3.1.3. Axit cyanhydric trong cây sắn và sản phẩm sắn Hàm lượng axit cyanhydric trong sắn phụ thuộc vào giống sắn, các bộ phận của cây sắn, tuổi các bộ phận của cây sắn và mùa vụ thu hoạch. * Giống sắn Một số giống sắn có hàm lượng HCN trong củ thấp.Ví dụ trong thịt của củ sắn chuối đỏ, hàm lượng HCN là 3,04mg%. Nhưng một số giống thì hàm lượng HCN lại rất cao. Ví dụ hàm lượng HCN trong thịt củ của sắn dù là 8,27mg%. Hàm lượng HCN trong lá sắn cũng tùy thuộc theo giống, một số giống sắn như Ba Trăng, Nếp Hồng Hà, KM140-1 chỉ có từ 600-900mg HCN/1kg vật chất khô của lá, nhưng một số giống khác như KM 95; KM140-2, KM108-2 thì có tới 1500-1700mg HCN/1kg vật chất khô (VCK) của lá. Căn cứ vào hàm lượng HCN trong củ sắn, người ta chia các giống sắn thành 2 nhóm: nhóm sắn ngọt và nhóm sắn đắng. Nhóm sắn ngọt bao gồm các giống sắn có hàm lượng HCN trong củ nhỏ hơn 80 ppm trong 100 gram chất tươi; theo sự phân loại khác thì sắn ngọt có hàm lượng HCN nhỏ hơn 0,01% trong chất tươi. Nhóm sắn đắng là các giống sắn có hàm lượng HCN ≥ 80 ppm trong 100 gram củ sắn tươi và theo sự phân loại khác là có hàm lượng HCN ≥ 0,01% trong củ tươi (Sinha và Nair, 1968 trích từ Silvestre và cộng sự (tài liệu dịch, 1990) Nartey, 1978; Fuller, 1987; Goll, 1981). Các bộ phận của cây sắn Axit cyanhydric phân bố không đều trên cây sắn, nó tập trung chủ yếu ở bộ phận dưới mặt đất. Hàm lượng axit cyanhydric ở các bộ phận dưới mặt đất chiếm trên dưới 70% tổng lượng HCN của cây, trong đó, khoảng 9% ở trong gốc già và khoảng 60% ở trong rễ, củ so với tổng lượng HCN của cây. Hàm lượng axit cyanhydric ở các bộ phận trên mặt đất chiếm khoảng trên dưới 29% tổng lượng axit cyanhydric của cây, trong đó lá chiếm khoảng trên dưới 2%, trong thân chiếm khoảng trên dưới 27% tổng lượng HCN của cây sắn. 63 Trong một bộ phận của cây sắn, hàm lượng HCN phân bố cũng không đồng đều. Ví dụ trong củ sắn, hàm lượng HCN trong vỏ gỗ là 7,6mg%, vỏ thịt 21,0mg%, hai đầu củ 16,2mg%, thịt sắn 9,72mg% và lõi sắn 15,8mg%. Trong lá sắn thì hàm lượng HCN ở cuống lá và gân lá ít hơn so với phiến lá. Trong thân cây sắn thì hàm lượng HCN ở lõi bấc ít hơn ở lớp gỗ và ở lớp gỗ ít hơn ở lớp vỏ cây. Hàm lượng HCN còn biến động theo tuổi của từng bộ phận của cây. Ví dụ đối với lá sắn thì hàm lượng HCN trong 1kg chất tươi của búp sắn là từ 330 - 790 ppm, của lá bánh tẻ là từ 340 - 1040 ppm, của lá già là từ 210 - 730 ppm. Hàm lượng HCN trong lá và trong thịt củ sắn có mối tương quan thuận với R = 0,55. Như vậy các giống sắn có hàm lượng HCN trong lá càng cao thì cũng có hàm lượng HCN trong củ càng cao và ngược lại (Fuller, 1987; Mener, 1987; Goll, 1981). 3.2. Phương pháp hạn chế và loại bỏ HCN trong sản phẩm sắn 3.2.1. Nguyên lý cơ bản về việc loại bỏ độc tố trong sản phẩm sắn Các phương pháp chế biến để loại bỏ độc tố trong sắn dựa trên ba nguyên lý cơ bản dưới đây: Loại bỏ trực tiếp Cyanogen glucosid bằng cách hòa tan trong nước. Vì Cyanogen glucosid sản sinh ra HCN, chất này bị loại bỏ thì HCN cũng bị loại bỏ. Làm phân giải Cyanogen glucosid thành xeton và HCN, sau đó dùng nhiệt làm bốc hơi HCN hoặc dùng nước làm rửa trôi HCN. Làm phá hủy hoặc ức chế enzim Linamariaza và glucosidaza. Các men này không hoạt động thì Cyanogen glucosid không thể phân giải thành xeton và HCN. Dựa vào các nguyên lý trên, trong thực tế người ta đã sử dụng các biện pháp dưới đây để hạn chế và loại bỏ HCN trong sản phẩm sắn. 3.2.2. Một số phương pháp chế biến củ sắn Các phương pháp chế biến sắn củ tạm thời được chia thành 3 loại: Sử dụng nhiệt, sử dụng nước và lên men. Sự phân loại này chỉ là tương đối vì có những phương pháp vừa sử dụng nhiệt vừa sử dụng nước hoặc ngược lại. 3.2.2.1. Các phương pháp chế biến sắn dựa vào sử dụng nhiệt làm khô trực tiếp * Chế biến và bảo quản sắn lát phơi khô hoặc sấy khô Sắn sau khi thu hoạch được rửa sạch, bóc vỏ hoặc không. Thái lát thủ công bằng tay hoặc bằng máy. Sau đó sắn được phơi trên sàn, nong, nia, cót... hoặc tốt nhất là trên sân xi măng. Sau khi phơi khô sắn phải để nguội rồi mới đem cất trữ. * Chế biến sắn khô - nghiền bột Người ta để cả củ hay thái lát rồi phơi khô hoặc sấy khô trong các lò sấy thủ công hay lò sấy điện. Sau khi sắn khô thì nghiền thành bột và cất trữ. 64 * Chế biến sắn viên Đây là phương pháp của Thái Lan. Sắn được rửa sạch rồi nghiền nhỏ sau đó được ép đùn qua hệ thống trục ngang. Trong quá trình ép sắn bị mất nước và được ép thành các viên dài từ 1-2cm sau đó sấy khô và bảo quản khi độ ẩm nguyên liệu là 13%. 3.2.2.2. Các phương pháp chế biến sử dụng nước * Phương pháp ngâm củ sắn tươi để chế biến bột sắn Ở những nơi sẵn nguồn nước, có thể chế biến bột sắn bằng cách ngâm củ sắn tươi dưới nước 10 - 15 ngày đến khi củ sắn mềm. Sau đó, vớt củ đem phơi hoặc sấy khô và bảo quản nơi khô ráo. Khi sử dụng thì bóc vỏ, lấy bột bên trong. * Chế biến tinh bột từ sắn khô Củ sắn khô được cắt thành miếng và được nghiền sơ bởi lực ép liên tiếp sao cho các miếng sắn không bị nghiền quá kỹ, ngâm sắn trong nước, tách tinh bột trong sắn, sau đó phơi hoặc sấy khô tinh bột và cất trữ. * Sản xuất tinh bột sắn ướt Củ sắn phải được thu hoạch và chế biến ngay trong 24 giờ sau thu hoạch để sản xuất được tinh bột sắn có chất lượng cao nhất. Sắn được bóc vỏ, mài xát sắn thành bột nhão, lọc bột để tách bã sắn khỏi bột sắn, lắng đọng nước lọc để thu hồi tinh bột, phơi