🔙 Quay lại trang tải sách pdf ebook Công nghệ sinh học dược Ebooks Nhóm Zalo Cống nghệ SINH HỌC DUỢC (DÙNG CHO ĐÀO TẠO Dược s ĩ ĐẠI HỌC) Chủ biên: GS. TS. NGUYỄN VĂN THANH Ml 910 Không khí ra • ^ • Lọc vô trùng Binh chứa mõi trường ; : l l á _ I óng dẳn tràn Lo, °i — ■ * Binh thu hoạch CD NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM CONG NGHẸ SINH HỌC DƯỢC ■ ■ (DỪNG CHO ĐÀO TẠO DƯỢC s ĩ ĐẠI HỌC) MÃ SỐ: D.20.Z.09 NHÀ XUẤT BẢN GIÁO DỤC VIỆT NAM HÀ NỘI - 2009 Chỉ đạo biên soạn VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ Chủ biên GS.TS. NGUYỄN VĂN THANH Những người biên soạn GS.TS. NGUYỄN VĂN THANH TS. TRẲN CÁT ĐÔNG PGS.TS. TRẦN THU HOA PGS.TS. BÙI TÙNG HIỆP TS. NGUYỄN TRỌNG HIỆP ThS. HUỲNH THỊ NGỌC LAN Tham gia tổ chức bản thảo ThS. PHÍ VÁN THÂM TS. NGUYỄN MẠNH PHA © Bản quyền thuộc Bộ Y tế (Vụ Khoa học và Đào tạo) 1040 - 2009/CXB/5 - 1960/GD Mã số : 7K829Y9 - DAI LỜI GIỚI THIỆU Thực hiện một số điều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo và Bộ Y tê đã ban hành chương trình khung đào tạo Dược sĩ đại học. Bộ Y tẽ tố chức biên soạn tài liệu dạy — học các môn cơ sở và chuyên môn theo chương trình trên nhằm từng bước xây dựng bộ sách đạt chuẩn chuyên môn trong công tác đào tạo nhân lực y tế. Cuốn Công nghệ sinh học Dược được biên soạn dựa vào chương trinh giáo dục của khoa Dược Đại học Y-Dược Tp. Hồ Chí Minh trên cơ sở chương trình khung đã được phê duyệt. Sách được các giáo sư, tiến sĩ, các nhà giáo có kinh nghiệm của Bộ môn Vi sinh - ký sinh biên soạn theo phương châm: kiến thức cơ bản, hệ thông; nội dung chính xác, khoa học; cập nhật các tiến bộ khoa học, kỹ thuật hiện đại và thực tiễn Việt Nam. Cuốn Công nghệ sinh học Dược đã được Hội đồng chuyên môn thẩm định sách và tài liệu dạy - học chuyên ngành Dược sĩ đại học của Bộ Y tê thẩm định năm 2009. Bộ Y tế quyết định ban hành là tài liệu dạy - học đạt chuẩn chuyên môn của Ngành trong giai đoạn hiện nay. Trong thời gian từ 3 đến 5 năm, sách phải được chỉnh lý, bổ sung và cập nhật. Bộ Y tế chân thành cảm ơn các tác giả và Hội đồng chuyên môn thẩm định đã giúp hoàn thành cuôn sách; cảm ơn GS.TSKH. Nguyễn Văn Dịp và PGS.TS. Cao Văn Thu đã đọc và phản biện để cuốn sách sớm hoàn thành, kịp thời phục vụ cho công tác đào tạo nhân lực y tế. Lần đầu xuất bản, chúng tôi mong nhận được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp, các bạn sinh viên và các độc giả để lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn. VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ LỜI NÓI ĐẦU Công nghệ sinh học đã xuất hiện từ khi loài người còn chưa có hiểu biết đầy đủ về các hệ thống sống. Các công nghệ sơ khai này được hình thành nhờ kinh nghiệm và chủ yếu liên quan đến việc chế biến thực phẩm và đồ uống lên men. Đến thế kỷ XIX, khi Louis Pasteur đặt nền móng cho vi sinh học thực nghiệm, công nghệ sinh học bước vào thời kỳ mới dựa trên khoa học sinh học. Từ lúc đó, công nghệ lên men hiện đại đã được phát triển để sản xuất các chất chuyển hóa từ vi sinh vật nhằm phục vụ đời sống và các ngành công nghiệp khác. Cũng trong thời kỳ này, vaccin đã được phát minh và đây có thể coi là sản phẩm công nghệ sinh học dược đầu tiên, nhưng một ngành công nghiệp sinh học dược thực sự chưa được hình thành. Sự ra đòi của công nghiệp sinh học dược thực sự được đánh dấu bằng việc sản xuất penicillin và streptomycin nhờ công nghệ lên men vào những năm 1940. Đến cuối những năm 1970, công nghệ sinh học dược đã bước vào một giai đoạn mới với việc sản xuất insulin ngưòi bằng kỹ thuột tái tô hợp di truyền. Chính việc áp dụng mạnh mẽ công nghệ gen trong sản xuất các protein trị liệu đã làm cho công nghệ sinh học dược trở thành động lực chính để đưa công nghệ này vào giai đoạn hiện đại với sự hội tụ của công nghệ gen và công nghệ lên men. Ngày nay, công nghệ sinh học dược vẫn dựa trên nền tảng công nghệ lên men để sản xuất ra sản phẩm, nhưng việc phát triển các sản phẩm mới chủ yếu dựa vào công nghệ gen, enzym và tế bào. Mặt khác, các hệ thống sản xuất không còn là tế bào vi sinh vật nữa mà có thể là tế bào động vật, thực vật, sinh vật chuyển gen và thậm chí các hệ thông phi sinh vật. Công nghê sinh học dược ngày nay đóng vai trò quan trọng đối với ngành Dược. Trong các năm gần đây, thuốc công nghệ sinh học chiếm đa sô" các thuốc mối được phát triển và cấp phép. Các hãng dược phẩm lớn trên thế giới đều có bộ phận công nghệ sinh học rất mạnh hoặc sáp nhập với các hãng công nghệ sinh học. Công nghệ sinh học trong ngành Y-Dược chiếm đến 80-90% tổng doanh thu của công nghệ sinh học nói chung. Dược phẩm công nghệ sinh học hiện nay không còn là các sản phẩm chuỹển hóa vi sinh vật mà chủ yếu là các protein tái tổ hợp, acid nucleic và tế bào. Trong sách này, chúng tôi cố gắng khái quát các công nghệ nền tảng của công nghệ sinh học dược và cung cấp các thí dụ về công nghệ sản xuất của một số dược phẩm cụ thể. Sách được chia làm năm chương tương ứng với các công nghệ nền đó là: công nghệ lên men, công nghệ enzym, công nghệ tế bào, công nghệ gen và công nghệ miễn dịch, trong mỗi chương đều có khái quát cáe vấn đề chung của công nghệ và ứng dụng sản xuất một sô" sản phẩm cụ thể. Sách được xuất bản lần đầu do đó không tránh khỏi thiết sót, rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của bạn đọc. CÁC TÁC GIẢ MỤC LỤC Lòi giới thiệu..................................................................................................................3 Lời nói đ ầu ............................................................ .............................................................................5 Bài 1. Mở đ ầu ................................................................................................................. 9 1. Khái niệm................................................................................................................. 9 2. Sự phát triển của Công nghệ sinh học thế giới...................................................... 13 3. Sự phát triển của Công nghệ sinh học Việt Nam.................................................. 14 4. Phát triển Cồng nghệ sinh học Việt Nam đến năm 2020................................................. 16 Chương 1. CÔNG NGHỆ LÊN MEN.......................................................................... 20 Bài 2. Khái niệm và phương pháp lên men công nghiệp....................................20 1. Đại cương................................................................................................................ 20 2. Chủng vi sinh vật................................................................................................... 21 3. Môi trường lên men................................................................................................ 36 4. Hệ thống lên men................................................................................................... 46 5. Giám sát quá trình ỉên men...................................................................................58 Bài 3. Sản xuất kháng sin h ....................................................................................... 61 1. Mở đầu.....................................................................................................................61 2. Sản xuất benzylpenicillin................................................................... ................ 62 3. Sản xuất penicillin V .............................................................................................68 4. Sản xuất cephalosporin c ......................................................................................68 5. Sản xuất erythromycin..................................................................... .................... 72 Bài 4. Thực phẩm chức năng....................................................................................81 1. Khái niệm......................................................................... ..................................... 81 2. Prebiotic.............................................................. .................................................. 83 3. Probiotic................................................................................................................. 85 4. Những khuynh hướng trong tương lai.................................................................100 tìài 5. Sản xuất một số sản phẩm iên men k h ác .................. :........................... 1U3 1. Sản xuất acid hữu cơ............................................................................................ 103 2. Sản xuất acid amin bằng con đưòng lên men......................................................118 3. Sản xuất một số vitamin......................................................................................132 Chương II. CÔNG NGHỆ ENZYM............................................................................145 Bài 6. Khái quát về công nghệ enzym - p ro tein .................................................145 1. Khái niệm............................................................................................................. 145 2. Xúc tác sinh học...................................................................................................146 3. Nguồn cung cấp enzym........................................................................................149 5. Enzym cốđịnh..................... ................................................................................ 158 Bài 7. ứng dụng enzym trong ngành Dược..........................................................170 1. Enzym trị liệu..................... !...................................... ........................................ 170 2. Sản xuất thuốc bằng công nghệ enzym............................................................ 181 Chương III. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO............................................................................191 Bài 8. Công nghệ nuôi cấy tế bào và ứng dụng trong ngành Y-Dược.............191 1. Công nghệ nuôi cấy tế bào.....................................................................................191 2. ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào.................................................................... 198 Bài 9. Công nghệ tế bào gốc..................................................................................... 201 1. Khái niệm...............................................................................................................201 2. Triển vọng và khó khăn trong việc ứng dụng tế bào gốc......................................207 3. Sản xuất phôi IVF (in vitro fertility)....................................................................209 Chương IV. CỒNG NGHỆ GEN................................................................................. 211 Bài 10. Công cụ và kỹ th u ật cơ b ản........................................................................ 211 1. Lược sử công nghệ gen.......................................................................................... 211 2. Công cụ cơ b ản ...................................................................................................... 212 3. Kỹ thuật thao tác gen................................ .......................................................... 220 4. Tối ưu hóa sự biểu hiện của gen tái tổ hợp...........................................................225 Bài 11. ứng dụng công nghệ g en ............................................................................230 1. Sản xuất protein tái tổ hợp...................................................................................230 2. Liệu pháp gen........................................................................................................ 249 Bài 12. Các phương pháp chẩn đoán phân tử ......................................................255 1. Những phương pháp cơ bản trong chẩn đoán phân tử ........................................ 256 2. ứng dụng của chẩn đoán phân tử........................................................................ 272 Chương V. CÔNG NGHỆ MIEN d ịc h ......................................................................283 Bài 13. Sản xuất v a c cin ............................................................................................283 1. Mỏ đầu................................................................................................................... 283 2. Phân loại vaccin....................................................................................................284 3. Phương pháp sản xuất vaccin...............................................................................286 4. Tá chất miễn dịch..................................................................................................293 Bài 14. Huyết thanh và kháng th ể ..........................................................................297 1. Lịch sử hình thành................................................................................................297 2. Các chế phẩm gamma globulin............................................................................ 298 3. Dự phòng bàng globulin huyết thanh miễn dịch..................................................301 4. Dự phòng bằng globulin miễn dịch cao................................................................ 302 5. Miễn dịch liệu pháp với kháng thể đơn dòng...................................................... 303 6. Miễn dịch liệu pháp trong điều trị ung thư......................................................... 303 Đáp án Tự lượng giá..................................................................................................305 Tài liệu tham khảo và đọc thêm.............................................................................. 306 Mục Ịục tra cứu (index).............................................................................................308 B ài 1 MỞ ĐẦU MỤC TIÊU 1. Trình bày được các khái niệm về công nghệ sinh học và công nghệ sinh học dược. 2. Trình bày được quả trình phát triển của công nghệ sinh học thế giới uà Việt Nam. 3. Chỉ ra được các đặc điểm chính của công nghệ sinh học. 1. KHÁI NIỆM 1.1. Đ ịnh n g h ĩa Thuật ngữ “công nghê sinh hoc” lần đầu tiên được nhắc đến bởi Karl Ereky, một kỹ sư ngưòi Hungary vào năm 1919. Lúc bấy giò, nó nhằm chỉ kiểu sản xuất trong đó sản phẩm được tạo ra từ nguyên liệu đầu với sự trợ giúp của sinh vật sổng. Ereky đã hình dung ra một “thời đại hóa sinh” tương tự như “thời đồ đá” và “thời đồ sắt”. Ngày nay, có nhiều định nghĩa về công nghệ sinh học, tuy nhiên định nghĩa công nghê sinh hoc là “bất kỳ công cụ nào được sử dụng để thao tác trên các sinh vật, các hệ thống sinh học hay một phần của nó để tạo ra sản phẩm hay dịch vụ” được công nhận rộng rãi. Từ định nghĩa này ta có thể thấy rằng, ngay cả trước khi loài người hiểu được sinh học là gì họ đã sử dụng Công nghệ sinh học (CNSH) để sản xuất rượu và bánh mì, đã biết biến đổi các đặc tính tự nhiên của sinh vật nhằm thu các sản phẩm có lợi. Với kinh nghiệm và các kiến thức tích lũy được đến nay CNSH đã có tầm ảnh hưởng sâu rộng đến nhiều khía cạnh đời sông con người, mở ra nhiều triển vọng về năng suất nông nghiệp hay điều trị bệnh tật, cải thiện chất lượng cuộc sông. Với việc tích lũy kiến thức và kinh nghiệm với các kỹ thuật sinh học hiện đại, định nghĩa CNSH được mở rộng bao gồm các ứng dụng của công nghệ tái tổ hợp di truyền, công nghệ nuôi cấy tê bào trong sản xuất và dịch vụ. CNSH hiện đại và cô điển không khác nhau về nguyên lý nhưng khác nhau về kỹ thuật được sử dụng. Ví dụ, việc cải thiện di truyền cổ điển và các kỹ thuật di truyền phân tử có cùng mục đích nhằm cải thiện sản phẩm đề thu được nhiều lợi ích hơn, tuy nhiên, các cải tiến mức phân tử cho kết quả chắc chắn hơn. Hầu hết các thuộc tính của sản phẩm sinh học đều được biến đổi theo hướng có lợi bởi nhà sản xuất. Phương pháp cổ điển đế biến đổi một tính trạng nào đó cần nhiều thời gian và quan trọng hơn nó phụ thuộc nhiều vào sự tồn tại của thuộc tính đó trong tự nhiên. Ví dụ, dể cải thiện tính đề kháng với sâu bệnh, các nhà khoa học cần tìm ra nguồn cung cấp kiểu gen đề kháng tương thích với loài cần cải tạo mối có thể lai được. Đôi khi điều này gần như không thề được vì tính trạng đó không tồn tại trong kho dự trữ gen của loài hoặc các loài lân cận. Với công nghệ gen, người ta có thể đưa một gen đề kháng như vậy từ một loài không tương thích vào loài cần cải thiện với kết quả tin cậy được mà không cần quan tâm đến sự tương thích về bộ máy sinh sản giữa hai loài. Điều này cho phép mở rộng gần như vô hạn kho dự trữ gen. Công nghệ sinh học hiện đại được thực hiện ở mức độ phân tử, nghĩa là các giới hạn trưốc đây có liên quan đến loài đều không còn nữa. Đó là vì tất cả các loài đều chứa ADN, phân tử mang toàn bộ thông tinh di truyền với mã di truyền phố biến cho tất cả các loài. Các phân tử ADN này có thổ được thao tác, xử lý, biến đổi bên trong hay bên ngoài tế bào, có thể di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác, vượt qua các biên giới của loài sinh học. 1.2, P hân loại cô n g nghệ sinh học Theo sự p h á t triể n của kỹ th u ậ t sản xuất, CNSH dược được chia làm ba th ế hệ: - T h ế hệ môt: sản xuất các sản phẩm thực phẩm và nước uống lên men. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm lên men hỏ vối giông tự nhiên và phần lớn là chưa được biết rõ, nuôi trồng và nuôi cấy mô thực vật. Giông sản xuất được cải tiến thông qua chọn lọc tự nhiên hay lai tạo. - Thê hê hai: sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào hay nuôi cấy mô để sản xuất. Sản phẩm của thế hệ này gồm kháng sinh, enzym, vitamin, acid amin, acid hữu cơ, dung môi. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm gây đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men kín, thuần chủng, được tôi ưu hóa để sinh sản phẩm tối đa. - T h ế hệ ba chính là CNSH hiên đại. Nó bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp di truyền. Ưng dụng công nghiệp của nó bao gồm dược phẩm, nông nghiệp, hóa chất, y học. Các sản phẩm hiện nay đang ỉà các protein trị liệu, chẩn đoán, vaccin thế hệ hai, ba, cải tạo giống nông nghiệp và xử lý môi trường. Cần lưu V rằng ngày nay tất cả các thế hệ CNSH đều sử dụng các kỹ thuật của thế hệ ba, bất kể họ sử dụng công nghệ thế hệ một, hai hay ba để sản xuất. Do đó phát triển CNSH cần đặt trọng tâm phát triển các kỹ thuật thế hệ ba để tạo tiền đề thúc đẩy chung. Xét về phạm vi ứng dụng CNSH có th ể được chia là ba loại: - Công nghệ sinh học xanh (Green Biotechnology): CNSH áp dụng trong nông nghiệp và xử lý môi trưòng. - Công nghệ sinh học trắng (White Biotechnology): sử dụng xúc tác sinh học và công nghệ lên men để tạo ra các sản phẩm công nghiệp như hóa chất hay enzym. - Công nghệ sinh học đỏ (Red Biotechnology): CNSH ứng dụng trong Y-Dược. Chẩn đoán và điều trị bệnh. Sản xuất dược phẩm. 1.3. Kỷ n gu yên cô n g nghệ sinh học h iện đại Công nghệ sinh học hiện đại với những tiềm năng ứng dụng to lớn đã thu hút sự quan tâm của nhiều người, tuy nhiên nó cũng làm một số ngưòi e ngại và thậm chí phản đối. Hai đặc điểm chính của CNSH là nguyên nhân của sự e ngại này là tốc độ áp dụng của nó trong nhiều lĩnh vực kinh tế trong các năm gần đây và cách tiếp cận đột ngột của nó vào thị trường tiêu dùng. Có thê thấy, ví dụ, thời gian từ lúc phát hiện ra công nghệ đến lúc sản phẩm có mặt trên thị trường được rút ngắn rất nhiều so với 50 - 100 năm trước đây. Trước đây, một sáng chế, như máy truyền hình, từ lúc phôi thai phải mất 20 - 30 năm mới phổ biến. Nhưng ngàv nay, nhiêu sản phẩm CNSH, như thực phẩm biến đổi gen, đã được đưa ra sử dụng trên thị trường ngay cả trước khi mọi ngưòi có được nhận thức đầy đủ về nó. Sự thiếu nhận thức của công chúng đã tạo ra tâm lý sợ hãi đối với các sản phẩm của CNSH. Có thể so sánh vối thòi điểm mà động cơ hơi nưóc và các dây chuyền công nghiệp được phát minh. Khi đó người ta sợ hãi trưốc sự cải thiện năng suất mà các phát minh này đem lại. Bảng 1.1. So sánh thời gian phát triển và thương mại hóa một số công nghệ Công nghệ Phát minh Bắt đẩu sản xuất Thời gian phát triển Viết máy 1888 1938 50 năm Truyền hình 1907 1936 29 năm Giống cây trồng biến đổi gen 1983 1994 11 năm 1.4. Các đặc đ iểm củ a côn g nghệ sin h học 1. Là một kỹ th u ậ t đa nàng, ứng dụng rộng rãi, và có tính chuyển đôi qua lại giữa các lĩnh vực, ví dụ một kỹ thuật được áp dụng cho y tế cũng có thê được sử dụng cho nông nghiệp. 2. Đòi hỏi m ức dô nghiên cứu cao. Tỷ lệ đầu tư cho nghiên cứu để phát triển một sản phẩm mới cao hơn các ngành khác 5 —10 lần và chiêm đên 40 — 50% lợi tức. Do đó, sự liên hệ giữa các cơ sở hàn lâm vối cơ sở ứng dụng sản xuất phải hết sức chặt chẽ. 3. Đa lĩnh vưc. Hội tụ của nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ khác nhau như di truyền học, hóa sinh, công nghệ thông tin, cơ khí tự động hóa,... 4. Có tính hợp tác cao. Để tạo được ứng dụng công nghiệp, CNSH phải có được sự phối hợp chặt chẽ và đồng bộ giữa năng lực nghiên cứu, cơ khí tự động hóa và sự phát triển của công nghệ sản xuất mới. cần thiết phải phối hợp các lĩnh vực có liên quan tạo thành một mạng lưới chặt chõ mói đảm bảo được đầu ra của công nghệ. 1.5. Công nghệ sin h học Y-Dược Công nghê sin h hoc Y-Dược (CNSHYD): được nhắc đến như là CNSH đỏ, là lĩnh vực CNSH tạo ra các sản phẩm phục vụ cho việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người. Trên thế giới CNSHYD là một mũi nhọn của CNSH và là lĩnh vực đang được đầu tư nghiên cứu mạnh nhất, tạo ra nhiều lợi nhuận nhất. Các đặc điểm của CNSHYD 1. Đòi hỏi mức đô đầu tư cho nghiên cứu cao: nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khỏe là các nhu cầu hết sức cấp bách trong khi quá trình phát triển sản phẩm lại phức tạp do đặt nặng các vấn đề về an toàn, độ chính xác, độ tin cậy. Do đó, để có được sản phẩm cần phải đầu tư lớn vê tài chính và nhân lực cho nghiên cứu, mới có thể rút ngắn thòi gian phát triển và tạo ưu thế cạnh tranh. 2. Quy mô vừa và nhỏ. Do khối lượng thành phẩm cần có để đáp ứng nhu cầu không lớn như các lĩnh vực khác như nông nghiệp hay hóa chất nên quy mô sản xuất của các quá trình CNSHYD thường từ nhỏ đến trung bình. 3. Tỷ lê đầu tư nghiên cứu cao hơn sản xuất', do quy mô sản xuất nhỏ nên đầu tư cho thiết bị sản xuất thường thấp; đầu tư chủ yếu tập trung cho nghiên cứu. 4. Có tính p hôi hợp cao: để có được ứng dụng, CNSHYD đòi hỏi sự hợp tác chặt chẽ giữa các ngành sinh học, hóa học, dược lý học, dược động học, bào chế. Quá trình phát triển một sản phẩm CNSHYD cần sự phổi hợp giữa cơ sở nghiên cứu vối cơ sở Y—Dược mới có thể triển khai các thử nghiệm lâm sàng và đảm bảo các vấn đề về an toàn và y đức. Sản phẩm của CNSHYD - Chẩn đoán y học: các công cụ chẩn đoán dựa trên ADN, enzym, miễn dịch học. Dự phòng bênh: vaccin, đặc biệt là vaccin thế hệ hai (subunit vaccin) và thế hệ ba (ADN vaccin). - Điều trị bệnh: các công cụ và nên tảng cần cho + Liệu pháp gen + Liệu pháp miễn dịch + Liệu pháp tế bào gổc - Dược phẩm'. + Dược phẩm tái tổ hợp: hormon, enzym tái tổ hợp, protein trị liệu. + Thuổc có nguồn gốc từ sinh vật như kháng sinh, enzym, coenzym, vitamin, probiotic, prebiotic, steroid, các chất có hoạt tính sinh học như taxol,... + Hệ thông chuyển giao thuốc: thuốíc được bao trong các màng sinh học có gắn các phân tử định hướng đến nơi cần điều trị nhờ hệ thống thụ thể, đo đó làm tăng hiệu quả sử dụng, giảm liều lượng và độc tính của thuốc. + Thuốc và nguyên liệu thuốc tổng hợp bằng con đường xxíc tác sinh học: thay thế xúc tác hóa học bằng xúc tác sinh học để đơn giảm hóa qưá trình tổng hợp nguyên liệu thuốc, do đó giảm giá thành, tăng khả năng cạnh tranh. Đặc biệt gần đây các d ư ợc phẩm tinh khiết quang học có tính đặc hiệu và hiệu quả cao hơn trong khi độc tính và độ an toàn cao hơn so với dạng hỗn hợp tiêu triền là một lĩnh vực mới trong tổng hợp nguyên liệu thuốc mà xúc tác sinh học là lựa chọn bắt buộc. + Các dược liệu quý bằng con đưòng nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào. 2. S ự PHÁT TRIỂN CỦA CỒNG NGHỆ SINH HỌC THỂ GIỚI Từ bình minh của nhân loại, người ta đã sử dụng các hệ thống sống để tạo ra sản phẩm, chủ yếu là lương thực, thực phẩm. Cây trồng, vật nuôi đã được lai tạo, vi sinh vật đã được sử dụng để sản xuất thực phẩm như rượu, bia, phô-mát và bánh mì, mặc dù bản chất và cđ chế của quá trình hoàn toàn không được hiểu rõ. Từ thế kỷ XIX, cùng với sự phát hiện ra vi sinh vật, các khám phá của Mendel đã đặt nền móng cho các quá trình lên men thuần chủng, khái niệm lên men vô trùng qua các công trình của Koch, Pasteur, và Lister. Trong Thế chiến I, CNSH đâ được sử dụng để sản xuất aceton từ tinh bột dùng cho công nghiệp sơn, phục vụ cho kỹ nghệ xe hơi. Các nghiên cứu trong những năm 1930 nhắm đến việc gia tăng năng suất sản phẩm nông nghiệp đê cung cấp cho công nghiệp thay vì nhập khẩu. Thế chiến II đã thúc đẩy quá trình sản xuất penicillin để phục vụ quân đội. Và từ đó CNSH hướng đến việc sản xuất dược phẩm và các hóa chất công nghiệp. Khái niệm vũ khí sinh học và chiến tranh sinh học cũng ra đời trong thời kỳ này. Bên cạnh đó CNSH trong nông nghiệp, thuốc trừ sâu sinh học, chế biến thực phẩm, sản xuất năng lượng cũng phát triển vượt bậc. Nửa sau của th ế kỷ XX, cùng vói sự phát hiện cấu trúc ADN và sự phát triển của ngành Sinh học phân tử, các công cụ thao tác gen dần dần được phát hiện và lần đầu tiên vào năm 1973 Stanley Cohen đã thành công trong việc tạo ra phân tử di truyền mói hoạt động được in vitro bằng việc sử dụng enzym giới hạn và ligase, mở ra kỷ nguyên CNSH hiện đại. Năm 1976, trên cơ sỏ thành tựu của Stanley Cohen, công ty Genetech (California, Mỹ) được thành lập và đến năm 1978 đã tạo dòng thành công insulin ngưòi vào vi khuẩn E. coli. Năm 1982, insulin người tái tổ hợp trong E. coli được cấp phép lưu hành bởi FDA, mở đầu cho hàng loạt dược phẩm tái tổ hợp ra đời. Năm 1997, I. Wilmut công bô' việc nhân bản vô tính động vật và tạo cừu Doly, mở ra triển vọng nhân bản nhiều loại động vật từ tế bào soma. Thomson và cộng sự (1998) đã công bô' việc phân lập được các dòng tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) từ phôi nang (blastocyst) người. Sau 4,5 tháng các tế bào này vẫn giữ nguyên khả năng phát triển thành các tế bào biểu mô, sụn, xương, cơ trơn, thần kinh, da. Đó là những cơ sở đầu tiên của công nghệ tế bào gốc. Ngày 26/6/2000, lần đầu tiên công bô' kết quả giải trình tự bộ gen người (Human Genome Project- HGP). Tháng 2-2001, công bô" tiếp những kết quả phân tích chi tiết hơn và tháng 4/2003 “Giải mã bộ gen người” đã ở dạng hoàn chỉnh. Thành tựu to lón này mở ra những triển vọng to lón cho sinh học phân tử, di truyền học, hóa sinh học, và công nghệ sinh học. Năm 2000, mức tiêu thụ sản phẩm CNSH hiện đại trên 50 tỷ USD và dự kiến sẽ tăng nhanh trong những năm sắp đến. Khác vối CNSH truyền thống, CNSH hiện đại sử dụng các tác nhân sinh học đã được cải thiện bằng kỹ thuật gen để chuyển hóa nguyên liệu thành sản phẩm với mục tiêu là năng suất chất lượng và thích ứng rộng đối với các điều kiện ngoại cảnh thay đổi. sản phẩm cụ thể của CNSH hiện đại là các protein tái tổ hợp, các sản phẩm chuyển hóa được tách chiết, tinh chế để sử dụng trong y tế để bảo-vệ sức khỏe con người và các ngành khác. Các công nghệ nền của CNSH hiện đại là công nghệ gen, công nghệ tế bào (vi sinh vật, động vật, thực vật), công nghệ lên men (fermentation technology) và công nghệ enzym (enzym technology) trong đó công nghệ gen là cốt lõi. 3. S ự PHÁT TRIỂN CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆT NAM 3.1. N hữ ng tiề n đ ể q u an trọn g Ngày 1-1-1889» Viện Pasteur Paris được thành lập. Tại đây những học trò của Pasteur như Calmette và Guierin đã làm ra vaccin chông lao (BCG), Emile Roux phát minh việc trị liệu bằng huyết thanh và tìm ra thuốc trị bệnh bạch hầu. Năm 1891, Viện Pasteur Sài Gòn, chi nhánh đầu tiên của Viện Pasteur ở nưốc ngoài đã được thành lập và Albert Calmette là giám đốc đầu tiên. Năm ấy Calmette mới 27 tuổi, ông tiếp nhận một phòng thí nghiệm đơn sơ tại Viện quân y Grall (Bệnh viện nhi đồng II Tp HCM ngày nay). Trong vòng không đầy 3 năm Calmette đã sản xuất được vaccin đậu mùa, vaccin chống dại, men làm nếp rượu và bước đầu triển khai công trình làm huyết thanh chống nọc rắn hổ mang. Năm 1893, Alexandre Yersin nôi nghiệp Calmette. Vào những năm 1895- 1896, Yersin bắt đầu xây dựng Viện Pasteur Nha Trang và trại chăn nuôi ngựa Suôi Dầu để chê huyết thanh. Ông cũng di thực cây Canhkina làm thuốc chống sôt rét và cây cao su góp phần phát triển kinh tế. Yersin là ngưòi phát hiện ra vi khuẩn dịch hạch và năm 1895 cùng với E. Roux đã nghiên cứu thành công cách chê huyết thanh miễn dịch điều trị người bị bệnh dịch hạch. Năm 1925, Viện Pasteur Hà Nội được thành lập. Năm 1936, Viện Đà Lạt và các Viện Pasteur Đông Dương khác được đặt dưới sự chỉ đạo của Paris. 3.2. G iai đoạn từ 1945 đ ến nay Năm 1949, BS. Nguyễn Văn Hưởng ở vùng kháng chiến đã sản xuất được vaccin phòng đậu mùa, tả, thương hàn. Năm 1950, BS. Phạm Ngọc Thạch và BS. Đặng Văn Ngữ đã nuôi cấy nấm Penicillium lấy dịch nuôi cấy để rửa vết thương cho thương binh. BS. Đặng Văn Ngữ trực tiếp sản xuất dịch thô penicillin ở chiến khu Việt Bắc. Công nghiệp vaccin: công ty vaccin và chế phẩm sinh học I Hà Nội và Viện Vaccin và chế phẩm sinh học Nha Trang đã sản xuất đủ lượng vaccin phòng bệnh hàng năm ở nưốc ta: vaccin viêm gan B (trên 4 triệu liều), vaccin viêm não Nhật Bản (trên 3 triệu liều), vaccin tả uống (trên 400 ngàn liều), vaccin dại (150 ngàn liều), và các loại vaccin khác như BCG (Viện Pasteur Tp HCM), vaccin thương hàn, ho gà và uốn ván. Công nghiệp aciđ amin và lên men: công nghiệp rượu bia tiếp tục phát triển kể từ khi nhà máy rượu Sài Gòn ra đòi và nãm 1887. Trong những năm của thập niên 1960: nhập nhà máy sản xuất bột ngọt (mì chính) và phát triển mạnh ỏ các tỉnh phía Nam. Từ 1996, nhiều công ty liên doanh như Ajino—moto, Vedan... đã xây dựng nhà máy bột ngọt liên doanh. Từ năm 1995 đến nay: các ứng dụng của CNSH hiện đại như chẩn đoán phân tử, chuyển gen động vật và thực vật, vi sinh vật tái tổ hợp, vaccin tái tô hợp bắt đầu nghiên cứu tại các viện, trường trong nước. Gần đây nhất là các dự án sản xuất vaccin bằng virus trên tế bào thận khỉ tiên phát của Công ty vaccin và sinh phẩm I Hà Nội. Viện công nghệ sinh học đang phối hợp vói viện vaccin Nha Trang nghiên cứu sản xuất vaccin H5N1 cho người bằng phương pháp nuôi cấy chủng NIBRG—14 giảm độc lực trên phôi gà. Gần đây Viện Pasteur TP. HCM đang dự định triển khai dự án nghiên cứu quy trình sản xuất vaccin cúm H5N1 dùng cho người bằng phương pháp nuôi cấy virus bất hoạt trên phôi gà và tế bào Vero. 3.3. Thành tựu 30 năm phát triển công nghệ sinh học ở TP. Hồ Chí Minh Một sô' kết quả điển hình trong việc ứng dụng và phát triển CNSH tại TP. HCM trưổc khi có Nghị quyết 18/CP có thể được tóm tắt như sau: 'Trong sản xuất nông nghiệp, chú trọng các đề tài phục vụ sự phát triển của nông nghiệp ngoại thành để thỏa mãn nhu cầu thực phẩm và một phần lương thực cho nhân dân thành phô' trên cơ sỏ thâm canh tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Đề tài sản xuất các chất kích thích sinh trưởng thực vật bằng vi sinh vật đã thành công trong việc sản xuất gibberellin ỏ quy mô phòng thí nghiệm và pilot. Đề tài nhân giống các cây trồng nông nghiệp bằng nuôi cây mô đã thành công trong việc nhân giống nhiều cây trồng có giá trị như khoai tây, cà phê, chuối, mía, cam, quýt, đu đủ, phong lan, địa lan..., góp phần đưa TP. HCM trở thành một trung tâm mạnh của cả nước về công nghệ nuôi cấy mô thực vật, có khả nàng chuyển giao công nghệ cho các địa phương khác. Đề tài sản xuất rau sạch bước đầu ứng dụng bẫy pheromon, thuốc trừ sâu vi sinh, thuổc thảo mộc... để hạn chế dư lượng thuốc trừ sâu trong rau, tạo cơ sở cho sự phát triển của sản xuất rau sạch phục vụ nhu cầu nhân dân thành phô". Một sô' đề tài đã ứng dụng thành công vi sinh vật và enzym phục vụ lĩnh vực chế biến lương thực, thực phẩm: lên men bề mặt mật rỉ đường bằng nấm mốc để tạo acid citric ở quy mô pilot, lên men nước dừa bằng vi khuẩn để tạo thành dừa quy mô thương phẩm, sản xuất glucose và fructose bằng công nghệ enzym ở quy mô pilot, cải tiến chất lượng về mùi và màu củ nưóc mắm xuất khẩu... Trong lĩnh vực bảo vệ môi trường, một sô' đề tài đã ứng dụng thành công vi sinh vật trong xử lý rác thành phân bón hữu cơ; phân lập và ứng dụng vi sinh vật trong tạo bùn hoạt tính để xử lý nước thải công nghiệp... Cùng với hoạt động nghiên cứu và phát triển CNSH ỏ các viện, trường đại học, Chương trình CNSH TP.HCM đã tạo cơ sở khá vững chắc cho việc thực hiện Nghị quyết 18/CP của Chính phủ về phát triển CNSH. 4. PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆT NAM ĐẾN NĂM 2020 Để đẩy mạnh việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng CNSH đến năm 2020, Đảng đã chỉ ra phương châm, mục tiêu, nhiệm vụ và giải pháp phát triển CNSH trong thòi gian tới như sau: Phương châm 1. Trên cơ sỏ tiếp nhận chuyển giao công nghệ, đẩy mạnh phát triển công nghệ nội sinh, đi thẳng vào công nghệ cao trong lĩnh vực CNSH nhằm vừa khai thác,tối ,ưu, vừa bảo vệ và phát triển nguồn tài nguyên sinh vật của đất nưốc; 2. Không ngừng nâng cao tính cạnh tranh của các sản phẩm sinh học đồng thời đảm bảo sự phát triển bền vững; 3. Huy động các nguồn lực của xã hội, các thành phần kinh tế tham gia phát triển CNSH. Mục tiêu 1. Góp phần đẩy mạnh, nâng cao chất lượng sản phẩm, sức cạnh tranh của nông sản hàng hóa, tăng nhanh tỷ lệ nông sản chế biến xuất khẩu; giảm nhập khẩu, tiến tới cung cấp một phần nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh thiết yếu cho nhân dân; 2. Xây dựng nền công nghiệp sinh học thành một ngành kinh tế - kỹ thuật công nghệ cao, sản xuất được một sô" sản phẩm chủ lực và có đóng góp xứng đáng cho GDP; 3. Phát triển CNSH đạt trình độ công nghệ tiên tiến trong khu vực; 4. Tạo ra phong trào ứng dụng CNSH rộng khắp trong quần chúng. Nhiệm vụ 1. Ung dụng rộng rải CNSH vào sản xuất và đòi sông. Trong lĩnh vực nông lâm ngư nghiệp, CNSH phải góp phần quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi mới có năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế cao, đóng góp thiết thực vào chuyển đổi cơ cấu kinh tế; tạo ra công nghệ chế biến nông sản nhằm đa dạng hóa và nâng cao chất lượng sản phẩm xuất khẩu. Trong lĩnh vực Y-Dược, CNSH có nhiệm vụ góp phần giảm nhập khẩu, từng bước tự túc các nguyên liệu làm thuốc; nhanh chóng áp dụng CNSH hiện đại vào khám chữa bệnh; tập trung nghiên cứu ứng dụng các công nghệ mũi nhọn đế sản xuất vaccin thê hệ mới, các loại thuốc điều trị là protein tái tổ hợp, đưa các liệu pháp công nghệ gen, công nghệ tế bào vào điều trị các bệnh hiếm nghèo, các vi sinh vật tái tổ hợp để sản xuất kháng sinh, vitamin và acid amin. CNSH môi trường tập trung nghiên cứu, phát triển và ứng dụng rộng rải các công nghệ xử lý các chất thải rắn, lỏng, và ô nhiễm đo sự cố tràn dầu. 2. Xây dựng và phát triển công nghiệp sinh học: tiến hành quy hoạch và đầu tư phát triển nền công nghiệp sinh học trong tất cả các lĩnh vực Nông nghiệp, Thủy sản, Y-Dược; trong đó đặc biệt chú trọng phát triển công nghiệp chế biến, công nghiệp nguyên liệu làm thuốc, vaccin thế hệ mới và các ngành công nghiệp phụ trợ. 3. Phát triển tiềm lực khoa học và công nghệ của CNSH, Mở rộng quỵ mô và nârig cao chất lượng đào tạo nguồn nhân lực, đảm bảo sau 2010 cung cấỊ cán bộ cho các nhu cầu nghiên cứu phát triển công nghệ, giảng dạy, qui sản xuất kinh doanh. Tăng cường đầu. tư và hoàn thiện mạng lưói các pl nghiệm CNSH, tập trung đầu tư dứt điểm và đưa vào sử dụng các p* nghiệm trọng điểm; xây dựng ở ba miền Bắc, Trung, Nam các trung tâi dầy đ,íL iả nước, Ĩ ^ Ĩ Ẹ về CNSH làm hạt nhân cho việc nghiên cứu và ứng dụng CNSH trong < nhanh chóng làm chủ các công nghệ nền trong lĩnh vực CNSH. Phấn đấu đến năm 2020 đạt trình độ tiên tiến trong khu vực đối vói một số lĩnh vực công nghệ quan trọng của CNSH. Tập trung nghiên cứu và ứng dụng công nghệ gen tạo ra các biên đổi bộ gen thực vật, động vật theo hưóng có lợi; chữa các bệnh đi truyền; chú trọng nghiên cứu các đặc điểm và các thay đổi bộ gen của người và vi sinh vật đo tác động của ô nhiễm môi trường và chất độc hóa học. Tập trung nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tế bào động và thực vật trong tạo và nhân nhanh giống cây trồng và vật nuôi có ưu thế về sản xuất, chất lượng; phát triển và ứng dụng công nghệ tế bào gốc trong trị liệu. Tập trung nghiên cứu và ứng dụng công nghệ enzym và protein trong công nghiệp chế biến và đặc biệt trong lĩnh vực miễn dịch học phân tủ phục vụ sản xuất vaccin thế hệ mới và chế phẩm chẩn đoán bệnh. Công nghệ vi sinh tập trung nghiên cứu, đánh giá và ứng dụng tài nguyên vi sinh vật; tạo chủng giông cao sản bằng công nghệ cao; nghiên cứu hoàn thiện, phát triển và ứng dụng các kỹ thuật lên men vi sinh vật trong sản xuất phục vụ phát triển công nghiệp sinh học. Giải pháp Tạo sự chuyển biến mạnh mẽ trong nhận thức của các cấp ủy Đảng, các ngành, các cấp và toàn xã hội về vai trò, vị trí và tầm quan trọng của CNSH trong sự nghiệp công nghiệp hóa và hiện đại hóa; Tạo hành lang pháp lý để phát triển CNSH và tăng cường công tác quản lý Nhà nưốc trong lĩnh vực CNSH; Xây dựng và tổ chức thực hiện có hiệu quả Kế hoạch tổng thể phát triển CNSH, Chiến lược đào tạo nguồn nhân lực, Quy hoạch phát triển công nghiệp sinh học; Đa dạng hóa các nguồn lực và tập trung đầu tư để nghiên cứu, sản xuất các sản phẩm CNSH cơ bản và thiết yếu phục vụ phát triển kinh tế - xã hội; hình thành và áp dụng những chính sách ưu đãi cao nhất cho phát triển nhanh các doanh nghiệp CNSH vừa và nhỏ; Tạo lập thị trường công nghệ cho CNSH, trong đó phải gắn kết chặt chẽ hoạt động khoa học và công nghệ với hoạt động sản xuất và kinh doanh của doanh nghiệp; khuyến khích và hỗ trợ cho các hoạt động chuyển giao và ứng dụng CNSH vào sản xuất và đồi sống; Mỏ rộng quan hệ hợp tác quốc tế, tranh thủ mọi quan hệ quốc tế để đào tạo đội ngũ cán bộ đầu đàn, chuyên gia giỏi và nâng cao trình độ nghiên cứu, phát triển công nghệ trong lĩnh vực CNSH; Đẩy mạnh thông tin, tuyên truyền để đưa các tiến bộ công nghệ trong lĩnh vực CNSH đến người sử dụng. Tự LƯỢNG GIÁ 1. Ý nghĩa của công nghệ gen đối vối sự phát triển của CNSH. 2. CNSH thế hệ 3 có đặc điểm gì và ảnh hưởng của nó đổi với sự phát triển của CNSH nói chung. 