🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Di truyền y học Ebooks Nhóm Zalo CK.0000070968 Chủ biên : 3UYẼN LIỆU GS. TS. TRỊNH VĂN BẢO PGS. TS. TRẦN THỊ THANH HƯƠNG 'ĩỂề&j?ĩ tỵ i/ i *MỈ b y NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM BỘ Y T Ế DI TRUYỀN Y HỌC (DÙNG CHO ĐÀO TẠO BÁC s ĩ ĐA KHOA) M ã số: Đ.01.X.10 (Tái bẳn lẩn thứ tư) NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM C h ỉ đao biên soan: CỤC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ Chù biên: GS.TS. TRỊNH VĂN BẢO PGS.TS. TRẦN THỊ THANH HƯƠNG N hữ ng người biên soạn: GS.TS. TRỊNH VĂN BAO PGS.TS. PHAN THỊ HOAN PGS.TS. TRẦN THỊ THANH HƯƠNG TS. HOÀNG THỊ NGỌC LAN PGS.TS. TRẦN THỊ LIÊN PGS.TS. TRẦN ĐỨC PHẤN PGS.TS. PHẠM ĐỨC PHÙNG TS. NGUYỄN VẢN Rực TS. NGUYỄN THỊ TRANG Thư k ý biên soạn: PGS.TS. TRẦN THỊ THANH HƯƠNG Tham gia t ổ chức bàn tháo: ThS. PIIÍ VĂN THÂM TS. NGUYÊN MẠNH PHA Jđi«ì OỢó ì i t ' ')IÍJỈí, J 2 ờ í ỹ Lới bĩilệu . Thực hiện m ộ t sô'điều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo và Bộ Y t ế đã ban hành chương bình klĩung đào tạo Bác s ĩ đa khoa. Bộ Y tê'tô’chức biên soạn tài liệu dạ y - học các m ôn cơ SỞ và chuyên m ôn theo chương trình trên nhằm từng bước x â y dựng bộ sách đạt chuẩn chuyên m ôn trong công tác đào tạo nhân lực ỵ tế. Sách D I TRU YỀN y H O C được biên soạn dưa vào chương trìn/i giáo dục của Trường Đại học Y H à N ộ i trên cơ SỎ chương tìn h khung đã được p h ê duyệt. Sách được cắc tấc giả GS.TS. Trịnh Văn Bảo , PGS. TS. Phan Thị Hoan, PGS. TS. Trần Thị Thanh Hương, TS. H oàng Thị Ngọc Lan, PGS. TS. Trần Thị Liên, PGS. TS. Trần Đức Phân, PGS. TS. Phạm Đức Phùng, TS. N guyễn Văn Rực, TS. N guyễn Thị Trang biên soạn theo phư ơng châm: kiến ửìức cơ bản, h ệ ứìôhg; n ộ i dung chính xác, khoa học, cập nhật các tiên bộ khoa học, k ỹ thuật hiện đại và thưc tiễn Việt Nam. Sách D I TRU YỀN Y H O C đã được H ội đồng chuyên m ôn thẩm định sách và tài liệu d ạ y - học chuyên ngành Bác s ĩ đa khoa của Bộ Y tếứìẩm định năm 2007. Bộ Y t ế q u yết định ban hành là tài liệu dạy - h ọ c đạt chuân chuyên m ôn của ngành trong giai đoạn hiện nay. Trong thời gian từ 3 đến 5 năm, sách p h ả i dược chỉnh lý, bô’su n g và cập nlĩật. Bộ Y tê'xin chân thành cẩm ơn các tác giả và H ội dồng chuyên m ôn thâm đinh đã giúp hoàn thành cuốn sách; cẩ m ơn GS. TS. Trương Đình Kiệt, TS. N guyễn Trần Chiêh đã đọc và phản biện đ ể cuốn sách sớm hoàn thành kịp thời p h ụ c vụ cho công tác dào tạo nhân lự c ỵ tê'. Chúng tôi m ong nhận được ý kiên đóng góp của dồng nghiệp, các bạn súĩh viên và các độc giả dê lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn. CỤC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ 3 J lờ i nói áau Để đáp ứng yêu cầu của Y học, bên cạnh cuốn Các nguyên lý sinh học, Bộ môn Y Sinh học - Di truyền Đại học Y Hà Nội đã soạn thảo cuốh sách Di truyền Y học. Nội dung cuốn sách Di truyền Y học biên soạn theo khung chương trình đào tạo của Bộ Giáo dục - Đào tạo và Bộ Y tế. Nội dung cuốn sách này nhằm cung cấp kiến thức cho các học viên theo chương trình đào tạo bác sĩ đa khoa. Di truyền Y học trong các năm qua đã phát triển rất nhanh cả về chiểu rộng lẫn chiều sâu; nội dung và kiến thức của Di truyền Y học đã thâm nhập vào hầu hết các chuyên ngành của Y học, vì vậy trong cuốn sách này chúng tôi chỉ đê' cập đến những vấn đề có tính chất nguyên lý của Di truyền Y học, kèm theo một sô ví dụ để minh họa. Sách biên soạn gồm 12 chương, mỗi chương được trình bày theo các đê' mục; mỗi chương tương ứng với 2 đến 4 tiết giảng; mỗi bài đều có mục tiêu và phần tự lượng giá để giúp cho học viên tập trung vào những nội dung cơ bản nhất cần học. Cuốn sách Di truyền Y học xuất bản lần này chủ yếu là dành cho đào tạo bác sĩ đa khoa và cũng là tài liệu tham khảo cho các đối tượng đào tạo cử nhân: điều dưỡng, kỹ thuật y học, y tê công cộng.... Sách cũng được dùng làm tài liệu ôn tập cho các đối tượng thi tuyển sau đại học: nghiên cứu sinh, cao học, bác sĩ chuyên khoa. Các tác giả tham gia viết cuốn sách này là các giáo sư, phó giáo sư, các giảng viên lâu năm chuyên ngành Y Sinh học - Di truyền, đặc biệt là cố| GS.TS. Trịnh Văn Bảo| đã có công lớn về chủ biên và biên soạn cuốn sách này. Trong khi biên soạn cuốn sách này, chúng tôi đã cập nhật và sử dụng những kiến thức mối, những thành tựu đã đạt được của Di truyền học nói chung và Di truyền Y học nói riêng. Tuy nhiên, cuôn sách chắc chắn còn chưa đáp ứng được yêu cầu nhiều mặt của bạn đọc, có thể có chỗ cần sửa, cần bổ sung, rất mong sự góp ý của bạn đọc và đồng nghiệp. Thay m ặt ban biên soạn PGS.TS. TRẦN THỊ THANH HƯƠNG TRƯỞNG B ộ MÔN Y SINH HỌC - DI TRUYỀN ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI 4 MỤC LỤC LỜI GIỚI THIỆU .......................................................................................................................... 3 LỜI NỐI ĐẤU ...............................................................................................................................4 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................................8 Chương 1 LƯỢC SỬ - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI (Ị GS.TS. Trinh Vãn Bảo Ị, PGS.TS. Phan Thị Hoan) 1. Lược sử của di truyền y h ọ c ................................................................................................... 9 2. Nội dung của di truyền học người ........................................................................................11 3. Phương pháp nghiên cứu của di truyền y học ................................................................... 16 Tự lượng giá ...............................................................................................................................23 Chương 2 NHIỄM SẮC THỂ VÀ BỆNH HỌC NHIỄM SẮC THỂ (I GS.TS. Trinh Vân Bảo I, PGS.TS. Phan Thị Hoan, TS. Nguyễn Văn Rực) NHIỄM SẮC THỂ CỦA NGƯỜI ..... ......................................................................................24 1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu Nhiễm sắc thể của người ....................................................... 24 2. Phương pháp xét nghiệm nhiễm sắc thể của người...........................................................25 3. Đặc điểm bộ nhiễm sắc thể của người ................................................................................27 Tự lượng giá ............................................................................................................................... 34 BỀNH HỌC NHIỄM SẮC THỂ .................................................................................................................34 1. Bệnh do rối loạn nhiễm sắc thể thường.............................................................................. 34 2. Bệnh do rối loạn nhiễm sắc thể giới tính ............................................................................45 Tự lượng giá ............................................................................................................................... 58 Chương 3 MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC (PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương, TS. Hoàng Thị Ngọc Lan) 1. Tách chiết và điện di ADN ....................................................................................................59 2. Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase Chain reaction: PCR) ..................................... 61 3. Xác định trình tự nucleotid trong phân tử ADN (Sequencing) .......................................... 62 4. Enzym giới hạn và chức năng của enzym giới hạn............................................................65 5. Lai acid nucleic...................................................................................................................... 67 6. Hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn ADN do enzym giới hạn tạo nên (Restriction fragment length polymorphisms: RFLP) ............................................................72 7. Dấu ấn ADN (DNA Fingerprinting)...................................................................................... 73 Tự lượng giá ............................................................................................................................... 74 5 Chương 4 Bộ GEN CỦA NGƯỜI (I GS.TS. Trinh Văn Bảo], PGS.TS. PHạm Đức Phùng, TS. Phan Thị Hoan) 1. Bộ gen là gi? Ý nghĩa của việc dựng bản đổ gen người ....................................................75 2. Đặc điểm bộ gen của ngưòi ..................................................................................................76 3. Một sô' phương pháp xác định bản đồ di truyền và bản đồ hình thể ..................................79 4. Cách ghi trong bản đồ gen ...................................................................................................86 5. Xác định trình tự nucleotid của ADN trong lập bản đổ gen người .....................................86 6. Dự án bộ gen người ...............................................................................................................87 Tự lượng giá ............................................................................................................................... 89 Chương 5 DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA CÁC BỆNH Ở NGƯỜI (Ị GS.TS. Trinh Văn Bảo Ị, TS. Nguyễn Thị Trang) BỆNH HEMOGLOBIN VÀ RỐI LOẠN CÁC YỂU Tố ĐÔNG M ÁU.......................................90 1. Mô hình cấu trúc và điều chỉnh biểu hiện gen của một gen tiêu biểu ồ người................ 90 2. Bệnh của hemoglobin............................................................................................................93 3. Đột biến gen gây rối loạn các yếu tố đông m á u ............................................................ 104 Tựlứợnggiá ...........................................................................................................................109 BỆNH RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH .................................................................... 110 1. Hậu quả chung do thiếu hụtenzym ................................................................................110 2. Một số bệnh rôl loạn chuyển h o á .................................................................................... 112 Tự lượng gia .......................................................................................................................... 133 Chựơng 6 DI TRUYỀN ĐƠN GEN (PGS.TS. Trần Thị Liên, PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương) 1. Phân loại c á c nhóm bệnh do rối loạn vật ch ất di truyền g ãy nên ..................................... 134 2. Các tính trạng và các rối loạn di truyền kiểu M endel.....................................................135 Tự lượng giá ...........................................................................................................................163 Chương 7 DI TRUYỂN NHÓM MÁU - c ơ SỞ DI TRỤYỂN CỦA HỆ THỐNG KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẨU NGƯỜI (PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương, PGS.TS. Trần Thị Liên) 1. Di truyền nhóm máu ......................................................................................................... 165 2. Cơ sỏ di truyền của Hệ thống kháng nguyên bạch cầu nguới - HLA ......................... 175 Tự lượng giá ........................................................................ .................................................. 178 Chương 8 DI TRUYỂN ĐA GEN VÀ DI TRUYỀN ĐA NHÂN TỔ Ở NGƯỜI (I GS.TS. Trinh Vãn Bảo I, PGS.TS. Trần Đức Phấn, PGS.TS. Trần Thị Liên) 1. Khái niệm và định nghĩa .................................................................................................. 179 6 2. Đặc điểm của di truyền đa nhân t ố ....................................................................................184 3. Một số bệnh, tính trạng di truyền đa gen ở ngưòi .............................................................186 4. Một số tính trạng, tật, bệnh di truyền đa nhân t ố ..............................................................188 5. Bằng chứng về vai trò di truyền và vai trò mỏi trường trong di truyền đa nhân t ố ..... 196 6. Dự báo nguy cơ tái hiện bệnh ỏ thế hệ s a u .......................................................................199 Tự lượng giá ............................................................................................................................. 200 Chương 9 BẤT THƯỜNG BẨM SINH (I GS.TS. Trinh Vãn Bảo], PGS.TS. Phan Thị Hoan, PGS.TS. Trần Đức Phấn) 1. Khái niệm về bất thường bẩm sin h.....................................................................................201 2. Phân loại bất thường bẩm sinh ..........................................................................................203 3. Nguyên nhân phát sinh Bất thường bẩm sinh ..................................................................205 4. Cơ chế bất thường bẩm sinh............................................................................................... 208 5. Các giai đoạn phát sinh Bất thưòng bẩm sin h ..................................................................210 Tự lượng giá ..............................................................................................................................211 Chương 10 DI TRUYỀN UNG THƯ ÍGS.TS. Trinh Văn Bào I, PGS.TS. Trần Thị Liên, TS. Hoàng Thị Ngọc Lan) 1. Ung thư: Nhóm bệnh rối loạn vật chất di truyền ...............................................................212 2. Nguyên nhân phát sinh ung th ư .........................................................................................215 3. Các cơ chế phát sinh ung th ư ............................................................................................ 217 Tự lượng giá ............................................................................................................................. 227 Chương 11 DI TRUYỀN HỌC QUẦN THỂ NGƯỜI (PGS.TS. Phạm Đức Phùng, TS. Hoànq Thị Ngoe Lan) 1. Sự đa hình của các quần thể ............................................................................................. 228 2. Các nhân tố ảnh hưởng lên tần số các a le n .......................................................................232 Tự lượng giá ............................................................................................................................. 235 Chương 12 TƯ VẤN DI TRUYỂN (Ị GS.TS. Trinh Văn Bảoị, PGS.TS. Trần Thị Thanh Hương) 1. Sàng lọc bệnh, tật di truyền (genetic screening) ..............................................................236 2. Chẩn đoán trưóc sinh ......................................................................................................... 239 3. Tư vấn di truyền (genetic counseling) ............................................................................... 241 4. Phòng bệnh, tật di truyền....................................................................................................248 5. Điểu trị bệnh, tật di truyền...................................................................................................249 Tự lượng giá ..... '....................................................................................................................256 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................... 257 7 DANH MỤC CHỮ VIET t Ắt NST Nhiễm sắc thể ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic Hb Hemoglobin PCR (Polymerase Chain reaction): phản ứng chuỗi polymerase FISH (Fluorescence in situ hybridization): lai tại chỗ huỳnh quang PHA Phytohemagglutinin IQ (Intelligence quotient): chỉ số tri tuệ TDF (Testis determining factor) yếu tố biệt hóa tinh hoàn (gen biệt hóa tinh hoàn) HLA (Human leukocyte antigen) kháng nguyên bạch cầu ngưòi Nu Nucleotid BTBS Bất thường bẩm sinh CPTTT Chậm phát triển tâm thần 8 Chương 1 LƯỢC SỬ - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ ơ DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI MỤC TIÊU 1. Nêu được lược sử phát triển của di truyền học người. 2. Nêu được các nội dung của di truyền học người. 3. Trình bày được các phương pháp nghiên cứu di truyền học người. 1. LƯỢC SỬ CỦA DI TRUYỀN Y HỌC 1.1. G iai đoạn m ở đầu Năm 1839, Schleiden và Schwan đê' xuất học thuyết tế bào với một nội dung quan trọng: "Mọi sinh vật đều được cấu tạo bởi tê bào", đó chính là nền tảng chung cho di truyền học nói chung, và cho di truyền học người nói riêng. Năm 1865, Mendel khi báo cáo vê' cấc quy luật di truyền cơ bản dựa trên các thực nghiệm của mình đã đề cập đến nhân tố di truyền. Các quy luật di truyền của Mendel đã trỏ thành quy luật di truyền chung của mọi sinh vật, và các tính trạng được di truyền theo các quy luật đó được gọi là di truyền theo Mendel (Mendelian Inheritance). Năm 1910, Morgan và các đồng nghiệp đă xác định: nhân tố di truyền mà Mendel đã đề cập chính là các gen xếp dọc thành hàng trên nhiễm sắc thể (NST) và tạo thành các nhóm liên kết, cốc gen chi phối sự hình thành tính trạng theo các quy luật khác nhau. 1.2. Lược sử củ a di tru y ền tế bào Năm 1882, W alther Flemming, nhà di truyền học tế bào người úc đã đưa ra hình ảnh minh họa đầu tiên vê' NST của người và đưa ra khái niệm phân bào nguyên nhiễm. 9 Näm 1888, Waldelayer là ngưòi đầu tiên đưa ra khái niệm NST. Năm 1912, W iniwarter kết luận nam có 47 NST và nữ có 48 NST. Năm 1923, Painter phân tích NST từ tinh hoàn của ngưòi đã có kết luận rằng: người có 48 NST, ông cũng đề xuất cơ chế NST giới X và Y ở người. Năm 1924, Levitsky đã đê' xuất công thức karyotyp để xếp bộ NST ngưòi. Năm 1956, Tjio và Levan đã nuôi cấy tế bào thai người và xác định chính xác số lượng NST của người là 2n = 46. 