hoặc sấy tinh bột (có độ ẩm dưới 13%), bảo quản tinh bột trong chum, vại có nắp đậy kín hoặc túi nilon. * Chế biến hạt sắn Từ sắn khô được loại đi cát bụi... và được nghiền thành bột, sau đó phun nước để sản phẩm có độ ẩm khoảng 18%. Hạt sắn được chế biến bằng cách ép trong các rổ sắt có lỗ và làm tăng nhiệt độ lên 820C, do đó sắn được hồ hóa và tạo ra các hạt có khả năng kết dính tốt. Sau đó hạt được thổi gió qua để giảm độ ẩm đi 3-4%, sau đó bao gói sản phẩm. 3.2.2.3. Các phương pháp chế biến dựa vào lên men sản phẩm * Ủ chua củ sắn Sắn củ sau khi thu hoạch rửa sạch sau đó nghiền nhỏ và trộn thêm các loại thức ăn khác. Mỗi 100kg củ sắn ủ chua với 10kg cám gạo và 0,5kg muối ăn, hoặc 70kg củ sắn ủ với 30kg dây lá khoai lang và 0,5kg muối, trộn đều sau đó cho vào dụng cụ ủ (túi polietylen hoặc chum vại...). Khối ủ được nén chặt, đậy kín để tạo điều kiện yếm khí cho sự lên men. * Làm giàu protein cho nguyên liệu sắn Sắn khô được cắt nhỏ có đường kính từ 2-4mm, làm ẩm đến 45% và hấp. Sau khi hấp để nguội nguyên liệu xuống 400C, sắn được trộn với dung dịch giống (Rhizopus oryzae MUCL 28627) và 3,4g ure; 1,5g KH2PO4; 0,8g MgSO4.7H2O và 22,7g acid 65 citric tính trên 100g chất khô. Tạo cho môi trường có độ ẩm 60%, pH là 3,5 và được trải đều trên các khay có đục lỗ, đặt trong phòng kín và lên men trong 65 giờ. * Chế biến bột Mussequè Đây là phương pháp của Angola. Sắn tươi sau khi rửa sạch, thái lát và để thành đống cho lên men trong 3 tuần. Sau đó sản phẩm được nghiền và rây bằng rổ. Lượng bột ẩm sau khi thu được có thể đem phơi nắng để cất hoặc nướng, rang.... * Chế biến bột Gari Củ sắn sau khi rửa và bóc vỏ sẽ được xát thành bột và cho vào các thùng để lên men trong vòng từ 1- 3 ngày. Sau đó có thể sử dụng làm thức ăn cho người và gia súc. 3.2.3. Một số phương pháp chế biến lá sắn * Chế biến bột lá sắn Theo Dương Thanh Liêm (1998) thì bột lá sắn được chế biến như sau: Lá sắn sau khi được thu gom thì loại bỏ hết cuống lá, phơi héo tại ruộng trong một ngày cho giảm bớt nước. Sau đó tiếp tục phơi nắng trên sân hoặc đưa vào hệ thống sấy ở nhiệt độ 60- 1000C cho khô giòn. Lá sau khi khô giòn được đưa đi nghiền thành bột, trải mỏng bột lá cho bay hơi nước và HCN. Cho bột lá sắn vào bao nhưng để hở miệng túi sau 2 tuần mới đóng gói để trong thời gian này, HCN tiếp tục thoát ra ngoài. * Phơi khô thân, lá sắn non Sắn trồng dầy với mục đích để thu lá, sau trồng 3- 3,5 tháng thu cắt lứa đầu, sau đó cứ khoảng 1,5 - 2 tháng thu cắt một lần. Thân cây sắn còn non, phơi cả thân, lá sắn (để nguyên cả cây hoặc băm nhỏ trước khi phơi) khi khô thì đánh đống hoặc nghiền thành bột để dự trữ. * Chế biến cao lá sắn Lá sắn được nghiền nhỏ sau đó lọc bỏ bã và đun nước dịch lá sắn ở nhiệt độ 800C, khi thấy có váng nổi lên thì vớt lấy và loại bỏ nước, có thể cho 10 - 20 g axit citric/100 lít nước dịch lá sắn khi bắt đầu thấy váng nổi lên thì sẽ thu được sản phẩm triệt để hơn. Sản phẩm thu được có thể sử dụng trực tiếp cho gia súc gia cầm hoặc sấy khô nghiền bột để trộn vào thức ăn hỗn hợp. * Ủ chua ngọn lá sắn Theo Nguyễn Xuân Trạch (2005) thì quy trình ủ chua ngọn và thân lá sắn như sau: Ngọn lá sắn thu về cần phải đập dập phần thân cây và băm nhỏ 3 - 4cm. Cứ 100kg ngọn lá sắn cần bổ sung 5 - 6kg bột sắn hay cám gạo, cám ngô và 0,5kg muối ăn. 3.2.4. Khả năng loại bỏ HCN từ các phương pháp chế biến * Hiệu quả của phương pháp sử dụng nước Củ sắn tươi giống chuối đỏ có hàm lượng HCN là 3,30mg% chất tươi, nếu không ngâm nước, chỉ thái lát phơi khô thì hàm lượng HCN còn 0,92mg%, nếu thái lát ngâm nước lã một ngày và phơi khô thì hàm lượng HCN chỉ còn 0,85mg%, nếu thái lát ngâm 66 nước vôi 5% trong 12 giờ và phơi khô thì còn 0,44mg%. Nếu lọc thô (mài sắn nhỏ sau đó lấy tinh bột) thì hàm lượng HCN còn 0,73mg% chất tươi; nếu ngâm lọc (ngâm nước dài ngày, lọc lấy tinh bột) thì hàm lượng HCN chỉ còn 0,36mg% chất tươi. Lá sắn tươi giống KM94 có hàm lượng HCN là 1073 mg/kg VCK, nếu thái nhỏ, không ngâm nước, phơi khô thì hàm lượng HCN là 368 mg/kg VCK, còn nếu thái nhỏ, ngâm nước, phơi khô thì hàm lượng HCN chỉ còn 250 mg/kg VCK(Trần Thị Hoan và cs., 2011). Như vậy dùng nước là một phương pháp khá hữu hiệu trong việc loại bỏ Cyanogen glucosid cũng như HCN trong sản phẩm sắn. * Hiệu quả của phương pháp sử dụng nhiệt Củ sắn tươi giống sắn dù có hàm lượng HCN 11,06mg% chất tươi, thái lát (3 - 6 mm) phơi khô thì hàm lượng HCN còn 3,04mg% chất tươi, nếu thái lát (3 - 6 mm), sấy thủ công ở 70ºC thì hàm lượng HCN còn 1,72 mg%. Sử dụng nhiệt (phơi, sấy) là một trong những biện pháp hữu hiệu loại bỏ HCN trong sản phẩm sắn. * Hiệu quả của phương pháp ủ chua Củ sắn tươi giống chuối đỏ có hàm lượng HCN là 3,30mg% chất tươi, sau khi ủ xilo 4 tuần thì hàm lượng HCN còn 1,79mg% chất tươi, sau 8 tuần còn 1,62mg% chất tươi. Tương tự, củ sắn tươi giống sắn dù có hàm lượng HCN là 11,06mg% chất tươi, sau khi ủ 4 tuần, hàm lượng HCN còn 6,57mg% chất tươi, sau 8 tuần còn 6,13mg% chất tươi. Củ sắn tươi có hàm lượng HCN là 112mg/1kg chất tươi, sau khi ủ chua 120 ngày thì hàm lượng HCN chỉ còn 44mg/1kg chất tươi. Một số tài liệu khác cho biết: củ sắn tươi có hàm lượng HCN là 131,1mg/1kg chất tươi, sau 28 ngày ủ chỉ còn 25,6mg/kg chất tươi, sau 100 ngày ủ chỉ còn 8,7mg/kg chất tươi (Phạm Sỹ Tiệp, 1999; Nguyễn Thị Hoa Lý, 1999; Nguyễn Thị Lộc, 2001). Hàm lượng HCN