3. Giải thích đặc điểm quy mô vừa và nhỏ của CNSHYD và ý nghĩa của nó đối vối việc phát triển CNSH ồ nước ta. 4. Sự kiện nào được xem là khởi đầu cho dược phẩm tái tổ hợp A. Phát hiện cấu trúc xoắn kép của ADN B. Phát hiện penicillin c. Insulin người tái tổ hợp trong E. coli được FDA cấp phép D. Công bô" kết quả Dự án Bộ gen Người 5. Công nghệ sinh học xanh là công nghệ A. Sản xuất nhiên liệu sinh học B. Sử dụng enzym trong sản xuất thuốíc c. ứng dụng trong nông nghiệp và môi trường D. Lai tạo giống cây trồng CHƯƠNG 1 CÔNG NGHệ LÊN M€N Bài 2 KHÁI NIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÔNG NGHIỆP MỤC TIÊU 1. Trình bày được mục đích và sản phẩm của lên men công nghiệp. , , ’ - 2. Biết được cách chọn lọc và cải tạo chủng lên men. 3. Trình bày được cơ sở hình thành công thức và các thành phần của mối trường 1 * __ PT1 mpn 1. ĐẠI CƯƠNG Thuật ngữ lên men (fermentation) từ tiếng La Tinh “fervere” có nghĩa là làm chín, dùng đế diễn tả hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hay dịch đường hóa ngũ cốc. Ngày nay, người ta hiểu lên men là tất cả các quá trình biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí. Hay nói một cách khác lên mert là sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Lên men công nghiệp được hình thành từ cuối thế kỷ XIX và phát triển mạnh từ nửa cuối thế kỷ XX. Hầu hết các quy trình sản xuất của công nghệ sinh học, kể cả CNSH hiện đại dựa trên công nghệ gen, đều dựa vào kỹ thuật lên men để tạo ra sản phẩm. 1.1. Mục đích Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật từ các nguồn gen tự nhiên, chê phẩm nhập nội và lên men truyền thống bằng con đường lai tạo, gây đột biến và tái tổ hợp nhằm tạo ra giống có hoạt tính và khả năng cạnh tranh cao đê ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, y tế và bảo vệ môi trường, phát triển các sản phẩm phân bón vi sinh, vi sinh vật trợ sinh (probiotic), thuốc bảo vệ thực vật, động vật, các chế phẩm vi sinh dùng để xử lý nước, làm sạch môi trường, các protein—enzym và các sản phẩm chuyển hóa của vi sinh vật. 1.2. Sản phẩm c ủ a cô n g nghệ lên m en 1. Sinh khôi vi sinh vật: giông, men bánh mì, vaccin, protein đơn bào, phân vi sinh, chê phẩm diệt côn trùng, probiotic. 2. Enzym vi sinh vật: a-am ylase, p-glucanase, amyloglucosidase, glucose isomerase, glucose oxidase, cellulase, hemicellulase, pectinase, invertase, protease, lactase, lipase, streptokinase... 3. Sản phẩm trao đổi chất a. Sơ cấp: rượu, bia, acid amin, acid hữu cơ, nucleotid, một sô" vitamin.... b. Thứ cấp: kháng sinh, lipid vi sinh vật, chất mang, các chất tăng trưởng, các chất có hoạt tính sinh học. 4. Sản phẩm tái tổ hợp gen: các protein tái tổ hợp và các sản phẩm khác được tạo ra nhờ các tế bào vi sinh vật chuyển gen 5. Các biopolymer và biosurfactant: các polysaccharid ngoại bào như xanthan, gellan, alginat vi sinh, cellulose vi khuẩn... và các chất hoạt động bề mặt (biosurfactant) được sản xuất bằng công nghệ lên men. 2. CHỦNG VI SINH VẬT 2.1. Khái quát Vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các quá trình công nghệ để tạo ra các sản phẩm hoặc cung cấp các chất trung gian đế tạo ra sản phẩm. Vi sinh vật được sử dụng nhiều do các ưu thế như dễ nuôi cấy ở quy mô lốn, tăng trưởng nhanh, sử dụng được các cơ chất rẻ tiền (trong nhiều trường hợp là các chất phế thải từ các công nghiệp khác) và khả năng cho nhiều sản phẩm đa dạng. Bên cạnh đó chúng dễ dàng được biến đổi di truyền làm cho khả năng cải thiện thuộc tính để sản xuất ra sản phẩm mối là vô tận. Trong các quy trình cổ xưa, sự lên men được thực hiện bởi một hỗn hợp các vi sinh vật (một số vẫn còn được tiếp tục đến ngày nay). Tuy nhiên, gần đây các nỗ lực để phân lập và cải tạo chủng diễn ra gần 120 năm trước đã dẫn đến khái niệm lên men thuần chủng, và đến nay đó là xu th ế chung. Các chủng lên men thường được phân lập từ môi trường tự nhiên bằng cách sàng lọc ngẫu nhiên, tuy nhiên, chủng cũng có thể có được từ các ngân hàng chủng. Hầu hết các vi sinh vật này, bất kể nguồn gốc, đểu trải qua quá trình biến đổi để cải tạo chủng bằng đột biến hay lai tạo nhằm tàng cường các đặc tính cần thiết cho công nghệ. Ngày nay, kỹ thuật di truyền đã được sử dụng nhiều trong việc cải tạo chủng, tạo ra tiềm năng to lón trong việc sử dụng vi sinh vật biến đổi di truyền để tạo ra các sản phẩm hoàn toàn mối mà không thể thực hiện được vỏi các vi sinh vật ban đầu. Trong đa sô trường hợp, các quy định vẩ an toàn ảnh hưởng nhiều đến việc chọn lựa chủng trong công nghiệp, về mặt an toàn, vi sinh vật được chia làm bốn loại: 1. Không gây bệnh cho người, động vật và môi trường (GRAS - Generally Recognized As Safe). 2. Có the gây khó chịu cho người, động vật và môi trường. 3. Gây bệnh, truyền bệnh nhưng có cách chữa trị. 4. Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa có cách chữa trị. Nói chung công nghiệp lên men thường ưu tiên sử dụng các chủng GRAS (generally recognized as safe - được coi là an toàn), đặc biệt đối với các quá trình sản xuất có liên quan đến thực phẩm. Nguyên nhân là do tiến trình xin cấp phép sử dụng một vi sinh vật mới trong công nghệ hết sức khó khăn và tôn kém. Nếu một vi sinh vật gây bệnh hay vi sinh vật biến đổi di truyền được sử dụng trong sản xuất, các biện pháp an toàn bổ sung phải được áp dụng. Các phương tiện tồn trữ đặc biệt được áp dụng để đảm bảo là các vi sinh vật này không thoát ra khỏi nồi lên men. Bảng 2.1. Một số ví dụ vỉ sinh vật GRAS Vi khuẩn Nấm sợi Bacillus subtilis Aspergillus niger Lactobacillus bulgaricus Aspergillus oryzao Lactococcus lactis Mucorjavanicus Leuconostoc oenos Penicillium roquefortii Nâ'm men Candida utilis Kluyveromyces lactis Kluyveromyces marxianus Saccharcmyces cerevisiae 2.2. P hân lập cá c ch ủ n g th ích hợp từ m ôi trường Vi sinh vật sản xuất có thể được mua từ các ngân hàng chủng, tuy nhiên, các chủng này tồn tại khắp nơi trong tự nhiên, do đó có thể phần lập chúng từ nơi sinh cư tự nhiên để giảm phụ thuộc vào các ngân hàng chủng và tạo ưu thê độc quyền về chủng sản xuất. Các chiến lược được áp dụng để phân lập chủng vi sinb vật công nghiệp thích hợp từ môi trường có thể được chia làm hai kiểu, “săn lùng” (shotgun) và có định hưống (objective). Trong kiểu “sàn lùng”, mẫu có chứa vi sinh vật sống tự do, biofilm (mảng sinh học), và các kiểu sinh thái của vi sinh vật khác được thu nhận từ thú, thực vật, đất, chất thải, nước thải, và đặc biệt tại các nơi có điều kiện bất thường. Các mẫu phân lập được sau đó được sàng lọc theo các đặc tính mong muôn. Kiểu có định hướng thì việc lấy mẫu có chủ đích hơn, thường là nơi sinh cư tự nhiên của vi sinh vật muốn phân lập. Ví dụ vi khuẩn sinh methan sẽ hiện diện trong lớp bùn trầm tích thiếu oxy dưới các ao, hồ, vi khuẩn phân hủy hemoglobin có nhiều ở các lò mổ, và vi khuẩn oxy hóa hydrocarbon dễ tìm thấy tại các giếng dầu hay gara sửa xe hoặc khi cần tìm vi sinh vật khả năng phân hủy một chất độc nào đó, người ta sẽ lưu tâm đến các vị trí có nhiều chất độc tương ứng. Sau khi lấy mẫu, một vấn đề quan trọng là phải quyết định sử dụng môi trường nào để phân, lập và nuôi cấy chúng. Thông thường bước đầu tiên ngưòi ta sẽ kìm hãm hoặc giết các vi sinh vật phổ biến trong mẫu và kích thích sự tăng trưởng của các vi sinh vật hiếm gặp. Sau đó vi sinh vật cần phân lập sẽ “được làm giàu” bằng kỹ thuật nuôi cấy tăng sinh để các vi sinh vật mong muôn biểu hiện các tính trạng và tăng số lượng trưóc khi phân lập và sàng lọc. Kỹ thuật này khá đơn giản: ngưòi ta thiết lập các điều kiện môi trưòng về nguồn năng lượng, carbon, và nitờ; chất, nhận hydro; khí trường; nhiệt độ; pH; ánh sáng; v.v..., khi đó hỗn hợp vi sinh vật được cấy vào và những vi sinh vật nào có khả năng thích nghi cao nhất sẽ chiếm ưu thế và “được làm giàu” so với các sinh vật khác. Tuy nhiên, cách này chỉ áp dụng được cho các vi sinh vật có đặc tính mong muốn là ưu thế sinh học của chúng. Môi trường tăng sinh lỏng nên được sử dụng nếu chủng mong muốn là chủng có tốc độ phát triển nhanh nhất. Trong trường hợp này, mẫu vi sinh vật sẽ được cấy chuyển lặp lại nhiều lần để thu được vi sinh vật mung muôn trong mẫu cấy cuối cùng. Tuy nhiên, nếu các chủng không có sự khác biệt đáng kể về thuộc tính tăng trưởng, phương pháp phân lập trên môi trưồng rắn nên được sử dụng: mẫu vi sinh vật được pha loãng và trải trên các môi trường tăng sinh rắn. Vi sinh vật sẽ tăng trưỏng thành khóm riêng biệt và được sàng lọc. Khi có được mẫu vi sinh vật thuần khiết trên môi trường rắn, các biện pháp sàng lọc sẽ được áp dụng trên các mẫu phân lập được. Ớ thòi điểm này, mức độ hoạt tính mong muôn không nhất thiết phải cao vì sau đó chủng sẽ được cải tiến và chọn lọc tiếp để làm mạnh các đặc điểm mong muôn và loại bỏ các tính trạng gây khó khăn cho công nghệ. Ngoài ra, các đặc điểm như tính ổn định, độc tính cũng là một yếu tô" tham gia chọn lọc. Việc phân lập chủng lên men thuần khiết từ các mẫu lên men vi sinh vật hỗn hợp trong các quy trình lên men cổ xưa cũng được tiến hành theo cách tương tự. Việc phân lập và chọn lọc một vi sinh vật tương đổi dễ dàng, tuy nhiên nếu thuộc tính mong muôn thuộc về một nhóm vi sinh vật hoạt động phối hợp vói nhau, ví dụ các vi sinh vật để phân hủy một phức hợp đa thành phần, thì vấn đề sẽ trỏ nên phức tạp hơn nhiều. Nhưng về nguyên tắc, người ta sẽ chia quá trình phức thành một loạt các quá trình con trong đó chỉ liên quan đến một vi sinh vật hay một enzym. 2.3. Các ngân h à n g ch ủ n g Các ngân hàng này S Ư U tập và lưu giữ các chủng vi sinh vật đã được phân lập và xác định một sô tính chất sơ bộ, là một nguồn cung cấp chủng rất mạnh. Trên thê giới có khoảng 500 ngân hàng khác nhau, hầu hết là nhỏ và cục bộ, hoặc được chuyên biệt về một nhóm vi sinh vật nào đó. Một số ngân hàng chủng chủ yếu được liệt kê trong Bảng 2.2. cần lưu ý khi sử dụng chủng từ nguồn này là tuy tiết kiệm rất nhiều chi phí để phân lập và sàng lọc sơ bộ từ môi trường tự nhiên, nhưng các đối thủ công nghệ cũng biết và có thể sử dụng các chủng như vậy do đó ưu thế cạnh tranh sẽ không còn. Bảng 2.2. Một số ngân hàng chủng quan trọng đối với công nghệ Ngân hàng Loại chủng được giữ American Type Culture Collection (ATCC), USA Tất cả Centraalbureau voor Schimmelculture (CBS), Hà Lan Nấm men và nấm sợi Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Pháp Tất cả Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture (DSMZ), Tất cả Đức Các ngân hàng chủng của Vương Quốc Anh Culture Collection of Algae & Protozoa (CCAP) Tảo và bào tử trùng European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) Tế bào động vật CABI Nấm sợi National Collection of Food Bacteria (NCFB) Vi khuẩn thực phẩm National Collection of Industrial & Marine Bacteria (NCIMB) Vi khuẩn (chung, công nghiệp, nước mặn) National Collection of Pathogenic Fungi (NCPF) Nấm gây bệnh National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB) Vi khuẩn gây bệnh thực vật National Collection of Type Cultures (NCTC) Vi khuẩn trong y học National Collection of Wood Rotting Fungi (NCWRF) Nấm phân hủy gỗ National Collection of Yeast Cultures (NCYC) Nấm men (không gây bệnh) 2.4. Các ch ủ n g cô n g n gh iệp và b iện pháp cải tạo Bất kể nguồn gấc, chủng được sử dụng trong công nghệ cần thỏa mãn một sô yêu cầu : 1. Ôn định di truyền. 2. Sản xuất hiệu quả sản phẩm mong muốn, con đường sinh tông hợp sản phẩm đã được khảo sát kỹ. .3. Không cần hay ít cần bổ sung vitamin và yếu tô" tăng trưỏng. 4. Sử dụng được các cơ chất phổ biến và rẻ tiền. 5. Có thế biến đối di truyền được. 6. An toàn, không gây bệnh, và không sản xuất chất độc, trừ khi đó chính là sản phẩm. 7. Dễ dàng thu hoạch từ quá trình lên men. 8. Dễ dàng phá vỡ tế bào nếu sản phẩm là nội bào. 9. ít tạo ra sản phẩm phụ để thuận tiện cho việc tinh chế sản phẩm. Các đặc tính khác như tính ưa nhiệt, ưa muổi cũng được quan tâm trong lên men. Ngoài ra, đặc biệt đối vói tế bào phát triển trong môi trường lỏng, chúng cần có khả năng tăng trưởng được trong các nồi lên men hiện có, tránh phát sinh chi phí chế tạo nồi mói, đồng thời có khả năng chịu khuấy, không sinh quá nhiều bọt và không có xu hướng bám vào các bề mặt. Cải tạo chùng Vi sinh vật hiếm khi được sử dụng trong công nghệ dưói dạng hoang dại. Trong hầu hết trường hợp, các chủng đột biến được tạo ra và chọn lọc để phù hợp với yêu cầu của công nghệ sản xuất, cải tạo chủng là một phần quan trọng sông còn của tiến trình triển khai trong hầu hết công nghệ lên men. Nó giúp giảm giá thành thông qua tăng năng suất hoặc giảm chi phí sản xuất. Nhiều phương pháp biến đổi di truyền đã được sử dụng để thay đổi đặc điểm di truyền của chủng. Chiến lược nhằm thu được chủng có các đột biến mong muốn đòi hỏi kiến thức sâu về chuyển hóa và di truyền của chủng ban đầu. Trong nhiều trường hợp việc cải tiến được tiến hành thông qua các phương pháp tái tổ hợp di truyền tự nhiên, trong đó kết hợp các yếu tô" di truyền từ các bộ gen khác nhau để tạo thành một kiểu gen mổi. Một cách khác là thông qua đột biến. Các chủng tái tổ hợp và đột biến được chọn lọc theo các đặc tính thích hợp cho lên men công nghiệp. Ngoài ra, gần đây người ta còn dựa vào kỹ thuật thao tác gen hay công nghệ gen. Công nghệ gen về lý thuyết có thể đưa một tính trạng mới, thông qua gen - ADN, vào tế bào, vượt qua các rào cản sinh học về loài và nguồn gen, do đó khả năng cải tạo chủng của nó là vô tận. Các chủng sau khi cải tạo thường không sông được trong môi trường tự nhiên, do chúng bị thay đổi cơ cấu điều hòa để tạo ra các chuyển hóa mất cân bằng. Ngoài ra chúng cũng cần được duy trì trên các môi trường chuyên biệt để chọn ỉọc và duy trì các thuộc tính được chọn lọc. Tái tô hợp tự nh iên ADN vi khuẩn thường ở dạng một nhiễm sắé' thể đơn và các plasmid. Mỗi plasmid có thể mang hàng trăm gen bổ sung và chúng có thể có hàng nghin bản sao trong mỗi tế bào. Các plasmid bổ sung các thông tin di truyền cho các tính trạng không có trong nhiễm sắc thể. Không như các tế bào nhân thật, vi khuẩn không sinh sản hữu tính, tuy nhiên chúng có thể trao đổi một số thông tin di truyền với nhau thông qua tiếp hợp, tải nạp và biến nạp, nhờ đó người ta có thể chủ động đưa thêm các tính trạng mới vào tế bào vi khuẩn. ơ các tế bào nhân thật, sự tái tô hợp di truyền xảy ra trong quá trình sinh sản hữu tính. Kiêu gen mời được tạo ra do sự trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể bô" mẹ trong quá trình giảm phân. Một số loài nấm quan trọng trong công nghệ, bao gồm Penicillium và Aspergillus, không có sinh sản hữu tính đúng nghĩa, tuy nhiên, chu kỳ cận hữu tính cung cấp một phương thức để tạo ra chủng mới. Điều này xảy ra khi hai thể đơn bội di truyền khác nhau được nuôi chung và đê sợi nấm hòa nhập với nhau tạo ra một chủng dị nhân cấu tạo bởi hệ sợi chứa các nhân có nguồn gốc từ mỗi chủng ban đầu. Việc tạo thể dị nhân ngày nay có thể thực hiện in vitro bằng cách hợp nhất thể nguyên sinh (protoplast). Ngoài ra, một số tế bào nhân thật, bao gồm một sô" nấm men, nấm sợi, cũng có plasmid nên cũng có thể dùng làm công cụ thao tác di truyền. Gây đột biến Gây đột biến liên tiếp xen kẽ với chọn lọc có định hưóng và sàng lọc các chủng sống sót là một công cụ cải tạo chủng hiệu quả. Các đột biến có thể tự nhiên hay cảm ứng, nhưng chúng đều có thể xem là hậu quả của các quá trình tự nhiên nên thường ít gặp vấn đề vối các quy định cấp phép hơn các chủng được tái tổ hợp bằng kỹ thuật thao tác gen. Các phương pháp gây đột biến nói chung có ứng dụng giới hạn vì chúng chủ yếu đạt được kết quả do làm rối loạn cơ chê kiểm soát. Các phương pháp truyền thông này đã được áp dụng thành công để loại màu vàng của penicillin (chrysogenin), một sắc tố vàng sản sinh bởi chủng Penicillium chrysogenum. Việc gây đột biến này cũng đã làm tăng hiệu suất penicillin. Các ví dụ khác vể đột biến làm yếu quá trình kiểm soát để tạo chủng năng suất cao hơn được thấy ỏ m.ột sô" vi sinh vật dùng đề sản xuất acid amin. Gần đây, các phương pháp mới được phát triển làm tăng khả năng đột biến chung và tăng tần suất đột biến của một gen cụ thể nhằm thu được kiểu đột biến mong muôn với tần suất cao nhất. Kỹ thuật gây đột biến định hướng này đòi hỏi các kiến thức nhất định về các gen điều khiển của gen đích và bản đồ gen của vi sinh vật. Hơn nữa, gây đột biến in vitro hiện nay được sử dụng phối hợp vối thao tác di truyền để làm biến đổi các gen hay một phần của gen đã được tạo dòng. Đột biến ngẫu nhiên Trong một quần thể vi sinh vật các đột biến diễn ra một cách tự nhiên không cần có sự can thiệp do các sai sót trong quá trình sao chép vật liệu di truyền. Đột biến tự nhiên xảy ra vối tần suất rất thấp, ví dụ hầu hết vi khuẩn tần suất này xấp xỉ 10“10 cho một gen qua mỗi thê hệ. Xác suất xảy ra một đột biến trên một gen (thay đổi một nucleotid) vào khoảng 10-5, và cho một cặp nucleotid là 10~8. Tần suất của các đột biến ngược (đột biến về dạng hoang dại) cũng tương tự, do đó nếu không có áp lực chọn lọc thì sự thay đổi kiểu gen và kiểu hình do đột biến ngẫu nhiên trong tự nhiên rất thấp. Ngay cả khi có áp lực chọn lọc để giữ lại các kiểu hình có ưu thế thì đột biến ngẫu nhiên cũng khó có ứng dụng trong việc cải tạo chủng vì tần suất đầu vào quá thấp. Đột biến nhân tạo - cảm ứng Tần suất đột biến có thể được tăng lên đáng kể nếu xử lý tế bào với các tác nhân gây đột biến hóa học, vật lý hay sinh học. Có thể chia đột biến làm ba loại: (1) thay thế cặp base ví dụ AT bằng GC; (2) chèn hoặc mất cặp base; (3) chèn hoặc mất hoặc thay đổi vị trí của một đoạn ADN trong nhiễm sắc thể. Các đột biến loại 1, còn gọi là đột biến điểm, rất dỗ nghịch đảo về dạng ban đầu. Nhiều phương pháp được sử dụng để cảm ứng đột biến: 1. Sử dụng base tương đồng. Các base này đủ giông vái các base tự nhiên, do đó bị đưa vào trình tự ADN trong quá trình sao chép. Chúng vẫn có chức năng bình thường, tuy nhiên có xu hướng bắt cặp nhầm khi sao chép lần hai và do đó gây ra các đột biến điểm. 2. Thay đổi về hóa học của các base. Một số tác nhân gây đột biến ảnh hưởng đến cấu trúc hóa học của base và do đó gây sai sót khi sao chép. Ví dụ, xử lý tế bào vối nitrit (HN02) gây khử amin của adenin, guanin, cytosin và gây bắt cặp sai. Các tác nhân alkyl hóa như ethyl hay methyl methanesulfonat, ethyleneimin, nitrogen mustard, và N—methyl—N—nitro—N’—nitrosoguanidin (MNG), là các chất gây đột biến mạnh nhất. Thuốc nhuộm Acridine (proflavin) hoạt động bằng cách chèn vào giữa các sợi ADN và gây chèn hay mất một cặp base. 3. Chiếu xạ. Chiếu xạ ƯV ảnh hưỏng đến các base pyrimidin và gây sai sót trong sao chép. 4. Gây đột biến bằng transposon. Thông qua tiếp hợp, các plasmid mang transposon (yếu tô" Tn) có thể được đưa vào tế bào cần gây đột biến. Transposon có thể chuyển vị đến các vị trí khác trên nhiễm sắc thể hay plasmid