1.3. Lược sử p h át triển củ a di tru yền p hân tử Năm 1885, Naegeli đã đề cập đến yếu tô’ di truyền qua tế bào chất. Năm 1902, Garrod trình bày về bệnh alcapton niệu, một bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, sau đó cùng vỏi Bateson, Garrod xác định bệnh này di truyền lặn theo kiểu Mendel. Đó là bệnh đầu tiên được xác định di truyền đơn gen. Hệ nhóm máu ABO của ngưòi được Landsteiner phát hiện năm 1900. Năm 1908, Ottenburg và Epstein xác định hệ nhóm máu này di truyền đơn gen theo quy luật Mendel. Năm 1911, Wilson xác định gen gây tậ t mù màu trên NST X, đây là gen đầu tiên của người được xác định vị trí. Năm 1944, Avery đã chứng minh được chính ADN (acid deoxyribonucleic) là vật liệu mang thông tin di truyền trong hiện tượng chuyển thể của vi khuẩn. Năm 1948, Gibson phát hiện enzym bất thưòng đầu tiên di truyền lặn NST thường: đó là enzym reductase trong bệnh methemoglobin (MetHb). Cho đến nay đã biết hon 200 enzym bất thưòng. Năm 1949, Pauling cho rằng bệnh hồng cầu hình liềm liên quan với một protein bất thưòng. Đề xuất của Pauling được Ingram minh chứng vào năm 1956 khi tác giả tìm ra cấu tạo bất thưòng của chuỗi polypeptid tạo nên Hb. Đây là dẫn chứng đầu tiên về đột biến gen cấu trúc dẫn dến sự thay đổi trình tự của acid amin trong phân tử protein. Đến năm 1959 chỉ mới biết có hai Hb bất thường, cho đến nay hơn 400 dạng Hb bất thường được biết. Năm 1953, Watson và Crick đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN. Năm 1957, Kornberg phát hiện ADN polymerase. Năm 1961, M armure và Doty phát hiện hiện tượng hồi tính (renaturation) của ADN. Năm 1962, Arber lần đầu tiên cung cấp nhũng dẫn chứng về sự có mặt của enzym cắt (Restriction Enzyme). 10 Năm 1967, Gellert phát hiện enzym nôĩ ADN (DNA ligase). Năm 1972-1973, kỹ thuật tạo gen đơn dòng (DNA cloning) được phát hiện trong các phòng thí nghiệm của Boyer, Cohen, Berg... Năm 1975, Sounthern thực hiện kỹ thuật lai chuyển gel (gel transfer hybridization) để dò tìm đoạn ADN đặc hiệu. Năm 1975-1977, Sanger, Maxam và Gilberg phát hiện các phương pháp để xác định trình tự nucleotid (DNA sequencing). Năm 1981, Palm iter và Brinster thực hiện chuyển gen ở chuột; Spradling và Rubin thực hiện chuyên gen ở ruồi giấm. Năm 1985, Mullis và cộng sự đề xuất kỹ thuật nhân đoạn ADN invitro (Polymerase chain reaction). Con người với 46 NST, có số lượng gen rất lớn. Sự sắp xếp của các gen trên 46 NST đã được thông báo ở các hội nghị quốc tê vê' dựng bản đồ gen của người viết tắ t là HGM (Human Gene Mapping). Ngày 12 - 2 - 2001, hầu như toàn bộ trình tự bộ gen của người đã được xác định. 2. NỘI DUNG CỦA DI TRUYỀN h ọ c n g ư ờ i Cũng như ở các sinh vật khác, di truyền học người quan sát nghiên cứu ỏ hai mức độ: tế bào, phân tử. 2.1. Di tru y ền t ế bào Các thành tựu của di truyên tế bão đá đóng gòp phần quan trọng cho sự hinh thành di truyền học. Chọn mẫu tế bào để nuôi cấy nhằm phát hiện NST là việc làm cần thiết. Năm 1960, Moorhead và cộng sự đã đề xuất phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi với sự kích thích phân bào của PHA (phytohemagglutinin) là protein được chiết tách từ đậu tây (Phaseolus vulgaris). Phương phốp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi từ đó đến nay đã trở thành phương pháp thường quy đê nghiên cứu NST người. Có thể áp dụng các phương pháp: nuôi cấy máu toàn phần, nuôi cấy bạch cầu lympho sau khi đã tách hồng cầu, theo phương pháp nuôi cấy dài hạn. Ngoài nuôi cấy lympho bào, trong một sô trường hợp tế bào tủy xương được chỉ định để nghiên cứu NST. Do tế bào tủy là những tế bào đang phân chia nên có thể dùng phương pháp trực tiếp, nuôi cấy ngắn hạn, nuôi cấy dài hạn. 11 Nuôi cấy tế bào từ các mô khác nhau của cơ thể như mô da, thận, phổi, gan cũng được chỉ định trong một sô' trường hợp. Một sô mô cơ thể như mảnh mô bào thai, tế bào tua rau gồm nhiều tế bào đang phân chia, do vậy có thể dùng phương pháp trực tiếp, nuôi cấy ngắn hạn, nuôi cấy dài hạn. Đe phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, ngưòi ta thưòng nghiên cứu NST từ tế bào ốì nuôi cấy. Sau khi đã có nhũng phương pháp để có NST người, người ta quan tâm đến xác định chính xác vị trí của NST trong karyotyp. Qua phân tích NST, ngưòi ta thấy bằng phương pháp nhuộm thông thường chỉ cho phép xác định vị trí của của một vài NST, còn nhiều NST không xác định được, do đó người ta áp dụng kỹ thuật băng: băng G, băng Q, băng R, băng c, bàng T... Cho đến nay, kỹ thuật băng là quy trình không thể thiếu trong nghiên cứu NST. Các hội nghị di truyền ngưòi: năm 1960 ở Denver, năm 1963 ỏ London, năm 1966 ồ Chicago, năm 1971, năm 1975 ở Paris, năm 1995 ở Memphis đã đưa ra cách xếp loại NST ngưòi trong trưòng hợp bình thưòng và bệnh lý và hệ thông quốc tế về danh pháp di truyền tế bào học người (An International System for Human Cytogenetics Nomenclature). Phân tích vật thể giới: vật thể giới cũng là vấn đề được quan tâm song song với NST. Năm 1949, Barr và Bertram lần đầu tiên phát hiện chất nhiễm sắc giới tính (vật thể Barr) ở trong nhân tế bào gian kỳ. Bản chất của vật thể Barr là một trong hai NST X bị bất hoạt về di truyền. Năm 1954, Davidson và Smith phát hiện vật thể hình dùi trông (Drumstick) là phần phụ đặc biệt của bạch cầu đa nhân, thưòng chỉ có ở bạch cầu đa nhân của người nữ. Năm 1970, Pearson phát hiện vật thể Y khi nhuộm nhân tê bào nam giói bằng phẩm nhuộm huỳnh quang quinacrin phần xa của nhánh dài NST Y bắt màu huỳnh quang rất mạnh, thể hiện bằng một đốm huỳnh quang ỏ nhân tế bào gian kỳ. Vật thể giới được ứng dụng để xác định rôì loạn NST giói và còn dùng để xác định mức độ ác tính trong mô ung thư. Nghiên cứu bệnh NST: rối loạn NST tương đôi phổ biến ở ngưòi. Năm 1959, Lejeune và cộng sự đã phát hiện 3 NST 21 ở trong nhân tế bào của ngưòi mắc hội chứng Down. Sau này người ta đã phát hiện rất nhiều hội chứng do rôì loạn NST về sô lượng và cấu trúc. 2.2. Di tru yền phân tử Sơ đồ kinh điển của sự chuyển thông tin di truyền là: 12 ADN ---- ■ —> AKN —— , — ► P ro te in ------------- > Tính trang phiên mã dịch mã • Mỗi khâu trong sơ đồ nêu trên đã hình thành một lĩnh vực nghiên cứu: Nghiên cứu bộ gen (Genomics): nghiên cứu xác định vị trí của các gen và của các marker trên 24 NST của người, giải trình tự các gen. Nghiên cứu sự phiên mã (Transcriptomics): nghiên cứu quá trình phiên mã và các yếu tô' ảnh hưởng đến quá trình đó. Nghiên cứu hệ protein (Proteomics): nghiên cứu quá trình dịch mã và các yếu tô' ảnh hưởng đến quá trình đó, nghiên cứu tập hợp tấ t cả các dạng protein được mã hóa bởi hệ gen. 2.3. Di tru yền quần th ể Di truyền quần thể người nghiên cứu tần số gen, tần số các dạng đột biến NST và tần số các kiểu hình tương ứng trong trạng thái bình thường và trong trạng thái không bình thường của một quần thể nào đó. Di truyền tê bào quần thể người xác định tần sô” các dạng đột biến NST của quần thể người ố các lứa tuổi khác nhau như quần thể sơ sinh, quần thể người trưởng thành, quần thể người cao tuổi... Di truyền học người áp dụng định luật Hardy - Weinberg để xác định tần sô' gen và các kiểu hình tương ứng trong quần thể như xác định tần sô’ gen chi phối các nhóm máu, chi phôi bệnh bạch tạng, các bệnh của Hb... Di truyền học ngưòi nghiên cứu sự biến động các tần sô’ gen, tần sô’ đột biến NST. tần sô' một sô' tính trạne tương ứng trong các điều kiện không đảm bảo cho sự cân bằng tự nhiên, ví dụ có sự tác động của một số tác nhân gây đột biến, có biến động của môi trường sống. 2.4. Di tru yền m iễn d ịch Di truyền miễn dịch dùng phưdng pháp miễn dịch để nghiên cứu di truyền của ngưòi, nghiên cứu sự chi phối của di truyền trong sự hình thành kháng nguyên, kháng thể. Di truyền miễn dịch nghiên cứu sự di truyền của các nhóm máu; nghiên cứu sự di truyền trong ghép mô, ghép tổ chức, ghép cơ quan, nghiên cứu hiện tượng di truyền tính kháng nhiễm và những đặc điểm của thể tạng. Dựa vào kỹ thuật công nghệ gen, một số chế phẩm sinh học, trong đó có một số kháng nguyên và kháng thể tương ứng được tạo gen đơn dòng, được sản xuất. 13 2.5. Di tru yền dược lý Di truyền dược lý nghiên cứu sự di truyền của một số enzym chuyển hóa thuốc trong cơ thể trong trạng thái bình thường và trong trạng thái bệnh lý. Di truyền dược lý cũng nghiên cứu tác động bất thường (gây đột biến, gây quái thai...) của một sô' dược liệu, một sô' thuốc hoặc một sô’ chê phẩm sinh học. Cuối cùng, di truyền dược lý nghiên cứu biện pháp phòng và chữa các hậu quả di truyền bất thường do dùng thuốc gây nên. Các enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa thuốc cũng như các enzym khác là sản phẩm của quá trình tổng hợp protein được chi phối bởi các gen. Đột biến gen có thể dẫn đến sự tổng hợp những enzym bất thường và từ đó dẫn đến không bình thưòng trong quá trình chuyển hóa thuốc. Ngược lại một số thuốc lại có tác động đến các gen, gây đột biến, và từ đó dẫn đến những biểu hiện của kiểu hình. 2.6. Di tru yền lâm sàn g Di truyền lâm sàng nghiên cứu các bệnh di truyền nhằm đề phòng, điêu trị các bệnh đó. Đe thực hiện được nhiệm vụ này, di truyền lâm sàng thực hiện các bưốc: - Thăm khám, lập bệnh án cho ngưòi bị bệnh và có thể cho một sô người trong gia đình người bệnh. - Xây dựng gia hệ để phân tích tính chất di truyền của bệnh. - Chỉ định và thực hiện các xét nghiệm cần thiết, trước hết là những xét nghiệm di truyền. - Xác định quy luật di truyền của bệnh tữ dó dề ra các phương pháp điéu trị thích hợp. - Cho các lòi khuyên di truyền cần thiết. Trong một sô trường hợp cần thiết phải thực hiện các chẩn đoán trước sinh để xác định tình trạng của đứa trẻ ngay từ giai đoạn phôi thai. Tùy theo đối tượng nghiên cứu, phục vụ mà hình thành các phân môn của di truyền học người như: di truyền sản khoa, di truyền nhi khoa, di truyền huyết học, di truyền tâm thần... 2.7. Di tru yền u n g th ư Ung thư là một vấn đề tồn tại lớn của y học, đã và đang tập trung sự chú ý của nhiều nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau trong đó có các nhà di truyền học. Mối liên quan giữa di truyền và môi trường trong sự phát sinh ung thư vẫn chưa 14 Báng tỏ trong nhiều trường hợp. Có tác giả cho rằng: do sự tác động của các yếu tố trong môi trưòng nên đột biến xẩy ra, tạo nên những tế bào bất thường phân chịa một cách hỗn loạn từ đó dẫn đến phát sinh ung thư. Một sô tác giả khác lại cho rằng: sự biến đổi của gen là nguyên nhân làm cho cơ thể dễ tiếp thu các yếu tô’ môi trường làm cho ung thư phát sinh và phát triển. Người ta đã quan sát thấy các dạng đột biến NST như đa bội, đơn nhiễm, ba nhiễm, NST bị đứt gẫy như trường hợp NST Philadelphia (Ph1) là NST 22 bị mất ỉoạn ở nhánh dài (22q-), đoạn đứt thường nối với nhánh dài NST 9 tạo NST :huyển đoạn t(9q;22q). P h 1 gặp trong tế bào người bệnh bạch cầu tủy xương mạn tính. Nghiên cứu ADN là một trọng tâm trong nghiên cứu ung thư, hầu hết các chất gày ung thư đồng thời cũng là chất gây đột biến. Bất kỳ loại ung thư nào, dù do nguyên nhân nào thì khởi đầu phát sinh ung thư đều do các rối loạn vật chất di truyền từ mức NST đến mức gen gây nên. 2.8. Ưu sin h h ọc Galton là một trong những ngưòi đầu tiên đề xuất ưu sinh học. Theo Galton: ưu sinh học nghiên cứu những tác động có thể sửa chữa những tính chất bẩm sinh, tạo điều kiện cho những phẩm chất tốt của cơ thể phát triển. Rất nhiều tính trạng của con người được hình thành là do sự phôi hợp của những vật chất sẵn có (di truyền) và sự tác động của môi trường vi mô hoặc vĩ mô. Con ngưòi cũng chịu sự chi phối của quy luật chọn lọc tự nhiên trong mọi giai ỉoạn phát triển cá thể: một sô' những phôi thai mang gen đột biến hoặc NST bị đột biến da bị dào thải như chết hợp tử, sẩy thai, thai chết lưu... Như vậy đa có sự ;họn lọc tự nhiên ngay từ giai đoạn phôi thai để cho ra đời những sơ sinh khỏe mạnh. Sau đó là quá trình chọn lọc sau khi đẻ, một sô trẻ bị tậ t nguyền tiếp tục bị iào thải... Con người không chịu sự tác động của quy luật chọn lọc tự nhiên một cách thụ ỉộng, mà luôn tìm các biện pháp để hạn chế những tính trạng không tốt, tăng :ường những tính trạng tốt nhằm để các thê hệ sau ngày càng tốt hơn. Đó chính là nhiệm vụ của ưu sinh học đôi với con ngưòi. Thực hiện nhiệm vụ của ưu sinh học là nhiệm vụ chung của cộng đồng từ việc thực hiện các vấn đề có tính chất phong trào như kế hoạch hóa gia đình đến việc thực hiện các kỹ thuật riêng biệt như chẩn đoán trước sinh. Đê thực hiện ưu sinh học vừa phải chăm chút nguồn gen của nòi giông, vừa phải quan tâm đến điều kiện để cho các gen tốt phát triển. 15 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u CỦA DI TRUYEN Y h ọ c 3.1. Phương pháp d i tru yền t ế bào 3.1.1. Q uan sá t n h iễm sắc th ể ở kỳ g iữ a Kỹ thuật làm tiêu bản, quan sát và đánh giá NST của ngưòi được áp dụng rộng rãi từ những năm 1960. Đe phát hiện bộ NST của tế bào sinh dưỡng của người, có thể dùng tế bào trong tủy xương, tế bào bào thai, tế bào bạch cầu lympho, tế bào tua rau thai... Bạch cầu lympho ở máu ngoại vi là loại tế bào thường được dùng trong nghiên cứu NST của người. Bạch cầu lympho ở máu ngoại vi là những tế bào không còn khả năng phân chia, vì vậy phải dùng PHA để kích thích cho tê bào chuyển thành những tế bào phân chia và dùng colchicin hoặc colcemid để cho NST dừng ở kỳ giữa. Nhuộm NST bằng kỹ thuật nhuộm thông thường hoặc bằng kỹ thuật nhuộm băng. Đe quan sát NST trong quá trình tạo tinh, sau khi sinh thiết một sô' ống sinh tinh, người ta làm tiêu bản để phân tích NST ỏ các giai đoạn trong quá trình tạo tinh. Đánh giá tình trạng của bộ NST bằng đánh giá, phân tích ở kính hiển vi, ỏ các ảnh chụp theo các quy định quốc tế. 3.1.2. Q uan sá t n h iễm sắc th ể ở n h â n t ế bào g ia n kỳ Bên cạnh xét nghiệm NST kỳ giữa, xét nghiệm vật thể giới tính ả nhân tế bào gian kỳ cũng là một xét nghiệm cần thiết đế đánh giá đột biến NST. Xét nghiệm vật thể giói tính thưòng được thực hiện ở tế bào niêm mạc miệng, tế bào niêm mạc âm đạo, tế bào chân tóc... Các vật thể giới thưòng được phân tích là vật thể Barr, vật thể Y, vật thể dùi trống. Phương pháp nhân nhỏ cũng là một phương pháp để phát hiện đột biến NST khi mẫu vật không xử lý colchicin. Nhân nhỏ là một phần nhân tách ra từ phần chính của nhân tế bào, đa sô' được hình thành trong kỳ giữa của giảm phân hoặc nguyên phân do NST chậm hay đoạn NST tạo thành. N hân nhỏ nếu nhiều giống như hình ảnh vụn NST, một loại tổn thương thoái hóa. Ở kỳ trung gian, bên cạnh nhân lởn phát hiện được hình ảnh nhân nhỏ. Các xét nghiệm di truyền học tê bào là những xét nghiệm không thể thiếu trong chẩn đoán bệnh di truyền, đặc biệt bệnh do rối loạn NST. 16 3.2. P hư ơng pháp di tru y ền hóa sin h Phân tích, định lượng một sô' sản phẩm của gen như phân tích, định lượng protein: enzym, hormon, Hb... là những cơ sở cần thiết để nghiên cứu di truyền, đặc biệt trong xét nghiệm chẩn đoán một sô' bệnh tậ t liên quan. Đây là bước phân tích trung gian giữa hoạt động của gen và kiểu hình. 3.3. P hư ơng pháp di tru y ền phân tử Về nguyên lý, các phương pháp di truyền phân tử dùng trong di truyền người cũng tương tự như khi dùng ở các sinh vật khác. Người ta có thể phân tích ADN hoặc phân tích sản nhẩm của sen: Drotein. Đê phân tích ADN người ta dùng các kỹ thuật tách chiết ADN, điện di ADN, lai ADN, nhân ADN bằng PCR; xác đinh trình tự nucleotid hoặc phân tích tính đa hình (polymorphisms) của ADN. Các kỹ thuật này sẽ được trình bày trong bài "Một sô' kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong Y học". Ngoài phân tích ADN nhân, người ta còn phân tích ADN ty thể. Mẫu vật thưàng được dùng trong xét nghiệm ADN là các mẫu vật tươi như máu, dìch não tủy, dịch ối, nưốc tiểu, nhưng cũne có thể là xươne hoặc các mẫu bệnh phẩm đã cô' định. Đe phân tích protein người ta có thể dùng các phương pháp khối phổ để phân tích các phức hợp protein. Phương pháp di truyền phân tử cho phép: - Phát hiện các biến đổi của ADN, của protein. - P h á t hiệrt rtgưcìi là n h m n n g gen b ện h (p h át h iện dị hợp tủ). - Phát hiện sớm những rối loạn chuyển hóa. 3.4. P hư ơng pháp lập gia hệ và phân tích gia hệ Phương pháp nghiên cứu gia hệ dùng để phân tích một tính trạng hay một bệnh tậ t nào đó xem nó có di truyền hay không và quy luật di truyền của nó như thế nào. Theo dõi một tính trạng hoặc một bệnh tậ t qua một sô' thế hệ, ít nhất là ba th ế hệ và lập bản đồ gia hệ. Mỗi cá thể trong một gia hệ có một ký hiệu theo quy ước quốc tế, tùy theo giói tính, có bệnh tậ t đang cần phân tích hay không, có là người mang gen bệnh lặn hay không v.v... Một số ký hiệu hay dùng trong lập gia hệ được trình bày ở bảng 1.1. Bản đồ gia hệ thường được vẽ theo hình bậc thang, từ trên xuống theo thứ tự các thê hệ ông bà, cha mẹ, con cháu. 2-DITRUYẾNY HỌC 17 Mỗi thê hệ là một bậc thang, các con của một cặp bô mẹ được ghi lần lượt từ trái sang phải và từ người con lớn nhất. Đương sự là bệnh nhân đến khám và từ đó người thầy thuôc hỏi và tìm hiểu dần cốc thành viên khác trong gia hệ để lập bản đồ gia hệ, đương sự được đánh dấu bằng một mũi tên bên dưới ký hiệu. Phía bên trái mỗi thê hệ của gia hệ ghi các chữ sô' La mã để chỉ thứ tự các th ế hệ trong gia hệ. Bên dưới (phía bên phải) của từng thành viên có ghi các chữ sô' Ả rập để chỉ sô' thứ tự của thành viên trong th ế hệ đó. Khi theo dõi một tính trạng qua rất nhiều thế hệ, gồm rất nhiều cá thể, bản đồ gia hệ hình bậc thang không đủ chứa tấ t cả các cá thể, cho nên trường hợp này phải lập gia hệ theo hình cung. Trong một gia hệ có bệnh di truyền, tần sô bệnh trong gia hệ giảm dần theo mức độ huyết thống theo hệ sô' di truyền: họ hàng bậc một (bô' mẹ, anh chị em ruột, con) có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất; giảm dần ở họ hàng bậc hai (ông, bà, chú, bác, cô dì ruột, cháu ruột); rồi đến họ hàng bậc ba (anh chị em họ)... Bàng 1.1. Các kỷ hiệu dùng để lập gia hệ Ý nghĩa cùa kỷ hiệu Ký hiệu theo hệ thống quốc tế Nam giới □ Nữ giới o Không biết giới 0 Thai / \ Người lành □ o Người bênh Người kiểu hình lầnh mang gen lặn trên nhiễm sắc thể thường n 3 Người kiểu hlnh lầnh mang gen lăn liên kết nhiễm sắc thể X © Người chưa củ thông tin hoặc thông tín không đắy đủ vé tinh trạng 0 0 [ s - o Không rõ lâ con đẻ hay không V Con nuôi (không cùng huyết thống) [ □ ] C o ] Con sinh dôi một hợp tửÃ ¿ b Con sinh dôi hai hợp tử Không rõ kiểu sinh đôi lâ một hay hai hợp tử c Ỗ ) Con ngoâi hôn nhân D -r-O Û Các thế hệ 1, II, III, IV Anh chị em cúng một thế hệ 1,2,3,4... 