trong sắn giống chuối đỏ là 8,76mg % chất tươi, trong sắn dù là 21,61mg % chất tươi, sau khi ủ chua thì hàm lượng HCN tương ứng là 1,50mg% chất tươi (sắn chuối đỏ) và 3,66mg% chất tươi (sắn dù). Một số tài liệu khác cho biết: Hàm lượng HCN trong lá sắn tươi từ 323 - 340mg/kg chất tươi, sau khi ủ 28 ngày, chỉ còn 68,2 - 88,4mg HCN/kg chất tươi. Hàm lượng HCN trong sắn tươi là 862,5mg/kg VCK sau khi ủ đã giảm xuống chỉ còn 32,5mg/kg VCK (Bùi Văn Chính, 1995; Nguyễn Thị Hoa Lý, 1999; Phạm Sỹ Tiệp 1999). Phương pháp ủ chua có thể loại bỏ 70% - 90% độc tố HCN trong củ và lá sắn. Đây là phương pháp dễ thực hiện, không phụ thuộc vào thời tiết, mặt khác thức ăn ủ chua còn làm tăng tính ngon miệng của vật nuôi. 3.3. Nghiên cứu, sử dụng sắn trong chăn nuôi Ngoài độc tố HCN, sản phẩm sắn (củ, lá) còn có các yếu tố hạn chế khác như: Củ sắn nghèo protein và một số axit amin thiết yếu có tỷ lệ thấp; lá sắn giàu protein nhưng 67 tỷ lệ xơ lại khá cao. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng sắn trong chăn nuôi với mục đích tìm ra mức sử dụng củ, lá sắn thích hợp, bảo đảm vật nuôi sinh trưởng, chuyển hóa thức ăn tốt, chi phí thức ăn cho một đơn vị sản phẩm thấp. Tuy các kết quả nghiên cứu không chỉ rõ ảnh hưởng của chất độc hay các yếu tố hạn chế khác của sắn đến sinh trưởng và sinh sản của gia súc, gia cầm nhưng các kết quả này rất có ý nghĩa thực tiễn, vì các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra mức độ phối hợp củ và lá sắn hợp lý vào khẩu phần ăn của vật nuôi. 3.3.1. Nghiên cứu sử dụng sắn trong chăn nuôi gia súc nhai lại Ở Ấn Độ đã sử dụng các khẩu phần cho bò thịt với 80% thân, lá sắn tươi; ở Madagasca đã sử dụng từ 20 - 30% củ sắn tươi trong khẩu phần thức ăn cho bò sữa; ở Châu Âu thức ăn hỗn hợp thường sản xuất với 20% bột sắn cho bò đực và 40% bột sắn cho bò sữa. Về sử dụng lá sắn trong chăn nuôi gia súc nhai lại đã có một số nghiên cứu như sau: Thí nghiệm hai khẩu phần cho bò sữa, khẩu phần 1 có chứa bột hạt bông, khẩu phần 2 có chứa bột lá sắn với mức 9% trong vật chất khô trong khẩu phần; kết quả cho thấy năng suất sữa của 2 lô là tương đương nhau. Nghiên cứu thay thế thức ăn hỗn hợp của dê sinh trưởng bằng bột lá sắn với các mức 25, 50, 75, và 100%; kết quả cho thấy từ mức 75% trở xuống có kết quả tăng trọng tương đương và chi phí thức ăn cho 1kg tăng trọng thấp hơn so với đối chứng (0% bột lá sắn) (Dương Tiến Khang, 2000; Warpat, 1993; Vũ Văn Tý, 2003; Ngô Tiến Dũng 2004). 3.3.2. Nghiên cứu sử dụng sắn trong chăn nuôi lợn 3.3.2.1. Nghiên cứu trên lợn thịt Nhiều tác giả đã khuyến cáo sử dụng bột sắn với tỉ lệ 30 - 50% trong khẩu phần sẽ đạt được hiệu quả kinh tế cao nhất. Nhưng cũng có thông báo cho biết bột sắn có thể dùng với tỷ lệ 60% trong khẩu phần vẫn cho tăng khối lượng 800g/ngày. Theo Serres và Tilon (1973) (trích theo Phạm Sỹ Tiệp, 1999) thì để tăng khối lượng 800g/ngày có thể dùng với khẩu phần có 75% bột sắn. Nhưng tăng khối lượng ảnh hưởng rất nhiều bởi chất lượng protein bổ sung. Tăng khối lượng đạt tối đa khi bổ sung protein có nguồn gốc động vật. Với khẩu phần có bột sắn, đậu tương và đươc bổ sung DL - methionine cũng cho kết quả tương tự. Nghiên cứu thay thế 28,5 %; 39,8%; 60% và 80% bột ngô bằng bột sắn để vỗ béo lợn thịt. Kết quả cho thấy sử dụng mức 39,8% cho tăng khối lượng cao nhất là 740g/con/ngày còn ở các mức khác thấp hơn. Nghiên cứu sử dụng khẩu phần cơ sở (lô I) gồm 50% bột sắn, 50% cám, 100 g protein thô từ cá, 1kg rau khoai lang và sử dụng khẩu phần thí nghiệm thay thế bột sắn bằng sắn ủ 60 ngày (lô II). Kết quả cho thấy tăng khối lượng lợn (g/con/ngày) lần lượt là 563 và 552 và tiêu tốn thức ăn lần lượt là 3,42 và 3,54kg/kg tăng khối lượng. Tuy lô II tiêu tốn thức ăn lớn hơn và tăng khối lượng thấp hơn đôi chút nhưng không có sự sai khác (P > 0,05). Sắn ủ nuôi lợn có hiệu quả kinh tế cao hơn bột sắn vì phương pháp chế biến này đơn giản và không phụ thuộc vào 68 điều kiện thời tiết (Từ Quang Hiển, Phạm Sỹ Tiệp, 2005. Nguyễn Khắc Khôi, 1982. Liu Jian Ping, 2000. Nguyễn Thị Hoa Lý và cs., 1999). Nghiên cứu sử dụng lá sắn ủ chua (1,6kg/con/ngày) cho lợn thịt trong 120 ngày, kết quả đã làm khả năng sinh trưởng của lợn tăng và làm cho tỷ lệ tiêu tốn thức ăn /1kg tăng khối lượng giảm 20% so với đối chứng. Nghiên cứu các mức lá sắn ủ chua trong khẩu phần ăn của lợn thịt cho thấy: Mức thay thế 10% VCK trong khẩu phần (0,25- 0,5kg lá sắn ủ/ngày) là phù hợp để tận dụng lá sắn làm thức ăn chăn nuôi (Bùi Văn Chính, 1969 - 1995. Dương Thanh Liêm và cs., 1998. Nguyen Van Lai and Rodriguez, 1988, Nguyễn Thị Hoa Lý, 2000). 