và làm gián đoạn các gen tại đó dẫn đến đột biến. Gây đột biến: u v , h n o 2,... Rửa và phân tán ờ m ật độ 107/ml Thêm 100 u /m l penicillin Nuôi cấy 5 h trong môi trường hoàn chỉnh Ù 5 h trong môi trường glucose không chứa nitơ N uôi cấy 2-20 h Loại bở pcnicillin Pha loãng đến 50- 100 tế bào/hộp Hình 2.1. Phương pháp lảm giàu thể khuyết dưỡng bằng penicillin Các loại thê đột biến và nguyên tắc chọn lọc Đột biến ngẫu nhiên hay cảm ứng nói chung đều là các sự kiện hiếm xảy ra đối với tế bào và số thể đột biến thu được từ một quần thể thường nhỏ. Thông thưồng người ta phải khảo sát hàng nghìn đĩa thạch với hàng triệu khóm (dòng tế bào) để tìm ra một thể đột biến mong muốn nếu không có biện pháp chọn lọc thích hợp để làm tăng số lượng của thể đột biến mong muốn trong dân sô". Do đó việc sàng lọc thế đột biến đóng vai trò quan trọng trong việc thu được thuộc tính mong muốn. Việc tăng sinh thể đột biến có thể đạt được bằng cách tiêu diệt các tế bào ban đầu hay nuôi cấy trong các điều kiện mà thể đột biến có ưu thế tâng trưởng. Có nhiều phương pháp để tăng sinh thể đột biến. Trên thực tế việc thiết kế chiến lược sàng lọc thể đột biến là một trong những nghệ thuật phức tạp và đòi hỏi cao nhất đối với các nhà vi sinh vật học, mỗi loại thể đột biến cần một biện pháp đột biến riêng. Việc nhận diện thể đột biến là một vấn đề khác. Nếu thể đột biến có kiểu hình rõ ràng, ví dụ có màu hay kháng lại một chất ức chế nào đó thì vấn đề rất đơn giản, chúng có thể dễ dàng nhận diện giừa các khóm vi khuẩn nguyên thủy. Một sô" thể đột biến có thể được phát hiện sau khi thêm các thuốc thử, ví dụ thêm dung dịch Lugol để phát hiện các thể đột biến thủy phân tinh bột đã được cấy trên thạch tinh bột. Việc phát hiện các thể đột biến khuyết dưõng bằng cách so sánh sự tăng trưởng của cùng dân sô" trên hai môi trường khác nhau. Tuy nhiên, việc phát hiện nhiều thề đột biến cần một chiến lược tốt và nhiều công sức. Các thể khuyết dưỡng. Nếu thể đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào đó thì nó chỉ phát triển trên môi trường có sẵn chất đó. Ví dụ thể khuyết dưỡng đối với leucin (leu-) có thể được nhận ra bằng cách so sánh hai môi trường, một chứa và một không chứa leucin. Khi đó các tế bào nguyên dưỡng mẹ (leu+) sẽ mọc trên cả hai, trong khi thế khuyết dưỡng chỉ mọc trên môi trường chứa leucin. Việc tăng sinh thể khuyết dưỡng có thể thực hiện bằng cách sử dụng các tác nhân tiêu diệt các tê bào đang tăng trưởng, ví dụ penicillin, khi đó các tê bào nguyên thủy đang tăng trưỏng mạnh sẽ bị chết và các tế bào đột biến sẽ không bị ảnh hưởng vì nó không tăng trưởng được trên môi trường tối thiểu. Hậu quả là khi loại bỏ yếu tô" chọn lọc, penicillin, thì tỷ lệ thể đột biến và thể nguyên dưỡng sẽ tăng lên 104 đến 106 lần (hình 2.1). Một phương pháp khác sử dụng nguyên tắc “tổng hợp gây chết”: tế bào nguyên dưỡng tăng trưởng được sẽ tổne hợp các chất chuyển hóa độc đối với nó ví dụ phosphat có phóng xạ hay các chất kháng chuyển hóa và sẽ bị chết, trong khi thể khuyết dưỡng không tăng trưởng được sẽ sống sót. Đột biến điều hòa. Vài thể đột biến có khả năng tạo enzym sinh tổng hợp hằng định, trong khi ở tế bào nguyên thủy sự tạo enzym này phụ thuộc các điều kiện chuyển hóa. Các tế bào này có thể được phát hiện trực tiếp từ môi trường thạch. Ví dụ, nếu một chất kháng chuyển hóa được them vào môi trường thạch, các tế bào nguyên thủy sẽ tích hợp chúng vào chuỗi peptid và do đó ngừng tăng trưởng. Tuy nhiên, thể đột biến do enzym hoạt động liên tục nên có sự sản xuất vượt mức chất chuyển hóa bình thường nên không sử dụng chất kháng chuyển hóa trong chuỗi peptid và do đó vẫn tăng trưỏng được. Đôi khi cơ chế điều hòa của thể đột biến bị tổn thương dẫn đến sự tiết chất chuyển hóa vào môi trường và kích thích sự tăng trưởng thứ cấp của tế bào nguyên thủy, điểu này có thể quan sát được trên thạch do sự hiện diện của các khóm vệ tinh bao quanh khóm đột biến. Hình 2.2. Sự phát triển khóm vệ tinh: thể đột biến kháng với chất kháng chuyển hóa 109 tê bào được trải trên hộp thạch chứa chất kháng chuyển hóa, sau khi ủ có 8 khóm mọc lên là các khóm của thể đột biến. Hai khóm có sự phát triổn kicu vệ tinh chứng tỏ sự để kháng của khóm đột biến ò trung tâm là do sự san xuất quá mức và bài xuất của chất chuyển hóa bình thường. Hoat đông của chất kháng chuyên hóa. Chất chuyển hóa và kháng chuyển hóa có câu trúc tưdng tự nhau, nhưng chất kháng chuvển hóa không có chức năng sinh học, thí dụ methionin và ethionin chỉ khác nhau vị trí của s trong cấu trúc phân tử: CH3 - s - CH2 - CH2 - CH - COOH I n h 2 Methionin CIĨ3 - CH2 - s - CH2 - CH - COOH t n h 2 Ethionin Do giống nhau, các chất kháng chuyển hóa được tham gia quá trình trao đổi chất, nhưng không làm được đầy đủ chức năng của chất trao đổi thực, nên chất giả này thường gây tác dụng ức chế và làm chết tế bào. Có nhiều nguyên nhân gây ra ức c h ế : - Một chất tương đồng với acid amin được tham gia vào cấu trúc một protein enzym làm cho enzym bất hoạt. - Chất tương đồng cạnh tranh với chất trao đổi về trung tâm hoạt động của enzym và do vậy ngăn cản sự chuyển hóa của chất trao đổi. - Các chất tương đồng xuất hiện ỏ sản phẩm cuối cùng của một chuỗi tổng hợp, do kết hợp vối enzym dị lập thể và làm giảm hoạt tính của nó hay do phản ứng với các chất ức chế mà làm giảm sự tổng hợp của các enzym. Do vậy, sự tổng hợp chất trao đổi thật bị ngăn cản và sinh sản của tế bào bị ức chế. Bảng 2.3. Quy trình chọn lọc và nhận biết một số thể đột biến Loại thể đột biến Quy trình chọn lọc hoặc tăng sinh Nhận biết thể đột biến Kháng chất ức chế, kháng sinh, chất độc hay thực khuẩn Khuyết dưỡng cần chất tăng trưởng (vitamin, acid amin, hay các chất chuyển hóa kháng) Trải khoảng 108 tế bào trên thạch dinh dưỡng chứa chất ức chê' Kỹ thuật sử dụng penicillin hay chất tương đồng (khảng chuyển hóa): nuôi cấy tế bào trên môi trường thiếu chất tăng trưởng nhưng chứa penicillin hay các chất khác chỉ tiêu diệt tế bào đang tăng trưởng, thể khuyết dưỡng không mọc trên môi trường tối thiểu nên sống sót Chỉ các thể đột biến kháng chất ức chê' mới mọc được Kỹ thuật cấy nhân bản trên hal môi trường hoàn chỉnh và tối thiểu, thể đột biến chỉ mọc trên môi trường hoàn chỉnh Loại thể đột biến Quy trình chọn lọc hoặc tăng sinh Nhận biết thể đột biến Mất khả năng sử dụng cơ chất đặc thù Nhạy nhiệt Mất ức chế hoặc sản xuất liên tục enzym dị hóa Mất ức chê' hoặc sản xuất liên tục enzym đồng hóa Kỹ thuật sử dụng penicillin và/hay ly trích các khóm được định vị: huyền địch tế bào được trải trên thạch dinh dưỡng chứa cơ chất sử dụng được bởi dạng hoang dại ở nồng độ bình thường (0,5 vol%), và cơ chất sử dụng bởi thể đột biến ỏ nồng độ rất thấp (0,005 vol%). Các khóm được định vị và chuyển qua hộp mới. Kỹ thuật sử dụng penicillin để diệt tế bào hoang dại tăng trưởng ở nhiệt độ cao. 1) nuôi cấy liên tục với cơ chất là yếu tố giới hạn tăng trưỏng; 2) cho tăng trưỏng luân phiên trên hai cơ chất khác nhau; 3) tăng trưởng khi có sự hiện diện của chất ức chế cảm ứng (kháng cảm ứng). Tăng trưởng với sự hiện diện của chất kháng chuyển hóa ức chế sự tăng trưởng của tế bào hoang dại Trong số các tế bào kháng lại được có các thể đột biển không bị ức chế đối với sản phẩm cuối. So sánh khóm trên các hộp thạch chứa cơ chất khác nhau; thể đột biến không thể phát triển trên cơ chất bình thường, sẽ cần cơ chất đột biến do đó sẽ bị nhận điện. Thể đột biến có tiết có thể được nhận diện bằng cách nhuộm hay dùng chỉ thị. So sánh khóm trên hộp thạch ủ ở các nhiệt độ khác nhau. Chỉ thu nhận các khóm mọc ở 25°c nhưng không mọc ở 37°c. Nếu huyền dịch tế bào được trải trên thạch dinh dưỡng chứa cơ chất không cảm ứng và sau thời gian ủ phun dung dịch chứa cơ chất sử dụng được + chỉ thị + chất ức chế tổng hợp protein enzym, chỉ có thể đột biến sản xuất liên tục mới co thể phân hủy cơ chất ngay lập tức và biến đổi chỉ thị. Chỉ có các thể đột biến tăng trưởng được, và có thể được bao quanh bởi các khóm vệ tinh của dạng hoang dại. Các phương p h áp chọn lọc khác. Nhiều phương pháp khác có thể được dùng để tách tế bào đột biến ra khỏi tế bào nhân nguyên thủy. Do một số tế bào đột biến tổng hợp liên tục sẽ có tỷ trọng khác với tế bào nhân nguyên thủy (do khác nhau về hàm lượng sản phẩm) nên có thể ủ tế bào trong điều kiện chỉ kích thích sự tổng hợp ỏ một trong hai loại tế bào và sau đó ly tâm trong thang nồng độ đường saccharose. Một số phương pháp dựa vào đáp ứng khác nhau của tế bào đối với các kích thích ngoại cảnh ví dụ sự di chuyển theo ánh sáng (quang ứng động), theo nồng độ chất dinh dưỡng (hóa ứng động), hay nồng độ oxy (khí ứng động), có thể được sử dụng để chọn lọc các thể đột biến có liên quan. Sự hấp phụ lên bề mặt các hạt (glycogen hay tinh bột, giọt dầu hay hạt lignocellulose) và sau đó tách ra bằng ly tâm phân đoạn có thể được áp dụng đối với các đột biên làm thay đổi cấu trúc bề mặt tê bào. Hoặc một kỹ thuật goi là “tự sát”, trong đó sử dụng một chất được chuyển hóa bởi dạng hoang dại thành chất độc và do đó giết chêt chúng. Ví dụ như các chất monofluoroacetat, bromopyruvat, hay chlorat, được chuyển thành fluorocitrat, bromolactat, hay chlorin có độc tính. Thể đột biển bị mất khả nàng này nên sống sót. Phương pháp này được áp dụng đê chọn lọc các đột biến mất nitrate reductase (chlorat, perchlorat), hay các thể đột biến lên men không sinh acid (bromide, bromate). Nhờ các phương pháp chọn lọc định hưống các thể đột biến ngàv càng được cải tiên và thích hợp, người ta đã chọn ra nhiều chủng có năng suất lên men cao dùng trong sản xuất enzym, acid amin, vitamin, các chất kháng sinh... Một huyền dịch tế bào chứa 1 0 -1 5 g/1 chất khô cần khoảng 200 - 300 mg một acid amin nhất định để tổng hợp protein. Trong thực tế ngày nay ngưòi ta đã tạo ra các chủng siêu tổng hợp tới 80 g/1 acid glutamic và 60 g/1 lysin hoặc cao hơn. Như vậy, các chủng này đã sản xuất thừa ra so vổi yêu cầu bản thân 200 — 300 lần. Đối vối riboflavin nhu cầu là 0,5 mg (20 - 50 ìg/g chất khô) mà năng suất lên -men đạt 5 g/1 tức là tăng 10.000 lần. Lai ghép t ế bào trầ n và biến nạp gen Trong các năm gần đây nhiều công trình tạo giống vi sinh vật công nghiệp bằng đột biến từ tế bào trần đã cho kết quả khả quan. Các phương pháp lai ghép tế bào trần và biến nạp gen (tái tổ hợp ADN) ỏ các tế bào vi sinh vật đã giúp cho việc tạo giống vi sinh vật công nghiệp. Nhiều chủng mới có hoạt tính cao, có khả năng sinh tổng hợp các chất liệu quý mà trước đây chỉ có thể sinh ra ở cơ thể động vật hoặc thực vật thì nay các gen điều khiển tổng hợp chất đó đã được ghép vào tế bào vi khuẩn. Công việc sau đó là tổ chức một quá trình lên men và đưa vào sản xuất công nghiệp như các sản phẩm truyền thống khác. Như vậy, công nghệ gen cho phép bỏ qua việc cải tạo chủng nguyên thủy để phù hợp với công nghê lên men, vì chủng ban đầụ chỉ là nguồn cung cấp gen trong khi chủng sản xuất (nhận gen) là một chủng đã được tối ưu hóa về mặt kỹ thuật lên men. Thào tác di truyền trên vỉ sin h vật Trong hơn 20 năm qua sự phát triển của kỹ thuật tái tổ hợp ADN và các phương pháp dung hợp tế bào, như tạo thể lai để sản xuất kháng thể đơn dòng, đã ảnh hưỏng mạnh đến công nghệ sinh học. Khác vối tái tổ hợp tự nhiên, kỹ thuật tái tổ hợp ADN mỏ ra khả năng vô tận để tạo ra gen mới. Các phương pháp này cũng có tính chuyên biệt cao và được kiểm soát tốt. Kỹ thuật này cho phép một trình tự ADN nào đó được chuyển từ sinh vật này sang sinh vật khác và cho phép thao tác trên nó để cải tiến, ví dụ như làm tăng hiệu suất sản phẩm bằng cậch loại bỏ các điểm thắt cể chai trong con đường chuyển hóa hay khuếch đại hay biên đối các bước nào đó trong quá trình chuyển hóa hoặc thay đổi codon mã hóa của chuỗi peptid. Nhìn chung, kỹ thuật thao tác di truyền cho phép đưa một đặc tính hoàn toàn mới vào vi sinh vật. Vi sinh vật thường được biến đổi để tăng tổng hợp hay tiết ra một số enzym có thể dẫn đến việc sản sinh một chất mới hay cho phép sử dụng các cơ chất rẻ tiền hơn. Vì không có giói hạn về nguồn gốc của gen mà vi sinh vật biêu hiện, nên có thể biểu hiện gen của thực vật hay động vật trong vi sinh vật. Các sản phẩm thực sự đã được sản xuất thành công như hormon tăng trương người, insulin, các interferon. Tuy nhiên, các phương pháp này không hoàn toàn thay th ế các phương pháp gây đột biến truyền thống mà chúng bổ sung cho nhau trong chiến lược cải tạo chủng công nghệ. Các sản phẩm như interferon, insulin, các kháng thể đơn dòng v.v... đã được sản xuất theo công nghệ lên men. Cũng cần lưu ý rằng việc dùng các chủng vi sinh vật đã được biến đổi di truyền phải hết sức thận trọng, vì nếu để chúng thoát ra ngoài thì việc kiểm soát chúng rất khó khăn và hậu quả khó lường trước dược. Vì vậy, ở các nước phát triển có các quy định ngặt nghèo với việc cấp phép sử dụng các chủng tái tổ hợp dùng cho công nghiệp. Chiến lược thao tác di truyền trên vi khuẩn Kỹ thuật di truyền liên quan đến việc thao tác trên ADN bên ngoài tê bào, đo vậy cần thiết phải tách và tinh chế gen đích từ bộ gen tế bào cho. Trình tự ADN phân lập được có thể bị biến đổi và cơ chế điều khiển sự biểu hiện của nó có thể bị thay đổi trước khi được đưa vào tế bào chủ mổi nhò các vector. Ngày nay với kỹ thuật PCR người ta có thể khuếch đại trực tiếp gen đích (đã biết trước trình tự hoặc ít nhất là trình tự ở hai đầu để thiết kế đoạn mồi) từ bộ gen tê bào cho rồi tạo dòng vào tê bào nhận mới. Bên cạnh đó, ngày càng có nhiều sinh vật được. giải trình tự bộ gen và còng bô' trong các ngân hàng gen, nên việc tìm trình tự của gen đích để tiến hành các thao tác di truyền càng trở nên dễ dàng hơn bao giò hết. Khi đã tìm được gen đích và trình tự của nó, các biến đổi di truyền cần thiết sẽ được thực hiện, như đột biến, thay đổi cách điều hòa, ... và gen bị biến đổi sẽ được đưa trở lại tế bào ban đầu hay tế bào mối để sử dụng đặc điểm mới của gen này. Các giới hạn của tế bào chủ nhân nguyên thủy Kỹ thuật thao tác di truyền về lý thuyết như trình bày ỏ trên tương đôì đơn giản, tuy nhiên, trên thực tế vấn để phức tạp hơn nhiều. Nếu E. colỉ được sử dụng làm tế bào chủ để biểu hiện gen không phải của nó, gen có thể không biểu hiện được. Vấn đề được khắc phục bằng cách tạo dòng gen đích kèm theo hệ thông điều khiển mà tê bào đích có thể nhận diện được. Hơn nữa để thu được nhiều sản phẩm, vector phải có nhiều bản sao và ổn định trong tế bào đích. Ngoài ra, gen đích cần được đặt dưới sự điều khiển của một promoter mạnh. Khi tế bào đích biểu hiện một số gen lạ hoặc gen của chính nó nhưng với mức độ cao, protein thu được có thể gây độc cho tế bào đích làm nó bị chết trong quá trình biểu hiện. Để khắc phục, một cơ chế kiểm soát sự biểu hiện có thể tắt mở, bằng chất cảm ứng chẳng hạn, để tế bào chỉ biểu hiện gen đích khi các đạt được điểu kiện nuôi cấy nhất định. Nói chung, các vi khuẩn Gram âm có thể biểu hiện các gen từ vi khuẩn Gram dương, tuy nhiên, ngược lại thì không phải lúc nào cũng thành công. Vấn đề đặc biệt khó khàn khi biểu hiện một gen của tế bào nhân thật ở vi khuẩn do sự khác nhau về bộ máy và cách thức phiên mã cũng như dịch mã. Ví dụ gen của tế bào nhân thật chứa các vùng không mã hóa, intron, được loại bỏ trong quá trình trưởng thành của mRNA. Vấn đề này có thể giải quyết bằng cách dùng enzym sao chép ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp ADN từ mRNA. Một vấn đề nữa là một sô" protein của tế bào nhân thật cần được biến đổi sau dịch mã để có hoạt tính, mà bộ máy này không hiện diện ở tế bào nhân nguyên thủy, vấn đề này chỉ có thể giải quyết bằng cách dùng tế bào đích nhân thật để biểu hiện. Protein tiết là dạng có nhiều thuận lợi đối với sản xuất vì nó làm giảm các chi phí để thu tách sản phẩm. Tuy nhiên, ở vi khuẩn Gram âm các protein này thường không tiết thẳng vào môi trường mà nằm lại trong màng ngoài, do vậy nếu muốn protein được tiết vào môi trường cần phải biểu hiện ở dạng tê bào không có thành tê bào, L-form. Ngoài ra còn có các vấn đề khác như sản phẩm gen không ổn định dẫn đến bị phân hủy bởi protease, protein không gập đúng nên không có hoạt tính. Tế bào chủ nhân thật Các tế bào chủ này có ưu thế là chúng có cơ chế biến đổi sau dịch mã để làm cho sản phẩm gen có được hoạt tính cần thiết. Saccharomyces cereưisiae là tế bào chủ hay dùng, vì nó có bộ máy di truyền được biết rõ, không gây hại và người ta có kinh nghiệm sử dụng nó trong công nghiệp lên men hàng trăm năm nay. Tuy nhiên, năng suất sản phẩm tương đối thấp, 1-5% tổng protein và một số protein bị giữ lại trong khoảng chu chất (periplasm). Các tê bào nhân thật khác có thể tốt hơn, đặc biệt là các methylotroph, Pichia angusta và Pichia pastoris. Các tế bào chủ này cổ promoter cảm ứng mạnh hơn và có khả năng biến đổi sau phiên mã khá giống tế bào người. Tính ổn định của chủng Một yếu tố quan trọng trong cải tạo chủng là tính ổn định của nó. Nghĩa là các chủng ổn định để có thể nuôi cấy, bảo quản, lưu, và không bị mất các đặc điểm đã được chọn lọc. Các chủng có mang plasmid cần được giữ với kháng sinh thích hợp đế đảm bảo sự ổn định của plasmid. Sự không ổn định của plasmid có thể do sự tái sắp xếp của plasmid, bất ổn định cấu trúc, hay bị mất plasmid, tính ổn định phân ly. Các vấn đề này có thể giải quyết bằng cách thiết kế các plasmid có chứa các gen cần thiết để ổn định plasmid nói chung và ổn định plasmid đã nhận gen ngoại lai, plasmid tái tổ hợp. Vấn đề ổn định phân ly có thể giải quyết bằng cách đưa thêm các yếu tô" thiết yếu cho sự sông sót của chủng vào plasmid, khi đó tế bào sẽ chết nếu bị mất plasmid. Ví dụ chúng chứa các gen gây chết ở nhiễm sắc thể và các gen ức chế ở plasmid, tế bào sẽ biểu hiện gen ức chế đế ngăn sự biểu hiện gen gây chết nếu chúng còn mang plasmid. Tuy nhiên, để đảm bảo sự ổn định tốt nhất vẫn là đưa gen đích tích hợp vào nhiễm sắc thể. 2.5. Bảo q uản g iô n g vi sin h vật Việc cải tạo thành công chủng mới sẽ không có ý nghĩa nếu chủng không được bảo quản để có thể sông sót và ổn định các tính trạng thu được. Do đó việc bảo quản chủng là một việc có ý nghĩa quan trọng trong vi sinh nói chung và vi sinh công nghệ nói riêng. Không có phương pháp hoàn hảo và phổ quát nào để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật, ngay cả các chủng của cùng một loài cũng có thể đáp ứng khác nhau đối với một phương pháp bảo quản nào đó. Thông thường các phương pháp sau đây được sử dụng trong việc bảo quản các chủng vi sinh vật: Cấy chuyển. Bảo quản các lọ hay ống môi trường đã được cấy chủng và định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới. Cách này tuy đơn giản nhưng mất nhiều công lao động khi phải bảo quản một sô' lượng chủng lốn, đồng thòi do quá trình trao đổi chất vẫn tiếp diễn, chủng có nguy cơ thay đổi các thuộc tính di truyền. Ông môi trường giữ chủng có thể được phủ dầu khoáng để tránh bay hơi nước và ngàn cản oxy. Làm khô. Nấm men, các nấm khác, và một số vi khuẩn có thể đ ư ợ c bảo quấn bằng cách trộn tế bào vói các giá mang (đất, cát, kiesélguhr, đĩa giấy, đĩa gelatin) và làm khô ở nhiệt độ phòng. Đ ông khô. Tế bào được phân tán trong môi trường chứa chất bảo quản đông lạnh như sữa gầy, đường,... rồi đông lạnh, mẫu đông lạnh được cho thăng hoa hơi nước dưói chân không cao đến khô. Toàn bộ quá trình diễn ra ở nhiệt độ rất thấp, do đó có thể bảo quản được tế bào một cách toàn vẹn về tính chất. Mẫu sau khi đông khô có thể bảo quản chông ẩm trong điểu kiện mát hay ở nhiệt độ phòng, trong khí trơ. Do không có nước nên sự chuyển hóa không diễn ra được, tế bào ở trạng thái ngủ và do đó các thuộc tính di truyền được bảo toàn. Đông lạnh. Huyền dịch tế bào trong chất bảo quản chông đông lạnh (cryoprotectant) như glycerol, glutamate, saccharose,... được đông lạnh nhanh và bảo quản ỏ nhiệt độ thấp -70°c, -140°c, hay -196°c. Nhiệt độ thấp ức chế quá trình chuyển hóa vào do đó đặt tê bào vào trạng thái ngủ. Cách làm này đơn giản và hiệu quả nhưng cần phải có phương tiện để duy trì nhiệt độ thấp liên tục trong nhiều năm. Nói chung sau thòi gian bảo quản chủng sẽ ít nhiều mất khả năng sống lại và có thế thay đổi tính chất ở nhiều mức độ, do đó cần tìm phương pháp tối ưu nhất cho từng chủng. Sau thòi gian bảo quản, trước khi đưa vào sử dụng cần kiểm tra lại tính chất của chủng. 