19 3.5. P hương pháp k h ảo sát con sinh đôi Đa thai hiếm gặp ở người, khoảng 1,9% trong các chủng tộc. Tần sô’ đa thai tùy theo chủng tộc. Ở người trong sô' đa thai thì sinh đôi là chủ yếu, hiếm gặp sinh ba, sinh tư... vì vậy phương pháp khảo sốt những đứa con sinh ra do đa thai gọi là phương pháp con sinh đôi. Ở người gặp hai loại sinh đôi: sinh đôi một hợp tử và sinh đôi hai hợp tử. Sinh đôi hai hợp tử do hai trứng thụ tinh bởi hai tinh trùng rồi phát triển thành hai cơ thể. Sinh đôi một hợp tử chiếm khoảng 20 - 30% tổng sô' cặp sinh đôi. Hai đứa trẻ sinh đôi một hợp tử hoàn toàn giống nhau về vật chất di truyền nên chúng giông nhau về giới, hình thái và nhiều tính trạng khác. Hai đứa trẻ sinh đôi do hai hợp tử có những tính chất giông và khác nhau như anh chị em thường, có thể cùng giới hoặc khác giới. Tuy nhiên cũng cần lưu ý rằng sinh đôi hai hợp tử có cùng điều kiện môi trường trong quá trình phát triển phôi thai. Do đặc điểm những cặp sinh đôi như vậy nên phương pháp so sánh tính chất của những cặp sinh đôi một hợp tử với sinh đôi hai hợp tử được dùng trong di truyền người để đánh giá tác động của di truyền, đồng thời đánh giá tác động của môi trường đến sự hình thành các tính trạng của cơ thể. Một tính trạng hoặc một bệnh nào đó có thể thấy ở cả hai đứa trẻ (có sự tương hợp) nhưng cũng có thể chỉ thấy ở một trong hai đứa trẻ (không tương hợp). Dựa trên một sô' lượng lớn các cặp đẻ sinh đôi do một hợp tử và các cặp sinh đôi do hai hợp tử, Holzinger đã đưa ra công thức để tính độ di truyền (H). Độ di truyền H = % sô' cặp sinh đôi một hợp tử tương hợp % số cặp sinh đôi hai hợp tử tương hợp 100% - % số cặp sinh đôi hai hợp tử tương hợp Nếu độ di truyền H = 1, tính trạng hoàn toàn do di truyền quyết định. Nếu độ di truyền H = 0, tính trạng hình thành không có tác động của di truyền. 3.6. P hư ơng pháp q uan sát nếp vân da Nếp vân da là những nếp chìm và những đường vân nổi nhỏ nằm trên mặt da ỏ mặt trong của bàn tay và mặt dưới bàn chân bao gồm tấ t cả các ngón. Nếp vân da có thể quan sát được trực tiếp hoặc in trên giấy trắng. Nếp vân da bàn tay được chú ý nghiên cứu nhiều hơn nếp vân da bàn chân. 20 Lòng bàn tay có ba nêp gấp chính: nếp dọc, nếp ngang gần và nếp ngang xa. Đôi khi hai nếp ngang chập lại với nhau thành một nếp ngang đơn độc đi thảng qua lòng bàn tay, tính chất này hay gặp ỏ người bệnh Down và một sô” bệnh khác (hình 1.1). Hình 1.1. Hình ảnh các nếp vân da lòng bàn tay N,: nếp dọc, N2: nếp ngang gắn, N3: nếp ngang xa; 1-13: các mién chu vi lòng bân tay; Th: gò cái; H: gò út; I,II, III, IV: các gồ cùa gốc các ngón tay; a,b,c,d: các chạc ba đáy ngón 2,3,4,5; A,B,C, D: các đưởng vân chính của các chạc ba đáy ngón a,b,c,d; t: chạc ba trục t; atd: góc atd Trên m ặt da lòng bàn tay có nhiều dải vân đi kèm theo nhiều hướng khác nhau, mỗi dải vân gồm nhiều đường vân chạy song song với nhau. Ở nhiều vị trí ba dải vân tiếp xúc với nhau tạo nên các chạc ba, còn gọi là ngã ba. Ở gốc các ngón tay 2, 3, 4, 5 có bôn chạc ba ký hiệu theo thứ tự a, b, c, d. Gần gốc CUÔÎ lòng bàn tay có một chạc ba gọi là chạc ba trục, ký hiệu là t. Góc hợp thành bởi các chạc ba a, t, d gọi là góc atd. Tại mô út và các mô cái, các dải vân thưòng đi song song và hình cung hoặc thắng, một số bàn tay xuất hiện dải vân cong thành hình móc hoặc hình vòng. M ặt trong đốt thứ ba các ngón tay có những dải vân uốn cong nhiều hay ít tạo thành những hình phức tạp gọi là hoa vân. Có thể quy về ba kiểu hoa vân chính: vân vòng, vân móc và vân cung (hình 1.2). Hoa vân vòng là dải vân gồm những đưòng đi theo hình vòng tròn hoặc hình bầu dục, có hai chạc ba ở hai bên và một tâm ở giữa dải vân. Hoa vân móc là dải vân gồm những đường uốh cong như cái móc, các đường vân đi về một phía thường là hướng về phía trong của bàn tay (vân móc trụ), đôi khi hướng ra phía ngoài (vân 21 móc quay), có một chạc ba nằm ở bên đôi diện với hưống đi của dải vân, ở giữa dải vân có một khe hẹp. Vân cung là dải vân có hình cánh cung, cả hai bên đểu không có chạc ba. Ở người bình thường, vân vòng và vân móc hay gặp nhất (khoảng 49% và 50%), vân cung ít gặp (khoảng 1%). Nếp vần da có những biến đổi khá rõ rệt trong nhiều bệnh rốỉ loạn NST và một sô bệnh di truyền khác. Vân vòng (W) Vân mốc (L) Vân cung (A) (cố hai chạc ba) (có một chạc ba) (không có chạc ba) Hình 1.2. Hình ảnh hoa vân đấu ngón tay 3.7. Phương pháp di tru y ền quần th ể Bằng các điểu tra, xét nghiệm hàng loạt ở các quần thể khác nhau, các nhà di truyền học xác định được tần sô" của một sô tính trạng, ví dụ tần sô đột biến tự nhiên của NST ở ngưòi bình thường, tần sô' tậ t mù màu, tần sô' các bệnh của Hb, từ đó tính ra tần sô' gen trong quần thể. Có thể áp dụng các phương pháp điều tra dịch tễ học để đánh giá ảnh hưởng của các nhân tô” môi trường đến bệnh tậ t di truyền: Phương pháp thuần tập (cohort study) được tiến hành ở hai nhóm quần thể: một nhóm có tiếp xúc với yếu tô' nguy cơ gây bệnh, một nhóm không tiếp xúc với yếu tô’ nguy cơ gây bệnh, từ đó so sánh phân tích để đánh giá ảnh hưởng của yếu tô nguy cơ đến tần sô đột biến biểu hiện bằng tần sô’ bệnh di truyền, tần số dị tật bẩm sinh ở từng nhóm. 3.8. Thăm khám lâm sàn g b ện h d i tru yền Nhiều bệnh di truyền không chỉ biểu hiện ở một cơ quan, một phần cơ thế mà thưòng biểu hiện ỏ dạng đa dị tậ t với những thay đổi ở các phần khác nhau của cơ thể, thay đổi cả thể lực và trí lực, vì vậy bệnh án di truyền liên quan đến nhiều chuyên khoa của y học. Ngưòi bác sĩ thăm khám bệnh di truyền cần mô tả chi tiết mọi thay đổi cơ thể của ngưòi bệnh. Độ biểu hiện của gen còn phụ thuộc vào thời gian, vì vậy mức độ biểu hiện của bệnh không như nhau ở các thòi điểm khác nhau. Chính vì thê thăm khám ở thời 22 điểm này không xác định được bệnh, nhưng thăm khám ỏ thòi điểm khác lại xác định được. Trên người bệnh, tùy theo mối tương quan giữa các alen (trội, lặn, trung gian...) mà các dấu hiệu của bệnh thể hiện khác nhau, vì thê cần xác định rõ môi tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Đê xác định được nguyên nhân, cơ chế của bệnh, cần tổ chức để thăm khám xét nghiệm được cho các thành viên trong gia đình người bệnh, xây dựng gia hệ để xác định được quy luật, cơ chế của bệnh. Sau khi thăm khám bệnh, người bác sĩ giải thích cho gia đình người bệnh nguyên nhân, cơ chê của bệnh, nêu rõ nguy cơ của bệnh, khả năng điều trị và cho gia đinh những lòi khuyên cần thiết. Tự LƯỢNG GIÁ 1. Nêu lược sử của di truyền y học. 2. Nêu tóm tắ t nội dung của di truyền tế bào, di truyền phân tử người. 3. Nêu tóm tắt nội dung của di truyền quần thể người, di truyền miễn dịch, di truyền dược lý, di truyền lâm sàng. 4. Nêu tóm tắ t nội dung của di truyền học trong ung thư, ưu sinh học. 5. Trình bày phương pháp di truyền tế bào. 6. Trình bày phương pháp di truyền hóa sinh và phương pháp di truyền phân tử. 7. Trình bày phương pháp xây dựng gia hệ và phân tích gia hệ. 8. Trình bày phương pháp phân tích nếp vân da. 9. Trình bày phương pháp khảo sát con sinh đôi. Viết công thức tính độ di truyền H; độ di truyền H cho biết vai trò của di truyền và môi trường trong việc hình thành tính trạng, bệnh tậ t như thế nào. 10. Trình bày phương pháp di truyền quần thể và phương pháp khám lâm sàng bệnh di truyền. 23 Chương 2 NHIỄM SẮC THỂ VÀ BỆNH HỌC NHIỄM SAC THE NHIỄM SẮC THỂ Củ a n g ư ờ i MỤC TIÊU 1. Trình bày được nguyên tắc chung đê làm tiêu bản N S T của người. 2. Trinh bày được các bước làm tiêu bản N S T từ tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi. 3. Trinh bày được các tiêu chuẩn để xếp bộ N ST của người. 4. Nêu được các quy định quốc tế về xếp bộ N ST của người. 1. S ơ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN c ứ u NHIẺM s a c t h e c ủ a n g ư ờ i Có thể tóm tắt thành tựu chính của di truyền tế bào học sau năm 1956 như sau: - Năm 1959, Lejeune khám phá ra thể ba nhiễm (trisomy) 21 trong hội chứng Down; Ford và cộng sự cùng Jacobs và Strong khám phá ra karyotyp XXY của người bị hội chứng Klinefelter và karyotyp x o của ngưòi bị hội chứng Turner. - Năm 1960, Moorhead và cộng sự công bô' phương pháp làm tiêu bản NST từ lympho bào nuôi cấy ngắn hạn với việc dùng PHA để kích thích phân bào. - Hai thể ba nhiễm NST thường là thể ba nhiễm 13 và thể ba nhiễm 18 đã được Patau và Edwards xác định. 24 - Cùng năm 1960, Nowell và Hungerford đã mô tả NST Philadelphia (mất đoạn nhánh dài của NST 22) trong bệnh bạch cầu thể tủy mạn tính (Chronic myeloid leukemia). - Năm 1963, hội chứng mèo kêu, một hội chứng do bị m ất đoạn nhánh ngắn của NST sô’ 5 (5p~), lần đầu tiên được phát hiện bởi Lejeune và cộng sự. - Năm 1964 - 1965, Schroeder và cộng sự (1964), German cùng cộng sự (1965) đã phát hiện tính di truyền của sự không bền vững NST gia tăng trong hội chứng thiếu máu Fanconi và Bloom. Jacob cho rằng: hiện tượng tâm lý bệnh tội phạm có liên quan tới các cá nhân nam XYY. - Năm 1968 - 1970, là sự ra đòi của các kỹ thuật nhuộm băng cho khả năng đánh giá chính xác tối từng chiếc NST trong bộ NST. Từ thập kỷ 1980, sự ra đời của phương pháp gọi là FISH (Fluorescence in situ hybridization - lai tại chỗ huỳnh quang) đã mở ra một bưốc đi mỏi. Phương pháp FISH đã đưa di truyền tế bào học sang một giai đoạn mới, giai đoạn kỹ thuật di truyền phân tử vào di truyền tế bào và một chuyên ngành mới ra đòi: di truyền tế bào phân tử, chuyên ngành trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử. Do di truyền tế bào học lấy đối tượng chính là nhân tế bào và cụ thể hơn là NST của tế bào cho nên nó phải quan tâm chủ yếu đến chu kỳ tế bào. Trong chu kỳ tê bào thì các giai đoạn được dùng nhiều nhất là gian kỳ và kỳ giữa, thỉnh thoảng có dùng kỳ sau. Ngày nay do sự phát triển của một số kỹ thuật nhuộm băng nên kỳ giữa (metaphase) trước kia gặp ngẫu nhiên nay người ta đã có kỹ thuật (tể làm tiêu bản có kỳ giữa sâm (prometaphase) và kỳ đầu (prophase). 2. PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM NHIẺM s a c t h ê ’ c ủ a n g ư ờ i 2.1. N guyên tắc ch u ng - Những mô dùng làm tiêu bản NST phải là những mô có nhiều tế bào đang phân chia: tủy xương, mô bào thai, mô tinh hoàn... - Những mô đã có nhiều tế bào đang phân chia có thể áp dụng phương pháp trực tiếp: làm tiêu bản NST ngay hoặc nuôi cấy ngắn hạn. Nhưng với những mô còn ít tế bào phân chia thì phải áp dụng phương pháp nuôi cấy dài hạn, với các tiến trình chi tiết khác nhau tùy từng loại mô, tùy loại tế bào. ĐỐI với những mô gồm các tê bào không còn khả năng phân chia phải kích thích cho tế bào phân chia. 25 - NST có số lượng và hình dạng rõ nhất và điển hình nhất ở kỳ giữa trong quá trình phân chia của tế bào, do vậy trưốc khi thu hoạch tế bào phải làm cho các tê bào dừng lại ở kỳ giữa bằng dung dịch colcemid hoặc colchicin. - Phải dùng sốc nhược trương để phá vỡ màng tế bào để đảm bảo cho NST có thể dàn đều trên một diện tích và tách ròi từng chiếc. Dung dịch nhược trương thường được dùng là KC1 0,075M hoặc natri citrat 1%. - Định hình tê bào bằng dung dịch carnoy: 3 phần methanol + 1 phần acid acetic hoặc hỗn hợp alcol - clorofoc - acid acetic tỷ lệ 6 : 3 : 1. - Dàn những tê bào lên tiêu bản và nhuộm bằng phẩm nhuộm nhân, ví dụ: giemsa, orcein acetic, carmín acetic... hoặc xử lý tiêu bản bằng các phương pháp nhuộm băng. 2.2. Phương pháp làm tiêu bản n hiễm sắc th ể từ t ế bào bạch cầu lym pho m áu n goại vi 2.2.1. Lấy m ẫ u vát Lấy máu theo quy định vô trùng từ tĩnh mạch hoặc đầu ngón tay, hoặc gót chân đôi vỏi trẻ sơ sinh. Dùng heparin để chống đông. 2.2.2. P hương p h á p cấy lym pho bào Lympho bào ở máu ngoại vi là những tê bào không còn khả năng phân chia, vì vậy cần phải kích thích để tế bào chuyển dạng và phân chia. Người ta đã dùng PHA, để làm chất kích thích phân bào. Có nhiều phương pháp cấy lympho bào: cấy máu toàn phần, cấy lympho bào đã tách khỏi hồng cầu. Ở đây chúng tôi giới thiệu phương pháp cấy máu toàn phần. 2.2.3. Các bước của q u á trìn h nuôi cấy được th ự c hiện trong điều kiện vô trù n g 2.2.3.1. Nuôi cấy tế bào - Môi trường nuôi cấy gồm: môi trường Parker hoặc F10, hoặc F12: 8 ml, huyết thanh AB hoặc huyết thanh bê: 2 ml, 1 - 2 giọt PHA, 5 - 6 giọt máu toàn phần. - Đặt các týp nuôi cấy hoặc lọ nuôi cấy trong tủ ấm 37° c thời gian 48h hoặc 72h. - Cho dung dịch colcemid hoặc colchicin vào lọ cấy trưổc khi thu hoạch 2h đê làm dừng các tế bào đang phân chia ỏ kỳ giữa. 2.2.3.2. Các bước thu hoạch tế bào - Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi ở phía trên để lại phần cặn tế bào rồi cho dung dịch nhược trương (KC1 0,075M) vào để phá vỡ màng tế bào. 26 - Sau khi dùng sốc nhược trương, ly tâm loại bỏ dịch nổi phía trên để lại phần cặn tế bào. Phần cặn tế bào được định hình bằng dung dịch carnoy. Bưỏc định hình tê bào được lặp lại 3 lần. - Sau khi ly tâm loại bỏ dịch nổi ỏ phía trên đê lại phần cặn tê bào, tế bào được trộn đều và dàn lên tiêu bản. Tiêu bản có thê được nhuộm bằng giemsa theo phương pháp nhuộm thông thường hoặc phương pháp nhuộm băng. 2.3. P hương pháp p hân tích tiêu bản n hiếm sắc th ể người Phương pháp đánh giá tiêu bản NST là chung cho mọi phương pháp nuôi cấy. Đê đánh giá NST có cốc bước cơ bản sau đây: - Quan sát tiêu bản NST ở dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Tìm các tế bào ở kỳ giữa có các NST dàn đều để đếm sô’ lượng NST trong tế bào đó. Trung bình cho mỗi mẫu phải đánh giá ít nhất 30 cụm kỳ giữa, trong trường hợp cần thiết phải phân tích 100 cụm kỳ giữa. - P hát hiện và phân tích các rối loạn cấu trúc NST trong khi đếm sô’ lượng NST. - Lập karyotyp. + Chụp ảnh một sô' cụm kỳ giữa, in phóng ảnh, cắt ròi từng chiếc NST, sau đó xếp từng cặp NST theo quy định quốc tế. Phương pháp xếp bộ NST như trên được gọi là phương pháp lập karyotyp. + Phân tích karyotyp ở kính hiển vi với phần mềm đặc hiệu của máy vi tính. - Tổng hợp các đánh giá ở kính hiển vi và các phân tích karyotyp kết hợp với các th ố m lcham lâ m oàng, n gư ời p h ụ trách xót n gh iôm ch o k ế t lu ậ n vồ bô N S T ngưòi được xét nghiệm. 3. ĐẶC ĐIỂM BỘ NHIỄM SAC THE CỦA NGƯỜI 3.1. Tiêu ch u ẩn đ ể xếp bộ n h iễm sắc th ể người Để xếp bộ NST ngưòi phải căn cứ vào 3 tiêu chuẩn sau đây: - Kích thước (chiều dài) của NST. Chiều dài của NST giảm dần từ đôi số 1 đến đôi sô 22. Cặp số 23 là cặp NST giới tính. - Chỉ sô tâm: Chiều dài nhánh ngắn p Chỉ sô tâm = — ---------------------------— = --------- Tổng sô' chiều dài NST p + q p: chiều dài nhánh ngắn; q: chiều dài nhánh dài. 27 - Chiều dài tương đôi của NST: đó là tỷ lệ giữa chiều dài của một NST nào đó so với chiều dài tổng cộng của bộ NST đơn bội có chứa NST X, tính theo phần nghìn trên cùng một tế bào. Ở tế bào soma của ngưòi có 46 NST, 46 NST này có thể chia thành 3 nhóm căn cứ vào vị trí của phần tâm: - Nhóm tâm giữa (metacentric): chiều dài của nhánh ngắn = chiều dài của nhánh dài (p = q). - Nhóm tâm lệch (submetacentric): chiều dài của nhánh ngắn ngắn hơn chiều dài của nhánh dài (p < q). - Nhóm tâm đầu (acrocentric): chiều dài của nhánh ngắn rất ngắn như không có. Ngoài những tiêu chuẩn kể trên, người ta còn quan tâm đến các đặc điểm khác như phần eo thắt thứ hai trên NST (phần eo thắt thứ nhất là phần tâm), có vệ tinh hay không, vị trí của các băng trên NST. Cũng cần lưu ý khi xếp bộ NST là một sô NST có tính đa hình. 3.2. Các quy định quốc tế về xếp bộ nhiễm sắc th ê người Tại hội nghị tổ chức ỏ Denver (1960), ở London (1963) và ở Chicago (1966), các nhà di truyền tế bào học đã thông nhất với nhau: 46 NST người được xếp thành 7 nhóm, ký hiệu là A, B, c, D, E, F và G, theo 3 tiêu chuẩn đã nêu ỏ phần trên. Nhóm A có 3 cặp NST có kích thước lốn nhất, gọi tên từ sô’ 1 đến sô' 3. Cặp sô' 1: tâm giữa, cặp HÔ 2: tâ m lệch , cộp sô* 3: tâ m giữa. Nhóm B có 2 cặp NST số 4 và sô' 5. Các NST trong nhóm này có kích thưóc lớn và không phân biệt được về chiều dài. Chúng đều có tâm lệch. Nhóm c có 7 cặp NST, bao gồm từ sô 6 đến số 12 là các NST có chiều dài trung bình. NST X cũng được xếp vào nhóm này. Tất cả các NST thuộc nhóm c đều tâm lệch, khó phân biệt giữa chúng với nhau. Nhóm D có 3 cặp NST sô’ 13, 14 và 15. Tất cả các NST thuộc nhóm này có kích thước trung bình và đều là NST tâm đầu, có vệ tinh gắn vào nhánh ngắn. Khó phân biệt giữa chúng vối nhau. Nhóm E có 3 cặp NST sô 16, 17 và 18, các NST này tương đối ngắn. NST sô 16 có tâm giữa, còn cặp sô 17 và 18 có tâm lệch. Nhóm F có 2 cặp NST số 19 và số 20. cả hai NST này có kích thước ngắn và đều có tâm giữa. 28 Nhóm G có 2 cặp NST sô" 21 và sô’ 22. Các NST có kích thưỏc ngắn, đều có tâm đầu và có vệ tinh. NST Y cũng được xếp vào nhóm này. Hai chromatid của NST Y xếp song song hơn so vối NST của nhóm G. NST Y không có vệ tinh. Ký hiệu mô tả bộ nhiễm sắc thê (công thức nhiễm sắc thể hay công thức nhân, karyotyp): đế mô tả bộ NST của một tê bào sinh dưỡng (tế bào soma) thì đầu tiên là viết sô' lượng NST, tiếp theo là dấu phẩy (,) rồi đến NST giới. Nếu có bất thường về số lượng hoặc cấu trúc NST thì tiếp đó là dấu phẩy (,) rồi đến ký hiệu bất thường