3.3.2.2. Nghiên cứu trên lợn nái Một số thí nghiệm phối hợp bột củ sắn vào thức ăn hỗn hợp của lợn nái chửa và nuôi con với các mức 0%, 20%, 30% và 65% có sự cân đối về protein và năng lượng. Kết quả cho thấy: Mức quá cao (65%) đã ảnh hưởng xấu đến các chỉ tiêu sinh sản và khối lượng lợn con ở 21 ngày tuổi. Vì vậy, các nhà nghiên cứu khuyến cáo: Mức phối hợp 30% bột sắn trong khẩu phần là hợp lý (Ravindran và cộng sự, 1983; Gomez và cộng sự, 1984). Các thí nghiệm khác phối hợp bột củ sắn trong khẩu phần ăn cho lợn nái chửa và nuôi con với mức 25% đến 30%, có sự cân đối năng lượng và protein. Kết quả cho thấy các chỉ tiêu về lợn mẹ (tăng trọng, hao hụt sau đẻ) và các chỉ tiêu về lợn con (số con đẻ ra, nuôi sống đến cai sữa, khối lượng lúc cai sữa) tương đương với lô đối chứng được ăn khẩu phần không có bột sắn. Các tác giả cùng khuyến cáo tỷ lệ bột củ sắn trong khẩu phần 30% là thích hợp (Nguyễn Nghi và cộng sự, 1984; Nguyễn Khắc Khôi và công sự, 1982). Một số thí nghiệm đã phối hợp bột lá sắn vào thức ăn hỗn hợp của lợn nái chửa, nuôi con với mức 0% đến 10%. Kết quả là: Lô được ăn thức ăn có chứa 10% bột lá sắn có các chỉ tiêu cao hơn lô đối chứng. Nghiên cứu sử dụng lá sắn ủ chua ở mức 0, 10 và 20% VCK trong khẩu phần ăn của lợn nái, kết quả cho thấy số lợn con sơ sinh/lứa; khối lượng sơ sinh; khối lượng 21 ngày tuổi ở lô sử dụng 20% đều thấp hơn các lô còn lại. Các nhà nghiên cứu cho biết thức ăn hỗn hợp có bột lá sắn đã làm giảm tỷ lệ thai chết lưu trong bụng mẹ (Dương Thanh Liêm và cộng sự, 1998). Nghiên cứu sử dụng sản phẩm sắn nuôi lợn con Thí nghiệm đối với lợn con từ 14 đến 56 ngày tuổi cho ăn thức ăn hỗn hợp chứa 0%, 14%, 20%, 28% và 40% bột củ sắn, có sự cân đối năng lượng và protein. Kết quả cho thấy lợn con khỏe mạnh, khối lượng lúc cai sữa giữa các lô xấp xỉ nhau và không có sự sai khác rõ rệt. Một thí nghiệm khác đối với 5 lô lợn con từ 35 đến 63 ngày tuổi, các lô được cho ăn thức ăn cơ sở khác nhau: 1) ngô, 2) đại mạch, 3) lúa mỳ, 4) yến mạch, 5) bột củ sắn (35% khẩu phần), có sự cân đối về protein. Kết quả về tăng trọng (g/con/ngày) của các lô lần lượt là: 386g, 380g, 354g, 360g và 416g. Tăng trọng của lợn con lô ăn thức ăn có bột sắn cao hơn các lô khác được giải thích là năng lượng tiêu hóa của bột củ sắn cao hơn các thức ăn còn lại (Aumaitre, 1969, Serres, 1973, trích từ Maner 1987). Các nghiên cứu sử dụng sắn nuôi lợn đã chỉ ra rằng mức độ phối hợp bột củ sắn vào thức ăn hỗn hợp của lợn thịt vào khoảng 30% đến 60% và lợn nái vào khoảng 20% đến 69 30% sẽ không có ảnh hưởng xấu đến khả năng sản xuất của lợn, mà còn cải thiện hơn khả năng sinh trưởng và sinh sản của lợn, không có hiện tượng lợn bị ngộ độc HCN, mặc dù khẩu phần có chứa bột sắn được sử dụng trong thời gian dài. 3.3.3. Nghiên cứu sử dụng sắn trong chăn nuôi gia cầm Julián Buitrago, 2002 nhận định như sau: khi sử dụng củ hoặc lá sắn để chăn nuôi gia cầm chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều các yếu tố bên trong và bên ngoài. Trong đó các nhân tố bên ngoài là: tuổi, quá trình chế biến (nghiền, đóng viên,...) và khẩu phần để nuôi gia cầm. Nhân tố bên trong là sự ảnh hưởng tới chất lượng, ích lợi và giá của sản phẩm. Vì vậy, đối với bột củ sắn, lượng tối đa sử dụng trong khẩu phần gia cầm chỉ từ 25- 30%. Nếu sử dụng với lượng lớn hơn thì phải sử dụng chất kết dính để giảm tính bụi của thức ăn. Đối với bột lá sắn thì yếu tố gây hạn chế sử dụng là xơ của lá sắn. Vì vậy, không nên sử dụng vượt quá 6-8% trong khẩu phần. Khi sử dụng với số lượng thấp trong khẩu phần thì lá sắn vẫn là thành phần quan trọng cấu thành protein và sắc tố trong thịt và lông, da và trứng của gà thịt lẫn gà trứng. 3.3.3.1. Sử dụng bột củ sắn * Nghiên cứu bổ sung bột củ sắn trong thức ăn hỗn hợp của gà thịt Điểm hạn chế của bột củ sắn lá thiếu hụt protein và một số axit amin thiết yếu, vì vậy phải phối hợp với các loại thức ăn khác để cung cấp đầy đủ các loại chất dinh dưỡng mà sắn thiếu. Trong khẩu phần sử dụng cho gia cầm thì đỗ tương là thức ăn có đầy đủ axit amin và lipit. Phối hợp 82% bột củ sắn và 18% đậu tương có giá trị tương đương với ngũ cốc (Julián Buitrago, 2002). Tại Mexico, người ta có thể sử dụng đến 50% bột sắn trong khẩu phần của gà con và cho kết quả sinh trưởng tương tự đối chứng, nhưng hiệu quả sử dụng thức ăn thấp hơn so với sử dụng bột ngô. Sử dụng bột củ sắn trong khẩu phần ăn của gà, nếu thức ăn được đóng viên thì bụi do sắn gây ra được khắc phục vì vậy có thể sử dụng bột củ sắn với lượng cao để thay thế cho ngũ cốc trong khẩu phần khởi động cũng như khẩu phần kết thúc của gà thịt. Lượng bột sắn có thể phối hợp từ 45-50% và bột lá sắn có thể từ 5-6%. Thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của ngô, sorghum và sắn đến khả năng tăng khối lượng của gà broiler từ 4-7 tuần tuổi. Kết quả cho thấy ở lô sử dụng bột sắn cho tăng khối lượng thấp hơn và tiêu tốn thức ăn cao hơn so với lô sử dụng ngô và bột sorghum nhưng sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Thí nghiệm trên gà broiler với 2 khẩu phần có bột củ sắn và ngô thì gà ăn khẩu phần ăn có bột sắn luôn có tỷ lệ nuôi sống cao hơn so với gà sử dụng ngô, tỷ lệ chết giảm 50% so với lô sử dụng ngô. Khi sử dụng bột sắn và không sử dụng chất chống khuẩn nhưng tỷ lệ sống vẫn cao hơn so với lô sử dụng ngô và có sử dụng chất chống khuẩn. Sự sai khác về tỷ lệ nuôi sống là có ý nghĩa thống kê. Nghiên cứu sử dụng 10% bột củ và lá sắn (50% bột củ và 50% bột lá sắn) vào khẩu phần của gà thịt broiler giai đoạn sinh trưởng. Kết quả cho thấy tỷ lệ này không ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ thân thịt 70 của gà. Các nghiên cứu khác cho thấy: Khả năng tăng khối lượng của gia cầm không bị ảnh hưởng khi sử dụng khẩu phần có 50% bột củ sắn. Tuy nhiên, phân thải ra rất nhớt, vì vậy chỉ nên sử dụng tối đa là 30%. Bột sắn củ hiếm khi được sử dụng dưới tỷ lệ 10% trong thành phần thức ăn hỗn hợp, thường thì người ta hay sử dụng ở tỷ lệ từ 10- 40%. Ở một số nước nhiệt đới người ta còn thử nghiệm sử dụng đến 60% trong khẩu phần (Muller và cs., 1971. Tejada và Brambila, 1969. Gil và