3. MÔI TRƯỜNG LÊN MEN 3.1. Cơ sở hình th à n h công thức m ôi trường Môi trường lên men phải thỏa mãn tất cả các yêu cầu về dinh dưỡng của vi sinh vật và đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật của công nghệ. Chất dinh dưỡng phải được tính toán đê hỗ trợ sự sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn. Hầu hết các quy trình lên men công nghiệp đều trải qua nhiều giai đoạn, như cấy hoạt hóa, nuôi quy mô nhỏ rồi mới đến quy mô sản xuất. Mỗi giai đoạn có các yêu cầu kỹ thuật khác nhau, do đó đòi hỏi thành phần môi trường cũng khác nhau. Tính chất sản phẩm cũng quyết định, ví dụ nếu sản phẩm chính là sinh khôi hay chất chuyên hóa sứ cấp thì môi trường được thiết kế để làm cho vi sinh vật tăng trưởng tối ưu. Trong khi nếu sản phẩm là chấl chuyển hóa thứ cấp thì việc sinh tổng hợp sản phẩm lại không có liên quan đến sự tâng trưởng, khi đó môi trường được tính toán nhằm cung cấp cho vi sinh vật sự tăng trưởng khởi đầu nào đó và theo sau là điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp mong muôn, một số’ nguồn dinh dưỡng sẽ bị giới hạn và sự tăng trưởng có thể ngừng. Bước đầu tiên trong việc hinh thành công thức môi trường là khảo sát tổng qúát quy trình dựa vào sự tăng trưởng và hình thành sản phẩm theo các liều lượng khác nhau của mỗi thành phần. Bưốc này chủ yếu là xem xét nguồn carbon, nitơ, khoáng chất, oxy đầu vào ảnh hưởng như thế nào đến sinh khối và lượng sản phẩm. Các thông tin này cho phép tính toán lượng tổi thiểu của mỗi thành phần để thu được lượng sinh khôi hay sản phẩm nhất định. Công thức hóa học tổng quát của tế bào vi sinh vật là C4H70 2N, hay tính theo khôi lượng khô thì tế bào vi sinh vật chứa 48% carbon, 7% hydro, 32% oxy và 14% nitơ, tỷ lệ này thay đổi đôi chút ở mỗi vi sinh vật. Trong đó, nguyên tô carbon là thành phần của các hợp chất hữu cơ của tế bào, cho và nhận electron. Nguyên tô" oxy nhận electron, là thành phần của nước. Nguyên tô" hydro là thành phần của nước, cho electron. Nguyên tô" nitơ cho và nhận electron là thành phần của các àcid nucleic và protein. Ngoài ra, các nguyên tô'khác như phospho, ỉưu huỳnh ... là thành phần của các coonzym A. Do đó việc xác định thành phần nguyên tô' cụ thê của tế bào vi sinh vật đang nghiên cứu cũng góp phần vào việc hình thành công thức môi trường, vì nó đảm bảo khi vi sinh vật tăng trưởng không có thành phần nào bị thiếu hụt, trừ khi có chủ định. Từ những nguyên tô' trên, thành phần hóa học của các vi sinh vật rất khác nhau (Bảng 2.4). Các điều kiện sốhg của vi sinh vật cũng rất khác nhau (Bảng 2.5). Bảng 2.4. Thành phần hóa học của các nhóm vi sinh vật Vi khuẩn Nấm men Nấm Protein 55-60% 40-50% 30-35% Lipid 7% 8% 8% Đường 9% 48% 49% A. nucleic 23% 8% 5% Bảng 2.5. Điều kiện sống của một sô loại vi sinh vật Nhiệt độ pH Nồng độ muối - Mesophile: 20-50°C - Thermophile: > 45°c - Psychophile: < 20°c - Vi khuẩn : 7-7,5 - Nấm men: 3-6 - Nấm: 3-6 Thiobacillus thiooxydans pH=0 s + 0 2 + H2o —> h zs o 4 Bacillus pasteurii pH > 8 Urê -> amoniac - Không ưa mặn: < 2% NaCI - Ưa mặn: 2-30% NaCI Có ba dạng m ôi trường: - Môi trường tổng hợp: đó là môi trường có thành phần hóa học chính xác về mặt định tính và định lượng. - Môi trường phức hoặc bán tổng hợp: người ta chỉ biết thành phần chính xác của một vài hợp chất (về mặt định lượng đối với các chất cần quan tâm như yếu tố tăng trưởng, các thành phần khác dựa theo kinh nghiệm). - Môi trường công nghiệp: nguyên liệu phức ban đầu chủ yêu bắt nguồn từ các sản phẩm nông nghiệp hoặc từ sữa vì chúng rẻ và tương đôi dồi dào. Nhưng chúng phải thỏa mãn các tiêu chuẩn nhất định về chất lượng (độ bền và cấu tạo...). Trong số các nguyên liệu công nghiệp ban đầu, các nguồn carbon có thể lằ tinh bột, nước mật, dầu, nước sữa và tập hợp các sản phẩm phụ của chúng. Các yếu tô' chính ảnh hưởng đến việc chọn các cơ chất cụ thể trong công thức môi trường như sau: 1. Giá thành và khả năng cung cấp; lý tưởng nhất là cơ chất rẻ, có thành phần chất lượng ổn định và sẵn có quanh năm. 2. Dễ xử lý, vận chuyển và bảo quản với chi phí thấp. 3. Không gây khó khăn cho quá trình tiệt trùng và không bị biến chất. 4. Có các thuộc tính vật lý như độ nhớt, khả năng trộn lẫn, ... không ảnh hương đến công thức chung, việc vận hành nồi cững như xứ lý sau lên men. 5. Giúp đạt được nồng độ sản phẩm đích với tốc độ hình thành và năng suất sản phẩm trên gam cơ chất cao. 6. Nồng độ và loại tạp chất cũng như khả năng tạo sản phẩm phụ thấp không làm ảnh hưỏng đến quá trình tách sản phẩm chính sau đó. 7. Có tính an toàn tốt. Thành phần cuối cùng của môi trường lên men không chỉ liên quan đến bản thân quá trình ỉên men mà liên quan đến chi phí tách loại tế bào ra khỏi môi trưòng và tinh chế sản phẩm sau lên men và chi phí xử lý chất thải của quy trình. 3.2. Các th à n h p h ầ n ch ín h củ a m ôi trường Nguồn carbon Nguồn carbon cần thiết có thể được xác định bằng hệ số’ hiệu suất sinh khổi (Y), là chỉ sô' thổ hiện hiệu suất chuyển hóa cơ chất thành sinh khôi. Ycarbon (g/g) = Sinh khối tạo ra (g) / Nguồn carbon sử dụng (g) Đối với một quy trình công nghệ việc xác định hệ số hiệu suất của tất cả các chất dinh dưỡng là cần thiết. Mỗi hệ sô' được xác định bằng một loạt các lô lên men trong đó cơ chất cần xác định là chất dinh dưõng hữu hạn duy nhất, trong khi các chất khác được cung cấp thừa. Bằng cách thay đổi nồng độ ban đầu của chất dinh dưỡng hữu hạn rồi so sánh với lượng sinh khối thu được ta có thể tính ra hiệu suất. Tuy nhiên, hệ số này gắn liền vói điều kiện lên men do đó nếu thay đổi pH, nhiệt độ, ... thì hệ số cũng thay đổi theo. Các vi sinh vật khác nhau có hệ số khác nhau đốỉ vói cùng một cơ chất (xem bảng) do có cách chuyển hóa cơ chất khác nhau. Ví dụ Saccharomyces cerevisiae nuôi bằng glucose có hệ sô" hiệu suất sinh khối là 0,56 và 0,12 g/g trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí tương ứng. Bảng 2.6. Hiệu suất sinh khối của môi trường tối thiểu với nguồn carbon khác nhau Y* glucos* V9 fttanol Y' matanol Y’ octan* Phát triển hiếu khí Aspergillus nidulans 0,61 Candida utilis 0,51 0,68 E. coli 0,52 Y' glucos*V9 •tanol Y1 metanol Yf octane Pichia angusta 0,36 Penicillium chrysogenum 0,43 Pseudomonas aeruginosa 0,43 Các Pseudomonas 0,54 1,07 Saccharomyces cerevisiae 0,56 0,63 Phát triển kỵ khí Moorella thermatica 0,11 E. coli 0,13 Klebsiolla pneuminiae 0,12 Saccharomyces cerevisiae 0,12 Vì nguồn carbon cũng đồng thời là nguồn năng lượiTg nên hiệu suất tạo ATP và sự sử dụng ATP của vi sinh vật cũng là một yếu tô" quan trọng. Thưòng việc ước lượng cần bao nhiêu ATP để tăng trưởng là rất cần thiết mặc dù khá khó khăn. Carbohydrate là nguồn carbon và năng lượng hay được sử đụng nhất trong lên men vi sinh vật. Tuy nhiên, rượu, alkan và acid hữu cơ cũng đôi khi được sử dụng. Chất béo động vật và dầu thực vật có thể sử dụng trong một sô" môi trường bên cạnh nguồn carbon chính. M ật m ía Glucose và saccharose tinh khiết hiếm khi được sử dụng trong lên men công nghiệp do giá thành cao. Mật mía là nguồn saccharose rẻ tiền hdn nhiều. Nó chứa khoảng 50-60% carbohydrate, chủ yếu là saccharose, ngoài ra còn chứa 2% chất có nitơ, một sô" vitamin và khoáng chất. Thành phần chính xác thay đổi tùy theo nguồn mía, nơi thu hoạch, điều kiện trồng và công nghệ làm đường được sử dụng. Nồng độ carbohydrate có thể giảm trong quá trình bảo quản do nhiễm vi sinh vật. Một cơ chất tương tự là sản phẩm phụ của công nghệ làm siro ngô, chứa chủ yếu là glucose. Cao chiết m ạch n h a Thành phần chứa khoảng 90% carbohydrate, trong đó có khoảng 20% đường 6 carbon (chủ yếu là glucose), 55% đường đôi (chủ yếu là maltose và một ít saccharose) và 10% maltotriose. Ngoài ra còn chứa 15-20% dextrin có nhánh và thảng. Nó cũng chứa một ít vitamin và khoảng 5% hợp chất có nitơ. Đây là nguồn carbon thích hợp cho lên men nấm sợi, nấm men và actinomyces. Thành phần cũng thay đổi tùy theo quy trình sản xuất mạch nha. Việc tiệt trùng các môi trường chứa cao chiết mạch nha cần kiểm soát tốt để tránh quá nhiệt. Các đường khử và acid amin có xu hướng tạo phản ứng Maillard khi bị đun nóng ở pH thấp. Phản ứng này tạo ra các sản phẩm ngưng tụ màu nâu, làm giảm khả năng lên men của vật liệu đồng thời một sô" sản phẩm có thể ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tinh bột và d extrin Các polysaccharid này không dễ sử dụng như các đường đơn hay đôi nhưng chúng có thể đ ư ợc chuyến hóa trực tiếp bởi vi sinh vật sinh amylase, nhất là các nấm sợi. Các enzym ngoại bào này sẽ thủy phân cơ chất thành hỗn hợp glucose, maltose hay maltotriose tương đôi giống thành phần của dịch chiết mạch nha. Tinh bột bắp được sử dụng phổ biến nhất. Đe dễ được sử dụng hơn trong các quy- trình lên men khác nhau, tinh bột thường được chuyển hóa thành dạng siro, chủ yếu chứa glucose. Đầu tiên tinh bột được gel hóa rồi thủy phân bằng acid loãng hay enzym thủy phân tinh bột, thường là glucoamylase của vi khuẩn. Nước thải sulfit Đường trong nưốc thải của công nghiệp giấy này có thể dùng để lên men nấm men. Nưốc thải từ việc xử lý cây họ thông có chứa 2—3% (kl/tt) đường, gồm 80% đường 6 carbon và 20% đường 5 carbon. Đường 6 carbon gồm glucose, mannose và galactose, trong khi đường 5 carbon chủ yếu là xylose và arabinose. Nước thải từ các cây rụng lá theo mùa chứa chủ yếu đường 5 carbon. Thông thường nước thải này cần được Ẩử lý trước khi sử dụng vì nó chứa sulphur dioxid. pH thấp đ ư ợc trung hòa bằng calci hydroxid hay calci carbonat và phải bổ sung thêm nguồn nitơ và phospho. Cellulose Cellulose được tìm thấy chủ yếu ở dạng lignocellulose, hợp thành từ cellulose, hemicellulose và lignin, trong thành tế bào thực vật. Lignocellulose có thể thu được từ chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và công nghiệp. Rất ít vi sinh vật sử dụng được cơ chất này và nó cũng khó bị thủy phân. Thường nó được sử dụng để lên men rắn. như nuôi một sô" loài nấm. Tuy nhiên, nó cũng có tiềm năng lớn vì khả năng chuyển hóa thành đưòng hay ethanol. Bă sửa chua (whey) Whey là một sản phẩm phụ của công nghiệp sữa. Hàng nàm có 80 triệu tấn, chứa khoảng 1 triệu tấn lactose và 0,2 triệu tấn protein sữa. Chi phí vận chuyển và bảo quản tôn kém, do đó, người ta thường làm bay hơi nưổc để cô đặc lactose dùng để lên men, sau đó tách loại protein sữa để sử dụng làm thức ăn gia súc. Nói chung lactose không phải là một đường lên men tốt như saccharose vì nó ít được chuyển hóa bởi vi sinh vật, ví dụ Saccharomyces cerevisiae không lên men lactose. Nó chủ yếu được sử dụng để lên men penicillin và hiện nay vẫn dùng trong lên men rượu, acid lactic, xanthan gum, protein đơn bào, vitamin B12 và acid gibberellic. A lkan và alcol n-alkan có chuỗi carbon 10 — 20 có thể được chuyển hóa bởi một sô' vi sinh vật. Thường thích hợp hơn khi sử dụng dạng hỗn hợp. Tuy nhiên, việc sử dụng chúng trong còng nghiệp hay phụ thuộc vào giá dầu. Methan cũng được sử dụng làm nguồn carbon bởi một sô* ít vi sinh vật, nhưng một sản phẩm của nó là methanol thì được ưa chuộng trong công nghiệp. Methanol tinh dễ tìm và rẻ; nó có thể trộn lẫn được vói nước, có tỷ lệ carbon cao, mặc dù cũng rất ít vi sinh vật có thế sử dụng nó. Mặt khác, không như các cơ chất khác, methanol độc đôi với vi sinh vật nên chỉ có thể sử dụng ỏ nồng độ rất thấp 0,1-1% (tt/tt). Khi lên men vói methanol, nhu cầu về oxy và nhiệt cao hơn bình thường và các alkan cũng vậy, thậm chi còn hơn. Các cơ chất này được ưa chuộng trong thập niên 70 — 80 nhưng ngày nay được coi là không kinh tế. Ethanol ít độc hơn và được sử dụng như là cơ chất duy nhất hay đồng cơ chất bởi nhiều vi sinh vật, nhưng nó khá đắt. Tuy nhiên, các công nghiệp chuyến hóa nó thành acid acetic vẫn còn rất phổ biến. Chất béo và dầu Các chất bco rắn của động vật chủ yếu chứa glycerid của acid palmitic, stearic hiếm khi đ ư ợ c sử dụng trong lên men. Tuy nhiên, dầu thực vật (chủ yếu là dầu hạt bông vải, hạt lanh, ngô, olive, cọ, hạt nho và đậu nành) và đôi khi dầu cá có thể được sử dụng làm nguồn carbon chính hay bổ sung đặc biệt trong lên men kháng sinh. Dầu thực vật chủ yếu chứa acid oleic và linoleic, nhưng dầu hạt lanh và đậu nành có khá nhiều acid linoleic. Dầu chứa nhiều năng lượng hơn carbohydrate có cùng khôi lượng. Ngoài ra carbohydrate thường chiếm thế tích lón hơn, trong khi dầu có thể đặc biệt hữu dụng trong lên men me bổ sung dinh dưỡng gián đoạn do chiếm thể tích nhỏ nên có chỗ đế bổ sung các thành phần khác. Nguồn nitơ Hầu hết các vi sinh vật công nghiệp đều có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ hay vô cơ. Nitơ vô cơ thường là muối amoni như sulfat, hydrophosphat hay amoniac. Amoniac có thể sử dụng làm chất điều chỉnh pH trong quá trình lên men. Nguồn nitơ hữu cơ bao gồm acid amin, protein và urea. Nó thường được sử dụng dạng phụ phẩm thô của các công nghiệp khác. Acid amin tinh khiết hiếm khi được sử dụng, thường là trong trường hợp nó là tiền chất của sản phẩm. Nước thải ngâm bắp Chất thải này thu được như là sản phẩm phụ của quá trình chiết tinh bột từ bắp và được sử dụng lần đầu tiên trong lên men penicillin từ những năm 40. Thành phần của nó thay đổi tùy theo chất lượng bắp và quy trình chế biến. Dịch chiết cô đặc chứa khoảng 4% (ki/tt) nitơ, bao gồm nhiều acid amin, vitamin và khoáng chất. Các cặn đưòng thường được chuyển thành acid lactic (9-20% (kl/tt)) nhờ các vi khuẩn nhiễm. Nước thải bắp đôi khi được thay thế bằng một thứ tương tự từ công nghệ chế biến tinh bột khoai tây. Cao nấm men Cao nấm men được sản xuất từ chất thải của lò bánh mì và bia rượu chủ yếu chứa Saccharomyces cerevisiae. Một nguồn khác là Kluyveromyces maxianus mọc trên whey (nưóc thải sữa chua) và Candida utilìs nuôi bằng cồn hay phế thải của công nghiệp giấy. Các cao chiết này sử dụng trong môi trường lên men là dạng cô đặc đã loại muối, chúng chứa các thành phần tan được của dịch thủy phân tế bào nấm men. Cao nấm men chứa quá 0,05% natri clorid không dùng được vì sẽ gây ăn mòn thiết bị. Sự thủy phân nấm men thưòng là tự hủy do các enzym nội sinh của nấm. Quá trình tự hủy khỏi đầu bằng shock nhiệt hay thẩm thấu làm cho tế bào chết mà không hư hại enzym. Nhiệt độ và pH được kiểm soát trong suổt quá trình để đảm bảo sự tự hủy được tối ưu và ổn định. Kiểm soát nhiệt đặc biệt quan trọng vì phải ngăn được sự phân hủy của các vitamin. Quá trình tự hủy điễn ra ở 50- 55°c trong nhiều giò trước khi nâng nhiệt độ lên 75°c để bất hoạt enzym. Cuối cùng tế bào được phá võ bằng enzym phá hủy màng sinh chất hay bằng tác nhân cơ học. Thành tế bào và các cặn khác được loại bỏ bằng ly tâm hay lọc và dịch tan thu được sẽ được cô đặc nhanh. Cao chiết thường được cung cấp dưới dạng lỏng chứa 50-65% chất rắn, dạng hồ nhão hay bột khô. Chúng chứa acid amin, peptide, vitamin tan trong nước và một ít glucose. Pepton Pepton thưòng là quá đắt đê sử dụng trong công nghiệp lên men. Chúng được sản xuất bằng cách thủy phân acid hay enzym các nguyên liệu chứa nhiều protein như thịt, casein, gelatin, keratin, đậu phộng, đậu nành, hạt bông, ... Thành phần acid amin của nó thay đổi theo nguồn nguyên liệu ban đầu. Ví dụ pepton từ gelatin thì nhiều prolin nhưng lại hiếm các acid amin có lưu huỳnh; trong khi pepton từ keratin thì giàu cả prolin lẫn cystein nhưng lại không có lysin. Pepton từ thực vật thường chứa một lượng tương đối lốn carbohydrate. Bă đậu nành Phần cặn còn lại sau khi ép dầu chứa khoảng 50% protein, 8% nitơ không phải protein, 30% carbohydrate và 1% dầu. Bã này thường được dùng trong lên men kháng sinh vì nó được chuyển hóa chậm nên giảm khả năng ức chế sự hình thành sản phẩm. Nước Tất cả các quá trình lên men, trừ lên men cơ chất rắn, đều cần một lượng lớn nước. Trong nhiều trường hợp, nước cũng cung cấp các yếu tô" vết khoáng chất. Do đó cần nguồn cung cấp nước sạch, ổn định chất lượng thành phần. Trước khi sử dụng cần loại các tạp rắn. Nếu nguồn nưóc bị “cứng”, cần được xử lý để loại muối như calci carbonat, các ion sắt và cloride cũng cần loại bỏ. Một số quy trình lên men cần nước có độ tinh khiết cao như nuôi cấy tế bào động vật, thực vật. Việc cung cấp nưốc sạch ngày càng trở nên khó khăn do đó trong quy trình cần có các khâu để tái sử dụng nguồn nước khi có thể. Khoáng chất Thông thường nưốc cung cấp có chứa lượng cobalt, đồng, sắt, magiê, molybden, kẽm đủ cho sự tăng trưởng. Ngoài ra các thành phần khác cũng chứa tạp của các khoáng chất này. Tuy nhiên, nếu hàm lượng của một số ion như calci, magiê, phospho, kali, lưu huỳnh và cloride quá thấp so vói yêu cầu thì cần có các biện pháp bồ sung. Vitamin và các yếu tô" tăng trưởng Nhiều vi sinh vật có thể tổng hợp tất cả các vitamin từ các thành phần cơ bản của môi trường. Đôi với một số vi khuẩn, nấm sợi và nấm men khác các thành phần này cần được bổ sung vào môi trường lên men. Hầu hết các nguồn carbon và nitơ đều chứa một sô' vitamin ỏ dạng tạp. Các yếu tô" tăng trưởng khác, acid amin, nucleotide, acid béo, sterol được thêm vào d ư ố i dạng tinh khiết hoặc để tiết kiệm chi phí có thể sử dụng dạng chiết xuất từ động vật hay thực vật. Các tiển chất Một sô” quy trình lên men cần được bổ sung các tiền chất nhất định, nhất là các quy trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp. Khi đó chúng được thêm vào vối liều lượng được kiểm soát chặt chẽ và thường ở dạng khá tinh khiết. Ví dụ acid phenylacetic hay phenylcetamid được thêm vào như là tiền chất của sợi nhánh của penicillin. D-threonin là tiền chất của L-isoleucin sản xuất bỏi Serratia marsescens và acid anthranillic được thêm vào khi sản xuất L—tryptophan bằng Hansenula anomala. Các chất cảm ứng và kích thích Nếu sự tạo thành sản phẩm phụ thuộc vào một chất cảm ứng đặc thù hay một chất có cấu trúc tương tự, nó phải có mặt trong môi trường hoặc được thêm vào tại những thời điểm xác định trong quá trình lên men. Trong nuôi cấy tê bào thực vật sự sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp như flavonoid, terpenoid có thể được khởi động bằng cách thêm các chất kích thích. Các chất này có thể được phân lập từ các vi sinh vật, nhất là các vi sinh vật gây bệnh thực vật. Các chất cảm ứng thường cần cho quá trình lên men vi sinh vật biến đổi gen (GMM - Genetic Modified Microorganism). Bởi vì sự tăng trưởng của các vi sinh vật này có thể bị rối loạn nếu gen đích được hoạt hóa, thường do mức độ phiên mã và dịch mã quá cao. Do đó, một hệ thông cảm ứng thường được thiết kế để tê bào tăng trưởng bình thường mà không có sự hoạt hóa của gen đích, khi sự tăng trưỏng đạt mức tối ưu nào đó, sự hoạt hóa gen đích sẽ xảy ra khi thêm chất cảm ứng, khi đó quá trình sản xuất sản phẩm đích mới bắt đầu và tế bào cũng bắt đầu chết. Các chất ức chế Các chất ức chê được dùng để thay đổi hưóng chuyển hóa của vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm và giảm các sản phẩm phụ hoặc làm ngưng quá trình chuyên hóa ỏ một giai đoạn nhất định nhằm tránh sản phẩm đích bị chuyển hóa xa hơn. Một thí dụ điển hình là lên men sulfit trong đó natri bisulfit được dùng để chuyển hướng lên men rượu của s. cereuỉsiae thành sản xuất glycerol. Một số GMM có mang plasmid chứa gen kháng kháng sinh, môi trường nuôi cấy chứa kháng sinh sẽ giúp loại bỏ những tế bào không mang plasmid. Chât thay đoi tính thấm tế bào Các chất này làm tăng tính thấm của tế bào bằng cách thay đổi cấu trúc thành hay màng tế bào để làm tăng sự phóng thích các sản phẩm nội bào vào môi trường lên men. Thường sử dụng penicillin hay các chất hoạt động bể mặt. Chúng thường được thêm vào trong quá trình lên men acid amin như acid glutamic bởi vi khuẩn Corynerbacterium và Breưibacterium. Oxy Tùy thuộc vào nhu cầu oxy của chủng vi sinh vật, oxy có thể được đưa vào dưới dạng không khí chứa 21% oxy hay dạng tinh khiết. Nhu cầu oxy của vi sinh vật thay đổi tùy theo nguồn carbon sử dụng. Trong hầu hết các quy trình lên men không khí hay oxy cung cấp được lọc vô trùng trưốc khi được bơm vào nồi. Chất chông bọt Bọt được tạo ra trong quá trình lên men do protein trong môi trường và khí sục vào. Nếu không kiểm soát được bọt, nó có thể làm tắc hệ thông dẫn khí, tràn nồi, gây nhiễm hay phóng thích vi sinh vật ra môi trường. Có ba hướng tiếp cận để kiểm soát bọt trong lên men: thay đổi công thức môi trường, dùng các biện pháp cơ học hay hóa học để phá bọt. Các chất phá bọt thường là các chất hoạt dộng bề mặt, chúng cần có các đặc tính sau: 1. Nhanh chóng phân tán và tác động nhanh. 