và NST bị bất thường. Nếu là bất thường sô’ lượng NST giới thì sau khi viết sô” lượng bộ NST và sau dấu phẩy viết luôn công thức NST giới. Ví dụ: 47.XXY. Nếu tế bào bị bất thường liên quan đến nhiều NST thì thứ tự các mô tả bất thường là: NST giới, NST có sô' thứ tự nhỏ viết trước. Ví dụ: 49, XXY, +13, +19 (Xem phần ký hiệu bộ NST) ■ C A 1 - * - , . ụ (1 IX li U 1 2 3 4 5 c ụ ụ u n Kí K *» 6 7 8 9 10 11 12 D | A AA Ab * * a « * » 13 14 15 16 17 18 F ** wv 20 An 6 h ầ 21 22 x x Hình 2.1. Karyotyp của người nữ bình thường (Phướng pháp nhũôm thường) 3.3. Các kỹ th u ật b ăng và cách gọi tên băng 3.3.1. Kỹ th u ậ t băng (b a n d in g techniques) Bằng phương pháp nhuộm thông thường chỉ có thể phân biệt được một sô nhỏ NST trong bộ NST của người, ví dụ các NST của nhóm A và nhóm E, còn hầu hết các NST khác khó xác định chính xác vị trí của chúng. Vì vậy từ cuối những năm 60, đầu năm 70, một sô’ kỹ thuật băng đã được đề xuất và áp dụng. Cơ sở của mọi kỹ thuật băng là cấu trúc và hoạt động của ADN trong NST. Như chúng ta đã biết, trên NST có những vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin), có những vùng nhiễm sắc thực (euchromatin). Khi nhuộm bằng một số thuốc nhuộm 29 nhân thì sau khi đã được xử lý bằng những phương pháp khác nhau, vùng dị nhiễm sắc và vùng nhiễm sắc thực bắt màu thuốc nhuộm khác nhau, thể hiện bằng những băng sẫm và những băng nhạt ở từng đoạn của NST. Cho đến nay đã có các kỹ thuật băng: - Băng Q: tiêu bản NST được nhuộm bằng dung dịch phẩm nhuộm huỳnh quang (quinacrin m ustard 0,05% hoặc quinacrin dihydrocloric 0,5%), quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang thấy các băng phát sáng huỳnh quang và băng tối xen kẽ đặc trưng dọc theo chiều dài NST. Dựa vào sô' lượng, kích thước, vị trí và độ phát quang của các băng đặc trưng cho từng NST mà nhận biết, phân biệt được các NST khác nhau và các vùng tổn thương, bất thường trên NST. - Băng G: tiêu bản NST được xử lý bằng dung dịch enzym phân giải protein như trypsin hoặc a - chyraotrypsin, hoặc xử lý bằng ion như xử lý với các dung dịch muối nóng, dung dịch kiềm. Sau đó tiêu bản được nhuộm bằng thuốc nhuộm giemsa. Quan sát ở kính hiển vi quang học thấy các băng bắt màu thuốc nhuộm sẫm và nhạt đặc trưng trên từng NST. số lượng, vị trí, kích thước của các băng đặc trưng cho từng NST. Tiêu bản lưu giữ được bền lâu hơn, tiện cho việc nghiên cứu. - Băng R: tiêu bản NST được xử lý bằng các dung dịch earle lần lượt với pH 5,3 và 6,5 ở 87°c, rửa tiêu bản rồi nhuộm bằng giemsa, quan sát dưới kính hiển vi quang học. Hình ảnh các băng sẫm và nhạt xuất hiện trên NST ngược vổi hình ảnh của băng G. - Băng C: tiêu bản NST được xử lý bằng dung dịch muối hoặc kiềm và nhiệt độ cao, sau đó nhuộm bằng giemsa, quan sát dưới kính hiển vi quang học. Kỹ thuật này nhuộm đặc hiệu với vùng dị nhiễm sác ở vị trí tâm, eo thứ cấp của các NST sô" 1, 9, 16 và nhánh dài của NST Y. - Băng T: (T là term inal là tận cùng tức là đầu m út của các NST) kỹ th u ậ t này ra đời năm 1973 (Dutrillaux) được cải tiến từ kỹ th u ậ t băng R. Nó giúp cho phân biệt được một sô' trong các băng của kỹ thuật băng R, đặc biệt là các băng kháng sự biến tính (sợi ADN không tách nhau). Kết quả là sau khi nhuộm xong các NST chỉ biểu hiệri một sô' băng được nhuộm màu, phần lớn nằm ở đầu mút NST đặc biệt là đầu mút nhánh ngắn NST số 4, 7 nhánh dài NST sô’ 8, 9, 11. Một vài nhánh ngắn NST tâm đầu cũng có thể bắt màu đậm. - Băng N và phương pháp nhuộm bạc: có hai phương pháp: không dùng nitrat bạc, dùng nitrat bạc và phải trải qua giai đoạn thuốc hiện. Với phương pháp băng N, tất cả các chromatid đều nhạt vừa phải, chỉ có những phần chứa gen sao mã ARN - ribosom, và các nhánh ngắn của các NST tâm đầu là bắt màu đậm. 30 Bằng kỹ th u ật nhuộm băng, có thể xác định chính xác vị trí của tấ t cả các NST trong karyotyp. Ở hầu hết các phòng thí nghiệm, kỹ thuật băng G (đôi khi gọi là GTG: băng G, xử lý bang trypsin và nhuộm bằng giemsa) được thực hiện đầu tiên, sau đó nếu cần mối sử dụng các kỹ thuật khác. Nói chung, khi dùng băng G, các băng nhạt thể hiện vùng giàu chất nhiễm sắc thực, các băng sẫm thể hiện vùng tập trung chất dị nhiễm sắc. Khi dùng kỹ th u ậ t băng, cần chú ý rằng một sô' băng trên NST có sự khác nhau giữa các NST về độ lớn, độ bắt màu, có thê di truyền tính chất này từ bô’ mẹ sang con theo kiểu di truyền Mendel. Đó là hiện tượng dị hình (heteromorphism) và đôi khi được dùng như một “m arker” đặc trưng cá thể. Hình sau đây trình bày sơ đồ một sô’ băng vối kỹ thuật băng G và R. Băng R Băng G 1 1 >p I t - J LU Hình 2.2. Sơ đố NST và vị trí các băng trên NST 3.2.2. C ách g oi tên bá n g n h iễ m sắc thê NST gồm hai chromatid dính vối nhau ở phần tâm. Phần tâm chia NST thành hai nhánh: nhánh dài ký hiệu là q, nhánh ngắn ký hiệu là p. Trên các nhánh có các vùng, vùng được đánh sô từ 1 trồ đi và từ tâm ra ngoài. Trong mỗi vùng có các băng (sẫm hoặc nhạt), các băng trong vùng cũng được đánh số từ 1 và từ phía tâm ra. Các vùng lại được chia thành các băng phụ và có thể chia băng dưới phụ nữa. Đe biểu thị một điểm trên NST, người ta dùng các ký tự sau: số của NST, ký hiệu nhánh, sô" của vùng, sô' của băng. Bốn ký tự này viết liên tục, nếu có thêm dưới băng thì sau 4 ký tự trên là dấu chấm rồi đến số của dưới băng. Ví dụ: 8p22: NST số 8, nhánh ngắn, vùng 2, băng 2. Ip32.12: NST số 1, nhánh ngắn, vùng 3, băng 2, băng phụ 1, băng dưói phụ 2. 31 Tại hội nghị ở Paris năm 1971 và 1975, theo hệ thống quốc tê về danh pháp di truyền tế bào ngưòi (2005), các nhà di truyền tê bào học đã bổ sung thống nhất về sự phân vùng, băng NST và cách ghi cốc ký hiệu về các rối loạn của NST. Sau đây giới thiệu một sô' ký hiệu thường dùng theo các quy định này. 3.3.3. N hữ ng ký hiêu bô nhiễm sắc th ể A... G Nhóm của NST 1... 22 Cặp NST X và Y NST giới tính / Sự phân tách những dòng tế bào trong cùng một cá thế p Nhánh ngắn của NST q Nhánh dài của NST + NST thừa NST thiếu r NST hình vòng i NST đểu s Vệ tinh t Chuyển đoạn ace Đoạn không tâm cen Phần tâm die Hai tâm h eo thắt thứ hai del Mất đoạn dup Nhân đoạn Chỗ gẫy :: Gẫy - nối lại -> “từ... đến” mar NST đánh dấu (marker) mat Nguồn gốc từ mẹ pat Nguồn gốc từ bố der Xuất phát từ ins Xen đoạn inv Đảo đoạn rcp Tương hỗ 32 - Rôi loạn về sô' lượng 46,XX 46,XY 47,XX,+21 47,XY,+13 47.XXY 45,X 46,XY/45,X Karyotyp người nữ bình thường Karyotyp người nam bình thường Người nữ có thừa một NST sô' 21 Người nam thừa một NST sô’ 13 Người nam thừa một NST X (Hội chứng Klinefelter) Người nữ thiếu một NST X (Hội chứng Turner) Thế khảm với hai dòng tê bào 45,x/46,xx/47,xxx Thể khảm vối ba dòng tế bào - Rối loạn về cấu trúc + Mất đoạn cuối: 46,xx,del (1) (q21) hoặc 46,xx,del (1) (pter —> q21:) Mất đoạn cuối của NST sô 1, với điểm đứt trong vùng 2, băng 1 của nhánh-dài. + NST đều: 46,X,i(Xq) hoặc 46,X,i(X) (qter —> cen -> qter) NST đều nhánh dài của NST X. + Đảo đoạn ngoài tâm: 46,XY,inv (2) (p21ql3) hoặc 46,XY,inv (2) (pter p21::ql3 —> p21::q31 -> qter) Đảo đoạn của NST số 2 giữa 2 điểm đứt vùng 2, băng 1 của nhánh ngắn và vùng 3, băng 1 của nhánh dài. + NST hình vòng: 46,XY,r(2) (p21ql3) Hình vòng NST sô’ 2 nôi liền chỗ đứt ở vùng 2, băng 1 của nhánh ngắn với vùng 1 băng 3 của nhánh dài. + Chuyển đoạn tương hỗ: 46,XY,t(2;5) (q21; q31) hoặc 46,XY,t(2;5) (2pter -* 2q21::5q31 —> õqter; 5pter -» 5q31::2q21 -» 2qter) Chuyển đoạn tương hỗ giữa NST sô' 2 với NST sô' 5, đoạn đứt ỏ vùng 2 băng 1 của nhánh dài NST số 2 và ở vùng 3 băng 1 của nhánh dài NST sô' 5. + Chuyển đoạn hòa nhập tâm: 45,xx,t(13;14) (p ll; q ll) hoặc 45,xx,t(13;14) (13qter -> 13pll::14qll -> 14qter) Hòa nhập tâm cân bằng giữa NST số 13 và NST số 14. Đoạn đứt rất gần với phần tâm nhánh ngắn NST sô 13 và trên nhánh dài của NST sô’ 14. 3- DI TRUYẾN Y HỌC 33 Tự LƯỢNG GIÁ 1. Trình bày nguyên tắc chung làm tiêu bản NST của người. 2. Trình bày phương pháp làm tiêu bản NST từ tê bào bạch cầu lympho máu ngoại vi. 3. Trình bày các tiêu chuẩn để xếp bộ NST của người. 4. Trình bày cốc quy định quốc tế về xếp bộ NST của người. BỆNH HỌC N H IỄM SAC THE MỤC TIÊU 1. Trinh bày được triệu chứng lâm sàng, di truyền tế bào và tiên lượng của các hội chứng liên quan đến rối loạn N S T thường. 2. Trinh bày được chức năng nhiễm sắc thê X và Y. 3. Trinh bày được vật thê giới tính ở người. 4. Trình bày được triệu chứng lăm sàng, di truyền tế bào và tiên lượng của các hội chứng liên quan đến rối loạn N S T giới tính. 5. Trình bày được các hiện tượng lưỡng giới giả và lưỡng giới thực. 1. BỆNH DO RỐI LOẠN NHIEM s ắ c t h e t h ư ờ n g Rối loạn NST trong tê bào, nhiều trường hợp được sửa chữa nên không biểu hiện ra kiểu hình. Những bệnh NST đã được nhận biết chỉ mối là một phần của rối loạn NST đã xẩy ra. Rối loạn NST xẩy ra trong suốt quá trình từ giai đoạn phôi thai, giai đoạn sơ sinh và các giai đoạn phát triển tiếp theo của cá thể. Cơ thể con ngưòi cũng như ở mọi sinh vật khác chịu mọi sự chi phối của quá trình chọn lọc diễn ra suốt quá trìn h phát triển cá thể. Qua nhiều điều tra nghiên cứu người ta ước tính có khoảng 50% trứng th ụ tinh có NST bị rối loạn, khoảng 90% phôi thai có NST bị rối loạn bị đào thải sớm hoặc muộn bằng hiện tượng sẩy thai, phần còn lại tiếp tục bị đào thải với những thai chết lưu, chết chu sinh, chỉ còn một phần nhỏ phôi thai có NST bị rối loạn được ra đòi. Theo ưốc tính có 34 khoảng 1/200 sơ sinh có NST bị rôi loạn. Những sơ sinh mang NST rốĩ loạn có những biếu hiện bệnh lý, tùy mức độ bệnh nặng hay nhẹ mà có thể tiếp tục bị chết sau khi sinh, sống được một thời gian hay có thể sổng đến giai đoạn trưởng thành được. Chính vì có sự chọn lọc tự nhiên như vậy nên sô người bị bệnh NST được phát hiện có không nhiều lắm, nhưng rối loạn NST liên quan với sự biến đổi của nhiều gen do vậy thường biếu hiện thành nhiều bệnh tật ở nhiều phần của cơ thế, ảnh hưởng đến hình thái chức năng của cơ thể, ảnh hưởng đến khả năng sống. Như đã biết, nguyên nhân của mọi dạng rối loạn là do tốc động của một sô’ tác nhân độc hại, tác nhân bất thường trong môi trường, trong cơ thế. Vì vậy khi môi trường bị ô nhiễm, cơ thể chịu nhiều tác động thì tần sô rốỉ loạn gen cũng như rôì loạn NST tăng cao và bệnh tậ t do rối loạn NST cũng như rôi loạn gen tăng lên. Phần sau đây trình bày một vài bệnh tậ t NST thường, đã được phát hiện và được mô tả nhiều. Ở trẻ em sau khi sinh, không gặp monosomi (2n - 1) NST thường, một sô’ thê ba nhiễm (2n + 1) NST thường, đã được mô tả. 1.1. Hội ch ứ n g D ow n Hội chứng Down hay gặp nhất trong các hội chứng có biểu hiện rối loạn NST ở trẻ sơ sinh sông. Năm 1846, Seguin lần đầu tiên mô tả những đặc điểm hình thái của bệnh với tên gọi “Furfuraceous Idiocy”. Năm 1866, John Langdon Down đã mô tả một sô bệnh nhân chậm trí tuệ với những dấu hiệu về hình thái rất đặc trưng: mặt tròn, khe mát xếch, nếp quạt, hình ảnh bất thường về nếp gấp ở lòng bàn tay và giảm trương lực cơ... Năm 1959, Lejeune và cộng sự đã phát hiện ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có 1.1.1. Tần sô' Hinh2.3. Bệnh nhân mắc hội chứng Down với 3 NST 21 47 NST và thừa 1 NST sô'21. Hội chứng Down gặp khoảng 1/700 - 1/800 trẻ SÖ sinh. Tần sô' này không có sự khác biệt nhau giữa các chủng tộc và giữa các tầng lớp xã hội trên th ế giới. 1.1.2. Tỷ lê giới tính: 3 nam: 2 nữ. 35 1.1.3. Triệu chứ ng lâm sà n g Hội chứng Down có những biểu hiện điển hình dễ nhận biết: Đầu nhỏ, ngắn, mặt tròn, gốc mũi tẹt, khe mắt xếch, nếp quạt, khẩu cái hẹp, vòm cung cao, lưõi to và dầy hay nứt nẻ, thường thè ra ngoài làm cho miệng không đóng kín (nửa mở). Tai nhỏ, có khi biến dạng, vị trí thấp. Cổ ngắn, gáy phẳng rộng. Bàn tay rộng, các ngón ngắn. « / - ế 8 i v % > * ■ „ rt * » V I / /V 'i if ii----------- 1? l ĩ 'ỉ ịị II ịị-ĩl u Ị? íô 1 0 « 3 *ẩ è í — D E 15 * » — ĩ « 1 X V Hình2.4. Karyotyp của bệnh nhân Down: 47, XY, + 21 (Phương pháp nhuộm băng G) Chậm phát triển trí tuệ, chỉ sô” IQ trung bình khoảng 30 - 50. Giảm trương lực cơ và nhão dây chằng. Nêp vân da bàn tay: nếp ngang duy nhất ở lòng bàn tay, có thể gặp ở một hoặc cả hai bàn tay. Chạc ba trục ở vị trí cao thường gặp ở vị trí t”. Tần sô” hoa vân ở mô út tăng. Thường gặp là dị tậ t tim, tần số được xếp theo thứ tự là thông liên thất, thông liên nhĩ, còn ông động mạch. Dị tật ông tiêu hóa: chủ yếu là hẹp tá tràng, không hậu môn và phình to đại tràng (Megacolon). Người ta cũng đã xác định vị trí các Hình 2.5. Vị trl các gen trên NST 21 có liên quan đến hội chứng Down gen trên NST 21 liên quan đến hội chứng Down: SOD-1; Gart; ets-2; a-A-crystalline; pfkl. 1.1.4. Di truyên tê bào hoc - Khoảng 92% trường hợp là thể ba nhiễm 21 thuần: 47,xx,+21 hoặc 47.XY.+21. Thê ba nhiễm 21 này xẩy ra do rối loạn sự phân ly cặp NST 21 trong quá trình tạo giao tử, karyotyp của bố mẹ là bình thường. Khoảng 1% những trường hợp, người ta có thê quan sát thấy thể khảm vối dòng thể ba nhiễm 21 rất ít ỏ một tron g h ai bô" m ẹ hoặc rối loạn ciVu trúc rủa các N S T k h á c (k h ôn g liê n q u an đôn NST21) trong bộ NST. - Khoảng 2 - 3% trường hợp là thể khảm vối 2 dòng tê bào: một dòng tê bào chứa 46 NST và một dòng tế bào chứa 47 NST, thừa 1 NST số 21:46, XX/47, XX, +21 hoặc 46.XY/47, XY, +21 hoặc thể khảm xẩy ra do rôi loạn phân ly cặp NST 21 trong quá trình phân cắt hợp tử. Kết quả tạo nên dòng tê bào thể ba nhiễm 21 bên cạnh dòng tế bào bình thường, dòng tê bào monosomi 21 bị loại bỏ. - Khoảng 4 - 5% trường hợp là thể chuyển đoạn, trẻ mắc hội chứng Down thể này có 46 NST vối 2 NST sô' 21 và NST 21 thứ 3 được chuyển đoạn với các NST tâm đầu khác trong bộ NST (hay gặp là NST sô' 13, 14 hoặc 15 thuộc nhóm D hoặc sô 21, 22 thuộc nhóm G). v ề triệu chứng lâm sàng, không khác so với bệnh Down do thê ba nhiễm 21 thuần, nhưng là bệnh có tính chất gia đình. Bô hoặc mẹ của những đứa trẻ mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là những người bình thường nhưng mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với các NST sô' 13, 14, 15 (nhóm D) hoặc NST 21, 22 (nhóm G). 37 Khả năng tạo giao tử và hợp tử ở người mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với NST 14: 45,XX(XY),t(14q;21q) được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Khả nâng tạo giao tử và hợp tử ở người mang NST chuyển đoạn giữa NST sô’ 14 và NST số 21 Người mang nhiễm sắc thể chuyển đoạn Giao tử Thụ tinh (+14, 21) Hợp tử Kiểu hình 14,1(14; 21), 21 14,21 *(14; 21) t(14;21), 21 14 14, t(14;21) 21 14, t(14;21), 21 0 + 14,21 14,14,21,21 14, t(14;2Í), 21 + 14,21 14, t(14;21), 21 14,14,21 + 14,21 14,14, t(14;21), 21 14,21,21 +14,21 14,14, t(14;21). 21,21 14,21 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (1): Binh thường. (2): Lành mang NST chuyển đoạn. (3): Hội chứng Down do chuyển đoạn. (4): Monosomi NST s6 21, chết phôi thai. (5): Thể ba nhièm NST số 14, thưởng chết phối thai. (6): Monosomi NST sổ 14, chết phôi thai. (7): Thể ba nhiễm kép NST SỔ 14,21, chết phôi thai. (8): Monosomi kép NSĨSỐ14, 21, chết phoi thai. Cơ chế di truyền hội chứng Down do chuyển đoạn t(21q;22q) cũng tương tự như trường hợp hội chứng Down do chuyển đoạn t(14q;21q). Trường hợp bô hoặc mẹ mang NST chuyển đoạn cân bằng giữa NST 21 với NST 21: 45,XX (XY),t(21q;21q). Khả năng tạo giao tử và hợp tử ở những người này hoặc là bị sẩy thai hoặc là sinh con mắc hội chứng Down. Nguy cơ sinh con mắc hội chứng Down không chỉ phụ thuộc vào kiểu chuyến đoạn mà còn phụ thuộc vào người bố hoặc mẹ mang NST chuyển đoạn. Theo một sô' tác giả, đối với trưòng hợp chuyển đoạn t(Dq;21q) hoặc t(21q;22q) thì nguy cơ là 16% nếu là người mẹ mang NST chuyển đoạn, nếu là ngưòi bố thì nguy cơ là 5%. Trường hợp chuyển đoạn t(21q;21q) kể cả ngưòi mẹ hoặc bố mang NST chuyển đoạn thì nguy cơ là 100% sinh con mắc hội chửng Down. Trường hợp mà bố hoặc mẹ đều có bộ NST bình thường (46,XX hoặc 46,XY) thì đứa con sinh ra mắc hội chứng Down do chuyển đoạn có thể là do rôi loạn mối phát sinh. Một số trường hợp do nhân đoạn cuối (q22) của NST 21 (thể ba nhiễm một phần) và biểu hiện hội chứng Down. 1.1.5. Tiên lượng Người bị hội chứng Down thường bị chết sớm vì tậ t của tim hoặc tậ t của ông tiêu hóa, thường bị nhiễm khuẩn, thường dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu. Trước đây khoảng 50% chết trong vòng 5 năm đầu, một số sống sót đến tuổi trưởng thành. Hiện nay do điểu kiện xã hội, sự chăm sóc y tế được cải thiện nên bệnh 38 nhân Down sống đến giai đoạn trưởng thành nhiều hơn, nhưng chỉ có một sô’ ít bệnh nhân nữ sinh con. Nam mắc hội chứng Down bị vô sinh. 1.1.6. N guyên n h ă n Bên cạnh các nguyên nhân do tác động của các tác nhân trong môi trường, tuổi mẹ có vai trò quan trọng: tỷ lệ con mắc hội chứng Down tăng nhanh theo tuổi mẹ: Mẹ 20 - 29 tuổi tần sô’sinh con thể ba nhiễm 21 là: 1/2000. Mẹ 30 - 34 tuổi tần sô’ sinh con thể ba nhiễm 21 là: 1/1200. Mẹ 35 - 39 tuổi tần sô sinh con thể ba nhiễm 21 là: 1/300. Mẹ 40 - 44 tuổi tần sô' sinh con thể ba nhiễm 21 là: 1/100. Mẹ trên 45 tuổi tần sô sinh con thể ba nhiễm 21 là: 1/50. Sô phụ nữ quá trẻ sinh con bi Down nhiều hơn so với phụ nữ ở độ tuổi 20 - 29. Tuối bô cao cũng có ảnh hưởng đến tần sô' sinh con bị Down. 1.1.7. C hăn đoán, p h ò n g bênh 1.1.7.1. Chẩn đoán - Dựa vào các triệu chứng lâm sàng: nhìn chung chẩn đoán lâm sàng hội chứng Down tương đối dễ dàng, tuy nhiên còn khó khăn đôi vối trẻ sơ sinh. - Dựa vào kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học với phương pháp nhuộm băng G: Đô'i với trường hợp nghi ngờ có thể tiến hành cấy mô (thường là mô da) đê phát hiện hội chứng Down thể khảm mô. 1.1.7.2. Phòng bệnh Hội chứng Down cho đến nay vẫn chưa có khả năng chữa được. Vì vậy, chẩn đoán trước sinh là nhằm hạn chê sinh ra những đứa trẻ mắc hội chứng Down. - Đôi tượng cần chẩn đoán trưốc sinh: + Tuổi của cốc cặp vợ chồng, nhất là tuổi của vợ (> 35 tuổi). + Các cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp và đẻ con dị tật, đặc biệt là đẻ con mắc hội chứng Down. + Vợ hay chồng là những người mang NST chuyển đoạn cân bằng: 45,XX(XỸ),t(Dq; 21q) hoặc 45,XX(XY)~t(21q; Gq). + Vợ hoặc chồng có tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến các chất phóng xạ, hóa chất... - Các bưóc thực hiện của chẩn đoán trước sinh (xem phần tư vấn di truyền): + Xét nghiệm sàng lọc AFP, ßHCG và uE3 trong huyết thanh mẹ (Triple test). + Siêu âm thai. + Nuôi cấy tê bào ốì để phân tích NST. + Sinh thiết tua rau để phân tích NST. 39 1.2. Hội ch ứ n g E d w ards Hội chứng thể ba nhiễm 18 được Edwards và cộng sự mô tả năm 1960. 