cs., 2000. Sriwattanaworachai và cs., 1989 dẫn theo Julián và cs., 2002. Tathawan và cs., 2002. Eruvbetine và cs., 2003. Stevenson và Jackson, 1983. Julián Buitrago, 2002). Một số nhà nghiên cứu khác lại có nhận định như sau: Bột củ sắn đã được sử dụng thay thế cho ngũ cốc trong khẩu phần của gia cầm nhưng thường thấy làm giảm năng suất của gia cầm. Theo các tác giả thì nguyên nhân chủ yếu do lượng HCN có nhiều trong khẩu phần và thành phần khẩu phần thường thiếu protein, amino axit, mỡ khoáng và vitamin vì vậy phải bổ sung các thành phần hóa học thiếu và làm hạn chế HCN trong củ sắn. Bột sắn có thể sử dụng thay thế ngô, gạo vỡ hay bột sorghum như là nguồn thức ăn để bổ sung năng lượng trong khẩu phần cho gà broiler. Tuy nhiên, gà sử dụng bột sắn có khối lượng nhỏ hơn và tiêu tốn thức ăn lớn hơn các khẩu phần khác nhưng không có sự sai khác về mặt thống kê (Tiémoko, 1988. Saentaweesuk và cs., 2000a. Buitrago và Lucket, 1999. Liu Jian Ping, 2000. Stevenson và Jackson, 1983. Barry, 1974. Tobayayong, 1935; McMillan và Dudley. 1941. Khajarern và cs., 1986). * Nghiên cứu sử dụng bột củ sắn chăn nuôi gà đẻ trứng Khi thay thế từ 10% đến 100% ngô bằng bột sắn cho gà đẻ trứng kết quả là ở mức thay thế cao rất khó cân bằng được tỷ lệ protein trong khẩu phần, màu sắc của lòng đỏ có xu hướng giảm dần khi tăng tỷ lệ bột sắn vì vậy phải bổ sung những nguồn giàu caroten vào trong khẩu phần. Tuy nhiên năng suất trứng vẫn tương đương với lô sử dụng 100% ngô (Pillai và cs., 1968. Gutiérrez và Martínez, 1997. Saentaweesuk và cs., 2000b. Hamid và Jalaludin, 1972). Nhiều nghiên cứu cho thấy sử dụng từ 20 - 30% bột sắn cho gà thịt và gà đẻ trứng là phù hợp (Miranda. 1957; Enquiez. 1969; Agudu. 1972; Jalaladin. 1973; trích Silvestre và cộng sự, tài liệu dịch, 1990). 3.3.3.2. Sử dụng bột lá sắn * Nghiên cứu sử dụng bột lá sắn chăn nuôi gà thịt Hamid và Jalaludin (1972) có nhận định như sau: Củ sắn thường được dùng trong khẩu phần, nhưng gần đây lá sắn đã trở thành sản phẩm khá triển vọng được sử dụng để cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phần gia cầm, chúng có khả năng cung cấp xơ, khoáng và vitamin, đồng thời có giá rẻ và không cạnh tranh với củ. Sử dụng bột lá sắn với tỷ lệ 4% để nuôi gà thịt Plymouth thì khối lượng gà kết thúc lúc 10 tuần tuổi cao hơn so với lô đối chứng từ 100 đến 400g và sử dụng bột lá sắn với các tỷ lệ 0; 2; 4; 6% để nuôi gà thịt công nghiệp 1A, đã có tác dụng tốt đến khả năng sinh trưởng của gà thịt. Tỷ lệ bổ sung thích hợp và có hiệu quả là 2- 4%. Nghiên cứu 71 đánh giá năng suất, khả năng sử dụng thức ăn và biến đổi của một số tổ chức của cơ thể gà ở thịt Anak 5 ở tuần tuổi khi sử dụng khẩu phần có bột lá sắn ở các tỷ lệ 0, 5, 10 và 15% cho kết quả như sau: Lượng thức ăn thu nhận, tăng khối lượng, chuyển hóa thức ăn của lô đối chứng và 5% lá sắn là khác nhau có ý nghĩa với lô sử dụng 10 và 15%. Khối lượng tim, gan, lách ở mức 0 và 5% cao hơn có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) so với mức 10 và 15%. Vì vậy chỉ nên dùng tối đa là 5% cho gà broiler ở giai đoạn kết thúc (Duong Thanh Liem, 1985. Duong Thanh Liem, 1998. Iheukwumere và cs., 2008). Thay thế bột đậu tương bằng bột lá sắn với các tỷ lệ 0, 30, 60% cho gà broiler thì khối lượng của gà lúc kết thúc thí nghiệm, khối lượng tăng trung bình, tiêu tốn thức ăn sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng (chỉ dùng bột đỗ tương). Gà sử dụng thức ăn thay thế 30% bột đỗ tương bằng bột lá sắn cho khối lượng kết thúc thí nghiệm, tăng khối lượng trung bình cao hơn còn tiêu tốn thức ăn thấp hơn so với sử dụng ở mức 60% và cũng cao hơn so với gà được nuôi bằng thức ăn có sử dụng bột lá keo dậu với các tỷ lệ trên (Onibi và cs., 2008). Nghiên cứu ảnh hưởng của các mức bột lá sắn 0, 5, 10 và 15% trong khẩu phần gà thịt cho biết tổng lượng huyết thanh, albumin và hemoglobin ở mức 0 và 5% lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với mức sử dụng ở mức 10 và 15% bột lá sắn. Tuy nhiên tỷ lệ cholesterol, creatinine và ure thì không có sự sai khác nhau. Tỷ lệ thịt xẻ ở lô đối chứng lớn hơn có ý nghĩa thống kê so với lô thí nghiệm và tác giả khuyến cáo chỉ sử dụng tối đa 5% bột lá sắn cho gà thịt broiler (Iheukwumere, 2007). * Nghiên cứu sử dụng bột lá sắn chăn nuôi gà sinh sản Julián Buitrago (2002) có nhận định là đối với bột lá sắn thì yếu tố gây hạn chế sử dụng là xơ của lá sắn. Vì vậy, không nên sử dụng vượt quá 6 - 8 % trong khẩu phần của gà đẻ. Khi sử dụng với số lượng thấp trong khẩu phần thì lá sắn vẫn là thành phần quan trọng cấu thành protein và sắc tố trong trứng gà. Theo các tác giả như: Miranda (1957); Enquiez (1969); Agudu (1972) và Jalaladin (1973) (trích p. Silvestre) thì khi sử dụng bột lá sắn từ 2 - 6% cho gà sinh sản là có hiệu quả nhất. Dùng lá sắn trong khẩu phần ăn cho gà đẻ làm tăng sắc tố trong lòng đỏ trứng. Ở Ấn Độ, bột lá sắn thay thế 50% bột củ sắn trong khẩu phần của gà đẻ, kết quả cho thấy dùng bột lá sắn tăng tỷ lệ đẻ lên 12% so với bột củ sắn (Pillai và cs., 1968). Dương Thanh Liêm (1998) sử dụng bột lá sắn với các tỷ lệ 0; 2; 4; 6% bổ sung vào thức ăn cho gà sinh sản thì có tác dụng tốt, tỷ lệ carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng tăng theo tỷ lệ bổ sung bột lá sắn vào thức ăn, mức thích hợp là 3% sẽ đem lại hiệu quả cao nhất. Như vậy, có thể đưa vào