2. Tác động mạnh vối liều thấp. 3. Có tác động kéo dài. 4. Không độc đối vối vi sinh vật lên men, ngưòi hay thú. 5. Giá rẻ. 6. Bền nhiệt. 7. Tương thích vỏi các thành phần môi trường và quy trình. Các chất phá bọt tự nhiên như dầu thực vật (đậu nành, hướng dương, cải dầu), dầu cá đã khử mùi, dầu khoáng, và mỡ động vật. Các chất phá bọt tổng hợp hầu hết là dầu silicon, poly alcol, glycol alkyl hóa. Một sô' chất có thê gây ảnh hưồng đến quá trình xử lv sau lên men nhất là công đoạn lọc. 3.3, Môi trư ờng n u ô i cấy tế bào độn g vật Các môi trương này thường dựa vào một môi trường nền phức hợp, như Eagle, có chứa glucose, khoáng, vitamin và acid amin. Đối vối tế bào động vật có vú, người ta thường thêm huyết thanh như huyết thanh bê, ngựa, ... Huyết thanh cung cấp các yếu tố tăng trương bao gồm các yếu tố khởi đầu và gắn kết, các protein liên kết. Chúng cũng cung cấp hormon, yếu tô vết và các chất ức chế protease. Do sự phức tạp trong thành phần của huyết thanh nên việc tìm kiếm các công thức rẻ tiền để thay thế rất khó khăn. Vấn đề tiệt trùng cũng có nhiều khó khán do các yếu tô" trong huyết thanh kém chịu nhiệt. Thông thường môi trường chứa 5-10% huyết thanh, gần đây người ta cô gắng tạo ra các chủng cần ít thậm chí không cần huyết thanh để tăng trương nhờ đó giảm giá thành nuôi cấy. 3.4, Môi trư ờ ng n u ô i cấ y t ế bào thự c v ậ t Ngược với môi trường nuôi cấy tê bào động vật, tê bào thực vật mọc trên các môi trường tổng hợp. Chúng thưòng chứa một nguồn carbon hữu cơ (hầu hết các tế bào thực vật phát triển dị dưỡng), một nguồn nitơ, khoáng, và các hormon tăng trưởng. Saccharose thường được dùng làm nguồn carbon, đặc biệt đôi với việc sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, nhưng glucose, fructose, maltose và đôi khi lactose củng đã được sử dụng. Nitrate thường đóng vai trò nguồn nitớ, được cung cấp ở dạng muôi amoni. Tuy nhiên, một số loài cần cung cấp nitơ hữu cơ dưới dạng acid amin. Thành phần và nồng độ các hormon thực vật thay đổi tùy theo loài và theo loại lên men, thường sử dụng auxin cùng với cytokinin để thúc đẩy sự phân bào. Môi trường lên men hai pha hay đ ư ợ c sử dụng trong đó pha đầu được cho tăng trưởng tốì ưu và pha hai được tối ưu để sản xuất sản phẩm. 3.5, Môi trư ờng g iữ g iố n g Môi trường này đ ư ợ c thiết kế để vi sinh vật có sức sống cao và giảm thiểu các biến động về di truyền. Đặc biệt chúng phải giảm lượng các chất chuyển hóa độc. Nếu chủng có đặc điểm không ổn định thì phải được giữ trên các môi trường có tính chọn ỉọc cho các tính trạng cần giữ (tham khảo công thức môi trường của các cơ quan lưu giữ chủng như ATCC, NCTC, ...). 4. HỆ THỐNG LÊN MEN 4.1. Nồi lên m en Nồi lên men hay bình phản ứng sinh học (fermenter/bioreactor) là thùng chứa tế bào, chiết xuất tế bào hay enzym thực hiện phản ứng sinh học. Nồi lên men có dung tích từ một vài lít đến hàng trăm nghìn lít, được làm bằng thủy tinh hay thép không rỉ, có hệ thông cảm biến đo và điều chỉnh nhiệt độ, pH và oxy hòa tan. Nồi lên men thường có hình trụ với hệ thống cánh quạt như chân vịt tàu thủy nhằm trộn đều và cung cấp oxy. Oxy tan trong nước rất hạn' chế (8,4 mg/1 ở 25°C) nên cần được cung cấp liên tục (không khí được sục vào và khuấy đều trong nồi lên men), cần phải có thiết bị theo dõi lượng oxy hòa tan trong môi trường. K hí thải vô trù n g Trong quá trình nuôi cấy hiếu khí, phải cung cấp oxy cho vi sinh vật hô hấp và phát triển sinh khối, đồng thời tạo điều kiện cho hệ enzym trong tê bào hoạt động và cho hiệu suất sinh tổng hợp cao. Song nếu độ thông khí quá mức thì hiệu quả lên men sẽ giảm, VD lên men vitamin B12 đạt hiệu suất tối đa ở độ thông khí 2,7g 0 2 /ml/giờ, nếu nâng cao hơn nữa sẽ làm giảm lượng vitamin. Ngoài việc đảm bảo cho luồng khí vào và khuấy, nồi lên men còn phải gắn thêm các bộ phận cản trên thành để làm tăng hiệu quả vận chuyển oxy và các cửa phụ để bổ sung tế bào nuôi và các chất thiết yếu vào môi trường. 4.2. Sự tản g trư ởng củ a tế bào tron g nồi lên m en Tỷ lượng (stoichiom etry) của tế bào 70% khôi lượng của tế bào là nước. Còn một nửa khôi lượng khô của tế bào là carbon và các nguyên tô' c, o, N và chiếm khoảng 92% tổng sô". Thí dụ, thành phần nguyên tố của E. colỉ. (Bảng 2.7) Bảng 2.7. Thành phẩn nguyên tố của tế bào E. co// Nguyên tố Tỷ lệ (% khô) c 50 0 20 N 14 H 8 p 3 s 1 K 1 Na 1 Ca 0,5 Mg 0,5 Cl 0,5 Fe 0,2 Các nguyên tố khác 0,3 Công thức hóa học tổng quát của tế bào vi sinh vật là C4H70 2N. Các yếu tô' ảnh hưởng đến tăng trưởng tẽ bào Sự tỏa nhiệt do tăng trưởng: một phần năng lượng trao đổi chất của tế bào thoát ra ở dạng nhiệt. Do đó cần có thiết bị điều nhiệt để nhiệt độ môi trường lên men dao động trong khoảng +/- 0,5 °c, nhằm duy trì các điều kiện sinh lý tối ư u cho tàng trưởng. Giới hạn cơ châ't: tốc độ tăng trưởng tối đa giảm 50% ỏ nồng độ 10-5 mol đối vói glucose và các hợp chất N, 10 6 mol đối vói vitamin và các nhân tố tăng trưởng. ức chế cơ chất: nồng độ cơ chất cao làm tôc độ tăng trưỏng tối đa giảm 50% ỏ nồng độ 1-2 mol với glucose và 0,1 - 0,2 mol vói nguồn N. Ưc chế sản phẩm: nồng độ sản phẩm cao làm tốc độ tăng trưỏng tôi đa giảm 50%. Loại ức chế thường gặp ethanol, acid hữu cơ, acid amiii, kháng sinh... ethanol vối nồng độ 1 mol sẽ ức chê nấm men, vi khuẩn, 4.3. Các phư ơng thứ c lên m en Có nhiều phương thức lên men khác nhau được phân loại theo các thuộc tính cơ bản như sau. Trên thực tê một quy trình lên men là sự kết hợp của nhiều phương thức lên men. Bình thu hoạch Hình 2.4. Thiết bị lên men liên tục Kiểu vận hành .Lên men gián đoạn hay lên men từng mẻ (batch fermentation) đây là dạng lên men cổ điển nhất. Môi trường dinh dưỡng được cho một lần vào nồi lên men và thực hiện lên men đến khi thu sản phẩm. Tuần tự theo các giai đoạn: nhân giống, sục khí, phản ứng, thu sản phẩm. Xong một mẻ, lại tiến hành mẻ mới. Lên men bô sung dinh dưỡng gián đoạn (fed-batch) trong đó mẫu lên men được tiến hành theo kiểu gián đoạn nhưng cơ chất không được cho hết một lần mà vào các thời điểm xác định một lượng nhỏ cơ chất được cho vào nồi lên men. Điều đó cho phép kiểm soát chính xác sự sinh trưởng của vi sinh vật và kéo dài thời gian pha lũy thừa hoặc hạn chế các sản phẩm phụ. Cách lên men này cho phép đạt năng suất sinh khối cao hơn. Ví dụ đốì với E. coli lên men fed— batch cho năng suất sinh khối vào khoảng 70 g /lít môi trường, nhưng chỉ đạt 20 g/lít nếu lên men trong điều kiện thông thường. Lên m en liên tụ c (continuous fermentation): trong quá trình lên men, nguồn dinh dưỡng được bổ sung liên tục và dịch lên men được lấy bớt ra liên tục và tạo ra sự cân bằng hợp lý (Hình 2.4). Phương thức cung cấp dinh dưỡng này làm cho các điều kiện trong nồi lên men luôn luôn ở trạng thái ổn định, do đó sản phẩm tạo ra tốt hơn. Ưu thế của phương thức lên men này là không phải nhân giống theo từng mẻ, mà có thể lắng đọng môi trường đầu ra để thu tế bào. Do vậy, thời gian lên men có thể được kéo dài hơn. Thí dụ, lên men rượu gián đoạn diễn ra trong 5-7 ngày, còn lên men liên tục có thể cả tháng, thậm chí cả năm. Độ kín của hệ thông Lên m en hở. Các sản phẩm có khối lượng lốn nhưng giá thành thấp như các sản phẩm lên men truyền thông (rượu, bia, giấm, sữa chua,...) thường được lên men trong các nồi lên men đơn giản và vận hành trong hệ thông hở, không kiểm soát chặt chẽ mức độ ngoại nhiễm. Các quy trình này thường vận hành ở pH hay nhiệt độ mà phần lớn các vi sinh vật ngoại nhiễm khó phát triển, hoặc sử dụrig các cơ chất đặc thù cho một số ít vi sinh vật nhất định, do đó nói chung mặc dù hệ thống không kín nhưng mức độ ngoại nhiễm vẫn được kiểm soát trong giới hạn nhất định. Lên m en vô trù n g . Các sản phẩm có giá trị cao hoặc có tiêu chuẩn an toàn cao (ví dụ dược phẩm) đòi hỏi hệ thống lên men phức tạp hơn. Hệ thông phải sử dụng môi trường và vật liệu đã tiệt trùng hoặc cho phép tiệt trùng ngay trong hệ thông (CIP — cleaning-in-place) và toàn bộ hệ thống phải đư ợc kiểm soát chặt về mức độ nhiễm trong suốt quá trình lên men. Các quy trình này thường sử dụng chủng vi sinh vật thuần. Sự thông khí Lên m en h iếu khí. Sự tăng trưởưg sinh khối hoặc tạo sản phẩm cần có sự hiện diện của oxy, do đó hệ thống lên men phải có cơ chế cung cấp và kiểm soát nồng độ oxy thông qua việc sục khí và khuấy trộn. Lên men kỵ khí. Ngược lại một số quy trình lên men cần đư ợc thực hiện ở điều kiện kỵ khí (lên men rượu), khi đó việc thông khí không còn cần thiết hoặc được thay thế bằng các khí không hô hấp được. Kiểu thiết bị sử dụng Lên men nổi Lên men bể mặt: môi trưòng lỏng chứa trong khay không quá 5 cm và tế bào mọc lớp trên bề mặt tiếp xúc trực tiếp với không khí. Kiểu lên' men này được gọi là lên men tĩnh. Nuôi cây lắc: dùng máy lắc đổ cung cấp oxy do môi trường được bị khuấy trộn nhò máy lắc. Nếu môi trưòng tăng trưỏng chỉ chiếm 10-20% thể tích bình erlenmeyer, có thể đạt mật độ tế bào 1-2 g khô/lít môi trường. Lên men bán rắn: cơ chất ẩm đế lớp mỏng trên khay. Lên men chìm Lên men chìm (submerged fermentation) là kiểu lên men chủ yếu trong công nghiệp. Khi lên men với quy mô lớn hay mật độ tế bào cao, người ta dùng bơm khí (compressor) đế thông khí. Thiết bị chủ yếu là nồi lên men (fermentor hay bioreactor) 4.4. Kỳ th u ậ t lên m en Lên men bể mặt Môi trường Môi trường rắn thường là cám, bột, ngô, tấm, gạo... Độ ẩm khoảng 60%. Môi trường lỏng thưòng dùng là nước đường hóa, nưốc bã rượu, rỉ đường. Vi sinh vật phát triển hấp thu những chất dinh dưỡng của môi trường (phải tiết ra enzyra) và sử dụng oxy phân tử, oxy không khí để hô hâ'p. Chính vì vậy nuôi cấy bề mặt cần phải có bề mặt thoáng rộng, lớp môi trường không quá sâu (2-5 cm). Thí dụ: nuôi cấy bề mặt môi trường rắn thường dùng cho nấm mổc Aspergillus để lấy enzym, hay nuôi cấy xạ khuẩn trên gạo ngô để lấy kháng sinh. Nuôi cấy Aspergillus niger trên bể mặt môi trường lỏng để lấy acid citric. Saccharomyces cerevisiae thường được dùng lên men nổi trong công nghiệp cồn. Nhản giông Việc nhân giống trong nuôi cấy bề mặt thường bằng hệ sợi hoặc bào tử của nấm mốc hoặc xạ khuẩn. Nuôi cấy nhân giống có thể để lâu cho nấm mốc và xạ khuẩn mọc già và sinh bào tử. Thu bào tử bằng cách dùng máy hút hoặc dùng chổi lông mềm đã tiệt trùng quét lên mặt môi trưòng rắn. Bào tử khô đựng trong các bình kín gắn par^fin bảo quản ồ những nơi mát và bảo quản được hàng năm. Tiến triển Cấy giống từ môi trường đã nhân giống. Các bào tử hoặc các mẫu hệ sợi trong môi trường lên men. sau thời gian tiềm phát sẽ phát triển mạnh. Quá trình phát triển của vi sinh vật cần oxy phân tử của không khí để hô hấp. sản phẩm của sự hô hấp là khí C 02, và nhiệt lượng tỏa xung quanh. Kết quả là nhiệt độ môi trưòng tàng lên, nồng độ C 02 cao lên và môi trường có thể bị khô dần hoặc ưốt thêm. Độ ẩm của phòng nuôi cấy vào khoảng 95 — 100%. Hoạt lực sinh tổng hợp vi sinh vật cao trong thòi kỳ các tê bào còn trẻ và giảm dần khi bắt đầu sinh bào tử. Hình 2.5. Buồng lên men bề mặt sử dụng khay 1. Giá đựng khay; 2. Khay; 3. cửa cho không khí sạch vào buồng; 4. cửa cho không khí ra; 5. Quạt; 6. Chỗ phun nước; 7. Bộ phận xả hơi nóng để điều chỉnh nhiệt độ của buống Phương tiên Khi nuôi cấy bề mặt người ta thường rãi môi trường trên các khay, mành, nong, nia. Đây là phương pháp cổ điển, nhưng ngày nay vẫn được phổ biến rộng rãi ở hầu hết các nưóc trên th ế giới. Phương pháp này chiếm tỷ lệ cao trong sản xuất các chế phẩm enzym và chiếm ưu thế cao trong công nghiệp sản xuất acid citric. Người ta có thể sử dụng buồng lên men bề mặt có các khay đựng môc trường và có những bộ phận thoáng khí, phun nưốc thành bên và điều chỉnh nhiệt bằng hơi nóng (hình 2.5). Lên men chìm Nhản giống Nuôi cấy chìm được tiến hành trong các thùng lên men chứa môi trường dinh dưỡng có cánh khuấy và sục khí để cung cấp oxy cho vi sinh vật phát triển. Trong quá trình lên men giông được tiến hành nhân giống qua các cấp cấp 1 trong bình đặt trên máy lắc, cấp 2 trong bình nhân giông 50 lít có cánh khuấy và sục khí, cấp 3 nếu các thùng lên men chính khoảng vài chục mét kbối. Tỷ lệ nhân giống khoảng 1 đến 10%. Tiến triển Giông sau khi được tiếp vào thùng lên inen qua một vài giờ ở giai đoạn tiềm ẩn, bắt đầu phát triển theo chỉ số logarit. 0 giai đoạn này, các thành phần dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng nhiều, nhiệt lượng tỏa ra cao, trên bề mặt môi trường nổi bọt, khôi bọt tăng dần, gây nhiễm trùng làm hỏng nồi men. Vì vậy khi thấy xuất hiện bọt phải cho dầu thực vật hay mỡ cá voi, hoặc chất phá bọt tổng hợp. Trong quá trình phát triển, vi khuẩn thường sinh ra các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid'propionic...) cùng với các gốc acid còn sót lại như so^2, c r 1, NO'1 của các muối amoni làm cho môi trường chuyển về acid. Do vậy người ta thường thêm khoảng 2 — 3% CaC03 để làm chất ổn định pH hoặc thêm urê hay NH4OH để điều chỉnh pH. Thời gian lên men khoảng 30 — 70 giờ, có khi dài hơn. N g u y ê n liệu Hình 2.6. Sơ đồ lên men chìm Đặc điểm lên men chìm Dùng môi trường dinh dưỡng có thể hầu như hoàn toàn đáp ứng về nhu cầu sinh lý của từng giống vi sinh vật. vỏi một đơn vị thể tích dịch nuôi cấy cho được sô" lư ợ n g chất sinh tổng hợ p cao và hiệu suất lên men nói chung cao hơn nhiều so với phương pháp lên men bề mặt. Các thiết bị lên men dễ cơ khí hóa, tôn ít nhân công và diện tích mặt bằng nhỏ. Tuy vậy, phương pháp này cũng có nhược điểm là đòi hỏi trang bị kỹ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ. Trong lên men chìm cần khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng đưực oxy hòa tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thông lọc sạch tạp trùng. Hệ thông này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy (hình 2.6). 4.5. Các yếu tô ản h hư ởng đ ến h iệu su ất lên m en Ảnh hưởng của pH môi trường Trong các dung dịch thường xuyên có ion H+ tự do. Nồng độ các ion H+ trong môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đẽn sự trao đổi chất và phát triển của vi sinh vật. Nồng độ ion H+ được thể hiện bằng sô" gam ion H+ trong 1 lít môi trường. Nếu trong 1 lít dung dịch có 0,001 g ion H+ thì nồng độ của nó là KH = 0,001g/l hay HK= 1/103 g/1 = 10~3g/l và môi trường có pH 3. pH môi trường ảnh hưởng lớn đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật: - Tác dụng trực tiếp của ion H+ hay ion OH“ đến tính chất keo của tế bào, đến hoạt lực của enzym - Tác dụng gián tiế p pH đến tế bào pH môi tr ư ờ n g ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của vi sinh vật không giống nhau. Có những pH, ở đó vi sinh vật vẫn phát triển bình thường, nhưng tạo ít hoặc không tạo sản phẩm. Thí dụ: trong sinh tổng hợp penicillin, ngưòi ta nhận thấy khi pH của môi trường dưỏi 6,0 thì vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng không tạo được penicillin - pha II hoàn toàn không có (hình 2.7). / a C 0 -----------1----------- 1---------H--------- H----------- 1---------- £ 6,4 6,8 7,2 7,6 8,0 pH môi trường Hình 2.7. Ảnh hưảng của pH môi trường đến sự tạo penicillin Đối với mỗi một sản phấm đều có vùng pH tối thích xác định. Thí dụ : việc tạo thành tetracyclin là tối đa ở vùng pH 6,8 - 8,0, đối vối streptomycin là 7,0 — 8,5; đối với penicillin 6,8 - 7,5 ; đối vối acid glutamic 6,8 — 7,5; đốì với lysin 6,8 — 7,2. Nồng độ glucose cao trong môi trường thường làm pH chuyên dần về phía acid, vì trong quá trình trao đổi chất vi tíinh vật tạo ra nhiều acid hữu cơ. Trị số pH đầu tiên của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sinh trưởng và sinh tổng hợp của vi sinh vật. pH đầu tiên tạo điều kiện thích hợp cho những giai đoạn đầu -của quá trình đồng hóa, tích tụ những “bán thành phẩm” để tổng hợp những phân tử các hợp chất cần thiết. Thí dụ : pH đầu thích hợp cho xạ khuẩn Act. aureofaciens trong quá trình tổng hợp biomycin là khoảng 6,6 - 6,8. Có trường hợp, phải thay đổi pH tối thích theo pha sinh trưởng và pha tích tụ sản phẩm. Thí dụ : trong lên men penicillin cần tạo ra ỏ pha sinh trưởng pH gần 6,8 và ở pha tạo thành penicillin pH khoảng 7,3 (hình 2.7). Nhu cầu óxy và ảnh hưởng của oxy đến quá trình sinh tổng hợp Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí cần phải có sự tiếp xúc giữa chúng vói không khí. Trong nuôi cấy bề mặt thì các lớp môi trường phải mỏng để tao ra mặt thoáng rộng và trong nuôi cấy chìm phải tạo được những điều kiện không khí hòa tan nhiều vào môi trường lỏng. Độ hòa tan oxy Vi sinh vật chỉ sử dụng oxy hòa tan trong môi trường lỏng. Tính chất này liên quan tối sự phân bố hệ enzym hô hấp tế bào chất (nước trong tế bào chất chiếm 80%). Lượng oxy hòa tan trong nước rất ít. Tế bào sử dụng oxy để hô hấp và làm giảm lượng ọxy trong môi trường. Thiếu oxy nhất thời sẽ phá võ sự trao đổi chất trong tế