1.2.1. T ần sô' Tần số chung của thể ba nhiễm 18 là 1/4000 - 1/8000 trẻ sinh. 1.2.2. Tỷ lê giới Tỷ lệ giói là 3 nữ: 1 nam. 1.2.3. Triệu chứ ng lãm sà n g Trẻ sinh ra thường nhẹ cân, thường đẻ non có trán hẹp, sọ dài và to, khe mắt hẹp, tai ở vị trí thấp, ít quăn và nhọn nên trông giống như tai chồn, miệng bé, hàm nhỏ và lùi ra sau. Bàn tay rấ t đặc biệt: ngón cái quặp vào lòng bàn tay, bàn tay nắm lại, ngón trỏ chùm lên ngón nhẫn. Bàn chân vẹo. Hình 2.6. Hình thái bên ngoài và đặc điểm bàn tay, bàn chân của bệnh nhân thể ba nhiễm 18 Nếp vân da rất đặc biệt: tần sô vân cung cao ở đầu ngón tay (7 - 10 ngón). Thường có nếp ngang đơn độc, chạc ba trục thường ở vị trí t’ hoặc t”. Dị tậ t kèm theo: thường có dị tậ t ỏ tim, cơ quan sinh dục, thoát vị rôn. 1.2.4. Di truyền t ế bào Khoảng 80% trường hợp là thể ba nhiễm thuần: 47,XX(XY),+18. 40 Khoảng 10% ở thể khảm: 46,XX(XY) / 47,XX(XY),+18. Khoảng 10% ỏ thể chuyển đoạn hoặc thể ba nhiễm kép, ví dụ: 48,XXY,+18. 1.2.5. Tiên lượng Rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặc chỉ sông trung bình 10 tuần. 1.2.6. N guyên n h ả n Tuổi mẹ có ảnh hưỏng rõ rệt đến tỷ lệ sinh con thể ba nhiễm 18; tuổi bô' cũng có ảnh hưởng. 1.2.7. C hẩn đoán, p h ò n g bệnh 1.2.7.1. Chẩn đoán - Dựa vào các triệu chứng lâm sàng, đặc biệt là bàn tay của trẻ bị bệnh. - Dựa vào kết quả xét nghiệm di truyền tê bào học. 1.2.7.2. Phòng bệnh Chẩn đoán trưổc sinh hội chứng thể ba nhiễm 18, bao gồm: - Siêu âm. - Nuôi cấy tê bào Ố1 để phân tích NST. - Sinh thiết tua rau để phân tích NST. 1.3. Hội chứng P atau Hội chứng thể ba nhiễm 13 được Patau và cộ n g sự m ô tả n ă m 1960 1.3.1. T ần s ố Tần số chung của thể ba nhiễm 13 là: 1/5000 - 1/10000 trẻ sinh. 1.3.2. Tỷ lệ giới Nữ mắc bệnh nhiều hơn nam. 1.3.3. T riêu ch ứ n g lă m sà n g Đầu nhỏ, nhãn cầu nhỏ hay không có Hình27 Bệnh nhâ ắc chứng thể nhãn cầu, tai ở vị trí thấp và biến dạng. ba nhiễm 13 Thường bị điếc, thường bị sứt môi hai bên, có thể nứt khẩu cái. Đôi khi bàn chân vẹo, 6 ngón ỏ bàn tay hoặc bàn chân. 41 Tâm thần vận động kém phát triển. Nếp vân da thường có nếp ngang đơn độc, chạc ba trục ở vị trí t”. Dị tật kèm theo: thường có dị tật ở tim, ở ông tiêu hóa. Bạch cầu đa nhân trung tính có nhiều phần phụ lồi ra có cuống hoặc không có cuống. 1.3.4. Di truyền t ế bào Khoảng 80% trường hợp là thể ba nhiễm thuần: 47,XX(XY),+13; 20% trường hợp là khảm: 46,XX(XY) / 47,XX(XY),+13 hoặc chuyển đoạn 13/13 do bô’ mẹ truyền cho hoặc mỏi phát sinh. 1.3.5. Tiên lượng Rất xấu, khoảng 80% trẻ thể ba nhiễm 13 chết trong năm đầu. Trong các trường hợp khảm, các biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và có thể sống lâu hơn. 1.3.6. N guyên n h â n Tuổi mẹ cũng ảnh hưỏng đến tần sô’ sinh con thể ba nhiễm 13. 1.3.7. Chẩn đoán, p h ò n g bệnh 1.3.7.1. Chẩn đoán - Dựa vào triệu chứng lâm sàng. - Dựa vào kết quả xét nghiệm di truyền tế bào học. 1.3.7.2. Phòng bệnh Chẩn đoán trưốc sinh hội chứng thể ba nhiễm 13, bao gồm: - Siêu âm. - Nuôi cấy tê bào ốỉ để phân tích NST. - Sinh thiết tua rau để phân tích NST. 1.4. Các th ể ba n h iễm k hác Ngoài 3 thể ba nhiễm đã nêu ỏ trên, còn có một sô’ thể ba nhiễm khác nhưng đa số đã gây chết phôi thai nên ít gặp, sau đây là một vài thể ba nhiễm hiếm gặp có thể thấy sau khi sinh: 1.4.1. T h ể ba nhiễm 8 Karyotyp: 47,XX,+8 42 Những biểu hiện chính: m ặt dài, môi dưới dày và trề ra, dị dạng xương và khớp, vẹo cột sống, các đốt sống biến dạng, nứt cột sống, thường dư sô' đốt sông và xương sườn, xương chậu giảm sản và hẹp, các ngón tay dị dạng. Nếp vân da ỏ tay chân của bệnh nhi sơ sinh có những nếp gấp sâu đậm. Bệnh nhân có thể sổng đến giai đoạn trưởng thành. Rất ít trường hợp là thể ba nhiễm thuần, đa sô’ ở trạng thái khảm. 1.4.2. Thê ba n h iễm 9 Karyotyp: 47,XX,+9 hoặc 47,XY,+9. Những biểu hiện chính: dị dạng phần đầu mặt: đầu nhỏ và dài, mắt sâu, khe mắt nhỏ và xếch, môi trên chùm lên môi dưới. DỊ dạng xương khớp, dị dạng tim mạch. Đa sô’ chết trong những tháng đầu. 1.4.3. T h ể ba n h iễm 22 Karyotyp: 47,XX,+22 hoặc 47,XY,+22. Những biểu hiện chính: đầu nhỏ, tai to và quay ra sau. Các ngón tay dài nhỏ. Chậm phát triển thể lực và trí tuệ. Đa sô' chết trong những năm đầu. 1.5. Hội ch ứ n g 5 p - (m ất đoạn nhánh ngắn n h iễm sắc th ể số 5): hội chứng mèo kêu Hội chứng 5p- đă được mô tả bởi Lejeune và cộng sự năm 1963. 1.5.1. T ần số: tần sô' chung: 1/50.000 trẻ sinh. 1.5.2. Tỳ lê giới: thường gặp ở trẻ gái hơn ở trẻ trai. 1.5.3. T riệu ch ứ n g lâm sà n g Trọng lượng khi sinh thấp, thòi kỳ sơ sinh, trẻ nhỏ có tiếng khóc không bình thường, yếu, rên rỉ giống như tiêng mèo kêu. Đầu nhỏ, m ặt tròn như mặt trăng; hai mắt xa nhau, có nếp quạt; lẹm cằm. Khi lốn lên khuôn m ặt có thể biến đổi nhưng vẫn có tiếng khóc the thé. Giảm trương lực cơ. Một sô triệu chứng trái ngược với triệu chứng của hội chứng Down: khe mắt chếch xuông dưới, không có nếp quạt, lác mắt, gốc mũi rộng, tai ở vị trí thấp, cổ ngắn, có thể dính ngón. Chậm phát triển trí tuệ: chỉ sô” IQ từ 20 - 50. Nếp vân da: thường gặp nếp ngang xa bị đứt quãng tại miền gian ngón hai. Có thể gặp nếp ngang đơn độc, chạc ba trục cao (t’), tăng tần sô' hoa vân ở mô cái. Dị tậ t kèm theo: thường gặp dị tật ở tim. 43 1.5.4. Dì truyền tế b à o Đa sô' là mất đoạn do mối phát sinh; kích thước đoạn mâ't thay đổi tùy từng trường hợp điểm đứt được xác định là pl4; pl5. Karyotyp là 46,xx,5p" hoặc 46,xx,del(5p). Một số ít trường hợp khảm, NST số 5 hình vòng nhẫn hoặc ở dạng chuyển đoạn di truyền từ bô mẹ. 1.5.5. Tiên lương Nhiều bệnh nhân sống đến tuổi trưởng thành nhưng cơ thể vẫn trong tình trạng kém phát triển. 1.5.6. N guyên n h â n Hội chứng này không liên quan đến sự tăng của tuổi mẹ. 1.6. Một số h ội ch ứ n g m ất đoạn khác Bảng2.2. Tóm tắt một sổ biểu hiện của một số hội chúmg mất đoạn hiếm gập khác Tên hội chúhg (tắn số ở trẻ sơ sinh) Biểu hiện 4 p - (0,5/100.000) oáu nhỏ, trán dô, xương sồng mũi nhô cao, gốc mũi rộng. Mắt rung giật nhãn cáu, lác, cố nếp quạt, cằm nhỏ, đỗi khi sứt môi cố thể nứt khẩu cái; tai to àvị trí thắp, đôi khi vẹo chi, dị dạng ngón. Thường dị dạng cơ quan sinh dục, tật cùa tim. Tăng van cung. Tâm thắn, vận động chậm phát triển. 18p- Người thắp. Mắt: sa mi mắt, cố nếp quạt. Gồc mũi dẹt. Tai to. Bân tay rộng ngắn, biến dạng xương tay. Cố khi thoát vi rón hoặc thoát vi bẹn. Thường cố tật ở tim. Chậm phát triển trí luệ. Đắu nhỏ, giảm sản vùng giữa mặt. Miệng cá chép vl mai dưới tréu ra vâ dái hơn mỗi trên. Tai nhô cao vá quăn. Cố hoặc không có tặt dtim. Tinh hoần ẩn, tăng tần số vân vồng. Chậm 18q - lớn, chậm phát triển tri tuệ và vận động. 1.7. N hiểm sắc th ể P h ilad elp h ia (P h 1) Trên tiêu bản NST của các bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu tủy mạn tính (Chronic Myeloid leukemia - CML) thường có một NST rấ t nhỏ, đó chính là NST 22 bị m ất đoạn ở nhánh dài (22q-), NST đó tên là NST Philadelphia (Ph1). Trong bệnh bạch cầu tủy mạn tính thường gặp chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 9 và NST số 22. Đoạn đứt ra của NST 22 thường nối vói phần còn lại của NST số 9 ở nhánh dài tạo nên NST chuyển đoạn t(9;22) (q34; q ll). Bệnh bạch cầu thể tủy mạn tính xấp xỉ 1/4 trong tấ t cả các trường hợp bệnh bạch cầu. 44 Bệnh bạch cầu thể tủy m ạn tính xẩy ra đối với tấ t cả các nhóm tuổi, nhưng hay gặp ở lứa tuổi từ 40 - 50. Không có biểu hiện khác biệt rõ rệt giữa tỷ lệ nam và nữ. 2. BỆNH DO RỐI LOẠN NHIEM s a c t h ê’ g i ớ i t í n h 2.1. N hiểm sắc th ể giới và sự hình thàn h giới tính Trong bộ NST người có 1 cặp NST giới: XX ỏ nữ và XY ở nam. Giới tính của người được quyết định vào lúc thụ tinh và do NST X và Y quyết định. 2.1.1. Chức n ă n g của nhiễm sắc thê X Trên NST X có các gen liên quan đến sự quy định giói tính: - Gen chi phôi sự hình thành và thực hiện chức năng của buồng trứng. - Gen chi phôi sự biệt hóa của tinh hoàn. - Gen kìm hãm sự hình thành tinh hoàn. - Cuôi nhánh ngắn của NST X và Y chứa đoạn tương đồng, có sự trao đổi chéo trong giảm phân và vùng này có tên là giả NST thường. Ngoài các gen nêu trên có các gen chi phối một sô tính trạng khác không liên quan đến sự quy định giói tính. Ở nữ vối cặp NST giới XX, gen kìm hãm sự hình thành tinh hoàn sản xuất ra yếu tô' kìm hãm gen biệt hóa tinh hoàn có trên NST X, do vậy tinh hoàn không h ỉn h th à n h : g e n c h i p h ô i Bự h ìn h th à n h v à c h ứ c n ă n g c ủ a b u ồ n g tr ứ n g h o ạ t đ ộ n g dẫn đến sự hình thành buồng trứng và thực hiện chức năng của buồng trứng. 2.1.2. Chức n ă n g củ a n h iễm sắc th ể Y Nhiễm sắc thể Y mang các gen chi phối việc sản xuất ra các yếu tố biệt hóa tinh hoàn, yếu tô’ trưởng thành và hoạt động của tinh hoàn. Ở nam giới vối cặp NST XY, gen biệt hóa tinh hoàn có tên trên bản đồ gen là TDF (Testis Determining Factor). Gen này nằm trên nhánh ngắn của NST Y ỏ vị trí p ll.3 . Gen biệt hóa tinh hoàn TDF khi hoạt động thực hiện các chức năng sau: - Úc chế sự hoạt động của gen kìm hãm sự hình thành tinh hoàn trên NST X, do đó gen biệt hóa tinh hoàn trên NST X hoạt động, đồng thời gen này kìm hãm sự hình thành buồng trứng. - Cùng vói sự hoạt động của gen biệt hóa tinh hoàn trên NST X, gen biệt hóa tinh hoàn trên NST Y hoạt động để hình thành tinh hoàn. 45 Các gen khác trên NST Y sau đó hoạt động để tinh hoàn trưởng thành và thực hiện chức năng. Giỗi và giới tính của cá thể được xốc định qua các giai đoạn: - Giai đoạn NST giói: được xác định khi thụ tinh trứng 23,X vối tinh trùng 23,X hoặc 23,Y. - Giai đoạn tuyến sinh dục: tùy thuộc cặp NST giói là XX hay XY mà tuyến sinh dục nữ hoặc tuyến sinh dục nam được hình thành. - Giai đoạn cơ quan sinh dục: giai đoạn hình thành cơ quan sinh dục bên ngoài. - Giai đoạn đăng ký giới tính hay giới tính pháp lý (legal sex): giới tính được đăng ký chính thức khi sinh. - Giai đoạn tâm lý giới tính: hành vi hướng nam hoặc hướng nữ. Khi có tuyến sinh dục, sự biệt hóa giới tính chịu tác động của hormon sinh dục. Ngưòi mẹ khi có thai dùng hormon nữ hoặc nam ảnh hưởng đến sự hình thành giối tính thứ phát của thai nhi. 2.2. V ật th ể giới tín h củ a người Các NST giối tính X và Y không chỉ quan sát được trong tê bào đang phân chia mà còn có thể thấy được trong nhân tê bào ở gian kỳ và được gọi là chất nhiễm sắc giới tính hay vật thể nhiễm sắc giới tính. 2.2.1. Vật th ể B a r r Tử năm 1921, người ta đã phân biệt được tế bào nam và nữ bằng các NST giới tính, nhưng phải đến năm 1949 thì mối phân biệt được bằng tế bào ỏ gian kỳ. Năm ấy Barr và Bertram khi nghiên cứu các nơron của mèo cái thấy có một khôi chất nhiễm sắc đặc biệt mà tế bào của mèo đực thì không có. Vật thể đó cũng được tìm thấy ở hầu hết tê bào động vật có vú và được đặt tên là vật thể Barr. Ở người, tế bào của hầu hết các mô đều có thể dùng để xét nghiệm vật thể Barr, nhưng tế bào niêm mạc miệng và tế bào niêm mạc âm đạo hay được dùng để xét nghiệm hờn cả. Các tiêu bản sau khi được định hình, được nhuộm bằng phẩm nhuộm kiềm tính như orcein, íuchsin, oresyl violet, xanh toluidin, thionin. Vật thể Barr thưòng là một khối hình thấu kính phảng lồi nằm áp sát m ặt trong của màng nhân, đôi khi có hình nón hoặc hình dạng khác, vật thể Barr bắt màu sẫm hơn màu của nhân. Kích thước trung bình là 1,2 X 0,7 um. Sô’ lượng vật thể Barr trong một tê bào được tính theo công thức: 46 Sô vật thể Barr = số NST X - 1. Như vậy ở phụ nữ bình thường có 2X thì có một vật thể Barr trong tế bào. Ở nam giới bình thường không có vật the Barr. Nguồn gốc của vật thể Barr theo giả thuyết của Lyon là xuất xứ từ một NST X bị bất hoạt và dị nhiễm sắc hóa nên bắt màu không giống các NST khác. 2.2.1.1. Giả thuyết Lyon _____A- „ ////;/>.££ Vât thể Barr ở tế bào niêm mac miêng - Irong các tẽ bào soma cua động " vật có vú cái, chỉ có một NST X là hoạt động, NST X kia bị kết đặc và bất hoạt, xuất hiện trên tiêu bản gian kỳ nhuộm đặc hiệu và được gọi là vật thể nhiễm sắc giới X. - Sự bất hoạt xẩy ra sâm trong thời kỳ phôi. - Nhiễm sắc the X bất hoạt có thể có nguồn bô” hoặc nguồn mẹ ô các tê bào khác nhau trong cùng cá thể. Khi một trong hai NST X nào của một tê bào đã bị bất hoạt thì cả dòng tê bào do tế bào ấy sinh ra đều giữ nguyên NST X bất hoạt ấy cho đến hết đời cá thể. Sự bất hoạt là ngẫu nhiên nhưng đã bát hoạt rồi thì không thay đổi. Giả thuyết bất hoạt một NST X đáp ứng nhiều trường hợp bình thưòng và h ện h lý V í dụ như- nữ b ìn h thư ờ n g có m ột v ậ t th ê Barr, nữ bj hội ch ứ n g T u rn er không có vật the Barr, nam bình thưòng không có vật thể Barr, nam Klinefelter có một vật the Barr. 2.2.1.2. ứng dụng của vật thểBarr Xét nghiệm vật thể Barr được dùng để chẩn đoán sâm trưốc sinh đứa trẻ tương lai là nam hay nữ (tế bào bong trong nước ô'i, tế bào gai rau), chẩn đoán hội chứng Turner và Klinefelter. Vật thể Barr chỉ xuất hiện ỏ một tỷ lệ nhất định trên tiêu bản: ở nữ, 50% và có thể cao hơn ở tê bào biểu mô, 21% ở tế bào niêm mạc miệng, 24% ở tê bào niêm mạc âm đạo. Ở nam giới bình thường không có vật the Barr, nếu có thì tỷ lệ rất thấp. Ở mô ác tính nữ, tỷ lệ vật thể Barr cũng thấp vì tê bào phân chia nhanh, gian kỹ ngắn nên cơ hội được nhìn thấy vật thể Barr cũng hiếm. Cách trả lời xét nghiệm: vật thể Barr dương tính hoặc vật thể Barr âm tính chứ không trả lòi là nữ hay nam. 47 2.2.2. Vật th ể d ù i trống Vật thể dùi trông do Davidson và Smith phát hiện năm 1954. Vật thể dùi trống được thấy ở bạch cầu đa nhân và được coi là một dạng phần phụ đặc biệt của nhân bạch cầu. Bằng kỹ thuật nhuộm giemsa hoặc phẩm nhuộm khác thấy bạch cầu nam và nũ khác nhau ố sự có mặt của vật thể dùi trống ở nữ. Thể dùi trông có phần đầu phình to dính vào múi của nhân bạch cầu bằng một cuống mảnh. Phần phình đa dạng, loại đặc trưng cho nũ gọi là dạng A, tức vật thể dùi trống có hình tròn hoặc bầu dục, đưòng k ín h Hình2.9. Vật thể dùi trống ở tế bào bạch cầu da nhân 1 - l,5nm. Các dạng khác, phần phình và cuống đa dạng và không đặc trưng. Vật thể dùi trốhg được coi là một NST X kết đặc rất m ạnh lúc gian kỳ. Tần sô vật thể dùi trống ở nữ vào khoảng 3% sô’ bạch cầu đa nhân trung tính. Ở nam không có vật thể này. 2.2.3. V ật th ể Y Vật thể Y do Pearson phát hiện năm 1970. Phần xa tâm của nhánh dài NST Y bắt màu huỳnh quang quinacrin rất mạnh nên có thể phát hiện được cả khi nhuộm nhân gian kỳ. Cũng như vật thể Barr, vật thể Y có thể được xét nghiệm ở hầu hết các mô; nhưng tê bào niêm mạc miệng, tế bào chân tóc, chân râu hay được xét nghiệm hơn. N hánh dài của NST Y rất đa hình; khoảng 10% người nam có chiều dài NST Y dài hơn bình thưòng và tính chất này di truyền được. Tỷ lệ tê bào có vật thể Y thay đổi tùy theo mô quan sát. Ở ngưòi bình thưòng (46,XY), khoảng 70% tê bào niêm mạc miệng có vật thể Y. Vật thể Y cũng được dùng để chẩn đoán giối tính. 2.3. Một số h ội ch ứ n g do rối loạn NST giới 2.3.1. Hôi chứ ng T u rn er Năm 1930, Ullrich đã mô tả một trường hợp với nhiều dị tật. Năm 1938, Turner đã mô tả 7 phụ nũ với nhiều biểu hiện như Ullrich đã mô tả nhưng có bổ sung thêm nhiều biểu hiện ỏ người trưởng thành. Năm 1959, Ford và cộng sự đã 48 xác định karyotyp của những bệnh nhân loại này là 45,X. Monosomi NST X có một tỷ lệ cao chết ngay ỏ giai đoạn phôi thai (98 - 99%), chỉ có một sô' nhỏ monosomi NST X sống đến khi sinh. Tần sô' trẻ em gái bị monosomi NST X lúc sinh là 1/3000. 2.3.1.1. Triệu chứng lăm sàng - ơ giai đoạn sò sinh: chưa có nhiều biếu hiện nên khó nhận biết: các dấu hiệu để nhận biết như trẻ nhẹ cân, chiều dài cơ thể ngắn, thừa da ở gáy, phù bạch huyết ở mu bàn tay và bàn chân. Các đặc điếm này cũng có thê phát hiện khi siêu âm thai. - ớ giai đoạn lớn và trưởng thành: + Trẻ em gái có người thấp, chậm lớn. Phần đầu mặt: hàm nhỏ, cằm nhỏ, sụp mi, tai ỏ vị trí thấp, mép xệ, tóc mọc thấp xuống tận gáy, cố ngắn và rộng (Hình 2.10), có nếp da thừa ở cố hình cánh bưởm nối liên từ xương chũm xuông đến mỏm cùng vai. + Cang tay cong ra ngoài, ngắn đốt bàn 4 và 5, da có nhiều nốt ruồi, móng tay giảm sản và lồi. + Nhi tính khi đã đến tuổi dậy thì; tuyến vú không phát triển, cơ quan sinh dục rất ít lông mu, không có lông nách. Tuyến sinh dục không phát triển, soi ổ bụng thường thấy dải màu trắng nhạt. Tử cung nhỏ, chẽ đôi. Giối tính thứ cấp không phát triển, vô kinh nguyên phát hoặc thứ phát, đôi khi có hiện tượng nam hóa. + Trên 50% trường hợp có hẹp động mạch chủ; 40 - 60% có dị tật ở liệ th ổ iig tiế t n iệu (th ậ n h ìn h móng ngựa, bàng quang chẽ đôi, hoặc thận ứ nước). + Xương: dị dạng ỏ đầu gối, ở cổ tay và bàn tay. Mâm chày trong thưòng hạ thấp, hơi chếch xuống dưới và vào trong, triệu chứng rõ lúc 7 tuổi. Tuổi xương chậu chậm phát triển. + Nội tiết: không có hoặc giảm estrogen và pregnandiol, tăng FSH, nhưng có trường hợp FSH bình thường. Lượng 17-cetosteroid thường thấp. 4- DI TRUYỂN Y HỌC 49 + Nếp vân da: tần sô' hoa vân mô ú t tăng, nhưng giảm ở mô cái. Tổng sô vân ngón tăng. + Tâm thần: thường thiểu năng trí tuệ nhẹ, có trường hợp bình thường. - Tiến triển: Bệnh nhân thường có tuổi thọ bình thường, trừ những trường hợp có tậ t nội quan nặng chết ở thòi kỳ mới sinh. Các bệnh nhân loại này thưòng vô sinh, tuy nhiên có trường hợp có thai sinh con, gặp ở trạng thái khảm. 2.3.1.2. Di truyền tế bào 55% trường hợp có karyotyp 45,X. Vật the Barr âm tính. 10% trường hợp ở dạng khảm: 45,x/46,xx hoặc 45,x/47,xxx. Có vật thể Barr nhưng tần sô' thấp. 20% trường hợp có NST X đều ồ nhánh dài: 46,X,i(Xq), vật thể Barr lớn hơn bình thường hoặc NST X đều ở nhánh ngắn: 46,X,i(Xp), vật thể Barr nhỏ hơn bình thường 5% trường hợp do mất đoạn NST X ở nhánh ngắn hoặc nhánh dài: 46,XXp hoặc 46,XXq-. 