khẩu phần ăn của gà lượng bột lá sắn từ 2 - 6% tùy theo giai đoạn và đối tượng gà thịt hay gà trứng. Khi bổ sung bột lá sắn vào thức ăn cần phải lưu ý cân đối lại năng lượng của khẩu phần và không đưa với tỷ lệ bột lá sắn quá cao để tránh ảnh hưởng của độc tố HCN và ảnh hưởng của chất xơ đến sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của gà. 72 Chương IV ĐỘC TỐ MIMOSIN TRONG KEO GIẬU Cây keo giậu được trồng rất phổ biến ở Nam Mỹ, Châu Úc và Nam Á với mục dích làm thức ăn chăn nuôi. Keo giậu được trồng xen với cỏ hòa thảo trên đồng cỏ chăn thả đã mang lại nhiều lợi ích to lớn như: Cải tạo đất, nâng cao năng suất đồng cỏ, nâng cao năng suất chăn nuôi và tổng hợp lại là nâng cao hiệu quả kinh tế chăn nuôi. Keo giậu còn được trồng để sản xuất bột lá keo giậu; ở một số nước, sản xuất bột lá keo giậu đã trở thành một ngành liên hợp nông - công nghiệp vừa cung cấp thức ăn cho gia súc trong nước vừa xuất khẩu ra nước ngoài. Lá keo giậu có ưu điểm là tỷ lệ protein và caroten cao, tỷ lệ xơ thấp, phơi khô nhanh, dễ nghiền thành bột; tỷ lệ protein trong lá không thua kém bất cứ cây thức ăn gia súc họ đậu nào. Trên đây là các lý do làm cho keo giậu được trồng khá phổ biến và được sử dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng vật nuôi ở trên thế giới. Tuy nhiên, trong keo giậu có chứa độc tố mimosin, vật nuôi ăn thức ăn có chứa mimosin với hàm lượng cao hoặc với hàm lượng thấp trong thời gian dài sẽ bị ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và khả năng sản xuất của chúng. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về độc tố này trong cây keo giậu như: cấu trúc hóa học, cơ chế gây độc, phương pháp loại bỏ độc tố trong thức ăn và tỷ lệ bột lá keo giậu phối hợp vào thức ăn hợp lý, đảm bảo được sức khỏe và năng suất của vật nuôi. 4.1. Chất độc mimosin trong keo giậu 4.1.1. Công thức hóa học và cơ chế gây ngộ độc Tên hóa học của mimosin là β - [ N (3- hydro - 4 oxypyridyl) ] - α - amino propyonic axit. Công thức hóa học: C8H10N204 Cấu trúc hóa học của mimosin như sau: Hình 4.1 Cấu trúc hóa học của mimosin 73 Do mimosin có ảnh hưởng xấu đến gia súc, gia cầm nên nó là yếu tố hạn chế trong việc sử dụng các loại thức ăn có chứa mimosin trong chăn nuôi. Vì vậy, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về độc chất này, đặc biệt là quá trình tổng hợp, phân hủy và tác động của mimosin đối với cơ thể động vật. Do cơ chế gây độc của mimosin khá phức tạp nên các tác giả chưa làm rõ được cơ chế này mà chỉ đề ra các giả thuyết từ các kết quả nghiên cứu. Tổng hợp các giả thuyết về tác động của mimosin như sau: Mimosin có tác động tới quá trình trao đổi các axit amin có cấu tạo mạch vòng tương tự như nó. Ví dụ, do có cấu trúc giống L - thyrosin mà mimosin có thể gây ra các tác động tương tự hoặc ngược lại với thyrosin. Nếu tác động ngược lại thì nó sẽ gây ức chế sinh tổng hợp protein và sẽ gây ra hiện tượng động vật chậm sinh trưởng. Người ta thấy khi động vật ăn thức ăn có chứa mimosin với khối lượng lớn và kéo dài thì hàm lượng thyrosin trong huyết thanh thấp. Thiếu hormon này là một trong những nguyên nhân dẫn đến động vật sinh trưởng chậm (Lin và cs., 1964, 1965; Ter Meulen và cs., 1981; Serrano và cs., 1983; Jones và Winter, 1979 - 1980). Mimosin tác động đến các enzym có liên quan đến kim loại, đặc biệt là các enzym có chứa cation sắt, làm ức chế một số phản ứng sinh học của các enzym này. Tác nhân chính tác động đến enzym là “cái càng” của nhóm chứa 3 - hydroxy - oxo của vòng pyridon trong mimosin (Tsai và Ling, 1972, 1979; Hashiguchi và Takashi, 1977). Mimosin có tác động tới các enzym như một chất đối kháng với vitamin B6 (photpho pyridoxal) mà các enzym này muốn hoạt động được phải có photpho pyridoxal. Như vậy mimosin đã gián tiếp ức chế các enzym. Ví dụ, như các enzym synthetaza cystathionin và cytsthionaza trong gan chuột, các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp cystein từ methionin. Mimosin đã gián tiếp ức chế các enzym này làm cho quá trình tổng hợp cystein bị đình trệ dẫn đến ảnh hưởng tới số lượng, chất lượng lông của động vật (lông thưa, rụng lông) (Lin và Ling, 1962; Lin và Tung, 1966; Fowden và cs., 1967; Hylin, 1969; Grove và cs., 1978). Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu khác lại cho rằng độc tính của mimosin là do tác động giữa nó và photpho pyridoxal gây ra (Yang và Ling, 1968; El - Harith, 1981), như mô tả ở hình 4.2 Hình 4.2. Phức chất tạo thành do tác động giữa mimosin và photpho pyridoxal Nguồn: Sethi và Kulkarni, 1995 74 Mimosin có tác động đến ADN (axit dezoxyribonucleic), ARN (axit ribonucleic) và ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. Nếu đúng như vậy, thì nó có thể đã ức chế ngay từ giai đoạn đầu của quá trình sao chép tế bào ở chuột (Hegarty và cs., 1964; Tsai và Ling, 1971; Serrano và cs., 1983; Mosca và cs., 1992). Mimosin ức chế tổng hợp hydroxy - prolin dẫn đến làm yếu đi quá trình tổng hợp collagen ở sụn phôi thai gà. Sự suy giảm collagen làm cho sụn bị mềm, các tổ chức khác (mao mạch, tử cung..) dễ bị rạn nứt, từ đó dẫn đến các triệu chứng như: xuất huyết mao mạch, thủng tử cung. Mimosin có tác động đến hệ thần kinh: Bằng chứng là các con chuột được cho ăn thức ăn chứa mimosin với khối lượng lớn và kéo dài sẽ bị liệt chân sau, nhưng sau khi không cho ăn thức ăn chứa mimosin nữa thì hiện tượng này mất đi, chân sau của chuột lại hoạt động trở lại bình thường (Yoshida, 1944; Ter Meulen và cs., 1979). 