bào. Vì thế phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của vi sinh vật. Tôc độ hòa tan của oxy trong môi trường lỏng được tính theo công thức : dc R ^ = KLa(C-C,) dt Trong đó : R : tốc độ hòa tan của oxy c : nồng độ oxy bão hòa ở áp suất riêng c x : nồng độ oxy hòa tan ỏ thời điểm lựa chọn KLa : hằng số tỷ lệ t : thời gian Môi trường lỏng được khuấy đều sẽ làm tăng tốc độ hòa tan của oxy. Song khuấy quá mạnh sẽ dẫn đến việc làm hỏng cơ học các tê bào và dẫn đến hiện tượng tự phân. Tăng áp suất riêng của phần (C) sẽ làm tăng độ hòa tan của oxy. Điều này^ó thể thực hiện bằng cách nén khí qua các máy nén (compressor). Khi nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí trong các bình nhỏ trên máy lắc, tốc độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào tốc độ của máy lắc (số vòng hoặc sô" lần lắc) và kiểu lắc (lắc tròn hay lắc ngang), cũng như tỷ số thể tích môi trường với thể tích chung của bình. Độ hòa tan của oxy còn phụ thuộc vào nhiệt độ khi nuôi cấy, vào nồng độ các chất hợp phần và độ nhớt của môi trường. Khi nhiệt độ tăng thì độ hòa tan giảm. Nồng độ oxy hòa tan trong các môi trường giảm hai lần khi nhiệt độ tăng từ 30 đến 37°c. Nồng độ oxy cũng giảm khi sử dụng các chất hoạt động bề mặt, các chất phá bọt và hàm lượng tàng của sinh khôi vi sinh. Có nhiều phương pháp xác định oxy hòa tan : hóa học, cực phổ, đo điện thế oxy hóa - khử, đo trên máy Vacbua. Phương pháp hóa học được dùng nhiều nhất là phương pháp sulfit. Phương pháp này dựa trên cơ sở oxy hóa sulíìt thành sulfat trong sự có mặt của ion đồng hoặc cobalt. Nhược điểm: không chính xác trong dịch nuôi cấy. Nồng độ oxy hòa tan được biểu thị bằng : - Phần trăm so với bão hòa. - Áp suất riêng. - Milimol hoặc miligam 0 2 (gam 0 2), lít trên giờ hay lít trên phút. Ánh hưởng của sự thông khí lên sự sinh trưởng của vỉ sinh vật Đối với nhiều vi sinh vật, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao sinh khối. Khi tăng tốc độ hòa tan oxy từ 0 đến 5 mmol 0 2/lít/phút lượng sinh khối cuổi cùng của Serratia marsescens sẽ tăng một cách đáng kể và sinh khối đạt cực đại ở 5 mmol 0 2/lít/phút. Nhưng nếu tiếp tục tăng thông khí nữa thì lượng sinh khổi cuối cùng sẽ giảm. Tốc độ sinh trưởng của Azotobacter ưineỉandii tăng nhiều khi tăng độ thông khí từ 0,21 đến 0,6 g/lít/giờ. Nhưng nếu quá 0,6 g/lít/giò thì sinh khối sẽ giảm, hình 2.8 biểu diễn môi tương quan giữa độ thông khí và hiệu suất sinh khối của nấm men Sac. cerevisiae. Nhu cầu oxy của vi sinh vật trong các giai đoạn sinh trưởng không giống nhau: trong thời kỳ đầu do sinh khôi còn ít, tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí mạnh là tốt. H------- 1----- 1------ 1-----h 1 2 3 4 5 mMol 0 2 /l/phut Hỉnh 2.8. Ảnh hưỏng của mức dộ thõng khí đên hiệu suất sinh khối của Saccharomyces cerevisiae Độ hòa tan của oxy phụ thuộc vào nhiệt độ. ở nhiệt độ 5 - 30°c, độ hòa tan của oxy có thề được tính theo công thức : c = —33T Trong đó : c biểu thị bằng ppm T : độ bách phân Mức độ thông khí tăng dần theo sinh khôi. Thường nhu cầu oxy cực đại khi mức độ sinh trưởng còn chưa dừng lại, khi tốc độ sinh trưởng giảm dần thì oxy hòa tan trong dịch nuôi cấy cũng giảm dần tới số' không. Ảnh hưởng của sự thông khí đến quá trình trao đổi chất và tích lủy sản phẩm sinh tông hợp Khi nuôi cây Propionibacterium jenseni trong điểu kiện hiếu khí thì nó có thể đồng hóa được glycerin, nhưng khi nuôi cấy trong điều kiện yếm khí thì không đồng hóa được. Khi nuôi cấy nấm men trong điều kiện yếm khí sẽ xảy ra quá trình lên men rượu, khi cung cấp oxy thì nấm men sẽ phát triển sinh khối. Thay đổi cường độ hiếu khí sẽ thay đổi tỷ số giữa các sản phẩm oxy hóa và khử ở các vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc như vi khuẩn lactic, vi khuẩn propionic. Nâng cao cưòng độ thông khí sẽ làm tăng tôc độ sinh trưởng và sô" lượng sinh khối vi sinh vật, đồng thời liên quan đến sự tạo thành sản phẩm trao đổi chất (kháng sinh, acid hữu cơ, acid amin, vitamin, enzym, ...). Mức thông khí tăng từ 1 đến 3 g 0 2/l/giờ làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp streptomycin một cách đáng kể. Hình 2.9 cho ta thấy sự thông khí ảnh hưởng rõ tới quá trình sinh tổng hợp Gramicidin s ỏ Bacillus brevis và ít có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn này. H------------1------------1-----------\— 1 2 3 4 0 2 g/1/giờ Hình 2.9. Sự tạo thành Gramicidin s trên môi trường tổng hợp phụ thuộc vào mức độ thông khí ở Bacillus brevis Trong quá trình oxy hóa trực tiếp glucose thành acid gluconic hoặc rượu thành acid acetic thì tốc độ sử dụng oxy đều cực đại. Trong lên men citric của Aspergillus niger thì hiệu suất cực đại trùng vối hoạt lực hô hấp tối đa của mốc này. Nuôi cấy Brevibacterium flavum nếu thông khí tốt sẽ tạo ra chủ yếu là acid glutamic và acid cetoglutaric, nêu thông khí không đủ sẽ tạo ra acid succinic và acid lactic và khi không thông khí thì sản phẩm sẽ là acid lactic. Kết quả tương tự đối với Corynebacterium gỉutamicum (Micrococcus glutamicus) trong quá trình lên men glutamic. Nếu thông khí không đầy đủ, các enzym lactatdehydrogenase và alanindehydrogenase sẽ hoạt động và tạo acid lactic, alanin từ acid pyruvic. Thông khí tốt tạo điều kiện cho hệ enzym glutamatdehydrogenase xúc tác phản ứng tạo acid glutamic từ acid a-cetoglutaric. Trong quá trình nuôi cấy hiếu khí, phải cung cấp oxy cho vi sinh vật hô hấp và phát triển tăng sinh khối, đồng thời tạo điều kiện để hệ enzym trong tê bào hoạt động và cho hiệu suất sinh tổng hợp cao. Song không phải mọi trường hớp đều theo tỷ lệ thuận: nếu độ thông khí quá mức thích hợp thì hiệu suất sẽ giảm. Lên men vitamin B12 đạt hiệu suất tôi đa ở độ thông khí 2,7 g 0 2/l/giờ, nếu nâng cao nữa sẽ làm giảm lượng vitamin (hình 2.10). Đối với mỗi quá trình lên men cần phải nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ thông khí đôi với hiệu suất tạo thành sản phẩm. Trong công nghiệp vi sinh, không khí được nén qua máy nén, qua hệ thông làm nguội, tách dầu nước, qua lọc rồi thổi vào nồi lên men. Trong các thùng lên men và các thùng nuôi cấy nhân giống đều có hệ thống khuấy để trộn môi trường và phân tán không khí. Cường độ sục khí và khuấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng loại vi sinh vật, vào từng điểu kiện nuôi cấy nhằm thu được hiệu suất sản phẩm tôi đa. >---- 1---- 1---- 1----1---- 1---- *. 1 2 3 4 5 g 0 2/ỉ/giờ Hình 2.10. Sự phụ thuộc vào tốc độ thòng khí của quá trinh lén men vitamin B,2 5. GIÁM SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN Các nồi lên men hiện đại được trang bị nhiều loại cảm biến tại chỗ (in situ) và được vận hành thông qua giao diện điều khiển kỹ thuật số (direct digital control - DDC). Điều này cho phép kiểm soát một cách chính xác nhiều thông số vận hành cùng lúc như nhiệt độ, pH, tốc độ cấp dinh dưõng, nồng độ oxy hòa tan, ... (Bảng 2.8). Các thông số này đảm bảo các điều kiện cần thiết đế vi sinh vật phát triển tối ưu, do đó được gọi là các thông sô' nuôi cấy. Ngoài các thông số nuôi cấy, một sô' nồi lên men hiện đại còn được trang bị các cảm biến in situ và các bộ phân tích trực tuyến (on-line) như lấy mẫu, phân tích khí thải, ... cho phép theo dõi thường xuyên các thông sô nuôi cấy. Các thông sô" này có thể được theo dõi với tần suất rất cao (30 — 1.000 lần/giờ). Với các tiến bộ về máy tính, việc kiểm soát các thông sô' nuôi cấy có thế được thực hiện một cách chính xác vói độ lặp lại cao. Bảng 2.8. Một số cảm biến in s itu để đo thông số nuôi cấy Thông số Cảm biến Khoảng hoạt động Độ chính xác Nhiệt độ Pt-100 0 -1 5 0 °c 0,1 °c Áp suất Piezoresistor 0 - 2 bar 20 mbar Lưu tốc khí Đồng hố nhiệt lượng 0 - 20 L min'1 20 mL m irrl pH Điện cực pH 2-12 0,02 p02 Điện cực Polarografic Clark 0 - 400 mbar 2 mbar PCO2 Điện cực pH có màng 0 - 100 mbar 2 mbar Các cảm b iế n ỉn s itu . Các cảm biến này được đặt ngay bên trong nồi và có thể được tiệt trùng cùng vối nồi mà không phải tháo ra (Bảng 2.8). Chúng được thiết kế dựa trên các nguvên lý khác nhau nhưng nói chung hầu hết các cảm biến này rất đáng tin cậy và được sử dụng thường quy trong các quy trình ở phòng thí nghiệm hay ở quy mô công nghiệp. Bảng 2.9. Ưu và nhược điểm của các nguyên lý cảm biến in s itu khác nhau Nguyên lý Ưu điểm Nhược điểm Mật độ quang Khoảng tuyến tính rộng Có nhiễu tín hiệu Huỳnh quang Độ nhạy cao Nhiều nhiễu Đo được hoạt động tế bào Khó diễn giải tín hiệu Độ dẫn Dãi đo được rộng Bị nhiễu bởi sự thông khí và khuấy Đo được hoạt động tế bào Khó diễn giải tín hiệu Siêu âm Khoảng tuyến tính rộng Bị nhiễu bởi sự thông khí và khuấy Không cấn vệ sinh Nhạy cảm với nhiệt Các bộ phân tích trự c tuyến. Một số thông số quan trọng không thê đo được bằng các cảm biến in situ như glucose và các thành phần môi trường, khi đó người ta dùng các phương pháp phân tích trực tuyến. Trong phương pháp này, mẫu được lấy và phân tích một cách tự động. Kiểu FIA (flow injection analysis) hay được dùng vì tôc độ, độ chính xác, độ tin cậy cao. Tuy nhiên, nhược điểm của FIA là chỉ phân tích được một tham số'. Thế hệ tiên tiến hơn sử dụng các kỹ thuật SIA (sequential injection analysis) cho phép đo nhiều tham sô trong cùng một thiết bị. Các hệ thống phân tích khác như khối phổ (mass spectrometry - MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), và sắc ký khí (GC) đôi khi cũng được dùng. Mặc dù các hệ thông phân tích này có thế phân tích nhiều tham số trong một lần chạy, nhưng chúng không thể sánh được với FIA về độ tin cậy cũng như tốc độ (tần suất đo cao). Tự LƯỢNG GIÁ 1. Trình bày các chiến lược phân lập chủng thích hợp để sản xuất. 2. Giải thích các tiêu chí của chủng lên men công nghiệp. 3. So sánh các kỹ thuật đột biến để cải tạo chủng. 4. Công thức hóa học của tế bào và cơ sở hình thành môi trường lên men. 5. So sánh kỹ thuật lên men hề mặt và lên men chìm. 6. Các thông số cần kiểm soát trong quá trình lên men và loại cảm biên tương ứng. 7. Sản phẩm nào sau đây không phải của lên men công nghiệp: A. Sinh khôi B. Streptokinase c. Insulin tái tổ hợp D. Kháng sinh quynolon 8. Yêu cầu nào kh ô n g đúng đôi với chủng lên men công nghiệp A. ít cần yếu tô' tăng trưởng B. An toàn, không gây bệnh c. Tiết được sản phẩm ra môi trường D. Dễ thu hoạch 9. Yếu tô" nào không ảnh hưởng đến việc lựa chọn thành phần môi trưòng lên A. Tính sẵn có B. Hiệu suất sử dụng và tạo sản phẩm c. ít tạo sản phẩm phụ D. Tan được trong nước 10. Cặp thông sô' - cảm biến nào sau đây không phù hợp A. Nhiệt độ — Pt-100 B. P 0 2 — Piezoresistor c. PC02 - Điện cực pH có màng D. Lưu tốc khí - Đồng hồ nhiệt lượng B ài 3 SẢN XUẤT KHÁNG SINH MỤC TIÊU 1. Trình bày được các bước chính trong lên men Penicillium chrysogenum sản xuất benzylpenicillin: thành phần môi trường, cách nuôi dường, chủng. 2. Trinh bày được tóm tắt quy trình lên men s. erythraea sản xuất erythromycin. 3. Nêu được nguyên tắc tách benzylpenicillin. 1. MỞ ĐẦU Đa sô kháng sinh được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng cách lên men. Thực tế khoa học lên men kháng sinh phát triển chậm mặc dù có sự gia tăng không ngừng việc sử dụng các thiết bị phức tạp, áp dụng các kỹ thuật kiểm soát và sử dụng máy tính. Khó tối ưu hóa quy trình lên men vì không thể có hai mẻ giống nhau hoàn toàn, hiệu suất lên men kháng sinh liên quan vói dân sô tê bào sống luôn thay đổi cả về sô lượng và chất lượng suốt chu kỳ sản xuất. Sản xuất benzylpenicillin (penicillin G, nguyên thủy chỉ là penicillin) được chọn là mô hình cho quá trình sản xuất kháng sinh. Đây là kháng sinh quan trọng nhất cả về lịch sử và giá trị y học. Penicilin là kháng sinh đ ư ợc sản xuất đầu tiên quy mô lớn. Hiện nay, penicillin vẫn được kê toa trên toàn cầu và còn là nguyên liệu đầu cho các kháng sinh bán tổng hợp. Ngoài ra trong bài này quy trình sản xuất kháng sinh macrolid erythromycin bằng xạ khuẩn Saccharopoỉyspora erythraea cũng được mô tả đế minh họa vì xạ khuẩn là nguồn sinh kháng sinh tự nhiên phong phú nhất. Năm 1928, Fleming tình cờ phát hiện ra các hộp petri nuôi tụ cầu bị nhiễm mổc có tạo vòng ức chế. Ông tách môc xanh này ra nghiên cứu và định danh là Penicillium notatum, tuy nhiên, ông chưa tách được chất có tác dụng cũng như nghiên cứu cấu trúc. Năm 1941, công nghệ sản xuất penicilin đã được hình thành. Các chủng đầu tiên chỉ đạt 10-15 IU/ml dịch men. Giai đoạn này người ta nuôi bằng phương pháp bề mặt, dùng nước lọc ra để rửa vết thương. Quá trình đột biến để cải tạo giông đồng thời đũa kỹ thuật lên men chìm vào sản xuất nâng hiệu suất tăng dần lên. Hiện nay hiệu suất tăng gấp 85.000 lần so với lúc ban đầu. ở Việt Nam, người nghiên cứu penicilin đầu tiên là cố giáo sư Đặng Văn Ngữ. Năm 1947, giáo sư đã mang chủng Peniciỉlium chrysogenum từ Nhật về và trong chiên khu Việt Bắc giáo sư đã sản xuất ra dịch men penicillin để chữa cho các thiíơng binh. 2. SẢN XUẤT BENZYLPENICILLIN 2.1. G iống Giông đê sản xuất penicillin là Penicillium notatum, được phân lập bởi Fleming vào năm 1928 từ sự nhiễm tình cờ. Vào năm 1940, Florey và Chain đã sản xuất được penicillin tinh khiết và tiềm năng chữa bệnh to lốn của nó trở thành hiện thực. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy bề mặt môi trường lỏng để nuôi cấy thê hiêu khí bắt buộc này kéo dài, cần nhiều thao tác và dễ bị nhiễm. Việc phân lập được chủng Penicillium chrysogenum cho hiệu suất cao (gấp 100 lần chủng của Fleming) từ quả dưa đỏ bị nhiễm ở chợ Peoria, thuộc bang Illinois - Mỹ đã cho một bưóc tiến quan trọng. Chủng p. chrysogenum có thể nuôi lên men chìm trong bình kín thể tích 250 m3 có khuấy và thông khí. Từ một nấm gốc này, mỗi nhà sản xuất penicillin có chủng đặc biệt bằng cách xử lý với các tác nhân gây đột biến như tia Rơnghen, tia tử ngoại và các chất ankyl hóa và chọn lọc để thu các biến đổi cải tiến. Các thể biên đôi chọn lọc này có khả năng sản xuất lượng penicillin lớn hơn nhiều so với chủng hoang dại, đặc biệt là khi lên men trong các điểu kiện môi trường có kiếm soát. Các kết quả gây đột biến và lai tạo chủng có thể tóm tắt như sau: - Tốc độ tạo sản phẩm và hiệu suất cao. - Có khả năng tạo thành sản phẩm trong điều kiện nuôi cấy chìm (các chủng đầu tiên chỉ sinh ra sản phẩm trong điều kiện nuôi cấy bề mặt). - Sử dụng đư ơc cơ chất phức tạp và tiêu thụ tốt phenylaeetat. - Không tạo sắc tô gây khó khăn cho việc tinh chế. - Có hệ sợi sinh trưởng rắn chắc nên dễ tách sợi nấm khỏi môi trường. Khó khăn là việc chọn lọc được các chủng dị hợp tử bền vững. Các quy trình chọn lọc chủng này trỏ thành đặc trưng cơ bản công nghệ sinh học công nghiệp. Các chủng sản xuất được bảo quản ở dạng ngủ bằng bất cứ kỹ thuật bảo quản nuôi cấy chuẩn nào. Huyền phù bào tử có thể được trộn vối giá thế trơ như đất, cát hay trong kê vô trùng, chia ra và sấy hoặc được trộn trong môi trường thích hợp và đông khô hoặc bảo quản trong bình nuôi cấy lỏng. Tất cả các hoạt động phòng thí nghiệm được tiến hành trong buồng thổi khí vô trùng đặt trong phòng có duy trì khí lọc áp suất hơi dương so với môi trường bên ngoài. Người thực hiện mặc áo choàng và làm việc vô trùng. Lên men kháng sinh là quá trình nuôi cấy vô trùng bắt buộc, không được để nhiễm sinh vật lạ. ó COOH N h án h ben acyl ; 6 -A m in o p e n ic illa n ic acid Hình 3.1. Câu trúc của penicillin G - penicillin tự nhiên 2.2. N hân giố n g Mục đích của nhân giông nhằm thu lượng giông tinh khiết cần thiết ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarit) cho giai đoạn lên men. Hình 3.2 là minh họa điển hình cho nhân giống. Thòi gian cho mỗi giai đoạn nhân giông được tính bằng ngày. Giống cấy cho giai đoạn sản xuất thường là 1 - 10% tổng thể tích lên men. Nếu lên men được cấy giông không đủ, có thể sẽ kéo dài thời gian tiềm ẩn trước khi bắt đầu tăng trưởng và như vậy sẽ làm kéo dài giai đoạn lên men. Điều này vừa không kinh tế vừa có thể làm tàng trường thoái hóa ảnh hưởng hiệu suất, chất lượng và do đó cũng tăng giá. Môi trường nhân giông được thiết kế đế cung cấp cho vi sinh vật tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết. Cung cấp oxy thích hợp ở dạng khí vô trùng và kiểm soát nhiệt độ ở mức mong muôn. Tiêu chuẩn chính để chuyển qua giai đoạn kê tiếp trong tiến trình là giông không nhiễm và tăng trưởng đến mật độ tê bào đã xác định trước. Thường thì sợi nấm mọc phân nhánh và theo thời gian dịch nuôi cấy sánh giông như xúp. Bào tử ngủ Giai đoạn nuôi trong phòng thí ____^ Giai đoạn nuôi trong môi nghiệm trên môi truồng rắn________ trưòìig lỏng trong bình lăc giai đoạn giai đoạn giai đoạn nhân giông ------► nhân giông ------► sản xuât 0,5-1,0 m3 10-20 m3 125-250 m3 V-------------------____________-_^ Giai đoạn nhân giống trong thiết bị Hình 3.2. Các giai đoạn chuẩn bị giống cho lên men benzylpenicillin 2.3. Lên m en Thiết bị lên men thường làm bằng thép không gỉ, hình trụ, đứng, kín, có dung tích 25-250 m3. Chiều cao của nó thường gấp ba lần đường kính. Cung cấp oxy Lên men penicillin cần oxy được cung cấp dạng không khí lọc vô trùng từ máy nén khí, tốc độ 0,5 - 1,2 (thể tích/phút). Hệ thống cánh khuấy và các gờ cản trong nồi lên men sẽ thúc đẩy sự thông khí. Kiểm soát nhiệt độ Quá trình sản xuất benzylpenicillin rất nhạy cảm với nhiệt độ. Nhiệt do chuyên hóa được sinh ra nhiều trong quá trình lên men nên nhiệt độ phải được giảm duy trì ở 26±l°c bằng hệ thông làm lạnh. Nhiệt này được chuyển bằng nước lạnh lưu thông qua các dãy ống trong nồi hoặc qua các ông xoắn quanh bên ngoài ở vỏ nồi. Hệ thông nưốc lạnh này cũng được dùng để làm nguội môi trường tiệt trùng trong nồi trưốc khi cấy giống vào. Thiết bị và tác nhân khử bọt Nuôi cấy vi sinh vật có thể tạo bọt khi chúng được khuấy và thông khí mạnh. Nếu không kiểm soát bọt tạo ra này, dịch nuôi cấy có thể bị mất qua đường khí thải. Vì vậy nồi lên men thường có hệ thông tự động để phát hiện bọt ngay khi chúng mới chóm, cung cấp áp suất ngược tạm thòi để môi trường trong nồi không bị trào và thêm tác nhân khử bọt vô trùng. Các cảm biến cũng được lắp vào hệ thống lên men để hiện Hên tục các biến sô" quan trọng như nhiệt độ và pH, công suất dùng của motor điện, dòng khí, oxy hòa tan và khí thải. Bổ sung môi trường Không phải tất cả các chất dinh dưỡng cần trong quá trình lên men được cho vào ngay từ môi trường nuôi cấy ban đầu. Một sô" thứ được tiệt trùng riêng và bổ sung vào trong khi lên men, thường là qua hệ thống tự động có chương trình liên tục điều chỉnh trước hoặc bổ sung vô trùng riêng rẽ. Hệ thống chuyển và lây mẫu Có các hệ thông vô trùng để chuyển giông vào nồi, để lấy mẫu thường quy trong quá trình lên men, để thu hoạch sớm, v.v... Sự vô trùng được đảm bảo bằng thiết kế kỹ th u ật và bằng dùng hơi nưốc đến tất cả các phần của nồi và hệ thông Ống liên quan. Việc lấy mẫu rất cần thiết để theo dõi sô" lượng tăng trưởng, động học các chất dinh dưỡng chính và nồng độ penicillin. Ngoài ra, kiểm tra nuôi cấy có bị nhiễm vi sinh vật không mong muốn hay không cũng rất quan trọng. 