5% trưòng hợp là NST X vòng: 46,X,r(X) ở dạng khảm hoặc thuần. 5% trường hdp có m ặt NST Y như trường hợp khảm 45,X/46,XY Nguồn gốc của NST X trong hội chứng Turner 45,X theo một sô nghiên cứu thì 75% NST X có nguồn gốc là từ mẹ. Tùy theo tình trạng của bộ NST mà các dạng bệnh có thay đổi: từ dạng điển hình kể trên đến các dạng nhẹ hơn, tuyến sinh dục từ dạng không phát triển, tuyến sinh dục loạn sản đến giảm sản tuyến sinh dục, từ chỗ vô kinh đến hiện tượng có kinh nguyệt ngẫu nhiên. - Tư vấn di truyền: tùy theo sự có m ặt của các dòng tế bào và mức độ hormon của người bệnh mà cho lời khuyên. 2.3.2. Hội chứ ng K lin efelter Năm 1942, Klinefelter và cộng sự đã mô tả hội chứng này. Năm 1959, Jacob và Strong chứng minh rằng karyotyp của người bệnh này 47.XXY. Tần số của bệnh: khoảngl/1000 trẻ sơ sinh nam. 2.3.2.1. Triệu chứng lăm sàng + Ở giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ: rất khó nhận biết vì không có dị dạng quan trọng, hoặc có những dị dạng không đặc hiệu như tinh hoàn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp, dương vật kém phát triển. 50 + Ở giai đoạn dậy thì: trong nhiều trường hợp người cao, chân tay dài (hình 2.11), nhưng cũng có trường hợp có hình thái nam bình thường. Một triệu chứng thưòng thấy là tinh hoàn không phát triển, mào tinh hoàn nhiều khi lớn hơn tinh hoàn, khoảng 35 - 50% trưòng hợp có chứng vú to. Giới tính nam kém phát triển, không râu, ít lông mu, dương vật bé, tình dục giảm. Tăng bài tiết FSH, sự bài tiết 17-cetosteroid bình thường hoặc giảm. Trí tuệ phát triển bình thường, có trường hợp suy giảm. Nếp vân da: giảm tổng sô' vân đầu ngón tay, tăng tần sô' vân cung; chạc ba trục lệnh về phía bà trụ bàn tay, tăng tần sô* nếp ngang đơn độc. Mô học: ở trẻ em, mô học tinh hoàn bình thường. Ở tuổi dậy thì, ông sinh tinh bị xơ hoá; một sô ông chứa tê bào Sertoli. Những tế bào Leydig tụ tập thành những đám lân. Ngưòi bị Klinefelter thường không có tinh trùng. 2.3.2.2. Di truyền tế bào Trong tê bào có cả vật thể Barr và vật the Y. Hình 2.11. Bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter 80% trưòng hợp Karyotyp: 47,XXY. Những trường hợp còn lại có thể ỏ trạng thái khảm: 46,XY/47,XXY; 46, XX/47.XXY hoặc 45,X/46, XY/47.XXY. Nguồn gốc của NST bất thường: 53% NST thêm có nguồn gốc từ bố, 34% do rối loạn giảm phân I ô mẹ, 9% do rốỉ loạn giảm phân II của mẹ, 3% do rối loạn phân cắt của hợp tử. Có sự phối hợp với tuổi mẹ cao làm tăng bất thường ở giảm phân I. 2.3.3. H ội ch ứ n g N oonan Hội chứng này có nhiều biểu hiện giông hội chứng Turner vì vậy còn có tên là hội chứng Turner nam, hội chứng Ullrich. Bệnh biểu hiện cả ở nữ hoặc nam. Bộ NST của nhũng ngưòi mắc hội chứng này là 46,XY hoặc 46,XX. Theo David W.S. thì bệnh di truyền theo kiểu trội NST thường. Gen bệnh đột biến nằm trên NST số 12: 12q22-qter. Tuy nhiên có trường hợp không xác định được đột biến ở bệnh nhân. Tuyến sinh dục có nhiều dạng, từ bình thường đến loạn sản biểu hiện nhiều 51 mức độ khác nhau, do vậy có thể sinh sản bình thường nhưng nhiều trường hợp tinh hoàn chưa xuống bìu, tinh hoàn lạc chỗ, vô sinh. Hẹp động mạch phổi là một biểu hiện thường gặp, ít gặp hẹp động mạch chủ. Trí tuệ của người mắc hội chứng Noonan cũng tương tự như hội chứng Turner. 2.3.4. H ội chứ ng 47,XYY Tần sô: 1/1000 trẻ sơ sinh nam. Cơ thể thường lớn, không có biểu hiện hình thái gì đặc biệt. Nội tiết không có thay đổi khác thường, có trường hợp sinh dục kém phát triển, tinh hoàn lạc chỗ, tậ t lỗ đái lệch thấp. Tâm thần: nhiều trường hợp có tính nết th ất thường, thiếu tự chủ, dễ bị kích động, hung hăng, phạm tội trộm cưỏp, giết người, vì vậy tần sô hội chứng 47.XYY ở các trung tâm giam giữ tội phạm có thê đến 2/100. Trong tế bào có hai vật thể Y. Người mắc hội chứng 47.XYY vẫn có khả năng sinh sản. Có trường hợp 48,XXYY. Những bệnh nhân có bộ nhiễm sắc thể 48.XXYY có kiểu hình tương tự hội chứng Klinefelter, nhưng có tính nết th ất thường hung hăng hơn cả trưòng hợp XYY. 2.3.5. H ội chứ ng 47,X X X Tần số: khoảng 1/1000 trẻ sơ sinh gái. Không có biểu hiện hình thái gì đặc biệt. Đa sô trường hợp sinh đẻ bình thưởng, một số trường hợp vô kinh thứ phát, thường m ãn kinh sớm. Thường có giảm trí tuệ ít nhiều. Nếp vân da: tăng tần số vân móc quay và vân cung. Tổng số vân ngón tay giảm. Tế bào có hai vật thể Barr. Có thể gặp trường hợp khảm: 46,xx/47,xxx. 2.3.6. H iện tượng lư ỡ ng giới Giới nam và giới nữ khác nhau về cấu trúc di truyền (NST), về tuyến sinh dục, cơ quan sinh dục, cấu tạo cơ thể và tâm lý giới tính. Định nghĩa thê nào là lưỡng giới vẫn còn có những ý kiến khác nhau. Tuy nhiên, có thể hiểu lưỡng giới là hiện tượng không có sự phù hợp của những tính chất nêu trên ở cùng một cá thể. Có thể phân biệt hai loại lưỡng giới: lưõng giới giả và lưỡng giới thật. 52 2.3.7. Lưỡng giới g iả 2.3.7.1. Lưỡng giới giả nam Là những người có tinh hoàn, bộ NST của những người này thường có NST Y: 46,XY; 47.XXY; 47,XYY và nhiều dạng khảm khác, cũng có trường hạp 46,XX. Các bất thường có thể xẩy ra ở cơ quan sinh dục bên trong hoặc bên ngoài dưới các hình thái khác nhau: - Nam có tử cung do không ức chế được sự phát triển của ống Muller. - Nam có chứng vú to. - Nam có tật lỗ đái lệch thấp. - Loạn sản tuyến sinh dục: tuyến sinh dục giảm sản hoặc tuyến sinh dục ở dạng một dải thô sơ. Hình 2.12. Hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa Trong các dạng của lưỡng giới giả nam, hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa (Testicular feminization syndrome) đã được mô tả nhiều. Hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa được Morris E. và Mahesh J. dùng để đặt tên cho các trường hợp rôi loạn theo kiêu di truyền lặn liên kết giới X ỏ các bệnh nhân nam có tinh hoàn, karyotyp 46,XY, kiểu hình có thể biêu hiện ở các mức độ khác nhau như: cơ quan sinh dục ngoài hoàn toàn là nữ, hoặc cơ quan sinh dục ngoài mơ hồ về giói tính, hoặc cơ quan sinh dục ngoài là nam, có dương vật, có khả năng sinh sản. Các trưòng hợp n à y là do UH uyêt tậ t vổ sô" lư ợ n g v à ch ất lư ợn g củ a rocop tor an d rogon đã được xác định là nằm trên locus gen thuộc nhánh dài của NST giới tính X: X qll-12. Bệnh di truyền theo kiểu lặn liên kết trên NST X. Có hai loại là hội chứng kháng androgen hoàn toàn và không hoàn toàn, tương đương với hai loại hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa hoàn toàn và hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa không hoàn toàn. + Loại kháng androgen hoàn toàn còn gọi là hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa hoàn toàn gặp ở 1/20000 - 1/64000 trẻ sơ sinh nam. Bệnh nhân loại này có rối loạn nặng nề cả về sô lượng và chất lượng của receptor androgen. Bệnh nhân có kiêu hình là nữ, loạn sản sinh dục, không có âm đạo hoặc âm đạo cụt, tinh hoàn nằm trong 0 bụng, trong ống bẹn hoặc ở môi lớn, vô kinh nguyên phát và hay gặp thoát vị bẹn trưốc tuổi dậy thì, phát triển tâm sinh lý hoàn toàn là nữ. + Loại kháng androgen không hoàn toàn có rối loạn một phần sô’ lượng và chất lượng của receptor androgen. Bệnh nhân loại này có sự nam hóa một phần cơ quan 53 sinh dục ngoài như hòa nhập một phần các nếp môi bìu, phì đại âm vật ở các mức độ khác nhau, âm đạo ngắn và mù. Tìm hiểu trong gia hệ thường không có tiền sử bệnh từ trưốc, nhưng trong một sô" trường hợp có nhiều thành viên trong gia đình cùng bị bệnh. Bệnh nhân có thể nam hóa lúc dậy thì với phì đại âm vật hay sự hòa nhập phía sau của các môi lớn. Trường hợp tinh hoàn trong ổ bụng hoặc ở ống bẹn sâu thì nguy cơ bị ung thư hóa rất cao nên cần phẫu thuật cắt bỏ tinh hoàn, nhất là trường hợp gây biến chứng thoát vị bẹn. Người nữ dị hợp tử có biểu hiện bình thường nhưng khoảng 20% có hiện tượng chậm kinh. Khoảng 2% nữ thoát vị bẹn là do hội chứng này. 2.3.7.2. Lưỡng giới giả nữ Là những người có buồng trứng nhưng cơ quan sinh dục bên ngoài có hình thái nam nhiều hay ít (tùy từng trường hợp từ phì đại âm vật đến có hình thái nam hoàn toàn). Karyotyp thường là 46,XX nhưng cũng có trường hợp ở trạng thái khảm. Cơ chê sinh bệnh chưa rõ nhưng có thể rổỉ loạn hormon do tác động của các nhân tố khác nhau. Có thể giải thích bằng các cơ chê sau đây: - Lưỡng giới giả nữ do thượng thận: Rối loạn tổng hợp steroid, hội chứng tăng sản thượng thận bẩm sinh phổ biến nhất (chiếm 95%) là do thiếu 21-hydroxylase, tăng sản ACTH, quá sản androgen gây nên nam hóa rõ ở trẻ gái ngay khi sinh. Loại này di truyền theo kiểu gen lặn NST thường mà gen đó nằm trên NST sô' 6 gần locus HLA - B. Loại rối loạn tổng hợp steroid do thiếu hụt lip-hydroxylase, không thấy có mối liên hệ với HLA. Đê’ điều trị các trường hợp này cần dùng glucocorticoid để phòng các hậu quả do thiếu hụt hydrocortisol gây ra, ngoài ra còn ngăn cản sự nam hóa nhanh và đề phòng sự tăng trưởng sớm với sự chín sớm của các đầu xương. - Lưỡng giối giả nữ không phải do thượng thận: Trong thòi kỳ thai nghén, ngưòi mẹ dùng thuốc thưòng là thuốc ngừa sẩy thai loại progestatif dẫn đến hậu quả thứ phát tăng androgen gây nam hóa thai nữ. Khôi u ỏ mẹ (arrhenoblastoma) hoặc ỏ thai gây sinh hormon. - Bất thường phát triển ống Muller: ống Muller bất sản, không có âm đạo bẩm sinh hoặc âm đạo giảm sản, tử cung không có hoặc không bình thưòng (ví dụ như hội chứng Rokitansky). Các trường hợp này thường có bất thường thận như bất sản thận hoặc thận lạc chỗ. - Cốc cơ chế còn chưa rõ. 54 2.3.8. Lưỡng g iớ i th á t Là những trường hợp trong cùng một cơ thể có cả tinh hoàn và buồng trứng ỏ dạng bình thường hoặc loạn sản. Căn cứ vào vị trí của tuyến sinh dục trong cơ thể có thể xếp thành 3 dạng sau: - Lưỡng giối xen kẽ: một bên có buồng trứng, bên kia có tinh hoàn, chiếm tỷ lệ 40%. - Lưỡng giới hai bên: cả hai bên đều có tuyến sinh dục hỗn hợp buồng trứng - tinh hoàn, chiếm tỷ lệ 20%. - Lưỡng giới một bên: một bên có buồng trứng hoặc tinh hoàn, bên kia là tuyến hỗn hợp, chiếm tỷ lệ 40%. Kiêu hình có nhiều dạng biến đổi tùy theo karyotyp. Cơ quan sinh dục: hình thái ái nam ái nữ biểu hiện nhiều mức độ khác nhau. Trong 2/3 trường hợp cơ quan sinh dục lúc đầu biểu hiện hình thái nam, tinh hoàn chưa xuống bìu, lỗ đái lệch thấp. Lúc dậy thì tuyến vú phát triển (80% trường hợp), hành kinh (50% trường hợp). Có trường hợp hình thái nam, vú to, ra huyết có chu kỳ. Trong 0 bụng có cấu trúc của cả ống Muller và ống Wolf, có vòi trứng, tử cung giảm sản hoặc bình thường, có mào tinh hoàn, túi tinh. Karyotyp thường là 46,XX; 46,XY hoặc có hai dòng tê bào 46,XX/46,XY. Ngoài ra cũng có thể gặp các trạng thái khảm khác. Với cá thể có cặp NST XX, có khó khăn để giải thích vì sao có tổ chức tinh hoàn, có thể có trạng thái khảm trong quá trình biệt hóa các dòng tế bào. v ề cơ quan sinh dục bên ngoài có nhiều dạng lưỡng giới khác nhau, về tâm lý giới tính từ dạng nam bình thường đến dạng nữ bình thưòng. Nhưng người lường giơi th ậ t đêu vô sinh. 2.3.9. R ối lo a n cấ u trú c n h iễm sắc th ể X - Chuyển đoạn cân bằng hoặc không cân bằng giữa NST X và NST thường dẫn đến thiểu năng buồng trứng nguyên phát hoặc thứ phát vối những biểu hiện hội chứng Turner ở mức độ khác nhau. - Các trường hợp m ất đoạn nhánh ngắn hoặc nhánh dài biểu hiện là hội chứng Turner, có liên quan giữa mức độ biểu hiện của bệnh với kích thước của đoạn bị rrmt. + Trường hợp NST X bị mất nhánh dài: tuyến sinh dục không phát triển, vô kinh, chiều cao có thể bình thưòng hoặc gần bình thường. + Trường hợp NST X bị m ất nhánh ngắn: tuyến sinh dục không phát triển, vô kinh, chiều cao có thể thấp (nhánh ngắn của NST X có mang gen chi phốỉ chiều cao và hình thái cơ thể). 55 - Các trường hợp NST X đều (đẳng NST), triệu chứng cũng như mất đoạn NST X. - Ví dụ: một trường hợp liên quan đến rối loạn cấu trúc NST X. Hội chứng chậm phát triển tâm thần liên kết nhiễm sắc thể X - Hội chứng M artin-B ell hay hội chứng nhiễm sắc the X dễ gẫy (Fragile X). Hội chứng này là nguyên nhân phổ biến dẫn đến chậm phát triển tâm thần có tính chất gia đình. Hội chứng chậm phát triển tâm thần liên kết NST X là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến chậm phát triển tâm thần hay gặp ở nam. Hội chứng này do đột biến của NST X ở vị trí phần cuối nhánh dài: Xq27.3 gây nên hiện tượng NST X dễ gẫy. Gen bị đột biến ở đây là gen FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) biểu hiện bằng sự lặp lại nhiều lần của bộ 3 nucleotid CGG, làm mất tính ổn định của phân tử ADN, khi tế bào được nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu gây nên hiện tượng dễ gẫy của NST X ỏ vị trí Xq27.3. sản phẩm của gen FMR1 là protein FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein), là một loại protein có nhiều trong mô não và mô tinh hoàn, chức năng của protein FMRP là tham gia điều hòa tổng hợp protein, ngoài ra protein này còn tham gia cấu tạo nơron và sự dẫn truyền qua synap. Khi gen FMR1 đột biến hoàn toàn, dẫn đến cơ thể thiếu hoàn toàn protein FMRP, sẽ có biểu hiện chậm phát triển tâm thần. Khi gen FMR1 ở dạng tiền đột biến, cơ thể vẫn có khả năng tổng hợp một lượng nhất định protein FMRP, do đó những ngưòi mang gen FMR1 tiền đột biến có thể hoàn toàn bình thường hoặc biểu hiện chậm phát triển tâm thần ở mức độ nhẹ. Ở người bình thường, sô' lần lặp lại của bộ 3 nucleotid CGG trong gen FMR1 từ 5 - 54 lần. Ở người mang gen tiền đột biến nhưng không có biểu hiện lâm sàng, sô lần lặp lại của bộ 3 nucleotid CGG trong gen FMR1 từ 60 - 200 lần. Ở người mang gen đột biến hoàn toàn, có biểu hiện lâm sàng rõ rệt, sô' lần lặp lại của bộ 3 nucleotid CGG trong gen FMR1 là 200 - 1000 lần hoặc hơn. Những người nam mang gen KMK1 tiển đột biến với sô lần lập của bộ ba nucleotid CGG từ 60-200 lần có biểu hiện bình thường nhưng có khả năng truyền gen bệnh và gây bệnh cho thê hệ tiếp theo. Ngưòi nam này sẽ truyền gen bệnh cho con gái và khi người con gái lấy chồng sinh con thì ở đòi con của họ có hiện tượng xảy ra như sau: Tiền đột biến với tần sô’ lặp lại của bộ ba nucleotid CGG là 60-200 lần sẽ phát triển thành đột biến hoàn toàn vối sô’ lần lặp lại của bộ ba nucleotid là trên 200 lần hoặc hơn. Hiện tượng này không xảy ra ỏ người nam mang gen tiền đột biến nhưng lại xảy ra ở con gái của họ khi người con gái sinh con. Tiền đột biến có xu hướng lan rộng ỏ thê hệ kế tiếp, tiền đột biến lớn có thể phát triển thành đột biến hoàn toàn. Các mức độ đột biến của gen sẽ ảnh hưởng đến trí tuệ ở các mức độ khác nhau. Ngưòi mang gen tiền đột biến và đột biến không bị ảnh hưởng tối khả năng sinh sản nên có thể truyền gen bệnh và bệnh cho thế hệ sau, do đó hội chứng Fragile X gây CPTTT có tính gia đình. 56 Đốỉ với nữ mắc hội chứng Fragile X, triệu chứng lâm sàng thường không điển hình, thường chỉ biểu hiện CPTTT ỏ mức độ khác nhau. Điều này liên quan đến NST X bất hoạt, sự bất hoạt này xảy ra ngẫu nhiên trong hai NST X và tỷ lệ khác nhau giữa các mô trong cơ thể. Nếu gen đột biến nằm chủ yếu trên NST X bị bất hoạt, người đó sẽ không biểu hiện bệnh hoặc biểu hiện bệnh không hoàn toàn. Trong trường hợp chuyển đoạn giữa NST X mang gen đột biến với NST thường, bệnh nhân vẫn có biểu hiện lâm sàng. Tuy nhiên, để xác định đó là hội chứng Fragile X, cần phải kết hợp triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân với làm xét nghiệm ở mức di truyền tế bào và phân tử. + Tần sô”: khoảng 1/4000 nam và 1/8000 nữ bị mắc hội chứng này. + Triệu chứng lâm sàng: Giai đoạn thơ ấu: bệnh biểu hiện ở mức độ nhẹ như giảm trương lực cơ, giảm vận động. Hình thái bộ m ặt rất đặc biệt với tai to vênh, m ặt dài; tinh hoàn to ở người nam sau tuổi dậy thì. Mức độ chậm phát triển tâm thần có thể từ nhẹ đến nặng tùy thuộc vào người mang gen tiền đột biến hay đột biến hoàn toàn. + Di truyền tế bào: Để phát hiện ra đoạn NST X dễ gẫy tại vị trí Xq27.3, ngưòi ta nuôi cấy tê bào bạch cầu lympho máu ngoại vi trong cốc môi trưòng đặc hiệu là môi trường nghèo acid folic hoặc môi trường dư thymidin, đoạn dễ gẫy biểu hiện dưới các dạng gap, iso gap, đứt đơn, đứt kép hoặc mất đoạn NST. Có trường hợp đoạn dễ gẫy biểu hiện bằng hai chấm nhỏ tách khỏi phần cuối nhánh dài NST X. Người mắc hội chứng này thưòng có khoảng 4 - 50% tê bào nuôi cấy có NST X biểu hiện dễ gẫy. Có thể dùng phương pháp di truyền phân tử xốc định sô' lần lặp lại của bộ 3 nucleotid CGG của gen FMR1. 2.3.10. R ối loạn cấ u trú c N S T y - Chuyển đoạn của NST Y với NST X hoặc các NST thường khác sẽ biểu hiện kiểu hình là nam hoặc nữ tùy theo kiểu chuyển đoạn. - Mất đoạn nhánh dài NST Y có kiểu hình nam, tinh hoàn có thể phát triển bình thường. Cũng có trường hợp lỗ đái lệch thấp, không có tinh trùng. - NST đều của nhánh dài NST Y (hình thành do m ất nhánh ngắn), có kiểu hình nữ nhưng tuyến sinh dục bất sản (yếu tố quy định tính chất nam nằm trên nhánh ngắn của NST Y). Thường gặp ở trạng thái khảm kết hợp với dòng tế bào khác thường là 45,X. - Mất đoạn nhánh ngắn NST Y: thường có kiểu hình nữ. Hầu hết có dải sinh dục với hội chứng Turner, đặc biệt có phù bạch huyết nhưng chiều cao bình 57 thường. Trưòng hợp này ngược với ngưòi nữ 46,XY có loạn sản tuyến sinh dục hoàn toàn và không có kích thước như hội chứng Turner. Hội chứng nam 46,XX Tần sô: khoảng 1/10000 trẻ sơ sinh nam. Hình thái bên ngoài: với chiều cao bình thường hoặc hơi thấp. Tinh hoàn nhỏ và mềm, giảm sản tế bào Leydig, không có tinh trùng, vô sinh. Cơ chế sinh bệnh: được giải thích bằng sự chuyển gen xác định tinh hoàn (TDF) từ nhánh ngắn của NST Y sang nhánh ngắn của NST X trong quá trình giảm phân hoặc trạng thái khảm với dòng tế bào có NST Y nhưng dòng tê bào này đã bị loại trừ ở giai đoạn phôi. Tự LƯỢNG GIÁ 1. Trình bày các biểu hiện lâm sàng, di truyền tế bào học và tiên lượng của hội chứng Down. 2. Trình bày các biểu hiện lâm sàng, di truyền tê bào học và tiên lượng của hội chứng Edwards. 