4.1.2. Hội chứng bị ngộ độc mimosin ở động vật và liều lượng gây độc Mimosin gây ra các hội chứng như: lông thưa, rụng lông, giảm tính thèm ăn, cường tiết nước bọt, sưng tuyến giáp, giảm khả năng sinh sản, giảm sinh trưởng (Ter Meulen và cs., 1979). Hội chứng trên dễ dàng nhận thấy khi động vật dạ dày đơn ăn khẩu phần có chứa bột lá keo giậu lớn hơn 10% hoặc động vật nhai lại ăn khẩu phần ăn có chứa lớn hơn 30% bột lá keo giậu trong thời gian dài. Đối với bột của hạt keo giậu cũng xảy ra hiện tượng tương tự, gà được ăn thức ăn có chứa 15% bột hạt keo giậu trong 12 ngày thì tiêu thụ thức ăn của gà giảm, tăng khối lượng của gà cũng giảm (Proverbs, 1984; Kamada và cs., 1997). Thức ăn có chứa 3,3g mimosin trong 1kg thức ăn đối với gà con và 4,9g đến 10g mimosin trong 1kg thức ăn đối với gà lớn thì khả năng tiêu thụ thức ăn của gà giảm hẳn và sinh trưởng cũng bị giảm rõ rệt (Ter Meulen và cs., 1984; D‟Mello và Acamovic, 1984; Kamada và cs., 1997). Tuy nhiên, các nhà khoa học nhận thấy rằng có tới 92% lượng mimosin ăn vào được thải ra ngoài. Điều đó chứng tỏ trong thức ăn có chứa mimosin (bột lá, bột hạt keo giậu...) thì nó không phải là yếu tố duy nhất gây giảm năng suất chăn nuôi. Tác động của mimosin đối với động vật cũng khác nhau, tùy thuộc vào từng lứa tuổi, loài gia súc. Ví dụ như: gà con mẫn cảm với mimosin tinh khiết hơn so với gà trưởng thành, gia súc dạ dày đơn mẫn cảm với mimosin hơn so với gia súc nhai lại (D‟Mello và Acamovic, 1982a, 1989). Keo giậu là thức ăn có chứa mimosin, nhưng lại được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi. Để sử dụng an toàn thức ăn này, người ta đã đưa ra khuyến cáo về tỷ lệ tối đa bột lá keo giậu trong khẩu phần và lượng tối đa mimosin ăn vào đối với gia súc gia cầm như sau: 75 Bảng 4.1. Tỷ lệ tối đa bột lá keo giậu trong khẩu phần ăn của động vật Loại động vật Tỷ lệ tối đa (% VCK khẩu phần) Lượng mimosin tối đa ăn vào (g/kg KL/ngày) Bò Dê Cừu Thỏ Lợn Gà đẻ Gà thịt 20 - 30 10 - 20 10 - 20 10 - 15 7 - 10 4 - 6 4 - 6 0,18 0,18 0,14 0,23 0,15 0,21 0,16 Nguồn: Szyska và cộng sự, 1983 4.2. Mimosin trong cây keo giậu Mimosin có trong một số cây thức ăn gia súc, nhưng chỉ có các sản phẩm từ cây keo giậu (lá tươi, bột lá keo giậu, bột cây keo giậu) được sử dụng rộng rãi và với khối lượng lớn trong chăn nuôi. Vì vậy, cần phải hiểu rõ về mimosin trong cây thức ăn này. Hàm lượng mimosin trong cây keo giậu biến động rất lớn theo loài, giống, các giai đoạn sinh trưởng, các bộ phận khác nhau của cây, khoảng cách thu hoạch, dinh dưỡng đất và phân bón, phương pháp chế biến. Hàm lượng mimosin biến động mạnh theo loài. Cụ thể: Hàm lượng này trong loài L. macrophylla là 5,4% vật chất khô (VCK), trong loài L. diversifolia là 2,0% đến 2,8% VCK, trong loài L. lanceolata là 6.2% VCK. Cây lai giữa loài L. diversifolia với loài L. leucocephala có hàm lượng mimosin từ 2,0% đến 3,8%. Trong cùng một loài hàm lượng mimosin cũng có sự biến động lớn. Ví dụ: L. pulverulenta có hàm lượng mimosin biến động từ 2 - 5%, đối với L. gregii là 1 - 2%, còn đối với L. leucocephala từ 3 - 9%. Trong loài L. leucocephala thì lượng mimosin của giống L. leucocephala l8 là thấp nhất (Rushkin 1977; Krishnamurthy và cs., 1983; Chandrasekaran và cs., 1981; Kewalramani và cs., 1987; Hauad Marroquin và cs., 1991). Hàm lượng mimosin có sự biến động lớn giữa các bộ phận của cây. Các nhà nghiên cứu khác nhau đã cho biết tỷ lệ mimosin lá non là: 5,1%; 6,8% và 8,6%, trong chồi, búp non là: 4,9%, 12%, trong lá trưởng thành là: 3,0%, trong cuống lá là: 1,8% và 3,8%, trong cành là: 2,2%, trong vỏ quả tươi là: 2,4% và 3,7%, trong hoa là: 3,7%, trong hạt là: 5,9%; 7,2% và từ 3,3% đến 14,5% VCK. Trong hỗn hợp cành và lá là: 2,4% và trong bột lá là: 4,3% VCK. Nhìn chung, trong các bộ phận của cây thì mimosin có tỷ lệ cao ở trong hạt, sau đó đến lá non, búp non, tỷ lệ này thấp hơn ở trong thân, cành, lá trưởng thành của keo giậu (Akbar và Gupta và cs., 1986; D‟mello và Acamovic, 1989; Wong và wan Zahari, 1995; Garcia và cs., 1996). 76 Hàm lượng mimosin trong các bộ phận của cây có sự biến động giảm theo sự phát triển của cây. Hàm lượng mimosin đạt cao nhất khi lá được 13 ngày tuổi là: 7,1% VCK, lúc 45 ngày tuổi là: 6,0% VCK, còn lúc 60 ngày tuổi là: 4,2% VCK. Hàm lượng mimosin có tương quan rất chặt chẽ với tuổi của lá. Nhìn chung các bộ phận non của cây có hàm lượng mimosin cao hơn các bộ phận già, nhưng trong toàn bộ quá trình phát triển của cây thì cây non có hàm lượng mimosin thấp hơn cây già (Ronia và cộng sự, 1979; Gupta và cộng sự, 1984; Deshumkh và cộng sự, 1987; Hauad Marroguin và cộng sự, 1991; Gupta và cộng sự, 1992). Hàm lượng mimosin trong cây biến đổi theo mùa. Mùa nóng hàm lượng mimosin trong cây tăng, ngược lại vào mùa đông hoặc đầu mùa xuân lại giảm xuống (Hauad marroquin và cộng sự, 1991; Gupta và cộng sự, 1992). Hàm lượng mimosin giảm khi khoảng cách giữa các lứa thu hoạch tăng. Bởi vì, hàm lượng mimosin trong cây tỷ lệ nghịch với tuổi của các bộ phận trong cây (cành, lá già có tỷ lệ mimosin thấp hơn so vói cành, lá non) (Takahashi và Ripperton, 1949). 