2.4. Kiểm soát lên men Sinh tổng hợp benzylpenicillin bị giảm nhiều nếu lượng oxy sẵn có thấp hơn ngưỡng mặc dù vi khuẩn vẫn tiếp tục tăng trưởng. Vì thế, nếu tốc độ tăng trưởng trong quá trình lên men được giữ như ở giai đoạn nhân giống, dịch nuôi cấy sẽ trở nên rất đậm đặc và sự thông khí sẽ không đủ để duy trì sản xuất penicillin nữa. Như vậy, các điều kiện điều chỉnh cho sự tăng trưởng nhanh chỉ đến khi dân sô' tê bào đạt được mật độ tối đa mà nồi lên men có thể cung ứng. Môi trường lên men Môi trường ban đầu cho vào nồi lên men là phức hớp thiết kê chỉ để cung cấp sô" lượng mong muôn cho tăng trưởng lúc đầu. Nguồn nitơ chủ yếu là cao ngô (corn steep liquor, CSL) là sản phẩm phụ của công nghệ tinh bột ngô. Nguyên liệu này không chỉ đặc biệt quan trọng cho lên men penicillin mà còn có giá trị trong nhiều môi trường nuôi nấm sản xuất kháng sinh. Cao ngô cũng chứa nhiều hợp chất carbon, như các acid và đường, các ion vô cơ và các yếu tô' tăng trưởng. Tuy nhiên, giông như một số’ chất dinh dưỡng khác, cao ngô là phức hợp dinh dưỡng, không được định rõ về mặt hóa học, có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên và biến đổi nhiều giữa các lô mẻ sản xuất. Đây là một trong những lý do làm cho các mẻ lên men không bao giờ hoàn toàn giông hệt nhau. Môi trường chứa các nguồn nitơ phụ trợ và các chất dinh dưỡng thiết yếu như calci (bổ sung ở dạng calci carbonat trung hòa tính acid tự nhiên của cao ngô), magiê, sulphat, phosphat, kali và kim loại vi lượng. Môi trường được tiệt trùng bằng hơi nước ở 120°c trong nồi lên men hoặc nồi riêng. Chất dinh dưỡng Môi trường tiệt trùng được khuấy, thông khí, chỉnh pH và nhiệt độ đúng giá trị trên màn hình kiểm soát quá trình. Sau đó cấy giống và bắt đầu pha tăng trưởng. Nguồn carbon ban đầu được cung cấp đủ lượng để duy trì sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu nhưng không đủ để cung cấp năng lượng cho sự sản xuất penicillin và duy trì sinh khôi cần thiết trong các giai đoạn còn lại của men. Nguồn carbon cho các giai đoạn sau này được cung cấp liên tục sao cho mức tăng trưởng nằm trong giỏi hạn cho phép. Nguồn carbon có thể là saccharose hoặc glucose, và để giảm chi phí có thể dùng loại không tinh khiết như mật đường hoặc dịch thủy phằn tinh bột. Vì nồng độ đưòng còn dư trong môi trường quá thấp không thể đo được, nên tốc độ cung cấp được xác định dựa theo kinh nghiệm và điều chỉnh lại theo các thông sô" hệ thổng. Một cách khác để có được giới hạn carbon nhưng tránh được các phiền phức do phải theo dõi chặt chẽ tốc độ cung cấp carbon là cung cấp tất cả carbohydrat ngay từ đầu dưới dạng lactose. Sự thủy phân lactose thành hexose có tốc độ hạn chế sẽ đảm bảo sự cung cấp lượng carbohydrate có thể đồng hóa một cách từ từ và ổn định. Calci, magiê, phosphat, và các kim loại vi lượng được bổ sung lúc đầu thường đủ chồ suổt quá trình ỉên men, nhưng vi sinh vật cần cung cấp thêm nitơ và lưu huỳnh để cân bằng dinh dưỡng carbon. Nitơ thường được bổ sung ở dạng khí amoniac. Việc cung cấp carbon và nitơ không chỉ đáp ứng cho nhu cầu của vi sinh vật về các nguyên tố này đúng theo tỷ lệ phân tử gam, mà chúng còn nhằm duy trì dự trũ ion amoni thích hợp và góp phần kiểm soát pH, sự chuyển hóa carbon làm acid hóa và được cân bằng bỏi tính kiềm của amoniac. Sulphate thường được cung cấp cùng với đường. Tất cả các dinh dưỡng được tiệt trùng trước khi đong vào nồi lên men. Sự nhiễm các vi khuẩn đề kháng vói kháng sinh vào nồi lên men hiếm khi xảy ra, nhưng thiệt hại do sự nhiễm này rất nghiêm trọng nên việc ngản chặn hết sức cần thiết. Vi khuẩn nhiễm tăng trưởng nhanh, sản xuất p-lactamase, tiêu thụ dinh dưõng, làm mất kiểm soát pH và ảnh hưởng quá trình chiết xuất sau đó. Pha tăng trưởng nhanh chóng chuyển sang pha sản xuất kháng sinh. pH và nhiệt độ tôi ưu cho sự tăng trưởng không phải là tôi ưu cho sự sản xuất kháng sinh và có thể có các thay đổi trong kiểm soát các thông sô' này. Khi bắt đầu pha sản xuất kháng sinh, acid phenylacetic (PAA) được bổ sung liên tục. Kích th ích b ằn g PAA PAA cung cấp nhánh bên cho benzylpenicillin; không có PAA, các vi sinh vật tổng hợp chỉ một lượng nhỏ penicillin này. Trong cao ngô có các hợp chất phenylacetyl (có từ phenylalanine trong hạt được biến đổi bởi hệ vi sinh vật trong tự nhiên), nên cao ngô là nguồn phức hợp nitơ rẻ và tốt nhất được dùng trong những thí nghiệm ban đầu và dẫn đến sử dụng PAA. PAA không chỉ kích thích sinh tổng hợp benzylpenicillin mà nó còn ức chế sự tạo thành các penicillin không mong muôn khác. Tuy nhiên, nồng độ cao PAA sẽ độc với nấm và vì thế không thể thêm nó một cách bừa bãi, mặt khác PAA đắt tiền. Việc cung cấp PAA được kiểm soát sao cho luôn duy trì được lượng PAA thích hợp mà không tới giới hạn độc. Giảm lượng PAA cho vào ngay trước khi kết thúc lên men để lượng tiền chất chưa sử dụng trong dịch nuôi cấy cuốỉ không quá thừa. Acid a-aminoadipic + Cystein + Valin 1 tripeptid L . . isopenicillin N PAA -> -ỳ Acid a-aminoadipic Benzylpenicillin Sinh tổng hợp benzylpenicillin đi từ ba acid amin: acid a-aminoadipic, cystein và valin, và PAA. Các acid amin tụ lại thành tripeptid, đóng vòng tạo cấu trúc vòng của penicillin với nhánh bên a—aminoadipyl, isopenicillin N. Sau đó thêm nhánh bên nhóm phenylacetyl từ PAA cho ra benzylpenicillin. Gần đây lý thuyết và công nghệ di truyền đã phát triển để có được chủng hoạt tính cao. Trong những năm 1980 đã có tiến bộ vượt bực về phân lập và thao tác các gen sinh tổng hợp theo con đường này và các con đường liên quan thành các cephalosporin (qua nấm mốc sản xuất cephalosporin c là Acremonium chrysogenum) và các cephamycin (qua xạ khuẩn sản xuất cephamycin c là Streptomyces clavuỉigerus). Ngày nay các nhà sản xuất kháng sinh có thể áp dụng kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho các chủng nấm mốc công nghiệp để sản xuất p-lactam và có những triển vọng thú vị về việc tạo các thay đổi di truyền làm tăng đáng kể sản phẩm, Còn cần cải tiến nhiều khía cạnh vì các chủng công nghiệp hiện hành và quá trình lên men chỉ mới chuyển < 10% tổng carbon thành penicillin. Kết thúc Quyết định ngưng lên men rất phức tạp và phải căn cứ vào một sô' yếu tố. Thường thì nhà sản xuất sẽ thu hoạch ngay sau khi có dấu hiệu đầu tiên của sự giảm hiệu quả chuyển đổi nguyên liệu thô đắt tiền nhất (nguồn carbon, tức là glucose) thành penicillin. 2.5. C hiết xuất Thu tế bào Khi thu hoạch, benzylpenicillin hòa tan ngoại bào, cùng vói nhiều chuyển hóa khác và các thành phần của môi trường. Bước đầu tiên của quá trình sau lên men là loại bỏ tế bào bằng cách lọc hoặc ly tâm. Giai đoạn này được tiến hành sao cho tránh nhiễm các vi sinh vật đề kháng sinh bằng cách tiết (3-lactamase vì có thể làm mất nhiều hoặc mất toàn bộ sản phẩm. Tách benzylpenicillin Giai đoạn tiếp theo là tách benzylpenicillin. Quá trình này thường dùng dung môi mặc dù cũng có các phương pháp khác như sắc ký trao đổi ion và kết tủa. ở pH 2-2,5 của dung dịch nước, penicillin có hệ sô' tách cao trong các dung môi hữu cơ như amyl acetate, butyl acetate và methyl isobutyl ketone. Việc chiết phải được tiến hành nhanh vì benzylpenicillin rất không ổn định ở các giá trị pH thấp này. Sau đó penicillin được chiết lại vào dung dịch đệm ở pH 7,5, lúc này penicillin có hệ số tách mạnh trong pha nưóc. Thu hồi dung môi bằng chưng cất để tái sử dụng. Xử lý chất chiết thô Benzylpenicillin được sản xuất dưới các dạng muôi khác nhau tùy theo dự định sử dụng là làm nguyên liệu đầu vào cho các nhà sản xuất bán tổng hợp các kháng sinh P-lactam hoặc cho sử dụng lâm sàng. Việc xử lý chất chiết penicillin thô thay đổi theo mục tiêu nhưng gồm có việc tạo muôi thích hợp, sau đó xử lý loại bỏ các chí nhiệt tô" (pyrogen) và tiệt trùng. Đe tiệt trùng thường dùng cách lọc nhưng muôi kim loại tinh khiết của penicillin có thế tiệt trùng bằng nhiệt khô. Đê dùng đường tiêm, kháng sinh được đóng gói trong lọ vô trùng ở dạng bột hoặc huyền dịch. Để dùng đường uống, có thể bào chế dạng viên bao phim hay bất cứ dạng chuẩn nào khác. Lấy mẫu ngẫu nhiên vối sô" lượng thích hợp thành phẩm đê đảm bảo kiểm tra chất lượng chặt chẽ đảm bảo đạt các yêu cầu về hoạt lực, tinh khiết, không có chí nhiệt tố và vô trùng. Tất cả các giai đoạn sản xuất kháng sinh từ lên men đến thành phẩm được tuân theo thực hành sản xuất thuốc tot (GMF) trong đó có cả kiểm soát chất lượng. GMP đòi hỏi “một hệ thống toàn diện từ khâu thiết kế, lập hồ sơ, thực thi và kiểm tra đến nhà xưởng, nhân sự, thiết bị và các tài nguyên khác nhằm đảm bảo sản phẩm sẽ đạt chất lượng đúng với dự định dùng”. 3. SẢN XUẤT PENICILLIN V Các penicillin khác nhau được sinh tổng hợp bằng cách bổ sung các chất cho acyl khác nhau. Ví dụ cho tiền chất acid phenoxyacetic thay vì PAA, penicillin V được sản xuất bởi quy trình tương tự như benzylpenicillin. Trong con đường sinh tổng hợp, nhánh bên a-aminoadipyl của isopenicillin N được thay bởi nhóm phenoxyacetyl (Bảng 3.1). Vi sinh vật dùng cũng là p. chrysogenum. Nhà sản xuất có thể dùng cùng một chủng đột biến để sản xuất cả hai sản phẩm hoặc có thế dùng các thể đột biến khác nhau cho hai loại penicillin. Tình huông này tương tự với các chủng Streptomyces aureofaciens dùng lên men sản xuất cả chlortetracyclin và demethylchlortetracyclin. Giông như benzylpenicillin, penicillin V vẫn được dùng rộng rãi và cũng có thể dùng làm nguyên liệu đầu để bán tổng hợp các penicillin không thể sản xuất trực tiếp bằng con đường lên men. 4. SẲN XUẤT CEPHALOSPORIN c Penicillin V hoặc benzylpenicillin có thể được chuyển thành cephalosporin bằng cách mở rộng vòng hóa học. Ví dụ có thể sản xuất cephalosporin thê hệ một như cephalexin theo cách này. Tuy nhiên, hầu hết các cephalosporin được dùng trong lâm sàng là sản phẩm bán tổng hợp từ sản phẩm lên men cephalosporin c. Chủng gốc (thời đó được gọi là Cephalosporium acremonium) được phân lập tại bờ biển Sardinian vào năm 1945 khi quan sát thấy là nước công địa phương ra biển khá sạch. Vì hoạt tính liên quan đến nhiều hợp chất khác nhau nên nghiên cứu tiến triển chậm. Cephalosporin c được tách đầu tiên vào năm 1952 nhưng phải mất một thập kỷ các cephalosporin bán tổng hợp mới được dùng trong lâm sàng. Con đường sinh tổng hợp cephalosporin c giống với các penicillin cũng như isopenicillin N. Giông với nhiều lên men kháng sinh khác, không cần dinh dưỡng tiền chất cho cephalosporin c. Trong các chất chuyển hóa của vi sinh vật có đủ cơ chất nhóm acetyl cho phản ứng acetyltransferase cuối. Chiết sản phẩm khỏi dịch nuôi cấy bằng cách hấp phụ vào carbon hoặc resin, ít dùng dung môi. Điều này minh họa một điểm chung quan trọng là các quá trình sản xuất kháng sinh khác nhau nhiều ở giai đoạn hồi phục sản phẩm chứ không phải giai đoạn lên men. Hình 3.4 minh họa lộ trình sản xuất điển hình từ nhân giống đến ra thành phẩm kháng sinh. COOH Hình 3.3. Câu trúc cephalosporin c Bảng 3.1. cấu trúc của một số penicillin tự nhiên, các penicillin sinh tổng hợp quan trọng nhất và penicillin bán tổng hợp Penicillin thiên nhiên Sản phẩm Mạch nhánh N-Acyl Benzylpenicillin (Penicillin G) 2-pentenylpenicillin (Penicillin F) CH3— CH2—C H = C H —CH2— CO— n-Amylpenicillin (Penicillin - Dihydro F) c h 3— (CH2)4- C O - n-Heptylpenicillin (penicillin K) CH3— (CH2)6- C O - p-Hydroxybenzylpenicillin (penicillin X) HO // w CH2—c o - Penicillin sinh tổng hợp Sản phẩm mong muốn Tiền chất Benzylpenicillin: không bền với acid, nhạy với (5- ( / __CO O H lactamase, hoat tính thấp trên VK Gram (-) \ — /Phenyl acetic acid Phenoxymethylpenicillin (Penicillin V): ổn định với / / \ Q__—CCX)H acid, các đăc tính khác giống penicillin \ ___ / 1 'A ■ ■ a r N------' Phenoxyl acetic acid Allylmercaptomethylpenicillin (Penicillin O): giảm H 2C = C H —C H 2— s— C H 2— COOH các đặc tính gây dị ứng A lly l m ercapto acetic acid Penicillin bán tống hợp Sản phẩm mong muốn Propicillin: ổn định với acid, nhạy với p-lactamase Methicillin: ổn định với acid, kháng p-ỉactamase Oxacillin: ổn định với acid, kháng P-lactamase Ampicillin: phổ kháng khuẩn rộng (đặc biệt kháng VK Gram (-), ổn định với acid, nhạy VÍN p-lactamase Mạch nhánh N-Acyl ể \ — o —C H -C O - CHo CH, O CH3 co— o c h 3 / \ -CO c h 3 CH—c o - I D(-) n h 2 Carbenicillin: phổ kháng khuẩn rộng (đặc biệt kháng ^ pseudomonas aeruginosa, ổn định với acid nhưng uống không công hiệu, nhạy với p-lactamase CH—CO COOH 1. Lên men Giông giai Chai lắc 0,5L đoạn 1 Óng bào tứ Chai môi trường m°' trườnê lòng 0,2 ml nuôi cấy thạch Vặn chuyển đến nhà máy để bào chế thành sản phẩm Ị - . _ T 1 thùng vỏ Sàn phậm tiệt Chất rần trùng trùng sẩy khô Hình 3.4. Quá trình sản xuất cephalosporin điển hình 5. SẢN XUẤT ERYTHROMYCIN Một ví dụ điển hình khác minh họa sản xuất kháng sinh bằng lên men vi sinh vật là quy trình sản xuất kháng sinh macrolid erythromycin bằng xạ khuẩn Saccharopolyspora erythraea (tên trước đây là Streptomyces erythreus). Xạ khuẩn (Actinomycetes) và đặc biệt là các thành viên của chi Streptomyces có ở khắp nơi trong tự nhiên và là nguồn phong phú cho các chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học. Bảng 3.2 liệt kê 62 chất chuyển hóa thứ cấp hữu dụng của hơn 9.000 phân tử có hoạt tính sình học phân lập từ xạ khuẩn cho đến nay (2004), chiếm hai phần ba các kháng sinh đã biết làm từ vi sinh vật và khoảng 60% các chuyến hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học ngoài kháng sinh. Gần 80% các phân tử này được làm từ Streptomyces. s. erythrap.a được mô tả lần đầu vào năm 1919 bởi Waksman. Năm 1952, hoạt tính kháng sinh của chủng s. erythraea NRRL2338 có nguồn gốc từ chủng phân lập đầu tiên được công bô'. Chủng NRRL 2338 sản xuất khoảng 0,25-1 g erythromycin trong 1 lít tùy điều kiện nuôi cấy. 50 năm sau, hiệu suất này tàng lên hơn gấp 10 lần, khoảng 10-13 g/L canh nuôi. Sự sinh tổng hợp erythromycin được mã hóa bởi các gen ery nằm trên đoạn ADN dài khoảng 60 kb, tóm tắt trong hình 3.4. Sự lên men sản xuất hỗn hợp erythromycin A, B, c, và D, trong đn chỉ có erythromycin A là chất được mong muốn (hình 3.5). Các hộp chất kia là sản phẩm hydroxyl hóa một phần hoặc các chất methyl hóa trung gian. Một chủng sản xuất tốt phải cho ra lượng erythromycin A cao, ít nhất là 8 -10 g/L, chứa trên 90% hàm lượng là erythromycin A. Một sô' hãng sản xuất lớn là Lilly (1952), Abbott (những năm 1970). sản lượng erythromycin hàng năm là 4.000 tấn. Mặc dù một ít erythromycin vẫn được dùng (1.000 tấn), phần lớn nó được chuyển đổi hóa học thành azithromycin (1.500 tấn), clarithromycin (1.500 tấn), và roxithromycin (400 tấn). Bảng 3.2. Danh sách các kháng sinh từ xạ khuẩn có ích Kháng sinh Xạ khuẩn Phân loại hóa học Đích ứng dụng Actinomycin D Streptomyces spp. Peptid Phiên mã Kháng ung thư Antìmycin A Streptomyces spp. Macrolid Hệ thống cytochrom Avermectin s. avermitilis Macrolid (PK) Các kênh ion chlorid Telocidal Kháng ký sinh trùng Bambermycin s. bambergiensis Các amino glycosid thay thế (phức hợp của hơn bốn moenomycin) Peptidoglycan Thúc đẩy tăng trưởng Bialaphos s. hygroscopicus Peptid Glutamin synthetase Diệt cỏ Kháng sinh Xạ khuẩn Phân loại hóa học Đích ứng dụng Bleomycin S. verticillus Glycopeptỉd Đứt sợi ADN Kháng ung thư Candicidin S. grise us Polyen macrolid (PK) Màng (thể tạo pore) Kháng nấm Cephamycin c Nocardia lactamdurans (và các chủng khác) (3-Lactam Peptidoglycan Kháng khuẩn Chloramphenicol S. venezuelae A/-Dichloracyl phenylpropanoid R Kháng khuẩn Chlorotetracyline S. aureofaciens Tetracyclin (PK) R Kháng khuẩn Acíđ Clavulanic S. clavuligerus p-lactam ức chế p~ Lactamase Phối hợp với p-lactam kháng khuẩn Cycloserin S. orchidaceus Cyclic peptid thay thế Peptidoglycan Kháng khuẩn Daptomycin s roseosporus Lipopeptid Acid Lipoteichoic? Kháng khuẩn Daqnorubicin (daunomycin) S. peucetius Anthracyclin (PK) Xen vào ADN Kháng ung thư Desferrioxamin S. pilosus Peptid Sắt chelat Tẩy sắt khi dư thừa sắt Doxorubicin (adiamycin) S. peucetius var. caesius Anthracyclin (PK) Xen vào ADN Kháng ung thư Erythromycin S. erythraea Macrolid (PK) R Kháng khuẩn FK506 (tacrolimus) S. hygroscopicus Macrolid (PK) Gắn vào FK protein ức chế miễn dịch Fortimicin Micromonospora olivoasterospora Aminoglycosid R Kháng khuẩn Fosfomycin Steptomyces spp. Acid Phosphoric Peptidoglycan Kháng khuẩn Gentamycin Micromonospora spp. Aminoglycosid R Kháng khuẩn Hygromycin B S. hygroscopicus Aminogiycosid thay thế R Kháng giun sán Kanamycin S. kanamyceticus Aminoglycosid R Kháng khuẩn Lasalocid S. lasaliensis Polyether (PK) Màng (thể mang ion) Kháng cầu trùng; thúc đẩy tăng trưởng Lincomycin S. lincolnensis Đường amide R Kháng khuẩn Milbemycin S. hygroscopicus Macrolide (PK) Các kênh ion chloride Kháng ký sinh trùng Mithramycin S. argillaceus Acid Aureolic Alkyl hóa ADN Kháng ung thư Mitomycin c S. caespitosus, S. verticillatus Benzoquinone Liên kết chéo ADN Kháng ung thư Monensin S. cinnamonensis Polyether (PK) Màng (thể mang ion) Kháng cầu trùng; thúc đẩy tăng trưởng Kháng sinh Xạ khuẩn Phân loại hóa học Đích ứng dụng Natamycin s. nataensis Tetraen polyen (PK) Màng (thể tạo pore) Kháng nấm Neomycin S. fradiae Aminoglycosid R Kháng khuẩn Nikkomycin s. tendae Nucleosid Sinh tổng hợp chitin Kháng nấm; insecticidal Nocardicin Nocardia uniformis P-Lactam Peptidoglycan Kháng khuẩn Nosiheptiđe s. actuosus Thiopeptid R Thúc đẩy tăng trưởng Novobiocin s. niveus Coumerìn glycosiđ ADN gyrase (GyrB subunit) Kháng khuẩn Nystatin s. noursei Polyen macrolid (PK) Màng (thể tạo pore) Kháng nấm Oleãndromycin s. antibioticus Macrolid (PK) R Kháng khuẩn Oxytetracycline s. rìmosus Tetracyclin (PK) R Kháng khuẩn Paromomycin s. rímosus forma paromomycinus Aminoglycosid R Kháng amib Phleomycin s. verticillus Glycopeptid Gãy sợi ADN Kháng ung thư Polyoxins s. cacaoi var. asoensis Nucleosid-peptid Sinh tổng hợp chitin Kháng nấm (bảo vệ thực vật) Pristinamycin s. prìstinaespiralis Peptidic macrolacton + polyunsatturated macrolactone (PK) R Kháng khuẩn Puromycin s. alboniger Purin nucleosid R Nghiên cứu Rapamycin s. hygroscopicus Macrolid (PK) Gắn FK protein ức chế miễn dịch Rifamycin Amycolatopsis mediterranei Ansamycin (PK) ARN polymerase Khảng khuản Ristocetin Nocardia Iruida Glycopeptid Peptidoglycan Kháng khuẩn Salinomycln s. albus Polyether (PK) Màng (thể mang ion) Kháng cầu trùng; thúc đẩy tăng trưỏng Spectinomycin s. spectabilis Aminocyclitol R Kháng khuẩn Spinosyns s. spinosa Tetracyclic mocrolid (PK) Chưa rõ Diệt côn trùng Spiramycin S. ambofaciens Macrolid (PK) R Kháng khuẩn Streptogramins S. graminofaciens Macrocyclic lacton R Kháng khuẩn Streptomycin s. grìseus Aminoglycosid R Kháng khuẩn streptothricin s. lavendulae N-Glycosid R Thúc đẩy tăng trưởng; bảo vệ thực vật Kháng sinh Xạ khuẩn Phản loại hóa học Đích ứng dụng Teichoplanin Actinoplanes teichomyceticus Glycoprotein Peptidoglycan Kháng khuẩn Tetracycline S. aureofaciens Tetracyclin (PK) R Kháng khuẩn Thienamycin s. cattleya (5-Lactam Peptidoglycan Kháng khuẩn Thiostrepton S. azureus Thiopeptid R Thúc đẩy tăng trường Tobramycin s. tenebrarius Aminoglycoside R Kháng khuẩn Tylosin S. fradiae Macrolide (PK) R Thúc đẩy tăng trưỏng Validamycin s. hygroscopicus Aminoglycosid R Bảo vệ thực vật Vancomycin Amycolatopsis orientalis Glycopeptid Peptidoglycan Kháng khuẩn Virginamycin s. virginiae Macrocyclic lacton