3. Trình bày các biểu hiện lâm sàng, di truyền tê bào học và tiên lượng của hội chứng Patau. 4. Trình bày các biểu hiện lâm sàng và di truyền tế bào học của hội chứng mèo kêu. 5. Trình bày nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph1). 6. Trình bày hội chứng Turner; trong hội chứng Turner xét nghiệm vật thể Barr và vật thể Y có kết quả như th ế nào. 7. Trình bày hội chứng Klinefelter; trong hội chứng Klinefelter xét nghiệm vật thể Barr và vật thể Y có kết quả như th ế nào. 8. Trình bày chức năng NST X và Y. 9. Trình bày vật thể giới tính ở ngưòi. 10. Trình bày cốc cơ chế gầy lưông giối giả nữ. 11. Trình bày hiện tượng lưõng giới giả nam - Hội chứng tinh hoàn nữ tính hóa. 12. Trình bày hiện tượng lưỡng giới thật. 13. Trình bày hội chứng chậm phát triển tâm thần liên kết NST X (hội chứng Fragile X). 14. Trình bày các hậu quả do rối loạn cấu trúc NST X và Y gây ra (trừ hội chứng fragile X). 58 Chương 3 MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ • • • ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC MỤC TIẾU 1. Trình bày được nội dung của kỹ thuật tách chiết ADN, ARN - điện di ADN. 2. Nêu được đặc điểm và chức năng của enzym giới hạn. 3. Trình bày được kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi polymerase. 4. Trình bày được nguyên lý, nội dung của các phương pháp xác định trinh tự nucleotid trong phân tử ADN. 5. Trinh bày được nội dung của một sô' kỹ thuật lai acid nucleic - tạo gen đơn dòng (gene cloning). 6. Nêu được nguyên lý của phương pháp phát hiện hiện tượng đa hình về chiều dài của đoạn ADN do enzym giới hạn tạo nên. 1. TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI ADN 1.1. T ách c h iế t ADN Ở tế bào Eukaryota, phần ADN chủ yếu nằm trong nhân tế bào, trên các NST, vì vậy trưốc hết cần bộc lộ ADN ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào. Sau đây là các bước chủ yếu của quy trình: - Bưốc 1: giải phóng ADN ra khỏi màng tê bào bằng cách nghiền, dùng áp suất, siêu âm hoặc dùng phương pháp hóa học hoặc dùng phương pháp sinh học (dùng enzym). Sau đó, hỗn dịch được ly tâm để loại bỏ chủ yếu các mảnh vụn của tê bào. 59 - Bưốc 2: tách bỏ phần protein trong tế bào, trong NST. Proteinase K thường được dùng. Ly tâm để loại bỏ phần tủa của proteinase K (tủa bằng phenol, chloroform). - Bước 3: kết tủa ADN (thường dùng Ethanol). ADN tủa được để khô ở nhiệt độ phòng và cho tan trong đệm TE (Tris, EDTA) và giữ ở nhiệt độ: - 4° c. Để bảo quản lâu dài, dung dịch ADN được bảo quản ở -20°c đến -80°c. 1.2. Tách ch iết ARN Phương pháp tách chiết ARN toàn phần cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với ADN: - Giải phóng ADN và ARN ra khỏi màng tế bào. - Tách loại bỏ phần protein. - Tủa acid nucleic. Bưổc tiếp theo: dịch chiết chứa acid nucleic được ủ với ADNase để phân hủy ADN, sau đó hòa tan dịch chiết chứa ARN trong nưóc; tủa bằng ethanol, đế thu được ARN toàn phần. mARN có thể được tách riêng. Dựa vào cấu trúc phân tử m ARN có đuôi poly A có thể tách mARN bằng sắc ký ái lực trên cột oligo T - cellulose. Hiện nay đã sử dụng bộ kit (bộ mẫu thử chuyên dụng) sử dụng các viên bi từ có mang oligo T trên bề mặt. Thông qua liên kết bổ sung A = T các mARN bám lên bề mặt các viên bi từ; sau đó bằng kỹ thuật ly tâm thu lại các viên bi và tách mARN. Kỹ thuật nầy cho phép tách giữ lại mARN vối khối lương rất nhỏ. Chú ý: trong quá trình thao tác, tránh lẫn ADN, ARN của đôi tượng khác vào dụng cụ. Tránh các enzym phá hủy ADN hoặc ARN cần nghiên cứu, đặc biệt ARN không bền dễ bị phân ly bởi ARNase. Sau khi tách chiết ADN, kiểm tra độ tinh khiết của ADN bằng xác đinh tỷ lê và QD260 _ „ 2 đươc coi là sach OD28Ũ OD23Ũ hoặc bằng phương pháp điện di ADN (xem phần thực tập). 1.3. Đ iện d i ADN Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp ADN, ARN di chuyển từ cực âm đến cực dương. Để kiểm tra và xác định tính chất của ADN, cần điện di ADN trên thạch (gel). Phân tử ADN càng nhỏ càng di động nhanh. Tùy theo kích thước của phân tử ADN mà người ta dùng các loại gel khác nhau: 60 - Phân tử ADN có dưói 500 đôi Nu Dùng polyacrylamid gel - Phân tử ADN có dưối 500 - 10.000 Nu Dùng Agarose gel - Phân tử ADN có nhiều đôi Nu hơn Dùng Agarose gel có lỗ to hơn (Pulsed field agarose gel). Để quan sát hình ảnh ADN khi điện di, người ta nhuộm ADN bằng etfridium bromide, dưới ánh sáng tử ngoại, ADN gắn vói ethidium bromide sẽ phát sáng. Khi cho chạy điện di ADN nghiên cứu thường có ADN mẫu (Marker) cùng chạy để so sánh, xác định sô' lượng Nu của đoạn ADN. Phương pháp điện di ADN còn được dùng để kiểm tra kết quả tách chiết ADN. 2. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (p olym erase ch ain reaction: PCR) Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất vào năm 1985. IIIII Mối * ,* * AdNTP: Taq Polymerase (ATP, GTP, CTP, TTP) Mục đích phương pháp: phát hiện và nhân đoạn ADN nhiều lần trong ống nghiệm. Để thực hiện được phương pháp cần có: phân tử ADN ban đầu, hai đoạn ADN mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tỏ ADN ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi. 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, mmiimmiiii rM-i-i-U-lill IIII M l l l r 92 - 95°c " ,Wr""V rfrr,ff I 'Sk52-52°c J U I» i-Imỉ Mói c T t y dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase có tính chịu nhiệt độ cao; enzym này được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus. Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kỳ, mồi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: 70 - 72°c V •ciflf I M I H I I Ĩ U I U Hình 3.1. Các bước của phương pháp PCR 61 - Giai đoạn biến tính: ủ ADN ban đầu ở nhiệt độ cao: 92 - 95°c để tách ADN thành sợi đơn. - Giai đoạn lai ghép: ADN mồi được lai ghép với sợi đơn của ADN ban đầu. Thực hiện ở nhiệt độ: 50 - 52°c. - Giai đoạn tổng hợp ADN: Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các Nu vào sau ADN mồi dựa ADN ban đầu làm khuôn. Thực hiện ỏ nhiệt độ: 70 - 72°c. Sau mỗi chu kỳ, từ một phân tử ADN ban đầu tổng hợp nên hai phân tử ADN, đến chu kỳ sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên 4 phân tử ADN. Qua các giai đoạn như đã nêu ở trên, và cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kỳ sau. Sau 30 chu kỳ từ một phân tử ADN ban đầu sẽ có 230 phân tử được tạo thành. Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhậy, từ một lượng ADN rất ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau khi áp dụng phương pháp PCR sẽ có một lượng lớn ADN đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu. Phương pháp PCR trong nhiều trường hợp đã thay thê cho phương pháp Southern blotting vì phương pháp này thực hiện nhanh, cần lượng ADN ít. Từ phương pháp PCR ban đầu, ngày nay người ta đã đê xuất nhiều cải biến để nâng cao tính năng của phương pháp. - PCR lồng (Nested PCR): trong kỹ thuật này dùng hai cặp mồi, có trình tự các Nu lồng vào nhau (có nghĩa rằng cặp mồi thứ hai có trình tự các Nu nằm trong cặp mồi thứ nhất). Đoạn ADN được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ 2. Điều này đã làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu của ADN lần 1, đồng thòi nó sẽ không nhân lên với những sản phẩm không đặc hiệu của lần 1. - Nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang: QF - PCR (quantitative - fluorescense - polymerase chain reaction): năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng phương pháp nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang - từ năm 1998 đến nay một sô’ phòng thí nghiệm đã thực hiện thành công kỹ th u ật này trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down. Ví dụ: dựa vào kết quả định lượng gen DSCR1 (gen được định vị ở vùng 21q21.1 - q 22.2 liên quan đến dị tậ t tim và chậm phát triển tâm thần của hội chứng Down), để xác định thai bị Down hoặc không. 3. XÁC ĐỊNH TRÌNH T ự NUCLEOTID TRONG PHÂN TỬ ADN (Sequencing) Vê' nguyên lý người ta có thể xác định trình tự các Nu trong cả bộ gen (genome) nhưng trong điều kiện hiện nay, ngưòi ta mới chỉ xác định trình tự Nu ỏ những đoạn ADN xác định. 62 Sau đây là hai phương pháp đã được ứng dụng để thực hiện xác định trình tự Nu: phương pháp hóa học và phương pháp enzym học, trong đó phương pháp enzym học được ứng dụng nhiều. 3.1. P hư ơng pháp en zym h ọc (phương pháp Sanger) Chuỗi ADN mạch kép Mạch đơn ADN^, 5' GCATATGTCAGTCCAG 3' 3' CGTATACAGTCAGGTC 5' ,3 ' CGTATACAGTCAGGTC 5' cán xác định 5' GCAT (Mối) + ADN Polymerase + dATP dTTP dCTP dGTP + ddATP váo ổnọỊ ốnq 1 GCAT A GCAT ATGTCA GCAT ATGTCAGTCCA * ddTTP váo ống 2 Ổng 2 GCAT AT GCAT ATGT GCAT ATGTCAGT + ddCTP váo 6ng3 Ổng 3 GCAT ATGTC GCAT ATGTCAGTC GCAT ATGTCAGTCC + ddGTPvâo Óng 4 Ổng 4 GCAT ATG GCAT ATGTCAG GCAT ATGTCAGTCCAG Hình 3.2. Minh họa quy trinh xác định trình tự Nu bằng phương pháp enzym học 63 Nguyên lý của phương pháp này là dùng các dideoxyribonucleotid để tránh gắn thêm các Nu tiếp theo. Phương pháp gồm các bước: - Bước 1: Phân tử cần xác định trình tự các Nu được dùng làm khuôn để tổng hợp nên một sô' đoạn ADN cùng bắt đầu ở 1 vị trí giông nhau nhưng kết thúc ỏ vị trí khác nhau. Phản ứng tổng hợp có ADN polymerase xúc tác in vitro. Trong 4 ống nghiệm có các thành phần giống nhau là sợi ADN khuôn, 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGPT, dTTP). Đánh dấu phóng xạ 32p cho 1 loại dideoxyribonucleotid ví dụ ddATP. Sự khác nhau là ỏ chỗ trong mỗi ông sẽ bổ sung thêm mỗi loại dideoxyribonucleotid khác nhau. Ví dụ ống 1 cho ddATP, ống 2 cho ddGTP, ống 3 cho ddCTP và ống 4 cho ddTTP. - Bước 2: trong quá trình tổng hợp dùng dideoxyribonucleotid là Nu bị mất nhóm OH ở vị trí thứ 3 nên khi nó được gắn vào chuỗi ADN thì không có sự gắn thêm Nu nữa. Hiện tượng nảy sẽ tạo ra một thang gồm các đoạn ADN có chiều dài khác nhau, hiện rõ khi điện di. - Bước 3: để xác định được vị trí của tấ t cả 4 loại Nu phải có sự kết hợp hình ảnh điện di của cả 4 ống thể hiện trên 4 làn với các băng khác nhau mà vị trí của từng băng đặc trưng cho vị trí từng Nu và đọc cũng theo thứ tự từ dưới lên. Tất cả các bâng được đọc bằng phương phốp tự chụp hình phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang. 3.2. P hư ơng pháp hóa h ọc (phương pháp M axam và G ilbert) Nguyên lý của phương pháp là dùng hóa chất liều ít để phá hủy một trong bốn loại Nu tạo nên chuỗi ADN. Các bước của phương pháp như sau: - Bước 1: tách ADN sợi kép thành sợi đơn, cho sợi đơn tiếp xúc với hóa chất để phá hủy một trong bốn loại base (ví dụ A). Vì chỉ xử lý liều ít nên hóa chất chỉ phá hủy một trong sô’ A có mặt. Cách xử lý này tạo ra một sô đoạn ADN có chiều dài khác nhau phản ánh vị trí của A đã bị phá hủy theo trình tự chuỗi. - Bước 2: các đoạn ADN này được điện di trên gel, được phát hiện bằng tự chụp hình phóng xạ: chỉ những đoạn ADN đã được đánh dấu 32p ở đầu 5' mới được hiện rõ trên gel, kích thước của chúng biểu hiện khoảng cách từ đầu đánh dấu đến vị trí A cần xác định. - Bước 3: để xác định vị trí của tấ t cả các Nu trong phân tử ADN, cách xử lý như trên được thực hiện đồng thời vói 4 ống cho 4 loại Nu, thông thường T cho mẫu 1, c cho ống 2, G cho ống 3, và A cho ống 4. 64 - Bước 4: đọc vị trí các Nu tương tự như phương pháp enzym. Vị trí của 4 loại Nu biêu hiện bằng 4 làn băng, vị trí được đọc từ dưới lên vì các đoạn nhỏ khi điện di chạy nhanh hơn các đoạn có kích thước lốn. Đọc Hỉnh ảnh điện di thứ tự Nu của 4 ống Đoạn ADN cắn xác định trinh tự Nu 32P - TGC ACTT G AACGCATGCT Cho hóa chất hùy Nu loại A Vị trí A bị hủy „ SÍP - TGCACTTGAACGC TGCT z JĨP - TGCACTTGA CGCATGCT 32P - TGCACTTG, ACGCATGCT 3ỈP - TGC CTTGAACGCATGCT 3' T c G A T 18 — c 17 — G 16 — T 15 — A 14 — c 13 — G 12 __ c 11 — A 10 — A 9 — G 8 — T 7 T 6 _ c 5 — A 4 c 3 mmm Gổạn cố đánh dấu Doạn không đánh dấu G 2 _ T 1 5' Hình 3.3. Minh họa quy trinh xác định trình tự Nu bằng phương pháp hóa học 4. ENZYM GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYM GIỚI HẠN 4.1. E nzym giới hạn (R estriction enzym e) Enzym giối hạn hay còn gọi là enzym hạn chế có đặc điếm là cắt ADN ở những vị trí xác định. Cho đến nay người ta đã biết khoảng trên 500 loại enzym giới hạn. Các loại enzym giới hạn có các đặc điểm sau: 5- DI TRUYỂN Y HỌC 65 - Các loại enzym giới hạn đều được chiết tách từ vi khuẩn. Tên của enzym giới hạn mang tên viết tắ t của vi khuẩn (xem bảng 3.1). - Cắt phân tử ADN xoắn kép ở những vị trí xác định cho từng loại enzym giới hạn. - VỊ trí cắt thưòng có 4 - 8 Nu, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là đoạn ADN gồm 4 đến 8 cặp Nu này có trình tự giông nhau khi đọc theo chiều 5’ - 3’. Vì vậy vị trí cắt của enzym giông nhau trên 2 mạch (xem vị trí cắt ỏ bảng 3.1). Bảng 3.1. Vị trí cắt cùa một số enzym giới hạn Tên enzym Chiết tách từ Đoạn cắt Đáu két dinh I Nơi cắt cùa enzym Eco RI Escherichia coli Bam HI Bacillus amyloliquefaciens Sma I Serratia marcesciens -G -A -A -T -T -C - I I I I I I -C -T -T -A -A |-G - -G I I -C -T -T -A -A -G -G -A -T -C -C - I I I I I I - C -C -T - A-Gr-G - -G I I -C -C -T -A -G -C -C -C -G -G -G - lililí -G -G -G ị-C -C -C - -c-c-c I -G -G -G - A -A -T -T -C -I G - G -A -T -C -C - I G - G -G -G - I I I c-c-c- - Sau khi bị cắt ADN có các đầu kết dính ở các sợi đơn. Cùng bị cắt vối cùng loại enzym giới hạn, các phân tử ADN có các đầu kết dính với các Nu bô sung cho nhau. 4.2. Chức n ăng củ a en zym giới hạn Enzym giới hạn ở vi khuẩn có vai trò phân giải ADN của virus khi virus thâm nhập vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn có enzym biến đổi đê methyl hóa enzym 66 giới hạn làm cho enzym giới hạn mất hoạt tính, không tác động đến ADN của vi khuẩn. Chức năng cắt của enzym giới hạn đã làm cho phân tử ADN dài có thể bị cắt ra từng đoạn để phân tích. Sau khi bị cắt, các đoạn ADN có thể được điện di trên agarose gel để xác định tính chất, hoặc dùng để tạo nên các phân tử ADN lai. 5. LAI A CID N U C LEIC 5.1. ADN dò (DNA probes) Trước khi thực hiện các kỹ thuật lai acid nucleic ngưòi ta phải tạo ra các ADN dò. ADN dò là một đoạn ADN sợi đơn mà trình tự Nu, tính chất của chúng đã được biết. Một sô loại ADN dò đã được bán tại thị trưòng. Có tên như vậy vì ADN dò có chức năng dò tìm những đoạn ADN sợi đơn tương ứng trên các phân tử ADN cần được phân tích, ví dụ các đoạn ADN bất thường trong một sô' bệnh cần chẩn đoán. Phương pháp tạo ADN dò: - Phương pháp sao mã ngược: P ro te in ------ > mARN ------ > cADN Ví dụ: - Phe - Trp - Met - Asp - Cys - Arg - 'l ' 'l ' 'l ' 'l ' 'l ' 'l ' ADN sợi đơn TTT - TCC - TAC - CTA - TCT - GCT - Hoặc (TTG) (CTG) (TCÜ) (GCC) - Phương pháp tổng hợp từ các Nu theo một trình tự đã biết. - Phương pháp tách chiết từ ADN của bộ gen. Trong phương pháp lai acid nucleic có phương pháp sử dụng phương pháp lai các alen vối các mẫu dò đặc hiệu (allele specific oligonucleotide), phương pháp thường dùng với các kỹ th u ật sau 5.2. Các phương pháp la i acid n u cleic 5.2.1. P hư ơ ng p h á p S o u th e rn b lotting Kỹ th u ật này được Southern phát hiện ra vào năm 1975. Mục đích của kỹ thuật: dò tìm một phân tử ADN trong số rấ t nhiều phân tử ADN. Đây là một phương pháp đã được dùng để phát hiện bệnh ở mức độ phân tử. Southern blotting cũng được dùng trong nhiều kỹ thuật lai ADN khác. 67 Cốc bước cơ bản của kỹ thuật: Tách chiết ADN từ các mẫu vật như bạch cầu, từ tế bào nước ối, tê bào ở tua rau thai... - Phân tử ADN được cắt bằng enzym giới hạn tạo nên những đoạn ADN có kích thưóc khác nhau, trong sô này có thể có đoạn mang gen cần tìm. - Điện di các đoạn ADN trên agarose gel: tùy theo kích thước của đoạn ADN mà có các băng điện di ở các vị trí khác nhau. - Để gel tiếp xúc với NaOH, NaOH làm biến tính ADN thành sợi đơn (cắt các cầu nối hydro. Có thể dùng nhiệt độ cao làm biến tính ADN. - Sau khi tráng gel được đặt lên giấy thấm, giấy thấm có tiếp xúc với dung dịch điện di, giấy nitrocellulose được phủ lên trên gel. Dùng một vật nặng ép lên trên giấy thấm, ADN sẽ thấm từ gel lên giấy nitrocellulose. Tựchụphlnh phóng xạ p Hình 3.4. Các bước của kỹ thuật Southern blotting 68 - Sau cùng, giấy nitrocellulose đã thấm ADN được cho vào bình lai đã có ADN dò. Nếu phân tử ADN sợi đơn mang gen tương ứng vối ADN dò sẽ có sự kết hợp ADN sợi đơn vối sợi đơn của ADN dò tạo nên phân tử lai theo nguyên tắc bổ sung của các cặp Nu. Trên giấy nitrocellulose sẽ hiện băng do sự kết hợp ADN dò vối ADN đích. Băng này có thể nhìn thấy khi dùng tự chụp hình phóng xạ hoặc dùng hóa chất. 5.2.2. P hư ơng p h á p N orthern blotting Khác vối phương pháp Southern blotting, acid nucleic đích ở đây là ARN chứ không phải ADN. Phát hiện ARN bằng cách lai với cADN đã đánh dấu cho nên kỹ thuật này được gọi là Northern blotting. 