4.3. Phương pháp hạn chế và loại bỏ mimosin trong thức ăn 4.3.1. Sự phân giải mimosin trong cơ thể động vật và trong cây Trong cơ thể động vật, mimosin và các chất trung gian của quá trình trao đổi mimosin và DHP dễ bị phân giải, đào thải ra ngoài. Quá trình phân giải này được minh họa bằng hình 4.3 dưới đây (Nguồn: Sethi và Kul Karni 1995): Đối với gia súc nhai lại, việc phân giải mimosin thành DHP hầu như là triệt để dưới tác động enzym trong dạ cỏ, còn đối với gia súc dạ dày đơn thì lại khác, các enzym phân giải mimosin thành DHP bị ức chế bởi nồng độ axit cao của dạ dày cho nên sự phân giải bị hạn chế, nhưng quá trình này vẫn có thể được xảy ra sau khi tiêu hóa hấp thu theo sơ đồ ở hình 4.3. Đây là lí do của việc sử dụng bột lá keo giậu với tỉ lệ thấp trong khẩu phần của động vật dạ dày đơn. Theo nguyên lý trên thì động vật nhai lại ít chịu tác động của mimosin, bởi vì vi sinh vật dạ cỏ và enzym tự nhiên trong lá keo giậu đã phân giải mimosin thành DHP. Tuy nhiên, DHP vẫn có tác động xấu đến tuyến giáp trạng của động vật có vú. Vì vậy, khi trâu, bò ăn lượng lớn lá keo giậu trong thời gian dài vẫn thấy hội chứng rụng lông, giảm tính thèm ăn, sinh trưởng chậm. Riêng đối với gia cầm, ảnh hưởng của DHP là không rõ rệt. Do đó, tăng cường quá trình phân giải mimosin thành DHP có thể tăng được tỉ lệ bột lá keo giậu trong khẩu phần ăn của gia cầm. Nhưng, một số nhà nghiên cứu vẫn cho rằng DHP làm giảm tính thèm ăn của gia cầm. Vì vậy, vẫn nên phối hợp bột lá keo giậu trong khẩu phần ăn gia cầm với tỷ lệ phù hợp (Christie và cs., 1979, Lowry, 1981; Jones và Megarrity, 1983; Tangendjaja và Lowry, 1984; D‟Mello và Acamovic, 1989). 77 Hình 4.3. Con đường trao đổi mimosin Ghi chú: M: mimosin; 3.4 - dihydroxy pyridin, MN: mimosinamin; MA: mimosin acid Ở trong cây, một phần mimosin được chuyển hóa thành DHP (3,4 - dihydropyridine) nhờ enzym; người ta tìm thấy enzym này trong lá non và vỏ quả non (dạng tươi) của cây keo giậu; không thấy enzym này ở vỏ quả già, cuống lá, hạt và mạch ngoại vi (Smith và Fowden 1966; Lowry 1981,1983). Sau khi thu hoạch, mimosin tiếp tục bị phân hủy thành DHP. Sự chuyển hóa mimosin thành DHP chỉ xảy ra khi có sự tiếp xúc trực tiếp giữa mimosin và enzym, dưới sự tác động của các yếu tố như là nhiệt (sấy, phơi nắng, ngâm nước nóng), ngâm trong nước, nghiền, gia súc nhai thức ăn... Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ngâm lá keo giậu tươi trong nước ấm 400C và mức pH = 7 trong 4 phút thì có tới 50% mimosin chuyển thành DHP, còn ngâm trong nước nóng 700C trong thời gian 15 phút thì có trên 78 80% mimosin bị phân giải. Emzym sẽ ngừng hoạt động khi pH < 4 và khi nhiệt độ > 700C hoặc khi sấy với nhiệt độ cao và thời gian quá ngắn (Hegarty và cs., 1964b; Lowry, 1981; Tangendjaja và Lowry, 1984; Lyon, 1985; Wee và Wang, 1987). 4.3.2. Các phương pháp hạn chế và loại bỏ mimosin Tuy mimosin có tỷ lệ trong lá keo giậu tươi khá cao (3%-5% VCK) nhưng nó rất dễ bị loại bỏ bằng các phương pháp xử lý dưới đây. Hiện nay, người ta đã sử dụng các biện pháp dưới đây để hạn chế hoặc loại bỏ mimosin trong thức ăn của vật nuôi. Sử dụng nhiệt (sấy khô, phơi nắng, ngâm nước nóng) là phương pháp đơn giản nhất nhưng có thể loại bỏ được hầu hết mimosin. Nhiệt độ cao vừa có tác dụng kích thích enzym phân giải mimosin hoạt động vừa tác động trực tiếp đến mimosin. Một điều cần lưu ý là khi sấy nhiệt độ quá cao và thời gian ngắn thì làm mất đi quá trình phân giải mimosin của enzym và làm biến tính protein của thức ăn. Trong phương pháp sấy thì sấy bằng hơi nước nóng (sấy ướt) hoặc ngâm lá keo giậu trong nước nóng rồi đem sấy thì sẽ loại bỏ được mimosin triệt để hơn (Hegraty và cs., 1964; National Academy of Science, 1977; Ter. Meulen và cs., 1979; Benge và Curant, 1981; Akhbar và Gupta, 1984; Kale, 1987; Sethi, 1989; Mali và cs., 1990). Ngâm nước cũng loại bỏ được mimosin. Ngâm lá keo giậu trong nước bình thường ở nhiệt độ trong phòng, trong 24 giờ loại bỏ được 97% mimosin. Nếu ngâm nước nóng thì loại bỏ mimosin nhanh hơn và triệt để hơn so với ngâm nước lạnh. Ngâm trong dung dịch nước xi măng có pH=8, nhiệt độ 45oC trong 10 phút có thể phá hủy hầu hết mimosin, phương pháp này có nhược điểm là tốn công, thời gian (ngâm nước xong mới đem đi phơi sấy) và quá trình ngâm nước, đặc biệt là ngâm nước nóng sẽ làm mất đi một lượng đáng kể protein hòa tan của lá (Labadan, 1969; Ter. Meulen và cộng sự, 1979; Padmavathy và Shobha, 1987; Soedarjo và Bortharkur, 1996). Riêng đối với hạt và vỏ quả keo giậu, xay nhỏ trước khi phơi, sấy sẽ loại bỏ được mimosin nhiều hơn là không xay. Xay nhỏ loại bỏ được khoảng trên 20% mimosin, xay nhỏ sau đó sấy thì hầu hết mimosin được loại bỏ. Bởi vì, xay nhỏ đã làm tăng khả năng tiếp xúc của men phân giải với mimosin và tăng khả năng bay hơi mimosin khi phơi sấy (Wee và Wang 1987; Soedarjo và Bortharkur 1996). Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu loại bỏ mimosin bằng hóa chất. Axetat natri là hóa chất xử lý mimosin hiệu quả nhất; sử dụng dung dịch này có thể loại bỏ tới 95% mimosin. Tiếp theo là dung dịch natri cacbonat, dung dịch này có thể loại tới 88% mimosin, dung dịch ure có thể loại bỏ tới 80% mimosin. Các nhà khoa học còn nghiên cứu sử dụng một số muối sắt và kẽm hoặc bazơ để khử mimosin. Ví dụ như FeSO4 2%, ZnSO4 2%, NaOH 0,5M trộn hoặc pha vào bột lá keo giậu. Cơ chế làm giảm đặc tính của mimosin là ion kim loại đã tạo thành phức chất bền vững với mimosin làm mất tính độc của mimosin 79