5.2.3. P hư ơ ng p h á p Dot b lo ttin g - Slot blotting Lai theo phương pháp dot-blot là phương pháp sàng lọc nhanh thường thực hiện vối những mẫu dò ASO (allele-specific oligonucleotide) để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một Nu. Phương pháp này không cần điện di trên thạch mà bằng thấm trực tiếp từ đó để xác định những đoạn Nu khác nhau. Quy trình thực hiện của kỹ thuật qua các bưốc sau: - Bước 1: dung dịch ADN đích được biến tính bằng nhiệt độ hay bằng dung dịch kali để tách ADN sợi kép thành ADN sợi đơn. - Bước 2: gắn ADN đích đã được biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hoặc màng nylon). - Bước 3: đưa màng lai chứa ADN đích vào dung dịch chứa ADN dò. B ư ớ c 4: »au k h o ả n g 2 0 — 24 giờ A D N dò sẽ gắn vào A D N đ ích tạo th à n h chuỗi kép. - Bước 5: rửa màng lai, để khô tự nhiên sau đó phân tích bằng tự chụp hình phóng xạ. Ngoài ra còn có thể gắn ADN dò lên màng lai, còn ADN đích được đê ỏ trong dung dịch và các bước tương tự như trên. Phương pháp này áp dụng để phân biệt giữa các alen khác nhau thậm chí bằng một vài Nu. Vối mục đích này người ta đã tạo ra những đầu dò ASO từ những chuỗi Nu có kích thước khác nhau. Những đầu dò ASO này thường chỉ có từ 15 - 20 Nu và bình thường được hoạt động dưới những điều kiện lai, ở đó ADN kép được tạo ra do sự kết hợp giữa dò và đích nếu base bổ sung giữa dò và đích là tương hợp. Nếu có sự không tương hợp (chỉ cần một nối lệch) giữa ADN dò và đích thì tạo nên chuỗi xoắn kép không bền vững. Bằng cách tăng nhiệt độ tối đa có thê 69 phát hiện những chỗ nối lệch này. Mặc dù ASO có thể đã sử dụng phương pháp lai Southern blot, nhưng ASO được sử dụng thuận lợi hơn trong những thực nghiệm dot-blot. Nhìn chung kỹ th u ật của dot-blot bao gồm lấy được dung dịch ADN đích (có thể là toàn bộ gen của ngưòi), nhưng đơn giản hơn là thu được những vết ADN ỏ trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon. Cần phân biệt kỹ thuật slot-blot và dot-blot. Hai kỹ th u ật này khác nhau ở những vết ADN thu được. Đối với dot-blot thì ADN thu được nằm ở trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon dạng vết tròn, còn slot-blot thì ADN thu được nằm ở những rãnh mà chúng ta đã khía trưốc trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon. 5.2.4. Kỹ th u â t la i ta i chỗ h u ỳn h q u a n g (Fluorescence in situ hybridization: FISH) Cuối năm 1980, kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng rãi để phát hiện cốc bất thưòng NST. Đây là kỹ th u ật đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì nó có thể thực hiện trên nhân tế bào gian kỳ không cần qua thòi gian nuôi cấy. Vì vậy, sau 24 - 48 giò đã có kết quả. Mẫu tế bào có thể lấy sớm từ tuần 12 (số lượng mẫu dịch ô"i 2 - 5 ml). Kỹ ,thuật FISH là một kỹ th u ật di truyền tế bào - phân tử sử dụng trình tự chuỗi ngắn ADN sợi đơn (ADN dò), các ADN dò sẽ được lai vởi ADN đích trên tiêu bản NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ. Dưới kính hiển vi huỳnh quang ta có thể phát hiện, định vị những chỗ ADN dò lai với ADN đích. Nhờ vậy, phát hiện được những rối loạn số lượng và cấu trúc NST. Có các loại ADN dò cd bản aau: - ADN dò phần tâm: loại ADN dò này chủ yếu sử dụng để phát hiện các bất thường sô' lượng NST và phát hiện các NST nhiều tâm, những mảnh không tâm. - ADN đò đặc hiệu locus lai từng vùng của một NST: loại ADN dò chủ yếu phát hiện các đột biến gen - các rối loạn cấu trúc NST như: nhân đoạn nhỏ, mất đoạn nhỏ v.v... mà phương pháp nhuộm băng không phát hiện được. - ADN dò toàn bộ NST: dùng những ADN dò lai dọc theo chiều dài của một NST. Điều này cho phép phân biệt các NST khác nhau dựa vào màu sắc của chúng. Phương pháp này chủ yếu phát hiện rô'i loạn số lượng, cấu trúc NST ví dụ phát hiện khi một phần của NST này gắn thêm một phần NST khác trong trường hợp chuyển đoạn. - Ngoài ra, còn có kỹ thuật mBand FISH (multicolor fluorescence in situ hybridization) để phát hiện các bất thường trên các vị trí băng NST. 70 - ứng dụng kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trưổc sinh hội chứng Down: sử dụng ADN dò NST 21; nếu nhân tê bào gian kỳ có 2 tín hiệu lai —> 2 NST 21; nếu có 3 tín hiệu lai -> 3 NST 21. 5.2.5. L a i A D N tro n g công nghệ sin h học - tạo gen đơn dòng Mục đích kỹ thuật: đưa những đoạn ADN (gen) cần thiết vào, loại bỏ những đoạn ADN bất lợi để tạo nên những phân tử ADN lai quy định tổng hợp nên sản phẩm (chê phẩm) có chất lượng cao, với sô’ lượng nhiều hơn, thời gian sản xuất ngắn hơn. Đe thực hiện được kỹ thuật này cần: phân tử ADN cho (có chất lượng tốt), phân tử ADN nhận (có khả năng nhân lên nhanh). Các bước cơ bản của kỹ thuật này bao gồm: - Chọn ADN cho và ADN nhận hay còn gọi là vector (thể truyền). Vector thường được dùng là các plasmid của vi khuẩn, các phage, đôi khi người ta còn dùng các cosmid. - Dùng enzym giối hạn như nhau để cắt ADN cho và ADN của vector. - Dùng enzym nôi (ligase) để nôi đoạn ADN cho và phân tử ADN vector để tạo phân tử lai. - Trong trường hợp Gen tái bản Kháng Kanamycin Cảm ứng tetracydin Kháng Kanamycin Kháng tetracyclin muốn đưa phân tử ADN lai vào vi khuẩn, ví dụ vào E. Hình 3.5. Các bước dể tạo phân tử ADN lai trong công nghệ gen coli, người ta dùng CaCl2 để tạo điều kiện cho phân tử lai xâm nhập vào vi khuẩn dễ dàng hơn. - Các phân tử ADN được đưa vào vi khuẩn sẽ nhân lên, trong đó có những phân tử lai, nhưng cũng có những phân tử chưa nhận ADN cho vì vậy cần phân 71 lập riêng phân tử lai, ví dụ trong trưòng hợp vi khuẩn kháng kháng sinh, có vi khuẩn vẫn mọc trong môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử cho mang tính cảm ứng với kháng sinh), có vi khuẩn không mọc đựơc trong môi trường đó vì đoạn ADN mang tính chất kháng kháng sinh đã được thay bằng đoạn ADN cảm ứng với kháng sinh. - Bằng phương pháp vi sinh vật học, người ta cấy truyền các khuẩn lạc mang tính chất cần nghiên cứu. - Ngưòi ta cũng còn dùng phương pháp chuyển các khuẩn lạc từ đĩa cấy petri sang giấy thâm, sau đó cho lai với ADN dò sau khi đã làm biến tính ADN đích, kết quả lai được đánh giá bằng tự chụp hình phóng xạ để phát hiện khuẩn lạc cần tìm. - Sự nhân lên nhiều lần một loại khuẩn lạc mang phân tử ADN đích nào đó trong vi khuẩn gọi là tạo dòng invivo. 6. HIỆN TƯỢNG ĐA HÌNH VỀ CHIỂU DÀI CỦA CÁC ĐOẠN ADN DO ENZYM GIỚI HẠN TẠO NÊN (R estriction fragm ent length polymorphism s: RFLP) Khi đã có ADN dò cho một bệnh nào đó thì việc chẩn đoán bệnh đó có thể thực hiện bằng phương pháp Southern blotting như đã nêu ồ trên. Nhưng thực tế, sô' ADN dò đã biết còn rất ít. Trong trường hợp chưa biết ADN dò, để chẩn đoán bệnh ngưòi ta có thể dùng một phương pháp gián tiếp, đó là phương pháp dùng các thay đổi tự nhiên của ADN hay còn gọi là RFLP. Vậy RFLP là gì? RFLP là hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn ADN do enzym giới hạn tạo nên. Người ta ước tính chỉ khoảng 10% ADN của ngưòi tham gia vào tổng hợp protein, phần còn lại có chức năng chưa được rõ. Ở những đoạn ADN không tham gia tổng hợp protein, có thể có những thay đổi của các base nhưng không ảnh hưồng đến kiểu hình. Tuy nhiên những sự thay đổi như vậy có thể được xốc định vì chúng làm thay đổi đoạn do enzym giối hạn tạo nên, làm thay đổi sô' lượng, chiều dài đoạn được cắt. Ví dụ: trên phân tử ADN có 3 vị trí cắt, như vậy 2 đoạn ADN được tạo thành, nhưng nếu có 2 vị trí cắt thì chỉ có một đoạn cắt đưọc tạo thành. Những sự thay đổi của các đoạn như vậy có thể được nhận diện bằng phương pháp điện di. Sự nhận diện các đoạn này phụ thuộc vào ADN dò được dùng, và phụ thuộc vào vị trí ADN dò được dùng. Nếu gen đích (ví dụ gen bệnh) liên kết với vị trí của RFLP, có nghĩa là gen và vị trí RFLP ỏ trên cùng một NST và ở gần nhau tạo nên một tái tổ hợp di truyền trong quá trình giảm phâa. Sự 72 nghiên cứu các ADN tái tổ hợp trong gia đình cho phép chẩn đoán kiểu gen. Như vậy RFLP được dùng như một dấu ấn (marker) trong chẩn đoán bệnh trước sinh hoặc sau sinh ngay từ khi chưa có biểu hiện bệnh. RFLP cũng được dùng để phân biệt cơ thê đồng hợp hay cơ thể dị hợp. Kan và Dozy là những người đầu tiên dùng RFLP đê chẩn đoán. Các tác giả đã chứng minh rằng trong gia đình có bệnh hồng cầu liềm (HbS) enzym cắt Hpa I đã cắt ADN và tạo nên các đoạn có kích thưỏc khác nhau, một đoạn phân ly với gen lành, đoạn khác phân ly với gen HbS. Kiến thức này được dùng cho chẩn đoán trước sinh. Hiện tượng đa hình chiều dài của các đoạn do enzyra giới hạn được di truyền theo quy luật Mendel. RFLP là một phương pháp được dùng đế lập bản đồ gen. 7. DÂU Ấn ADN (DNA F in gerp rin tin g) - Mục đích của kỹ thuật: kỹ thuật này nhằm phân biệt được người này vối người khác, cá thể cùng loài dựa vào sự có mặt và phân bô' của các vạch ADN giống như khi dùng dấu vân da bàn tay. - Nguyên lý của kỹ thuật: một dấu ấn ADN có tên là VNTR (variable number of tandem repeats) hay còn gọi là microsatellite, có 11 tới 60 đôi base, dấu ấn này có mặt nhắc đi nhắc lại nhiều lần trong bộ gen. Sự có m ặt của đoạn ADN dấu ấn này đặc trưng cho từng cá thể. - Số lần nhắc lại của dấu ấn này có thể khác nhau trong từng locus và các dấu ấn ADN giống nhau có thể gặp ỏ những vị trí khác nhau của bộ gen. Nếu locus gen nàm trong phạm ví cúa đoạn bị cát bởi enzym giới hạn thì chiều dài của doạn cát thay đổi tùy theo sô’ lần nhắc lại của VNTR. - Tính đa hình do VNTR rất đặc trưng cho nên kỹ thuật này đã được sử dụng trong việc xác định phụ hệ và trong y pháp. - Kỹ thuật để phát hiện VNTR: cũng bao gồm các bước như khi tiến hành Southern blotting đến bước chuyển VNTR sang giấy nitrocellulose nhưng sau đó lai ADN đích với ADN dò để phát hiện phân tử lai. Ngày nay, sau khi phát hiện ra kỹ thuật PCR người ta có thể phát hiện trực tiếp các VNTR với các đôi mồi đặc hiệu. Mót sô tra n g th iế t bị cơ bản cho p h ò n g th í nghiệm p h â n tử Đế ứng dụng một sô’ kỹ th u ật sinh học phân tử ứng dụng trong y học như tách chiết ADN - PCR. 73 1. T rang th iế t bị cơ bản - Máy ly tâm thông thưòng trong phòng thí nghiệm với ống ly tâm (5 - 100ml) hoặc ly tâm ống nhỏ (0,5 — 2 nl). Máy ly tâm lạnh. - Tủ ấm, bình cách thủy (tốt nhất là bình có lắc). - Tủ lạnh từ 4°c đến -20°c hoặc -80°C: tùy mức độ bảo quản mẫu, có thể bảo quản ADN trong nitơ lỏng với thời gian dài hàng chục năm. - Tủ ấm 37°c, máy đo pH, máy lắc, máy sấy khô, máy hấp ẩm (tiệt trùng), tủ sấy với nhiệt độ cao, cân (có thể cân được g, mg). - Micropipet các loại: 0,5 - lOOnl; 20 - 100fj.l; 200 - 1000(11, các loại đầu týp cho micropipet. - Ông Eppendort, các loại ống đong, các loại dụng cụ thông thường của phòng xét nghiệm sinh hóa như chai, cốc..., giấy thiếc, giấy chỉ thị màu. 2. Hóa ch ấ t - Hóa chất dùng để tách ADN - ARN - Hóa chất pha các dung dịch đệm Tham khảo thực tập Di truyền Y học Bài “Một sô' kỹ thuật sinh học phân tử thông dụng ứng dụng trong Y học”. 3. Những máy thông dụng - Thiết bị soi tử ngoại. - Máy điện di. - Máy PCR. T ự LƯỢNG GIÁ 1. Trình bày phương pháp tách chiết ADN và phương pháp điện di ADN. 2. Trình bày đặc điểm và chức năng của enzym giới hạn (enzym hạn chê). 3. Trình bày nguyên lý và các phương pháp xác định trình tự nucleotid trong phân tử ADN. 4. Nêu đặc điểm của ADN dò, phương pháp tạo ADN dò. 5. Trình bày kỹ th u ậ t Southern Blotting. 6. Trình bày kỹ th u ậ t PCR (Polymerase chain reaction): phản ứng chuỗi polymerase. 7. Nêu hiện tượng đa hình về chiều dài của các đoạn ADN do enzym giói hạn tạo nên (RFLP). 74 Chương 4 BỘ GEN CỦA NGƯỜI MỤC TIÊU 1. Nêu được khái niệm bộ gen người, mục tiêu và ý nghĩa của dự án bản đồ gen người. 2. Trinh bày được đặc điểm bộ gen người. 3. Trình bày được một số phương pháp xác định bản đồ di truyền và bản đồ hình thề. 1. BỘ GEN LÀ GÌ? Ý NGHĨA CỦA VIỆC D ựN G BẢN Đ ồ GEN NGƯỜI Bộ gen (genome) chỉ toàn bộ các đơn vị di truyền chứa trong một bộ đơn bội (n) NST của loài. Mỗi giao tử bình thưòng chứa một bộ gen, mỗi tế bào soma chứa 2 bô een. Bộ gen của người là sự phân bô' ở các vị trí xác định của các gen trên chuỗi ADN trên 24 NST của ngưòi (22 NST thưòng và NST X, Y). Ngày nay người ta còn quan tâm đến các gen ngoài nhân, các gen nằm trên ADN của ty thể. Trong một tê bào sinh dưỡng bình thường, gen trong nhân chỉ có hai bản nhưng gen trong ty thể phải có hàng ngàn bản, vì mỗi tê bào chỉ có một nhân nhưng có tới trên một ngàn ty thể. Bản đồ bộ gen ngưòi là kết quả mô tả định vị các gen trên NST của người. Theo truyền thống thì bản đồ được phân chia theo các vùng tương ứng với cốc băng trên 24 NST (22 NST thường + X + Y). Trước khi di truyền học phân tử ra đòi, việc xây dựng bản đồ gen được tiến hành rất chậm chạp. Sự ra đòi của di truyền học phân tử đã gỡ được mối bế tắc trong nghiên cứu xây dựng bản đồ gen ngưòi, đã vạch ra được những đưòng nét cơ bản cho nghiên cứu. 75 Tháng 10 năm 1990, nước Mỹ lần đầu tiên chính thức công bô' Dự án bộ gen người (Human genome project). Một loạt các quốc gia khác như Anh, Pháp, Nhật, Canada và Đức cũng có những đầu tư đáng kể cho Dự án bộ gen người. Ba mục tiêu chính của dự án này là: - Dựng bản đồ di truyền (Genetic map). - Dựng bản đồ hình the (Physical map). - Xác định trình tự của cả ba tỷ đôi base của bộ gen người. Nhiễm sắc thể Bản đổ di truyért Bản đó hình thể Giải trinh lự ADN Hình 4.1. Sơ dó tóm tắt 3 mục tiêu khoa học chính cùa dự án bộ gen người Xây dựng được bộ gen của ngưòi với việc hoàn thành cả ba mục tiêu nêu trên sẽ cung cấp những kiến thức, cơ sở khoa học đế: - Giải thích rõ được nguyên nhân, cơ chế của nhiều tính trạng bình thường hoặc bệnh lý từ đó sẽ có những chẩn đoán, điều trị chính xác hơn, hiệu quả hơn. - Tách được dòng gen để nghiên cứu, để sửa chữa gen phục vụ điều trị gen (Gene therapy). - Sản xuất được các sản phẩm của gen (các loại protein) phục vụ đời sống, chẩn đoán, điều trị. 2. ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI Khoa học đã ước tính được bộ gen đơn bội của người gồm ba tỷ đôi base. ADN của người cũng như ADN của các Eukaryota khác bao gồm những trình tự mã hóa 76 (các exon) xen kẽ vối những trình tự không mã hóa (intron). Tùy mức độ có mặt của chúng trong nhân mà các trình tự ADN được chia làm ba loại: - ADN có trình tự duy nhất: là các gen mã hóa cho các protein, chiếm khoảng 10% bộ gen. Thuật ngữ gen đã có gần một thê kỷ (Johansen, 1909) nhưng khái niệm về gen, thực thể nó như thế nào thì thật là bí ẩn, sự khám phá về nó vẫn còn tiếp tục. Theo nghĩa truyền thống, gen là vật chất di truyền quyết định một tính trạng xác định, hay nói tương đối chính xác hơn, sau Mendel, gen là một đoạn ADN mã hóa một protein xác định. Nhưng sau này người ta thấy không nhất thiết một gen quyết định một tính trạng mà có thể có nhiều gen cùng quyết định một tính trạng và sự biểu hiện của gen phụ thuộc nhiều nhân tô nên hình thành loại tính trạng di truyền đa nhân tô". Thê nhưng đây chỉ là sự biểu hiện của gen qua tính trạng, qua kiểu hình, còn bản thân gen, chân dung của nó ra làm sao thì cho đến nay, ngay cả khi di truyền học phân tử đã phát triến cao độ thì khái niệm về gen vẫn chưa thực sự hiểu biết hết được. Các gen này sẽ được dịch ra protein bằng ARN polymerase II và gen được gọi là gen nhóm II. Các gen này chỉ mã hóa ra một loại protein. Gen ở sinh vật bậc cao bị gián đoạn bởi những vùng không mã hóa. Thường thì gen bắt đầu từ phía 5’ bằng một vùng chứa các yếu tô' điều chỉnh, kê đó là vùng khởi động, cả hai vùng này gộp lại thành vùng điều chỉnh. Tiếp theo là các vùng mã hóa. Các vùng mã hóa gọi là exon bị gián cách bởi các vùng không mã hóa gọi là intron. Exon đầu tiên có thêm một vùng gọi là vùng khởi đầu dịch mã, exon cuối có thêm về phía sau một vùng kết thúc dịch mã. Hai vùng này cũng thuộc về exon. Sô lượng exon trong các gen khác nhau không giống nhau. Ví dụ như gen fetoprotein của huyết thanh chuột nhắt gồm 15 exon: exon ngắn nhất gồm 53 đôi base, exon dài nhất gồm 280 đôi base, tổng chiều dài của các exon là 2229 đôi base. Gen cấu trúc ở người (đoạn ADN) gồm các đoạn exon xen kẽ intron. Toàn bộ các đoạn intron và exon này sẽ phiên mã thành phân tử mARN tiền thân. Phân tử mARN tiền thân này sẽ cắt loại các đoạn mRAN phiên mã từ intron và nối các đoạn mARN phiên mã từ exon để tạo thành phân tử mARN thuần thục. Sô' lượng các intron trong một gen cũng giông như sô’ lượng exon của nó, không giông nhau ở các gen. Kích thước của các gen nói chung rất biến thiên, có gen có thể lón hơn 2 triệu đôi base (gen của Dystrophin). Không có mối tương quan trực tiếp giữa kích thước của protein với chiều dài của gen mã hóa ra nó, mặc dù người ta thấy các chuỗi peptid lớn tương ứng vói những gen lớn. - ADN có trình tự lặp lại nhiều lần (ADN vệ tinh): chiếm khoảng 10 - 15% bộ gen, đó là các trình tự không mã hóa. Phần lớn các ADN vệ tinh khu trú tại vùng 77 tâm của NST, tương ứng với băng c tức là phần dị nhiễm sắc cấu trúc. Cốc chuỗi Nu này không phân tán trong NST mà khu trú tập trung, chức năng chưa rõ. ADN lặp lại nhiều lần được chia thành hai loại: loại thứ nhất có chuỗi nucleotid ngắn (5 - 10 đôi base) xếp nối đuôi nhau, sô’ lượng bản sao có thể tới hàng trăm triệu. Các chuỗi này tăng methyl hóa ỏ tế bào soma và giảm methyl hóa ỏ tế bào tạo giao tử, tại NST Y. Loại thứ hai có chuỗi Nu dài hơn, từ 100 đến 200 đôi base, cũng xếp nôi đuôi nhau. Ngoài hai loại có tính khu trú ở trên, còn có một loại nữa có tính phân tán gọi là vệ tinh nhỏ (minisatellite) không nằm trong vùng dị nhiễm sắc cấu trúc, loại này rấ t có ích cho việc lập bản đồ gen. - ADN có trình tự lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% bộ gen của người, chúng cũng có cấu trúc gồm các đoạn chuỗi Nu lặp lại nhưng đoạn chuỗi dài hơn, từ 100 đến 1000 đôi base, kém đồng nhất hơn nhiều so với loại lặp lại nhiều lần. Loại ADN này phân tán trong toàn bộ gen, phần lớn chúng không thấy hoạt động phiên mã. Chúng không mã hóa nhưng cũng có thể có chức năng phiên mã: chúng là gen của các rARN, tARN và một sô' gen khác nữa. Ngoài ba loại trình tự kể trên, trong bộ gen người còn có các gen nhẩy (transposon), đó là những đoạn ADN có khả năng tích hợp vào bất cứ đâu của bộ gen. Như vậy, dựng bản đồ gen bao gồm xác định vị trí của các gen mã hóa protein (coding genes) đồng thời xác định vị trí của các đoạn ADN không mã hóa, có tính đa hình. Hình 4.2 giới thiệu sô' lượng các gen mã hóa đã được phát hiện theo thời gian. 78